JP2004008106A - プロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アスペルギルス・オリゼー由来の特定のアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは該タンパク質の1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。該蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
【効果】本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。
【選択図】 なし
【効果】本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
プロリンイミノペプチダーゼ(プロリルアミノペプチダーゼ、EC3.4.11.53、本明細書ではプロリンイミノペプチダーゼという)は、N末端にプロリン残基を有するペプチドを加水分解してプロリンを遊離させる酵素である。
これまでに多くのプロリンイミノペプチダーゼの酵素学的性質が決定され、解析されてきた。例えば、バクテリアでは、E. coli〔J. Biol. Chem. 234, 1740−1744(1959)〕、Bacillus coagulans〔J. Bacteriol. 174, 7919−7925(1992)〕,Neisseria gonorrhoeae〔Mol.Microbiol. 9, 1203−1211(1993)〕, Lactobacillusdelbrueckii〔Microbiology 140, 524−535 (1994)〕, Aeromonas sobria〔J.Biochem. 116,818−825(1994)〕由来のもの等が知られている。またBacillus coagulans, Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus delbrueckii , Aeromonas sobriaについては、遺伝子配列についても報告されている。
【0003】
麹カビ(黄麹菌)であるアスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒等の日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。これら黄麹菌を含むアスペルギルス属については、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・ニドランス由来のプロリンイミノペプチダーゼのみが遺伝子データベースであるGenbankに遺伝子配列情報の報告がある(ACCESSION;AJ315565, AJ315566)。またアスペルギルス・ニガーについては蛋白質の配列の報告(ACCESSION;CAC40647)もあるが、精製酵素及び該遺伝子産物のプロリンイミノペプチダーゼ活性についての報告はなされていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによって先ずポリペプチドに分解される。更にロイシンアミノペプチダーゼ(以下、LAPと略称する。)によりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、アミノ酸及びジペプチドを主体とした低分子ペプチドに分解される。しかしながらLAPは、ペプチド中にプロリンが存在する場合、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したXaa−Pro−peptideの状態で作用が停止する。そのため醤油諸味中でXaa−Pro−peptideからのXaa及びそれに続くプロリンの遊離を行う酵素が強く望まれている。
【0005】
アミノペプチダーゼPは、LAPが作用しないXaa−Pro−peptideからN末端のXaaを遊離させる。ここにプロリンイミノペプチダーゼが作用することによりN末端のプロリンが遊離され、再びLAPの基質となりうる。プロリンは、呈味性を有するアミノ酸であるため、呈味の改変が可能となる。N末にプロリンを有するペプチドは、苦味と関連があることが判っているので、プロリンイミノペプチダーゼの作用によってプロリンが遊離することにより、苦味の低減効果が期待できる。従って、麹菌からプロリンイミノペプチダーゼが見い出され、その作用を強化することができれば醤油及び酵素分解調味料の製造においてアミノ化率の向上と呈味性の改善が期待できる。そのため、酵素の大量調製が比較的容易な微生物からプロリンイミノペプチダーゼを得ることが待ち望まれており、麹菌のような安全性の高い微生物より単離されることは更に強く望まれている。
これ故、本発明は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するPro−peptideを分解することができる新規プロリンイミノペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組み換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたプロリンイミノペプチダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、黄麹菌より新規プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
1.以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
2.配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。
3.以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
4.請求項2に記載の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
5.以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列鎖からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
6.配列番号1で表される塩基配列と75%以上の配列相同性を示し、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
7.請求項3、4、5又は6に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
8.請求項7記載の組み換えベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
9.請求項8記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダーゼの製造法。
である。
【0007】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明のプロリンイミノペプチダーゼ
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当な宿主−ベクター系で発現させることにより得ることができる。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、該酵素活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。更に、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列全長と80%以上、望ましくは85%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であってもよい。
2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。2つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位(全アミノ酸又は全塩基)数に対する百分率で示される。
【0008】
上記の原理に従い、2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin及び Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264−2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873−5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403−410, 1990)。更に、Gapped BLASTは、BLASTより感度良く配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389−3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列相同性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova等によって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett.,174:247−250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは、以下の通りである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 3, Filter: ONを用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for a mismatch: −2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap:2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ONを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【0009】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444−2448, 1988)を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにnr−ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、2つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。
【0010】
2.プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。更に具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspegillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)が挙げられる。これらの菌体を、プロリンイミノペプチダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地(2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分オートクレーブしたもの)を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量(例えば1g)を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathala等の方法〔DNA, 2(4):329−335, 1983〕で全RNAを調製する。
このようにして得られた全RNAを鋳型として、RT−PCRを行う。プライマーとしては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであれば如何なる組み合わせのものを用いてもよく、例えば、配列番号3及び配列番号4の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT−PCRは、市販のキット、例えば、RNA LA−PCR Kit(宝酒造製)を用いて常法により行うことができる。得られた本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の例を夫々配列番号1及び配列番号2に例示する。
【0011】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【0012】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、以下のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等黄麹菌が挙げられる。これらの生物から、常法によりRNA又はゲノムDNAを調製し、プラスミド又はバクテリオファージに組み込み、ライブラリーを調製する。次いで、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、充分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号1に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【0013】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬(ベーリンガ・マンハイム社製)、0.1 %(W/V) N−ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩(8−16時間程度)で行い、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、57℃以上、好ましくは62℃以上、最も好ましくは67℃以上である。
また、配列番号1に記載の塩基配列全長と75%以上、望ましくは80%以上、最も望ましくは85%以上の配列相同性を示すような塩基配列は、本発明のプロリンイミノペプチダーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
上記のような塩基配列の配列相同性あるいはコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなDNAは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群あるいは公共データベースのなかから、例えば、前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
このようにして得られたDNAがプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してプロリンイミノペプチダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【0014】
3.組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換あるいは形質導入する宿主中でプロリンイミノペプチダーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換あるいは形質導入された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシン若しくはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列(例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等)を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を6コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【0015】
4.形質転換体又は形質導入体の取得
本発明の形質転換体又は形質導入体は、宿主を、本発明の組み換えベクターで形質転換又は形質導入することにより得られる。宿主としては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリシア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255−269(1995)の方法等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99−104(1989)の方法を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182−187(1990)の方法等を用いることができる。
また形質導入は、例えば、エシェリシア・コリの場合、ビー・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第299−309頁(1979年)〕によって行なうことができる。
【0016】
5.プロリンイミノペプチダーゼの製造
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの製造法は、本発明の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類及び組え換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選択すればよい。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。
【0017】
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。本発明のプロリンイミノペプチダーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもでき、破砕した後、Triton X−100, Tween−20, Nonidet P−40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清に本発明のプロリンイミノペプチダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のプロリンイミノペプチダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【0018】
[プロリンイミノペプチダーゼ活性測定法]
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの活性は、proline−p−nitroanilideを基質とし、酵素作用によって遊離するp−nitroanilineを用いて測定できる。
基質溶液: Pro−p−nitroanilid (シグマ)を終濃度20mMとなるように20 mM トリス緩衝液(pH7.5)に溶解させた溶液
反応停止液:氷酢酸
酵素溶液10μlに20 mMトリス緩衝液(pH7.5) 390μlを加えて、37℃、5分間プレインキュベートした後、基質溶液を100μl加えて、37℃で10分間反応させ、500μlの反応停止液を加えて、酵素反応を停止させた後、405nmの吸光度を測定する。上記の条件下で1分間あたり1μモルのp−nitroanilineを生成する酵素量を1単位(U)とする。
【0019】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例
アスペルギルス・オリゼーのプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspegillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地(前述)に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Cathala等の方法〔DNA, 2(4):329−335, 1983〕で全RNAを抽出した。更に、DNA−freeキット(Amibion製)を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA1.0 ugを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit(Clontech社製)を用いてRT−PCRを行った。
【0020】
逆転写反応のプライマーは、オリゴdTの3’側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、逆転写反応は、42℃で60分行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書に従い、RNaseH、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼ等を含んだカクテルを加え、16℃で90分反応させた後、更にT4DNAポリメラーゼを加え、16℃で50分反応させ、2本鎖cDNAのライブラリーを合成した。次いで、上記反応物にアダプターDNA、DNAリガーゼ等を加え、アダプターを結合させた二本鎖cDNAのライブラリーを合成した。夫々反応液組成及び反応条件は、全て添付の説明書に従った。
次いで、上記で得られた二本鎖cDNAのライブラリーを鋳型として、配列番号3及び配列番号4のプライマーを用いて、PCRを行い、5’側は、開始コドンの直前から、3’側は終止コドン直後から増幅した。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 Takara EX Taq DNA Polymerase(宝酒造社製)を用い、反応液の組成は、ポリメラーゼに添付の説明書に従った。
PCR反応は、94℃、2分の後、94℃、30秒、55℃、30秒、72℃、2分を30サイクル行い、72℃、5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.5kbのバンドが確認された。なお、サーマルサイクラーとしては、GeneAmp 5700 Sequence detection system(PE Applied Biosystems社製)を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった。
【0021】
次いで、TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen社製)を用いて、上記増幅産物をpCR2.1TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F’株(Invitrogen社製)を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体よりQIAprep spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いてシークエンス反応を行い、LI−COR MODEL4200Lシークエンサー(LI−COR社製)で塩基配列を決定した。その結果、配列番号1に示す約1.3kbのオープンリーディングフレーム(ORF)のDNA配列が明らかとなった。このプラスミドpAOPIP1は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP−8065として寄託されている。
プラスミドpAOPIP1に含まれるクローンの開始コドンから終始コドンの直前までの塩基配列を配列番号1に記載する。上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、447アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列を、配列番号2に記載する。更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBIblastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、アスペルギルス・ニガーのプロリンイミノペプチダーゼ(GenBank:AJ315565)であり、77.8%の配列相同性を示した。
【0022】
また、配列番号1の塩基配列について配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、上記アスペルギルス・ニドランスのプロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子(GenBank: AJ296646)であった。コード領域全長の配列相同性を解析ソフトGENETYX−Mac Ver.10.1で調べたところ、1341塩基にわたり、71.3%の配列相同性であった。
【0023】
【発明の効果】
本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。
本発明により、上記プロリンイミノペプチダーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。また本発明は、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【0024】
【配列表】
【0025】
【0026】
【0027】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
プロリンイミノペプチダーゼ(プロリルアミノペプチダーゼ、EC3.4.11.53、本明細書ではプロリンイミノペプチダーゼという)は、N末端にプロリン残基を有するペプチドを加水分解してプロリンを遊離させる酵素である。
これまでに多くのプロリンイミノペプチダーゼの酵素学的性質が決定され、解析されてきた。例えば、バクテリアでは、E. coli〔J. Biol. Chem. 234, 1740−1744(1959)〕、Bacillus coagulans〔J. Bacteriol. 174, 7919−7925(1992)〕,Neisseria gonorrhoeae〔Mol.Microbiol. 9, 1203−1211(1993)〕, Lactobacillusdelbrueckii〔Microbiology 140, 524−535 (1994)〕, Aeromonas sobria〔J.Biochem. 116,818−825(1994)〕由来のもの等が知られている。またBacillus coagulans, Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus delbrueckii , Aeromonas sobriaについては、遺伝子配列についても報告されている。
【0003】
麹カビ(黄麹菌)であるアスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒等の日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。これら黄麹菌を含むアスペルギルス属については、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・ニドランス由来のプロリンイミノペプチダーゼのみが遺伝子データベースであるGenbankに遺伝子配列情報の報告がある(ACCESSION;AJ315565, AJ315566)。またアスペルギルス・ニガーについては蛋白質の配列の報告(ACCESSION;CAC40647)もあるが、精製酵素及び該遺伝子産物のプロリンイミノペプチダーゼ活性についての報告はなされていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによって先ずポリペプチドに分解される。更にロイシンアミノペプチダーゼ(以下、LAPと略称する。)によりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、アミノ酸及びジペプチドを主体とした低分子ペプチドに分解される。しかしながらLAPは、ペプチド中にプロリンが存在する場合、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したXaa−Pro−peptideの状態で作用が停止する。そのため醤油諸味中でXaa−Pro−peptideからのXaa及びそれに続くプロリンの遊離を行う酵素が強く望まれている。
【0005】
アミノペプチダーゼPは、LAPが作用しないXaa−Pro−peptideからN末端のXaaを遊離させる。ここにプロリンイミノペプチダーゼが作用することによりN末端のプロリンが遊離され、再びLAPの基質となりうる。プロリンは、呈味性を有するアミノ酸であるため、呈味の改変が可能となる。N末にプロリンを有するペプチドは、苦味と関連があることが判っているので、プロリンイミノペプチダーゼの作用によってプロリンが遊離することにより、苦味の低減効果が期待できる。従って、麹菌からプロリンイミノペプチダーゼが見い出され、その作用を強化することができれば醤油及び酵素分解調味料の製造においてアミノ化率の向上と呈味性の改善が期待できる。そのため、酵素の大量調製が比較的容易な微生物からプロリンイミノペプチダーゼを得ることが待ち望まれており、麹菌のような安全性の高い微生物より単離されることは更に強く望まれている。
これ故、本発明は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するPro−peptideを分解することができる新規プロリンイミノペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組み換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたプロリンイミノペプチダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、黄麹菌より新規プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
1.以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
2.配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。
3.以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
4.請求項2に記載の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
5.以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列鎖からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
6.配列番号1で表される塩基配列と75%以上の配列相同性を示し、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
7.請求項3、4、5又は6に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
8.請求項7記載の組み換えベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
9.請求項8記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダーゼの製造法。
である。
【0007】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明のプロリンイミノペプチダーゼ
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当な宿主−ベクター系で発現させることにより得ることができる。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、該酵素活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。更に、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列全長と80%以上、望ましくは85%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であってもよい。
2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。2つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位(全アミノ酸又は全塩基)数に対する百分率で示される。
【0008】
上記の原理に従い、2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin及び Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264−2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873−5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403−410, 1990)。更に、Gapped BLASTは、BLASTより感度良く配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389−3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列相同性として、本明細書では、Tatiana A. Tatusova等によって開発されたBLAST 2 Sequencesソフトウェア(FEMS Microbiol Lett.,174:247−250,1999)を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは、以下の通りである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Open gap: 11 and extension gap:1 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 3, Filter: ONを用いる。塩基配列の場合、blastnプログラムを用いパラメーターとしては、Reward for a match: 1, Penalty for a mismatch: −2, Strand option: Both strands, Open gap: 5 and extension gap:2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11, Filter: ONを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【0009】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア(W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444−2448, 1988)を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにnr−ntを用い、ktup値は6を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、2つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。
【0010】
2.プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。更に具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspegillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)が挙げられる。これらの菌体を、プロリンイミノペプチダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地(2.78gの小麦ふすまに2.22gの脱イオン水を加え、121℃・50分オートクレーブしたもの)を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、30時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量(例えば1g)を移し、乳棒を用いて粉砕し、Cathala等の方法〔DNA, 2(4):329−335, 1983〕で全RNAを調製する。
このようにして得られた全RNAを鋳型として、RT−PCRを行う。プライマーとしては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであれば如何なる組み合わせのものを用いてもよく、例えば、配列番号3及び配列番号4の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT−PCRは、市販のキット、例えば、RNA LA−PCR Kit(宝酒造製)を用いて常法により行うことができる。得られた本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA及びそれによりコードされるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の例を夫々配列番号1及び配列番号2に例示する。
【0011】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【0012】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、以下のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等黄麹菌が挙げられる。これらの生物から、常法によりRNA又はゲノムDNAを調製し、プラスミド又はバクテリオファージに組み込み、ライブラリーを調製する。次いで、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、充分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号1に記載の配列の少なくとも100塩基以上、望ましくは200塩基以上、最も望ましくは450塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【0013】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬(ベーリンガ・マンハイム社製)、0.1 %(W/V) N−ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩(8−16時間程度)で行い、洗いは、0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、57℃以上、好ましくは62℃以上、最も好ましくは67℃以上である。
また、配列番号1に記載の塩基配列全長と75%以上、望ましくは80%以上、最も望ましくは85%以上の配列相同性を示すような塩基配列は、本発明のプロリンイミノペプチダーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
上記のような塩基配列の配列相同性あるいはコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなDNAは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群あるいは公共データベースのなかから、例えば、前述のBLASTソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
このようにして得られたDNAがプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してプロリンイミノペプチダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【0014】
3.組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換あるいは形質導入する宿主中でプロリンイミノペプチダーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換あるいは形質導入された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシン若しくはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列(例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等)を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を6コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【0015】
4.形質転換体又は形質導入体の取得
本発明の形質転換体又は形質導入体は、宿主を、本発明の組み換えベクターで形質転換又は形質導入することにより得られる。宿主としては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリシア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255−269(1995)の方法等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99−104(1989)の方法を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182−187(1990)の方法等を用いることができる。
また形質導入は、例えば、エシェリシア・コリの場合、ビー・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第299−309頁(1979年)〕によって行なうことができる。
【0016】
5.プロリンイミノペプチダーゼの製造
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの製造法は、本発明の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類及び組え換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選択すればよい。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。
【0017】
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。本発明のプロリンイミノペプチダーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもでき、破砕した後、Triton X−100, Tween−20, Nonidet P−40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清に本発明のプロリンイミノペプチダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のプロリンイミノペプチダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【0018】
[プロリンイミノペプチダーゼ活性測定法]
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの活性は、proline−p−nitroanilideを基質とし、酵素作用によって遊離するp−nitroanilineを用いて測定できる。
基質溶液: Pro−p−nitroanilid (シグマ)を終濃度20mMとなるように20 mM トリス緩衝液(pH7.5)に溶解させた溶液
反応停止液:氷酢酸
酵素溶液10μlに20 mMトリス緩衝液(pH7.5) 390μlを加えて、37℃、5分間プレインキュベートした後、基質溶液を100μl加えて、37℃で10分間反応させ、500μlの反応停止液を加えて、酵素反応を停止させた後、405nmの吸光度を測定する。上記の条件下で1分間あたり1μモルのp−nitroanilineを生成する酵素量を1単位(U)とする。
【0019】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例
アスペルギルス・オリゼーのプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼーRIB40株(Aspegillus oryzae var. viridis Murakami,anamorph;ATCC42149)の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った5gのふすま培地(前述)に接種し、30℃で、30時間静置培養した。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Cathala等の方法〔DNA, 2(4):329−335, 1983〕で全RNAを抽出した。更に、DNA−freeキット(Amibion製)を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA1.0 ugを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit(Clontech社製)を用いてRT−PCRを行った。
【0020】
逆転写反応のプライマーは、オリゴdTの3’側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、逆転写反応は、42℃で60分行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書に従い、RNaseH、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼ等を含んだカクテルを加え、16℃で90分反応させた後、更にT4DNAポリメラーゼを加え、16℃で50分反応させ、2本鎖cDNAのライブラリーを合成した。次いで、上記反応物にアダプターDNA、DNAリガーゼ等を加え、アダプターを結合させた二本鎖cDNAのライブラリーを合成した。夫々反応液組成及び反応条件は、全て添付の説明書に従った。
次いで、上記で得られた二本鎖cDNAのライブラリーを鋳型として、配列番号3及び配列番号4のプライマーを用いて、PCRを行い、5’側は、開始コドンの直前から、3’側は終止コドン直後から増幅した。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 Takara EX Taq DNA Polymerase(宝酒造社製)を用い、反応液の組成は、ポリメラーゼに添付の説明書に従った。
PCR反応は、94℃、2分の後、94℃、30秒、55℃、30秒、72℃、2分を30サイクル行い、72℃、5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.5kbのバンドが確認された。なお、サーマルサイクラーとしては、GeneAmp 5700 Sequence detection system(PE Applied Biosystems社製)を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった。
【0021】
次いで、TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen社製)を用いて、上記増幅産物をpCR2.1TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10F’株(Invitrogen社製)を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体よりQIAprep spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いてシークエンス反応を行い、LI−COR MODEL4200Lシークエンサー(LI−COR社製)で塩基配列を決定した。その結果、配列番号1に示す約1.3kbのオープンリーディングフレーム(ORF)のDNA配列が明らかとなった。このプラスミドpAOPIP1は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP−8065として寄託されている。
プラスミドpAOPIP1に含まれるクローンの開始コドンから終始コドンの直前までの塩基配列を配列番号1に記載する。上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、447アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列を、配列番号2に記載する。更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBIblastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、アスペルギルス・ニガーのプロリンイミノペプチダーゼ(GenBank:AJ315565)であり、77.8%の配列相同性を示した。
【0022】
また、配列番号1の塩基配列について配列相同性の高い配列を検索した。検索には、NCBI blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、上記アスペルギルス・ニドランスのプロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子(GenBank: AJ296646)であった。コード領域全長の配列相同性を解析ソフトGENETYX−Mac Ver.10.1で調べたところ、1341塩基にわたり、71.3%の配列相同性であった。
【0023】
【発明の効果】
本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。
本発明により、上記プロリンイミノペプチダーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。また本発明は、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【0024】
【配列表】
【0025】
【0026】
【0027】
Claims (9)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質 - 配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質 - 請求項2に記載の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
- 以下の(a)又は(b)のDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列鎖からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA - 配列番号1で表される塩基配列と75%以上の配列相同性を示し、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
- 請求項3、4、5又は6に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
- 請求項7記載の組み換えベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
- 請求項8記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダーゼの製造法。
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