JP4051251B2 - プロリダーゼ、その遺伝子及びプロリダーゼの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリダーゼ(プロリンジペプチダーゼ、イミドジペプチダーゼ、EC3.4.13.9、以下、プロリダーゼという)は、C末端にプロリン又はヒドロキシプロリン残基を有するジペプチドを加水分解する酵素である。
【０００３】
これまでに哺乳類から古細菌に至るまで多くのプロリダーゼの酵素学的性質が決定され、また、遺伝子についても解析されてきた。例えば、哺乳類ではマウスの肝臓由来[非特許文献１参照]、ヒトの肝臓由来[非特許文献２]のものが知られており、バクテリアでは、大腸菌(E. coli)[ 非特許文献３]、ラクトバチルス・デルブルエキー（Lactobacillus delbrueckii）[非特許文献４]由来のものが知られている。また、古細菌では、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）[非特許文献５]由来のもの等が知られている。以上のプロリダーゼは、遺伝子についても報告されている。
また、酵素のみが知られていて、遺伝子についての報告がないものとしては、例えば、キサントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）（特許文献１）由来のもの等がある。
【０００４】
麹カビ(黄麹菌)であるアスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒等の日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。
これら黄麹菌を含むアスペルギルス属については、アスペルギルス・ニドランス由来のプロリダーゼのみ、遺伝子データベースであるGenbankに遺伝子配列情報の報告があるものの（ACCESSION；AJ296646）、精製酵素及び該遺伝子産物のプロリダーゼ活性についての報告はなされていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平9−249号公報
【非特許文献１】
Biochim. Biophys. Acta, 1308 (1), 15-16 (1996)
【非特許文献２】
J. Biol. Chem., 264 (8), 4476-4481 (1989)
【非特許文献３】
Nucleic Acids Res., 18 (21), 6439 (1990)
【非特許文献４】
Mol. Gen. Genet. 247, 494-500 (1995)
【非特許文献５】
J Bacteriol., 180(18):4781-9, (1998)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによってポリペプチドに分解され、更にポリペプチドからロイシンアミノペプチダーゼによりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、アミノ酸及びジペプチドを主体とした低分子ペプチドに分解される。
【０００７】
生産される麹菌の酸性カルボキシペプチダーゼは、基質がトリペプチドになると分解しにくくなり、ジペプチドとなると更に分解しにくくなる。特に、カルボキシル末端がプロリンのペプチドを分解しにくいため、これらのペプチドは醤油中に残存しやすい。
【０００８】
一方、ロイシンアミノペプチダーゼは、アミノ末端がグリシンのペプチドや酸性ペプチドを分解しにくいため、これらのペプチドが醤油中に残存しやすい。また、ロイシンアミノペプチダーゼは、ペプチド中にプロリンが存在する場合、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したXaa-Pro-ペプチドの状態で作用が停止する。醤油諸味中では、このXaa-Pro-ペプチドにプロリルジペプチジルペプチダーゼが特異的に作用しXaa-Proを遊離することにより、更にロイシンアミノペプチダーゼの作用が可能となり、アミノ酸の遊離生成が進行するものと考えられている。醤油中のジペプチドとして、中性ペプチドが13種類、酸性ペプチドが13種類の存在が報告され、その構造も推定されているが、上記の影響からGly-ProをはじめとするXaa-Proが多数認められている。
【０００９】
従って、これらXaa-Proのジペプチドを分解することにより、醤油及び酵素分解調味料のアミノ化率を向上させることが可能となる。更に、プロリン自体が呈味性を有するアミノ酸であるため、呈味の改変が可能となり、Glu-Pro、Asp-Pro等Xaaが旨味に関わるアミノ酸の場合にも、旨みの向上といった効果が期待できる。
【００１０】
また、醤油中に残存しているXaa-Proとしては、Ser-Pro、Thr-Pro、Ala-Pro、Gly-Proが同定されているが、これらのXaaは全て甘味や旨味を呈するアミノ酸であり、醤油の甘味や旨味の向上が期待できる。そのため、酵素の大量調製が比較的容易な微生物からプロリダーゼを得ることが待ち望まれており、麹菌のような安全性の高い微生物より単離されることは更に強く望まれている。
これ故、本発明は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するXaa-Proを分解することができる新規プロリダーゼ、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、黄麹菌より新規プロリダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
１．以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１３】
２．配列番号２で表されるアミノ酸配列全長と70%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１４】
３．以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１５】
４．配列番号２で表されるアミノ酸配列全長と70%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードするプロリダーゼ遺伝子。
【００１６】
５．以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【００１７】
６．前記３．、４．又は５．に記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
７．前記６．記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
８．前記７．記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物よりプロリダーゼを採取することを特徴とするプロリダーゼの製造方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．本発明のプロリダーゼ
本発明のプロリダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたプロリダーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得ることができる。
【００１９】
本発明のプロリダーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。更に、プロリダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列の全長と7０%以上、望ましくは7５%以上、更に望ましくは8０%以上、最も望ましくは8５%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であってもよい。
【００２０】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００２１】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin及び Altschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTは、BLASTより感度良く配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２２】
配列間の配列相同性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova等によって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 174:247-250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは、以下の通りである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50,expect: 10, word size: 3, Filter: ON を用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for amismatch: -2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ON を用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００２３】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に、高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターとしてデフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行なう場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。
【００２４】
２．プロリダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼ等の黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。更に具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspergillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)が挙げられる。これらの菌体を、プロリダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分間オートクレーブしたもの）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathala等の方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製する。
【００２５】
このようにして得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行なう。プライマーとしては、本発明のプロリダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよく、例えば、配列番号３及び配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えば、RNA LA-PCR Kit（宝酒造社製）を用いて常法により行なうことができる。得られた本発明のプロリダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のプロリダーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるプロリダーゼ遺伝子の例を夫々配列番号１及び配列番号２に例示する。
【００２６】
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、プロリダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしている遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２７】
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼ等の黄麹菌が挙げられる。これらの生物から、常法によりRNA又はゲノムDNAを調製し、プラスミド又はファージに組み込み、ライブラリーを調製する。次いで、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸、充分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーであれば、コロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーであれば、プラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行ないうるものである。
【００２８】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02%(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、52℃以上、好ましくは57℃以上、更に好ましくは62℃以上、最も好ましくは67℃以上である。
【００２９】
また、配列番号１に記載の塩基配列と70%以上、望ましくは75%以上、更に望ましくは8０%以上、最も望ましくは8５%以上の配列相同性を示すような塩基配列は、本発明のプロリダーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
【００３０】
上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなDNAは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群又は公共データベースのなかから、例えば、前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００３１】
このようにして得られたDNAがプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してプロリダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００３２】
３．組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、本発明のプロリダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でプロリダーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。
【００３３】
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、プロリダーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００３４】
４．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組み換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のプロリダーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリシア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌が挙げられる。形質転換は、宿主により公知の方法で行なうことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)）等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)）を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる方法（Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)）等を用いることができる。
【００３５】
５．プロリダーゼの製造
本発明のプロリダーゼの製造法は、本発明の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からプロリダーゼ蛋白質を採取することからなるものである。培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のプロリダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロリダーゼを生産させることができる。
【００３６】
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のプロリダーゼを生産することができる。本発明のプロリダーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のプロリダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いて、細菌を破砕した後、Triton X-100, Tween-20, Nonidet P-40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離し、その上清から本発明のプロリダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のプロリダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のプロリダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロリダーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【００３７】
［プロリダーゼ活性測定法］
本発明のプロリダーゼの活性は、Leu-Proを基質とし、酵素作用によって遊離するアミノ酸のアミノ基を酸ニンヒドリン法を用いて測定できる。
基質溶液: L-Leu-Pro (シグマ社製)を終濃度20mMとなるように20 mM トリス緩衝液(pH7.5)に溶解させた溶液
反応停止液: 氷酢酸
ニンヒドリン試薬：3%(w/v)ニンヒドリン(ナカライテスク社製)、 60%(v/v)氷酢酸、40%(v/v)リン酸
酵素溶液10μlに20 mM トリス緩衝液(pH7.5) 390μlを加えて、37℃、5分間プレインキュベートした後、基質溶液を100μl加えて、37℃で15分間反応させ、500μlの反応停止液を加えて、酵素反応を停止させる。更に、ニンヒドリン試薬500μlを加えて、100℃で10分間煮沸後、冷却して515nmの吸光度を測定する。上記の条件下で1分間あたり1μモルのプロリンを生成する酵素量を1単位(U)とする。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。但し、本件発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
１．アスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae )RIB40株(Aspergillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養し培養物を得た。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Cathala等の方法［DNA, 2(4):329-335, 1983］で全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion社製）を用いてDNase I処理を行ない、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA1.0 ugを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を用いてRT-PCRを行なった。
逆転写反応のプライマーは、オリゴdTの3'側にアダプター配列の付いたキットに付属のものを用い、逆転写反応は、42℃で60分間行なった。
【００３９】
次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書に従い、RNaseH、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼ等を含んだカクテルを加え、16℃で90分間反応させた後、更に、T4DNAポリメラーゼを加え、16℃、50分間反応させ、２本鎖ｃDNAのライブラリーを合成した。
次いで、上記反応物にアダプターDNA、DNAリガーゼ等を加え、アダプターを結合させた二本鎖ｃDNAのライブラリーを合成した。夫々の反応液組成及び反応条件は、全て添付の説明書に従った。
【００４０】
次いで、上記で得られた二本鎖ｃDNAのライブラリーを鋳型として、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いて、PCRを行ない、5'側は、開始コドンの直前から、3'側は、終止コドン直後から増幅した。夫々のプライマーの5'側にはクローニングを容易にするために制限酵素サイトを付加させた(例えば、配列番号３にはKpnI、配列番号４にはBam HIを導入した)。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 Takara EX Taq DNA Polymerase（宝酒造社製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
【００４１】
PCR反応は、94℃、2分間の後、94℃、30秒間、55℃、30秒間、72℃、2分間を30サイクル行ない、72℃、5分間行なった。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.5kbのバンドが確認された。なお、サーマルサイクラーとしては、GeneAmp 5700 Sequence detection system（PE Applied Biosystems社製）を用い、温度コントロール法は、カリキュレートコントロールによった。
【００４２】
次いで、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F'株（Invitrogen社製）を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体よりQIAprep spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、サーモ・シークェネース・サイクル・シークエンシング・キット（Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit）（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてシークエンス反応を行ない、LI-COR MODEL4200Lシークエンサー（LI-COR社製）で塩基配列を決定した。
【００４３】
その結果、配列番号１に示す約1.5kbのオープンリーディングフレーム（ORF）のDNA配列が明らかとなった。このプラスミドpPEPP5347は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-7826として寄託されている。また、pPEPP5347に含まれるクローンの開始コドンから終止コドン直前までの塩基配列を配列番号１に記載した。上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、500アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載した。
【００４４】
更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastp（ HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列相同性を示したものは、アスペルギルス・ニドランスのプロリダーゼ（GenBank:AJ296646）であり、35%の配列相同性を示した。
【００４５】
また、配列番号１の塩基配列について配列相同性の高い配列を検索した。検索に、NCBI blastn（HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列相同性を示したものは、上記アスペルギルス・ニドランスのプロリダーゼをコードする遺伝子（GenBank: AJ296646）であった。コード領域全長の配列相同性を解析ソフトGENETYX-WIN Ver.5.0で調べたところ、1416塩基にわたり、44%の配列相同性であった。
【００４６】
2.プロリダーゼcDNAの発現
上記のプラスミド pPEPP5347を鋳型とし、開始コドンを含む配列番号5及び終始コドンを含む配列番号6のプライマーを用いて、全長プロリダーゼcDNAをPCR増幅した。
次いで、このPCR産物を酵母発現ベクターpYES2.1-V5-his-TOPO(Invitorogen社製)にTAクローニングし、プラスミド pYES5347を作製した。上記のプラスミドは、ガラクトースにより目的蛋白質(プロリダーゼ)の誘導発現が可能である。宿主は、INVSc1 (Genotype:MATa、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52/ MATα、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52)を使用し、酢酸リチウム法により、上記のプラスミド pYES5347により宿主酵母を形質転換した。選択培地には、［0.67% アミノ酸を含まないYeast Nitrogenbase (Difco社製)、2% ラフィノース (和光純薬工業社製)、ウラシルを含まないYeast Synthetic Dropout Medium Supplement (SIGMA社製)］を使用した。酢酸リチウム法は、「蛋白質実験プロトコール-機能解析編-」(P63-P88細胞工学別冊：秀潤社)の記載に従った。
【００４７】
次いで、得られた形質転換体を用いて、pYES2.1-V5-his-TOPOベクターに添付のプロトコールに従い、蛋白質の発現を行なった。200 ml用バッフル付三角フラスコを用いて選択培地20 mlに形質転換体をコロニーより植菌し、30 ℃、140 rpmで約14時間、旋回培養して、これを種培養とした。次いで、種培養の濁度(OD600)を測定し、初期濁度がOD600 = 0.4となるように蛋白質発現誘導培地へ種培養を接種した。蛋白質発現誘導培地による培養は500 ml用坂口フラスコを使用し、培地50 mlで30 ℃、140rpmで振とう培養した。蛋白質発現誘導培地は、選択培地の炭素源を1% ラフィノース、2% ガラクトース(和光純薬工業社製)としたものを使用した。
【００４８】
誘導を開始してから48時間後の培養液を3000rpmで10分間遠心分離し、上清を菌体外分泌蛋白質画分、沈殿を菌体画分とした。菌体画分に対し、ペレットと等容の抽出バッファー(20mM tris-HCl pH7.5、45mM KCl、25mM グリセロール)を加えて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。この懸濁液に、等容のグリセロールを加えて15分間激しく攪拌した後、15000rpm、20分間遠心分離を行ない、上清を菌体内蛋白質抽出画分とし、沈殿を菌体表面残渣画分とした。
【００４９】
上記で得られた菌体内蛋白質抽出画分を粗酵素液とし、プロリダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示した。表中の数値は、蛋白質の発現誘導48時間後の培養液1 mlあたりのプロリダーゼ活性（mU/ml）を示す。「ベクター」はプラスミド pYES2.1-V5-his-TOPOの形質転換体、「5347」は、プラスミド pYES5347の形質転換体を夫々示す。また、(-)は、ガラクトースを含まない蛋白質非発現誘導培地、(+)は、ガラクトースを含む蛋白質発現誘導培地で培養したことを示す。
【００５０】
蛋白質発現誘導培地で培養したプラスミド pYES5347の形質転換体は、プラスミド pYES2.1-V5-his-TOPOの形質転換体と比較して約12倍のプロリダーゼ活性を示した。また、プラスミド pYES5347の形質転換体を、ガラクトースを含まない蛋白質非発現誘導培地で培養した時と比較しても約18倍のプロリダーゼ活性を示した。
以上のことより、本発明により得られた遺伝子がプロリダーゼ遺伝子であり、本遺伝子を使用することでプロリダーゼの大量製造が可能となることが明らかとなった。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法が提供された。
本発明により、上記プロリダーゼの蛋白質工学的な改良が行なえるようになった。また本発明は、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマーDNA
配列番号４：プライマーDNA
配列番号５：プライマーDNA
配列番号６：プライマーDNA
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリダーゼ(プロリンジペプチダーゼ、イミドジペプチダーゼ、EC3.4.13.9、以下、プロリダーゼという)は、C末端にプロリン又はヒドロキシプロリン残基を有するジペプチドを加水分解する酵素である。
【０００３】
これまでに哺乳類から古細菌に至るまで多くのプロリダーゼの酵素学的性質が決定され、また、遺伝子についても解析されてきた。例えば、哺乳類ではマウスの肝臓由来[非特許文献１参照]、ヒトの肝臓由来[非特許文献２]のものが知られており、バクテリアでは、大腸菌(E. coli)[ 非特許文献３]、ラクトバチルス・デルブルエキー（Lactobacillus delbrueckii）[非特許文献４]由来のものが知られている。また、古細菌では、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）[非特許文献５]由来のもの等が知られている。以上のプロリダーゼは、遺伝子についても報告されている。
また、酵素のみが知られていて、遺伝子についての報告がないものとしては、例えば、キサントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）（特許文献１）由来のもの等がある。
【０００４】
麹カビ(黄麹菌)であるアスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒等の日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。
これら黄麹菌を含むアスペルギルス属については、アスペルギルス・ニドランス由来のプロリダーゼのみ、遺伝子データベースであるGenbankに遺伝子配列情報の報告があるものの（ACCESSION；AJ296646）、精製酵素及び該遺伝子産物のプロリダーゼ活性についての報告はなされていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平9−249号公報
【非特許文献１】
Biochim. Biophys. Acta, 1308 (1), 15-16 (1996)
【非特許文献２】
J. Biol. Chem., 264 (8), 4476-4481 (1989)
【非特許文献３】
Nucleic Acids Res., 18 (21), 6439 (1990)
【非特許文献４】
Mol. Gen. Genet. 247, 494-500 (1995)
【非特許文献５】
J Bacteriol., 180(18):4781-9, (1998)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによってポリペプチドに分解され、更にポリペプチドからロイシンアミノペプチダーゼによりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、アミノ酸及びジペプチドを主体とした低分子ペプチドに分解される。
【０００７】
生産される麹菌の酸性カルボキシペプチダーゼは、基質がトリペプチドになると分解しにくくなり、ジペプチドとなると更に分解しにくくなる。特に、カルボキシル末端がプロリンのペプチドを分解しにくいため、これらのペプチドは醤油中に残存しやすい。
【０００８】
一方、ロイシンアミノペプチダーゼは、アミノ末端がグリシンのペプチドや酸性ペプチドを分解しにくいため、これらのペプチドが醤油中に残存しやすい。また、ロイシンアミノペプチダーゼは、ペプチド中にプロリンが存在する場合、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したXaa-Pro-ペプチドの状態で作用が停止する。醤油諸味中では、このXaa-Pro-ペプチドにプロリルジペプチジルペプチダーゼが特異的に作用しXaa-Proを遊離することにより、更にロイシンアミノペプチダーゼの作用が可能となり、アミノ酸の遊離生成が進行するものと考えられている。醤油中のジペプチドとして、中性ペプチドが13種類、酸性ペプチドが13種類の存在が報告され、その構造も推定されているが、上記の影響からGly-ProをはじめとするXaa-Proが多数認められている。
【０００９】
従って、これらXaa-Proのジペプチドを分解することにより、醤油及び酵素分解調味料のアミノ化率を向上させることが可能となる。更に、プロリン自体が呈味性を有するアミノ酸であるため、呈味の改変が可能となり、Glu-Pro、Asp-Pro等Xaaが旨味に関わるアミノ酸の場合にも、旨みの向上といった効果が期待できる。
【００１０】
また、醤油中に残存しているXaa-Proとしては、Ser-Pro、Thr-Pro、Ala-Pro、Gly-Proが同定されているが、これらのXaaは全て甘味や旨味を呈するアミノ酸であり、醤油の甘味や旨味の向上が期待できる。そのため、酵素の大量調製が比較的容易な微生物からプロリダーゼを得ることが待ち望まれており、麹菌のような安全性の高い微生物より単離されることは更に強く望まれている。
これ故、本発明は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するXaa-Proを分解することができる新規プロリダーゼ、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、黄麹菌より新規プロリダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
１．以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１３】
２．配列番号２で表されるアミノ酸配列全長と70%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１４】
３．以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質。
【００１５】
４．配列番号２で表されるアミノ酸配列全長と70%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードするプロリダーゼ遺伝子。
【００１６】
５．以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【００１７】
６．前記３．、４．又は５．に記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
７．前記６．記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
８．前記７．記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物よりプロリダーゼを採取することを特徴とするプロリダーゼの製造方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．本発明のプロリダーゼ
本発明のプロリダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたプロリダーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得ることができる。
【００１９】
本発明のプロリダーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。更に、プロリダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列の全長と7０%以上、望ましくは7５%以上、更に望ましくは8０%以上、最も望ましくは8５%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であってもよい。
【００２０】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００２１】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin及び Altschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTは、BLASTより感度良く配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２２】
配列間の配列相同性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova等によって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett., 174:247-250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは、以下の通りである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50,expect: 10, word size: 3, Filter: ON を用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for amismatch: -2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ON を用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００２３】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に、高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターとしてデフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行なう場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。
【００２４】
２．プロリダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼ等の黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。更に具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspergillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)が挙げられる。これらの菌体を、プロリダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地（2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分間オートクレーブしたもの）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathala等の方法（DNA, 2(4):329-335, 1983）で全RNAを調製する。
【００２５】
このようにして得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行なう。プライマーとしては、本発明のプロリダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよく、例えば、配列番号３及び配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えば、RNA LA-PCR Kit（宝酒造社製）を用いて常法により行なうことができる。得られた本発明のプロリダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のプロリダーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるプロリダーゼ遺伝子の例を夫々配列番号１及び配列番号２に例示する。
【００２６】
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、プロリダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしている遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２７】
本発明のプロリダーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼ等の黄麹菌が挙げられる。これらの生物から、常法によりRNA又はゲノムDNAを調製し、プラスミド又はファージに組み込み、ライブラリーを調製する。次いで、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸、充分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーであれば、コロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーであれば、プラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行ないうるものである。
【００２８】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02%(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、52℃以上、好ましくは57℃以上、更に好ましくは62℃以上、最も好ましくは67℃以上である。
【００２９】
また、配列番号１に記載の塩基配列と70%以上、望ましくは75%以上、更に望ましくは8０%以上、最も望ましくは8５%以上の配列相同性を示すような塩基配列は、本発明のプロリダーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
【００３０】
上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなDNAは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群又は公共データベースのなかから、例えば、前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００３１】
このようにして得られたDNAがプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してプロリダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００３２】
３．組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、本発明のプロリダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でプロリダーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。
【００３３】
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、プロリダーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００３４】
４．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組み換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のプロリダーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリシア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌が挙げられる。形質転換は、宿主により公知の方法で行なうことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)）等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)）を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる方法（Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)）等を用いることができる。
【００３５】
５．プロリダーゼの製造
本発明のプロリダーゼの製造法は、本発明の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からプロリダーゼ蛋白質を採取することからなるものである。培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のプロリダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロリダーゼを生産させることができる。
【００３６】
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のプロリダーゼを生産することができる。本発明のプロリダーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のプロリダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いて、細菌を破砕した後、Triton X-100, Tween-20, Nonidet P-40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離し、その上清から本発明のプロリダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のプロリダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のプロリダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロリダーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【００３７】
［プロリダーゼ活性測定法］
本発明のプロリダーゼの活性は、Leu-Proを基質とし、酵素作用によって遊離するアミノ酸のアミノ基を酸ニンヒドリン法を用いて測定できる。
基質溶液: L-Leu-Pro (シグマ社製)を終濃度20mMとなるように20 mM トリス緩衝液(pH7.5)に溶解させた溶液
反応停止液: 氷酢酸
ニンヒドリン試薬：3%(w/v)ニンヒドリン(ナカライテスク社製)、 60%(v/v)氷酢酸、40%(v/v)リン酸
酵素溶液10μlに20 mM トリス緩衝液(pH7.5) 390μlを加えて、37℃、5分間プレインキュベートした後、基質溶液を100μl加えて、37℃で15分間反応させ、500μlの反応停止液を加えて、酵素反応を停止させる。更に、ニンヒドリン試薬500μlを加えて、100℃で10分間煮沸後、冷却して515nmの吸光度を測定する。上記の条件下で1分間あたり1μモルのプロリンを生成する酵素量を1単位(U)とする。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。但し、本件発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
１．アスペルギルス・オリゼのプロリダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae )RIB40株(Aspergillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地（前述）に接種し、30℃で、30時間静置培養し培養物を得た。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Cathala等の方法［DNA, 2(4):329-335, 1983］で全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion社製）を用いてDNase I処理を行ない、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA1.0 ugを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を用いてRT-PCRを行なった。
逆転写反応のプライマーは、オリゴdTの3'側にアダプター配列の付いたキットに付属のものを用い、逆転写反応は、42℃で60分間行なった。
【００３９】
次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書に従い、RNaseH、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼ等を含んだカクテルを加え、16℃で90分間反応させた後、更に、T4DNAポリメラーゼを加え、16℃、50分間反応させ、２本鎖ｃDNAのライブラリーを合成した。
次いで、上記反応物にアダプターDNA、DNAリガーゼ等を加え、アダプターを結合させた二本鎖ｃDNAのライブラリーを合成した。夫々の反応液組成及び反応条件は、全て添付の説明書に従った。
【００４０】
次いで、上記で得られた二本鎖ｃDNAのライブラリーを鋳型として、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いて、PCRを行ない、5'側は、開始コドンの直前から、3'側は、終止コドン直後から増幅した。夫々のプライマーの5'側にはクローニングを容易にするために制限酵素サイトを付加させた(例えば、配列番号３にはKpnI、配列番号４にはBam HIを導入した)。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 Takara EX Taq DNA Polymerase（宝酒造社製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
【００４１】
PCR反応は、94℃、2分間の後、94℃、30秒間、55℃、30秒間、72℃、2分間を30サイクル行ない、72℃、5分間行なった。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.5kbのバンドが確認された。なお、サーマルサイクラーとしては、GeneAmp 5700 Sequence detection system（PE Applied Biosystems社製）を用い、温度コントロール法は、カリキュレートコントロールによった。
【００４２】
次いで、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F'株（Invitrogen社製）を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体よりQIAprep spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、サーモ・シークェネース・サイクル・シークエンシング・キット（Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit）（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてシークエンス反応を行ない、LI-COR MODEL4200Lシークエンサー（LI-COR社製）で塩基配列を決定した。
【００４３】
その結果、配列番号１に示す約1.5kbのオープンリーディングフレーム（ORF）のDNA配列が明らかとなった。このプラスミドpPEPP5347は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-7826として寄託されている。また、pPEPP5347に含まれるクローンの開始コドンから終止コドン直前までの塩基配列を配列番号１に記載した。上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、500アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載した。
【００４４】
更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastp（ HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列相同性を示したものは、アスペルギルス・ニドランスのプロリダーゼ（GenBank:AJ296646）であり、35%の配列相同性を示した。
【００４５】
また、配列番号１の塩基配列について配列相同性の高い配列を検索した。検索に、NCBI blastn（HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い配列相同性を示したものは、上記アスペルギルス・ニドランスのプロリダーゼをコードする遺伝子（GenBank: AJ296646）であった。コード領域全長の配列相同性を解析ソフトGENETYX-WIN Ver.5.0で調べたところ、1416塩基にわたり、44%の配列相同性であった。
【００４６】
2.プロリダーゼcDNAの発現
上記のプラスミド pPEPP5347を鋳型とし、開始コドンを含む配列番号5及び終始コドンを含む配列番号6のプライマーを用いて、全長プロリダーゼcDNAをPCR増幅した。
次いで、このPCR産物を酵母発現ベクターpYES2.1-V5-his-TOPO(Invitorogen社製)にTAクローニングし、プラスミド pYES5347を作製した。上記のプラスミドは、ガラクトースにより目的蛋白質(プロリダーゼ)の誘導発現が可能である。宿主は、INVSc1 (Genotype:MATa、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52/ MATα、his3Δ1、leu2、trp1-289、ura3-52)を使用し、酢酸リチウム法により、上記のプラスミド pYES5347により宿主酵母を形質転換した。選択培地には、［0.67% アミノ酸を含まないYeast Nitrogenbase (Difco社製)、2% ラフィノース (和光純薬工業社製)、ウラシルを含まないYeast Synthetic Dropout Medium Supplement (SIGMA社製)］を使用した。酢酸リチウム法は、「蛋白質実験プロトコール-機能解析編-」(P63-P88細胞工学別冊：秀潤社)の記載に従った。
【００４７】
次いで、得られた形質転換体を用いて、pYES2.1-V5-his-TOPOベクターに添付のプロトコールに従い、蛋白質の発現を行なった。200 ml用バッフル付三角フラスコを用いて選択培地20 mlに形質転換体をコロニーより植菌し、30 ℃、140 rpmで約14時間、旋回培養して、これを種培養とした。次いで、種培養の濁度(OD600)を測定し、初期濁度がOD600 = 0.4となるように蛋白質発現誘導培地へ種培養を接種した。蛋白質発現誘導培地による培養は500 ml用坂口フラスコを使用し、培地50 mlで30 ℃、140rpmで振とう培養した。蛋白質発現誘導培地は、選択培地の炭素源を1% ラフィノース、2% ガラクトース(和光純薬工業社製)としたものを使用した。
【００４８】
誘導を開始してから48時間後の培養液を3000rpmで10分間遠心分離し、上清を菌体外分泌蛋白質画分、沈殿を菌体画分とした。菌体画分に対し、ペレットと等容の抽出バッファー(20mM tris-HCl pH7.5、45mM KCl、25mM グリセロール)を加えて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。この懸濁液に、等容のグリセロールを加えて15分間激しく攪拌した後、15000rpm、20分間遠心分離を行ない、上清を菌体内蛋白質抽出画分とし、沈殿を菌体表面残渣画分とした。
【００４９】
上記で得られた菌体内蛋白質抽出画分を粗酵素液とし、プロリダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示した。表中の数値は、蛋白質の発現誘導48時間後の培養液1 mlあたりのプロリダーゼ活性（mU/ml）を示す。「ベクター」はプラスミド pYES2.1-V5-his-TOPOの形質転換体、「5347」は、プラスミド pYES5347の形質転換体を夫々示す。また、(-)は、ガラクトースを含まない蛋白質非発現誘導培地、(+)は、ガラクトースを含む蛋白質発現誘導培地で培養したことを示す。
【００５０】
蛋白質発現誘導培地で培養したプラスミド pYES5347の形質転換体は、プラスミド pYES2.1-V5-his-TOPOの形質転換体と比較して約12倍のプロリダーゼ活性を示した。また、プラスミド pYES5347の形質転換体を、ガラクトースを含まない蛋白質非発現誘導培地で培養した時と比較しても約18倍のプロリダーゼ活性を示した。
以上のことより、本発明により得られた遺伝子がプロリダーゼ遺伝子であり、本遺伝子を使用することでプロリダーゼの大量製造が可能となることが明らかとなった。
【００５１】
【表１】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質、プロリダーゼ遺伝子、組み換え体DNA及びプロリダーゼの製造法が提供された。
本発明により、上記プロリダーゼの蛋白質工学的な改良が行なえるようになった。また本発明は、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【００５３】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマーDNA
配列番号４：プライマーDNA
配列番号５：プライマーDNA
配列番号６：プライマーDNA
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質 - 以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA - 請求項２又は３に記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
- 請求項４記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
- 請求項５記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物よりプロリダーゼを採取することを特徴とするプロリダーゼの製造方法。
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