JP2990280B1 - アミノペプチダ―ゼ及びその前駆体の遺伝子、該遺伝子を含むベクタ―並びに形質転換体 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 ペプチド性の苦味除去・低減作用を有し、ペ
プチドやアミノ酸を主成分とする調味液の製造等、食品
産業上有用なアミノペプチダーゼの遺伝的情報および大
量発現システムを提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
するアミノペプチダーゼ前駆体の遺伝子、プラスミドお
よび形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１７８）、な
らびに、配列表の配列番号４記載の塩基配列を有するア
ミノペプチダーゼの遺伝子、プラスミドおよび形質転換
大腸菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノペプチダー
ゼ及びその前駆体の遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド
ベクター並びに形質転換体に関する。アミノペプチダー
ゼは、タンパク質やペプチドのＮ末端側に作用し、アミ
ノ酸単位で加水分解する酵素であり、ペプチドやアミノ
酸を主成分とする調味液の製造等に活用されている。ま
た、一部のものは、ペプチド性の苦味を除去・低減する
作用を有している。この発明は、アミノペプチダーゼ及
びその前駆体の遺伝子に関するものであり、本酵素を活
用することにより、苦味を低減ないし消滅することがで
きるので、食品分野における活用が期待される。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
調味液やカルシウム吸収促進作用を持つカゼイン分解物
など、タンパク質の加水分解物を含む素材が開発され、
各種食品分野で利用されている。しかし、これらのタン
パク質分解物を含有する素材は、苦味を呈するものも多
い。そのため、商品化に困難をきたす原因となることも
ある。これには、タンパク質が酵素等によって分解され
た際に生じる疎水性アミノ酸に富む苦味ペプチドが関与
していることが多い。

【０００３】この苦味ペプチドをタンパク質分解酵素で
分解すれば、苦味は低減あるいは消滅させることができ
る。しかしながら、タンパク質を分解する酵素のうち、
Ｎ末端からアミノ酸を分解するアミノペプチダーゼに関
しては、市販されているものが少なく、実用化も限られ
ている。また、フラボバクテリウム属微生物に由来する
アミノペプチダーゼの遺伝子を単離したという報告もな
されていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アミノペ
プチダーゼを食品加工の分野等に活用するために、フラ
ボバクテリウム属微生物からのアミノペプチダーゼ遺伝
子のクローニングを計画し、本遺伝子のクローニングと
大量生産に成功し、本発明を完成させた。

【０００５】すなわち、請求項１記載の本発明は、配列
表の配列番号１記載の塩基配列を有するアミノペプチダ
ーゼ前駆体の遺伝子である。請求項２記載の本発明は、
請求項１記載のアミノペプチダーゼ前駆体遺伝子を含む
プラスミドである。請求項３記載の本発明は、請求項２
記載のプラスミドで形質転換された大腸菌（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７１７８）である。

【０００６】請求項４記載の本発明は、配列表の配列番
号２記載の塩基配列を有するアミノペプチダーゼの遺伝
子である。請求項５記載の本発明は、請求項４記載のア
ミノペプチダーゼ遺伝子を含むプラスミドである。請求
項６記載の本発明は、請求項５記載のプラスミドで形質
転換された大腸菌である。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下において本発明を詳しく説明
する。本発明者らは、以下のようにして本発明のアミノ
ペプチダーゼ遺伝子を解明することに成功した。

【０００８】（１）アミノペプチダーゼ遺伝子の部分塩
基配列の決定 本発明者らは、高いアミノペプチダーゼ活性を有するフ
ラボバクテリウム属の細菌の１種、フラボバクテリウム
・ブレブ（Flabovacterium breve）Ｔ−３８２株を用い
て以下の操作を行った。なお、本発明に使用できる微生
物は、フラボバクテリウム属に属するものであればよ
く、上記のＴ−３８２株に限定されない。

【０００９】フラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株
を常法により栄養培地で培養したのち、培養物から菌体
を除去して得られた培養上清から、高度に精製したアミ
ノペプチダーゼを得た。精製手段は、イオン交換クロマ
トグラフィーなどの既知の方法を適用することができ
る。ついで、常法により、この精製酵素のＮ末端のアミ
ノ酸配列を決定し（配列表の配列番号３に記載）、該配
列をもとにフォーワードプライマー（配列表の配列番号
４に記載）及びリバースプライマー（配列表の配列番号
５に記載）を作成した。

【００１０】これらのプライマー（配列表の配列番号４
および５参照）と、フラボバクテリウム・ブレブＴ−３
８２株から斉藤の方法（蛋白質核酸酵素，第１１巻、４
４６頁）により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ
ＣＲ反応により増幅させた。その結果、８００ｂｐの明
瞭なバンドが得られた。該バンドのＤＮＡ塩基配列を解
読し、その塩基配列の情報をつなぎ合わせて、プライマ
ー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号
６に記載）が得られた。この７１５ｂｐのＤＮＡ塩基配
列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたＮ末端の
アミノ酸配列（配列表の配列番号３に記載）の２１番目
からの配列が認められることから、アミノペプチダーゼ
遺伝子の一部であることが判明した。

【００１１】（２）５’及び３’側未知領域の塩基配列
の決定 上記（１）において得られた塩基配列は、アミノペプチ
ダーゼ遺伝子の一部であることから、未解明の部分につ
いても塩基配列の特定を試みた。この実験を行うにあた
り、本発明者らは、Genomics、 25 号、674 頁、1995年
に記載されたサーマル・アシンメトリック・インターレ
ースドＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）を利用した。

【００１２】ＴＡＩＬ−ＰＣＲとは、既知の配列に特異
的なプライマーと非特異的プライマーとを組合せて使用
することにより、既知の配列に隣接する未知ＤＮＡ配列
を特異的に増幅する方法である。すなわち、鋳型ＤＮＡ
へのアニーリング温度が異なる２種類のオリゴヌクレオ
チドである特異的プライマー及び非特異的プライマーを
用意し、ＰＣＲのアニーリング温度を変化的に制御する
ことにより、非特異的産物の増幅を抑制し、目的配列を
優先的に増幅するものである。前記（１）で得られた７
１５ｂｐのＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号６に記
載）の情報をもとに、３つのフォーワードプライマー
（配列表の配列番号７〜９に記載）、３つのリバースプ
ライマー（配列表の配列番号１０〜１２に記載）を化学
合成した。また、未知領域に非特異的に結合する混合プ
ライマー（配列表の配列番号１３に記載）を化学合成し
た。

【００１３】まず、３つのフォーワードプライマーのそ
れぞれ（配列表の配列番号７〜９に記載）と混合プライ
マー（配列表の配列番号１３に記載）との組み合わせを
用い、先に抽出したフラボバクテリウム・ブレブＴ−３
８２株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＴＡＩＬ−ＰＣＲを
行った。増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を解読
し、解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせたところ、
プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列が得られ
た。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳した。その結
果、前記（１）で得られた７１５ｂｐのＤＮＡ塩基配列
（配列表の配列番号６に記載）の一部（１３９番目から
２３８番目のアミノ酸）が認められた。このことから、
得られたＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１４に記
載）は、アミノペプチダーゼ遺伝子の３’下流部分であ
ることが判明した。

【００１４】また、同様に、３つのリバースプライマー
のそれぞれ（配列表の配列番号１０〜１２に記載）と混
合プライマー（配列表の配列番号１３に記載）との組合
せを用いて、先に抽出したフラボバクテリウム・ブレブ
Ｔ−３８２株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＴＡＩＬ−Ｐ
ＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を
解読し、得られた塩基配列の情報をつなぎ合わせたとこ
ろ、プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列
表の配列番号１５に記載）が得られた。このＤＮＡ塩基
配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた、７１
５ｂｐのＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号６に記載）
の一部（１番目から６６番目のアミノ酸）が認められる
ことから、アミノペプチダーゼ前駆体遺伝子の５’上流
部分であることが判明した。

【００１５】なお、本発明者らは、上記配列の解明に際
してＴＡＩＬ−ＰＣＲを用いたが、他の方法によること
もできる。例えば、フラボバクテリウム・ブレブＴ−３
８２株のゲノムライブラリーから標識したプローブを用
いてスクリーニングする方法が挙げられる。すなわち、
フラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株のゲノムＤＮ
Ａを適当な制限酵素で断片化した後、λファージベクタ
ーに組み込み、ゲノムライブラリーを作成する。続い
て、このゲノムライブラリーの中から、天然酵素のアミ
ノ酸配列を基に化学合成したオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズするクローンをスクリーニングすることによ
って、上記配列を得ることができる。

【００１６】（３）請求項１記載の本発明のアミノペプ
チダーゼ前駆体遺伝子の全塩基配列の決定 上記（１）及び（２）で得られたＤＮＡ塩基配列の情報
から、最終的に、アミノペプチダーゼ前駆体の遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列を決定した（配列表の配列番号１に記
載）。すなわち、これが請求項１記載の本発明のアミノ
ペプチダーゼ前駆体の遺伝子である。請求項１記載の本
発明のアミノペプチダーゼ前駆体の遺伝子は、全長２５
２１ｂｐからなり、４９７個のアミノ酸をコードする。

【００１７】この配列、とりわけ構造遺伝子部分の塩基
配列が正しいことを確認するため、以下の操作を行っ
た。まず、上記（２）で得られた３’下流および５’上
流のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１４と１５に記
載）の情報を基に化学合成したフォーワードプライマー
（配列表の配列番号１６に記載）とリバースプライマー
（配列表の配列番号１７に記載）とを用いて、先に抽出
したフラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株のゲノム
ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し
た。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解読し、アミノペ
プチダーゼ前駆体遺伝子（配列表の配列番号１に記載）
の１９０〜２２８２番目が正しいことを再確認した。

【００１８】請求項１記載の本発明のアミノペプチダー
ゼ前駆体の遺伝子のうち、活性型酵素をコードする遺伝
子の部分を特定するために、まず、前記（１）で解明し
た活性型酵素のＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番
号３参照）との比較を行った。その結果、請求項１記載
の本発明のアミノ酸配列（配列表の配列番号１参照）の
うち、１０３９番目以降の部分に活性型アミノペプチダ
ーゼの遺伝子を有することが明らかとなった。

【００１９】続いて、活性型アミノペプチダーゼの遺伝
子のＣ末端側を特定した。その際、Ｃ末端側はホモロジ
ー検索の結果から推定される部位とした。得られた塩基
配列は、配列表の配列番号２に示す通りであり、全長９
１２ｂｐからなり、３０４個のアミノ酸をコードする。
すなわち、これが請求項４記載の本発明のアミノペプチ
ダーゼ遺伝子である。

【００２０】請求項４記載の本発明のアミノペプチダー
ゼ遺伝子の塩基配列から推定されるタンパク質の分子量
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した
ところ、３４，０００ダルトンであり、本遺伝子でコー
ドされる蛋白の分子量３３，９１４と良く一致してい
た。

【００２１】なお、請求項１記載の本発明のアミノペプ
チダーゼ前駆体遺伝子および請求項４記載の本発明のア
ミノペプチダーゼ遺伝子は、本発明者らが先に解明した
アエロモナス属微生物由来のアミノペプチダーゼ（特開
平８−１７３１６８号公報）とは全く異なる塩基配列を
有するものである。本発明のアミノペプチダーゼ前駆体
遺伝子は、新規な塩基配列を有する遺伝子であり、Nati
onal Center for Biotechnology Information のpsi-BL
AST によるホモロジー検索の結果、平成１１年２月９日
現在、これと４０％以上の相同性が認められる遺伝子は
見当たらなかった。

【００２２】（４）酵素遺伝子の大腸菌における発現 請求項１記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆体遺伝
子のプラスミドへのクローニングと発現を実施した。ま
ず、プラスミドｐＱＥ６０を制限酵素により分解した。
次に、この制限酵素切断プラスミドとＤＮＡの塩基配列
が合致するよう、請求項１記載の本発明のアミノペプチ
ダーゼ前駆体をコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列を基
に作成したフォーワードプライマー（配列表の配列番号
１８に記載）とリバースプライマー（配列表の配列番号
１９に記載）を用い、フラボバクテリウム・ブレブＴ−
３８２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、
アミノペプチダーゼ前駆体をコードするＤＮＡを増幅し
た。

【００２３】増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素で分解
し、これを先に精製した制限酵素分解したプラスミドと
混合し、定法によりライゲーション反応を行い、プラス
ミドｐＦＢＡＰＮＭＣを調製した。これが請求項２記載
の本発明のプラスミドである。この請求項２記載の本発
明のプラスミドを用いて大腸菌を形質転換した。得られ
た形質転換菌が請求項３記載の本発明の形質転換された
大腸菌である。この形質転換された大腸菌は、工業技術
院生命工学工業研究所に寄託されており、その受託番号
はＦＥＲＭ Ｐ−１７１７８である。

【００２４】請求項３記載の形質転換された大腸菌から
発現するタンパク質は、後述の実施例に示すように、ア
ミノペプチダーゼ活性を示すことが明らかである。すな
わち、請求項１記載の本発明の前駆体遺伝子から得られ
る前駆体アミノペプチダーゼが、該前駆体を活性型に変
換する酵素によるプロセッシングを受けて活性型のアミ
ノペプチダーゼとなること、また、請求項４記載の本発
明の遺伝子がコードする活性型アミノペプチダーゼは、
プロセッシングを受けることなく高いアミノペプチダー
ゼ活性を発現することが明らかとなった。

【００２５】次に、請求項４記載の本発明のアミノペプ
チダーゼ遺伝子のプラスミドへのクローニングと発現を
実施した。まず、寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７
１７８）から得られるプラスミドｐＦＢＡＰＮＭＣを鋳
型とし、二つのプライマー（配列表の配列番号２０と２
１）を用いて、ＰＣＲ法によりアミノペプチダーゼをコ
ードするＤＮＡを増幅した。なお、本発明者らは、上記
ＰＣＲの鋳型にプラスミドｐＦＢＡＰＮＭＣを用いた
が、フラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株のゲノム
ＤＮＡを用いることもできる。増幅されたＤＮＡ断片を
制限酵素分解し、これを先述の前駆体の場合に用いたの
と同様の制限酵素分解プラスミドと混合し、常法により
ライゲーション反応を行ってプラスミドｐＦＢＡＰＭを
調製した。得られたプラスミドが請求項５記載の本発明
のプラスミドである。

【００２６】このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換
して得られる形質転換大腸菌が、請求項６記載の本発明
の形質転換体である。この形質転換体からは、微量では
あるがアミノペプチダーゼ活性を有することが確認され
ている。

【００２７】以上に説明したように、本発明は、フラボ
バクテリウム・ブレブＴ−３８２株由来のアミノペプチ
ダーゼ及びその前駆体の遺伝子並びにそれらの大量発現
系を提供するものである。アミノペプチダーゼは、調味
液の製造等に活用される他、苦味を低減あるいは消滅す
る作用を有する。本発明により、このアミノペプチダー
ゼの遺伝情報が提供され、該酵素の大量生産に有用であ
る。

【００２８】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ （１）部分塩基配列の決定 フラボバクテリウム・ブレブ（Flabovacterium breve）
Ｔ−３８２株を栄養培地に培養したのち、菌体を除去し
て得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィ
ーを活用して高度に精製したアミノペプチダーゼを得
た。この精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーＧ
１００５Ａ型（ヒューレットパッカード社製）により、
そのＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３に記
載）を決定した。

【００２９】解読できたアミノ酸配列の中から、コドン
の縮重の少ない領域を選び出し、１箇所のフォーワード
プライマー（配列表の配列番号４に記載）を化学合成し
た。リバースプライマー（配列表の配列番号５に記載）
は、Ｎ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３に記
載）のホモロジー検索の結果から、データベースを活用
してアミノ酸配列のアライメントを作成し、保存されて
いるアミノ酸配列領域を見いだし、そのアミノ酸配列領
域の情報を基にして作成した。

【００３０】フラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株
から、斉藤の方法（蛋白質核酸酵素，第１１巻、４４６
頁）によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡ
を鋳型とし、先の二つのプライマー（配列表の配列番号
４と５）を用いてＰＣＲ反応により増幅させた。その結
果、８００ｂｐの明瞭なバンドが得られた。

【００３１】得られたバンドをクローニングし、ｄロー
ダミン・ターミネーター・サイクルシークエンシング・
キット（パーキンエルマー社製）を用いてＤＮＡ塩基配
列を解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせ
て、プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列
表の配列番号６に記載）が得られた。この７１５ｂｐの
ＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得ら
れたＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３に記
載）の２１番目以降の配列が認められることから、アミ
ノペプチダーゼ遺伝子の一部であることが判明した。

【００３２】（２）５’及び３’側未知領域の塩基配列
の決定 次に、Genomics、 25 号、674 頁、1995年に記載された
サーマル・アシンメトリック・インターレースドＰＣＲ
（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）を実施するために、次のプライマ
ーを用意した。上記（１）で得られた７１５ｂｐのＤＮ
Ａ塩基配列（配列表の配列番号６に記載）の情報をもと
に、フォーワードプライマー１（配列表の配列番号７に
記載）、フォーワードプライマー２（配列表の配列番号
８に記載）、フォーワードプライマー３（配列表の配列
番号９に記載）、リバースプライマー１（配列表の配列
番号１０に記載）、リバースプライマー２（配列表の配
列番号１１に記載）、リバースプライマー３（配列表の
配列番号１２に記載）を化学合成した。また、未知領域
に非特異的に結合する混合プライマー１（配列表の配列
番号１３に記載）を化学合成した。

【００３３】先に抽出したフラボバクテリウム・ブレブ
Ｔ−３８２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、化学合成した
フォーワードプライマー１（配列表の配列番号７に記
載）と混合プライマー１（配列表の配列番号１３に記
載）とを用い、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。Ｔ
ＡＩＬ−ＰＣＲの温度条件は、９７℃−１分間、９８℃
−１分間を１サイクル、９８℃−３０秒間、５６℃−１
５秒間、７２℃−３０秒間を５サイクル、９８℃−３０
秒間、３０℃−３分間、３０℃から７２℃まで３分間で
昇温、７２℃−１分間を１サイクル、９８℃−３０秒
間、５８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間、９８℃−３
０秒間、５８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間、９８℃
−３０秒間、３８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間を１
５サイクル、７２℃−５分間を１サイクルとした。

【００３４】続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したフォーワードプライマー２
（配列表の配列番号８に記載）と混合プライマー１（配
列表の配列番号１３に記載）を用いて２回目のＴＡＩＬ
−ＰＣＲを行った。

【００３５】さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したフォーワードプライマー３
（配列表の配列番号９に記載）と混合プライマー１（配
列表の配列番号１３に記載）を用い、３回目のＴＡＩＬ
−ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列
を解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせ
て、プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列
表の配列番号１４に記載）が得られた。

【００３６】このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳した
ところ、前記（１）で得られた７１５ｂｐのＤＮＡ塩基
配列（配列表の配列番号６に記載）の一部（１３９番目
から２３８番目のアミノ酸配列）が認められた。このこ
とから、得られたＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１
４に記載）は、アミノペプチダーゼ前駆体遺伝子の３’
下流部分であることが判明した。

【００３７】また、同様に、先に抽出したフラボバクテ
リウム・ブレブＴ−３８２株のゲノムＤＮＡを鋳型と
し、先に化学合成したリバースプライマー１（配列表の
配列番号１０に記載）と混合プライマー１（配列表の配
列番号１３に記載）を用い、1回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ
を行った。

【００３８】続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したリバースプライマー２（配
列表の配列番号１１に記載）と混合プライマー１（配列
表の配列番号１３に記載）を用い、２回目のＴＡＩＬ−
ＰＣＲを行った。

【００３９】さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したリバースプライマー３（配
列表の配列番号１２に記載）と混合プライマー１（配列
表の配列番号１３に記載）を用い、３回目のＴＡＩＬ−
ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を
解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせて、
プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の
配列番号１５に記載）が得られた。このＤＮＡ塩基配列
をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた７１５ｂｐ
のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号６に記載）の一部
（１番目から６４番目のアミノ酸）が認められることか
ら、アミノペプチダーゼ前駆体遺伝子の５’上流部分で
あることが判明した。

【００４０】（３）アミノペプチダーゼ前駆体遺伝子の
全塩基配列の決定 次に、ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより明らかになったＤＮＡ塩
基配列（配列表の配列番号１４と１５に記載）の情報
と、先のアミノ酸配列情報を基に作成したプライマーか
ら得られたＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号６に記
載）の情報から、最終的に、アミノペプチダーゼ前駆体
の遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定した（配列表の配列番
号１）。

【００４１】この配列、とりわけ構造遺伝子部分の塩基
配列が正しいことを確認するため、以下の操作を行っ
た。まず、フォーワードプライマー４（配列表の配列番
号１６に記載）とリバースプライマー４（配列表の配列
番号１７に記載）を化学合成し、これらのプライマーを
用いて、先に抽出したフラボバクテリウム・ブレブＴ−
３８２株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＤＮ
Ａ断片を増幅した。そのＤＮＡ断片の塩基配列を解読し
たところ、決定したアミノペプチダーゼ前駆体の遺伝子
のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１）のうちの、１
９０番目〜２２８２番目の部分の塩基配列が確認され
た。

【００４２】一方、前記（１）でアミノペプチダーゼ活
性型酵素のＮ末瑞のアミノ酸配列（配列表の配列番号３
参照）を解読しており、そのアミノ酸配列は配列番号１
に示したアミノ酸配列中の１１３番目以降の配列と一致
したことから、前駆体遺伝子の塩基配列中の１０３９番
目以降に活性型アミノペプチダーゼ遺伝子を見いだし
た。

【００４３】活性型酵素の遺伝子は、アミノペプチダー
ゼのＮ末端アミノ酸配列をもとに、アミノペプチダーゼ
前駆体遺伝子から構成し、配列表の配列番号２に示し
た。その際、Ｃ末端側はホモロジー検索の結果から推定
される領域とした。活性型酵素の分子量は、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定したところ、３４，
０００ダルトンであり、本遺伝子でコードされる蛋白の
分子量３３，９１４と良く一致していた。

【００４４】（４）酵素遺伝子の大腸菌における発現 次に、アミノペプチダーゼとその前駆体遺伝子のプラス
ミドへのクローニングと発現を実施した。まず、プラス
ミドｐＱＥ６０を制限酵素Nco I とBam HIで分解した
（Ａ）。次に、この制限酵素切断プラスミド（Ａ）とＤ
ＮＡの塩基配列が合致するよう、アミノペプチダーゼ前
駆体をコードするＤＮＡ塩基配列を基に、フォーワード
プライマー５（配列表の配列番号１８に記載）とリバー
スプライマー５（配列表の配列番号１９に記載）を化学
合成した。

【００４５】フラボバクテリウム・ブレブＴ−３８２株
のゲノムＤＮＡを鋳型とし、両プライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法によりアミノペプチダーゼ前駆体をコードするＤ
ＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素Nc
o I とBam HIで分解した（Ｂ）。制限酵素分解したプラ
スミド（Ａ）と制限酵素分解したＤＮＡ断片（Ｂ）とを
混合し、常法によりライゲーション反応を行い、プラス
ミドｐＦＢＡＰＮＭＣを調製した。得られたプラスミド
を用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換菌を液
体培養し、これを遠心処理し上澄を得た（Ｃ）。一方、
菌体を超音波破砕し、遠心により可溶性画分を得た
（Ｄ）。

【００４６】得られる上澄（Ｃ）と可溶性画分（Ｄ）に
は、アミノペプチダーゼ前駆体が含まれることから、前
駆体を活性型に変換する酵素で上澄（Ｃ）と可溶性画分
（Ｄ）を処理し、それらのアミノペプチダーゼ活性を測
定した。すなわち、アミノペプチダーゼ前駆体にプロセ
ッシング酵素を与えた後、２０ｍＭトリスバッファー
（ｐＨ８．５）中で３０℃、１時間反応させ、アミノペ
プチダーゼ前駆体を活性型に変換した。その結果、上澄
（Ｃ）と可溶性画分（Ｄ）は、それぞれ５０単位／ｍ
Ｌ、４０単位／ｍＬのアミノペプチダーゼ活性が得られ
た。

【００４７】次に、プラスミドｐＦＢＡＰＮＭＣを鋳型
とし、二つのプライマー（配列表の配列番号２０と２
１）を用いてＰＣＲ法により、活性型アミノペプチダー
ゼをコードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断
片を、制限酵素Nco I とBam HIで分解した（Ｅ）。制限
酵素分解ＤＮＡ断片（Ｅ）と、先に調製した制限酵素分
解プラスミド（Ａ）とを混合し、常法によりライゲーシ
ョン反応を行い、プラスミドｐＦＢＡＰＭを調製した。

【００４８】得られたプラスミドを用い大腸菌を形質転
換した。得られた形質転換菌を液体培養し、これを遠心
処理し上澄を得た（Ｆ）。一方、菌体を超音波破砕し、
遠心により可溶性画分を得た（Ｇ）。上澄（Ｆ）と可溶
性画分（Ｇ）のアミノペプチダーゼ活性を測定したとこ
ろ、それぞれ極微量（１単位／ｍＬ程度）の活性が得ら
れた。また、大腸菌体内において発現した大半の酵素は
封入体を形成した。

【００４９】（５）まとめ 以上の実施例から、フラボバクテリウム・ブレブＴ−３
８２株由来のアミノペプチダーゼ前駆体および活性型ア
ミノペプチダーゼをクローニングし、形質転換した大腸
菌からアミノペプチダーゼを得ることができた。

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、アミノペプチダーゼ及
びその前駆体の遺伝子が提供される。これを発現させて
得られるアミノペプチダーゼは、調味料の製造や脱苦味
等に有用であることから、本発明の遺伝子は食品産業等
の分野における活用が期待される。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> Gene of aminopeptidase precursor, and vector containing said gene and transformat <130> P111018K <160> 24 <210> 1 <211> 2521 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 1 cgcaaaaatt taagaatgag aaagataaat cagaagattt gaagaaaata aaaccttcga 60 taatgtagtg caaccgactc gcgaagaaac cataaatgct tttcatttga aaggaaaatg 120 gcgcgaaaag tttttcaaaa acgataatcc aattgttttg gaattgggtt gtggaaaagg 180 cgaatatact gttgccatgg cgcgtcgaga tgcccatcgt aattttatag gtgttgatat 240 aaaaggtgca cgattttggc gaggtgcaaa aactgccatc gaagaaggat tgaataatgt 300 tggttttata cgtacacaaa ttgaattgat tgatcatttg tttgaccaaa acgaggtgga 360 cgaaatttgg attacttttc cagatccaca aatcaaattt agacgtacca aacaccgttt 420 gactcaccca gattttttga atcgatatgc taaaatttta aaaccagaag gaactgttaa 480 tttgaaaacc gattcagaat ttttacatgg ctatacacat ggtgttatac agcttttagg 540 tcacaaagtt ttgaaatcat cacatgacgt ttaccatcca gatcgtgctg atatacctgc 600 agttgtaact gaggtgcaaa ctttttacga atcaaaattt ttacaagaaa ataaaaaaat 660 tacgtacatt agtttttcat taacacctta aaaatcaaga aa atg ctt ctg aac 714 Met Leu Leu Asn 1 aaa att tta cta ctt tca ctt tct cta tta aat gtt ggt ctc ttt gca 762 Lys Ile Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Asn Val Gly Leu Phe Ala 5 10 15 20 caa cat tcg cac aaa cta cca aaa gat act ccc aaa agt tac ttt tat 810 Gln His Ser His Lys Leu Pro Lys Asp Thr Pro Lys Ser Tyr Phe Tyr 25 30 35 gca acg atg aat gct gat cag gcc gat aaa tta aag gtt tta cat ccc 858 Ala Thr Met Asn Ala Asp Gln Ala Asp Lys Leu Lys Val Leu His Pro 40 45 50 aat gat gtt aaa att tta gcc atc aac aaa aat gaa gct gta gtc aac 906 Asn Asp Val Lys Ile Leu Ala Ile Asn Lys Asn Glu Ala Val Val Asn 55 60 65 atg agc aat tat gct gct gca gat tta cat caa ttt gta ttg tcg cat 954 Met Ser Asn Tyr Ala Ala Ala Asp Leu His Gln Phe Val Leu Ser His 70 75 80 ggt cca ggt ttt ata ctt cat acg gat gaa aaa atc gct aaa aat tat 1002 Gly Pro Gly Phe Ile Leu His Thr Asp Glu Lys Ile Ala Lys Asn Tyr 85 90 95 100 tta caa aga cca caa acc aaa act tca agt gtt ctt gat ttt aac att 1050 Leu Gln Arg Pro Gln Thr Lys Thr Ser Ser Val Leu Asp Phe Asn Ile 105 110 115 agc gaa gat gaa att gta aaa gat tac atc aca caa gtt aaa gaa gga 1098 Ser Glu Asp Glu Ile Val Lys Asp Tyr Ile Thr Gln Val Lys Glu Gly 120 125 130 aat ata caa acg acc ata caa gct tta gaa gca att cat aca cga ttt 1146 Asn Ile Gln Thr Thr Ile Gln Ala Leu Glu Ala Ile His Thr Arg Phe 135 140 145 cat ttg tca aac act cga aat gtc ggc atg gaa tac atc aaa aat ttg 1194 His Leu Ser Asn Thr Arg Asn Val Gly Met Glu Tyr Ile Lys Asn Leu 150 155 160 tgg caa tcc att att gat gaa tcg gga aga gat gat ttg aaa gtc gag 1242 Trp Gln Ser Ile Ile Asp Glu Ser Gly Arg Asp Asp Leu Lys Val Glu 165 170 175 180 ttt tat acc cac aat aac aca cct caa tat tca gtt att ttc acg atc 1290 Phe Tyr Thr His Asn Asn Thr Pro Gln Tyr Ser Val Ile Phe Thr Ile 185 190 195 gaa ggc aac gaa gaa gca gat gaa tac atc att att ggc ggt cat gcc 1338 Glu Gly Asn Glu Glu Ala Asp Glu Tyr Ile Ile Ile Gly Gly His Ala 200 205 210 gac agt att gtg agt tca tct tgg ggc gga aat tac gaa ttg cgt tca 1386 Asp Ser Ile Val Ser Ser Ser Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Leu Arg Ser 215 220 225 cct gga gct gat gat aat gcg agt gga att gcc acc gtt aca gaa gcg 1434 Pro Gly Ala Asp Asp Asn Ala Ser Gly Ile Ala Thr Val Thr Glu Ala 230 235 240 ttg aga ata ttg gta gaa aat agt ttt cgt ccc aaa aaa acc att cag 1482 Leu Arg Ile Leu Val Glu Asn Ser Phe Arg Pro Lys Lys Thr Ile Gln 245 250 255 260 att atg gcc tat gca gcc gaa gaa gtt gga ttg gtg gga tct aat gaa 1530 Ile Met Ala Tyr Ala Ala Glu Glu Val Gly Leu Val Gly Ser Asn Glu 265 270 275 atc gct aca aaa tat cga aat caa ggt atg gac gtc aaa gca tat gta 1578 Ile Ala Thr Lys Tyr Arg Asn Gln Gly Met Asp Val Lys Ala Tyr Val 280 285 290 caa ttt gac atg acc aat tat aaa ggt tct cca aat gat gtt tac atc 1626 Gln Phe Asp Met Thr Asn Tyr Lys Gly Ser Pro Asn Asp Val Tyr Ile 295 300 305 act aca gat tca tac aat tca aat gac cta aat tta ttt ttg gtc gaa 1674 Thr Thr Asp Ser Tyr Asn Ser Asn Asp Leu Asn Leu Phe Leu Val Glu 310 315 320 tta atg gaa cat tac aat gct tct gga gat cat tct ttt act tat ggt 1722 Leu Met Glu His Tyr Asn Ala Ser Gly Asp His Ser Phe Thr Tyr Gly 325 330 335 340 tac acc att tgt aac tat ggc tgt tct gat cat gca tcg tgg gca aac 1770 Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Trp Ala Asn 345 350 355 aaa ggt ttt cct gct gct ttc cct ttc gag tcg agt ttt aat gat agt 1818 Lys Gly Phe Pro Ala Ala Phe Pro Phe Glu Ser Ser Phe Asn Asp Ser 360 365 370 aat cct aac att cac act agt aat gat acc tat tca aaa tca aat gaa 1866 Asn Pro Asn Ile His Thr Ser Asn Asp Thr Tyr Ser Lys Ser Asn Glu 375 380 385 agt agt gcg cat gcc gca aaa ttt gca aaa tta gca ctg caa ttt tta 1914 Ser Ser Ala His Ala Ala Lys Phe Ala Lys Leu Ala Leu Gln Phe Leu 390 395 400 gta gaa gcg act aaa cca act gat gat tta ggt cta aat aac acc tca 1962 Val Glu Ala Thr Lys Pro Thr Asp Asp Leu Gly Leu Asn Asn Thr Ser 405 410 415 420 aag agc aat tct aaa ata gtg gtg aat caa aaa aca tta aac tat ttt 2010 Lys Ser Asn Ser Lys Ile Val Val Asn Gln Lys Thr Leu Asn Tyr Phe 425 430 435 tta gaa agc tcg atg aat aat aac cga gtg aaa att atc aat cca aca 2058 Leu Glu Ser Ser Met Asn Asn Asn Arg Val Lys Ile Ile Asn Pro Thr 440 445 450 ggt caa att gtt tat caa aac gat aaa ctt tca tca aat gga caa ctt 2106 Gly Gln Ile Val Tyr Gln Asn Asp Lys Leu Ser Ser Asn Gly Gln Leu 455 460 465 aat tta aca caa tta acc aat ggc atg tat atc gtt gtt ttc gaa tcc 2154 Asn Leu Thr Gln Leu Thr Asn Gly Met Tyr Ile Val Val Phe Glu Ser 470 475 480 gat aag ggt gaa aaa ttc act tca aaa ttc tta att cat taa acaacatat 2205 Asp Lys Gly Glu Lys Phe Thr Ser Lys Phe Leu Ile His Stop 485 490 495 actttaggac ataaaaaaaa gaggcataag cctctttttt tatatttata tccaatcaaa 2265 acttaattta aactctgcaa ataagcaatc caacctaagg tttggtactc ttttgctgcc 2325 gttttgaaat ctaccgctct atataatcca cgaccgacaa tcataaaatc ggtatggtaa 2385 tttttgaata caatctctgg cgtattatat tgttgtcctt tgttgtccct gacaccgaaa 2445 tattaacacc tggtgtaaat aataacaatt tattacccac tttacgttgc gctacacacc 2505 cccaaaacat taggtt 2521 <210> 2 <211> 912 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 2 gat ttt aac att agc gaa gat gaa att gta aaa gat tac atc aca caa 48 Asp Phe Asn Ile Ser Glu Asp Glu Ile Val Lys Asp Tyr Ile Thr Gln 1 5 10 15 gtt aaa gaa gga aat ata caa acg acc ata caa gct tta gaa gca att 96 Val Lys Glu Gly Asn Ile Gln Thr Thr Ile Gln Ala Leu Glu Ala Ile 20 25 30 cat aca cga ttt cat ttg tca aac act cga aat gtc ggc atg gaa tac 144 His Thr Arg Phe His Leu Ser Asn Thr Arg Asn Val Gly Met Glu Tyr 35 40 45 atc aaa aat ttg tgg caa tcc att att gat gaa tcg gga aga gat gat 192 Ile Lys Asn Leu Trp Gln Ser Ile Ile Asp Glu Ser Gly Arg Asp Asp 50 55 60 ttg aaa gtc gag ttt tat acc cac aat aac aca cct caa tat tca gtt 240 Leu Lys Val Glu Phe Tyr Thr His Asn Asn Thr Pro Gln Tyr Ser Val 65 70 75 80 att ttc acg atc gaa ggc aac gaa gaa gca gat gaa tac atc att att 288 Ile Phe Thr Ile Glu Gly Asn Glu Glu Ala Asp Glu Tyr Ile Ile Ile 85 90 95 ggc ggt cat gcc gac agt att gtg agt tca tct tgg ggc gga 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tct gga gat cat tct 672 Phe Leu Val Glu Leu Met Glu His Tyr Asn Ala Ser Gly Asp His Ser 210 215 220 ttt act tat ggt tac acc att tgt aac tat ggc tgt tct gat cat gca 720 Phe Thr Tyr Gly Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala 225 230 235 240 tcg tgg gca aac aaa ggt ttt cct gct gct ttc cct ttc gag tcg agt 768 Ser Trp Ala Asn Lys Gly Phe Pro Ala Ala Phe Pro Phe Glu Ser Ser 245 250 255 ttt aat gat agt aat cct aac att cac act agt aat gat acc tat tca 816 Phe Asn Asp Ser Asn Pro Asn Ile His Thr Ser Asn Asp Thr Tyr Ser 260 265 270 aaa tca aat gaa agt agt gcg cat gcc gca aaa ttt gca aaa tta gca 864 Lys Ser Asn Glu Ser Ser Ala His Ala Ala Lys Phe Ala Lys Leu Ala 275 280 285 ctg caa ttt tta gta gaa gcg act aaa cca act gat gat tta ggt cta 912 Leu Gln Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Pro Thr Asp Asp Leu Gly Leu 290 295 300 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 3 Asp Phe Asn Ile Ser Glu Asp Glu Ile Val Lys Asp Tyr Ile Thr Gln 1 5 10 15 Val Lys Glu Gly Asn Ile Gln Thr Thr Ile Gln Ala Leu Glu Ala Ile 20 25 30 His Thr Arg Phe His Leu Ser Asn Thr Arg Asn Val Gly Met Glu Tyr 35 40 45 Ile Lys Asn Leu Trp Gln Ser 50 55 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 4 attgtaaaag attatattac acaagtnaar gargg 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 5 gtatcttgtg twgtatgaat ctttggrttr tartc 35 <210> 6 <211> 715 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 6 a aat ata caa acg acc ata caa gct tta gaa gca att cat aca cga 46 Asn Ile Gln Thr Thr Ile Gln Ala Leu Glu Ala Ile His Thr Arg 1 5 10 15 ttt cat ttg tca aac act cga aat gtc ggc atg gaa tac atc aaa aat 94 Phe His Leu Ser Asn Thr Arg Asn Val Gly Met Glu Tyr Ile Lys Asn 20 25 30 ttg tgg caa tcc att att gat gaa tcg gga aga gat gat ttg aaa gtc 142 Leu Trp Gln Ser Ile Ile Asp Glu Ser Gly Arg Asp Asp Leu Lys Val 35 40 45 gag ttt tat acc cac aat aac aca cct caa tat tca gtt att ttc acg 190 Glu Phe Tyr Thr His Asn Asn Thr Pro Gln Tyr Ser Val Ile Phe Thr 50 55 60 atc gaa ggc aac gaa gaa gca gat gaa tac atc att att ggc ggt cat 238 Ile Glu Gly Asn Glu Glu Ala Asp Glu Tyr Ile Ile Ile Gly Gly His 65 70 75 gcc gac agt att gtg agt tca tct tgg ggc gga aat tac gaa ttg cgt 286 Ala Asp Ser Ile Val Ser Ser Ser Trp Gly Gly Asn Tyr Glu Leu Arg 80 85 90 95 tca cct gga gct gat gat aat gcg agt gga att gcc acc gtt aca gaa 334 Ser Pro Gly Ala Asp Asp Asn Ala Ser Gly Ile Ala Thr Val Thr Glu 100 105 110 gcg ttg aga ata ttg gta gaa aat agt ttt cgt ccc aaa aaa acc att 382 Ala Leu Arg Ile Leu Val Glu Asn Ser Phe Arg Pro Lys Lys Thr Ile 115 120 125 cag att atg gcc tat gca gcc gaa gaa gtt gga ttg gtg gga tct aat 430 Gln Ile Met Ala Tyr Ala Ala Glu Glu Val Gly Leu Val Gly Ser Asn 130 135 140 gaa atc gct aca aaa tat cga aat caa ggt atg gac gtc aaa gca tat 478 Glu Ile Ala Thr Lys Tyr Arg Asn Gln Gly Met Asp Val Lys Ala Tyr 145 150 155 gta caa ttt gac atg acc aat tat aaa ggt tct cca aat gat gtt tac 526 Val Gln Phe Asp Met Thr Asn Tyr Lys Gly Ser Pro Asn Asp Val Tyr 160 165 170 175 atc act aca gat tca tac aat tca aat gac cta aat tta ttt ttg gtc 574 Ile Thr Thr Asp Ser Tyr Asn Ser Asn Asp Leu Asn Leu Phe Leu Val 180 185 190 gaa tta atg gaa cat tac aat gct tct gga gat cat tct ttt act tat 622 Glu Leu Met Glu His Tyr Asn Ala Ser Gly Asp His Ser Phe Thr Tyr 195 200 205 ggt tac acc att tgt aac tat ggc tgt tct gat cat gca tcg tgg gca 670 Gly Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Trp Ala 210 215 220 aac aaa ggt ttt cct gct gct ttc cct ttc gag tcg agt ttt aat 715 Asn Lys Gly Phe Pro Ala Ala Phe Pro Phe Glu Ser Ser Phe Asn 225 230 235 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 7 aggcaacgaa gaagcagatg aa 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 8 caccgttaca gaagcgttga g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 9 ctatgcagcc gaagaagttg g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 10 atattctcaa cgcttctgta acg 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 11 ttccactcgc attatcatca gc 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 12 atgtattcat ctgcttcttc gtt 23 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> artificial Sequence <220> <221> unsure <222> 5, 10 <223> Designed oligonucleotide based on random sequence. <400> 13 agwcngawgn acwaaa 16 <210> 14 <211> 1010 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 14 a ttg gtg gga tct aat gaa atc gct aca aaa tat cga aat caa ggt 46 Leu Val Gly Ser Asn Glu Ile Ala Thr Lys Tyr Arg Asn Gln Gly 1 5 10 15 atg gac gtc aaa gca tat gta caa ttt gac atg acc aat tat aaa ggt 94 Met Asp Val Lys Ala Tyr Val Gln Phe Asp Met Thr Asn Tyr Lys Gly 20 25 30 tct cca aat gat gtt tac atc act aca gat tca tac aat tca aat gac 142 Ser Pro Asn Asp Val Tyr Ile Thr Thr Asp Ser Tyr Asn Ser Asn Asp 35 40 45 cta aat tta ttt ttg gtc gaa tta atg gaa cat tac aat gct tct gga 190 Leu Asn Leu Phe Leu Val Glu Leu Met Glu His Tyr Asn Ala Ser Gly 50 55 60 gat cat tct ttt act tat ggt tac acc att tgt aac tat ggc tgt tct 238 Asp His Ser Phe Thr Tyr Gly Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Cys Ser 65 70 75 gat cat gca tcg tgg gca aac aaa ggt ttt cct gct gct ttc cct ttc 286 Asp His Ala Ser Trp Ala Asn Lys Gly Phe Pro Ala Ala Phe Pro Phe 80 85 90 95 gag tcg agt ttt aat gat agt aat cct aac att cac act agt aat gat 334 Glu Ser Ser Phe Asn Asp Ser Asn Pro Asn Ile His Thr Ser Asn Asp 100 105 110 acc tat tca aaa tca aat gaa agt agt gcg cat gcc gca aaa ttt gca 382 Thr Tyr Ser Lys Ser Asn Glu Ser Ser Ala His Ala Ala Lys Phe Ala 115 120 125 aaa tta gca ctg caa ttt tta gta gaa gcg act aaa cca act gat gat 430 Lys Leu Ala Leu Gln Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Pro Thr Asp Asp 130 135 140 tta ggt cta aat aac acc tca aaa agc aat tct aaa ata gtg gtg aat 478 Leu Gly Leu Asn Asn Thr Ser Lys Ser Asn Ser Lys Ile Val Val Asn 145 150 155 caa aaa aca tta aac tat ttt tta gaa agc tcg atg aat aat aac cga 526 Gln Lys Thr Leu Asn Tyr Phe Leu Glu Ser Ser Met Asn Asn Asn Arg 160 165 170 175 gtg aaa att atc aat cca aca ggt caa att gtt tat caa aac gat aaa 574 Val Lys Ile Ile Asn Pro Thr Gly Gln Ile Val Tyr Gln Asn Asp Lys 180 185 190 ctt tca tca aat gga caa ctt aat tta aca caa tta acc aat ggc atg 622 Leu Ser Ser Asn Gly Gln Leu Asn Leu Thr Gln Leu Thr Asn Gly Met 195 200 205 tat atc gtt gtt ttc gaa tcc gat aag ggt gaa aaa ttc act tca aaa 670 Tyr Ile Val Val Phe Glu Ser Asp Lys Gly Glu Lys Phe Thr Ser Lys 210 215 220 ttc tta att cat taa acaacatata ctttaggaca taaaaaaaag aggcataagc c 726 Phe Leu Ile His Stop 225 tcttttttta tatttatatc caatcaaaac ttaatttaaa ctctgcaaat aagcaatcca 786 acctaaggtt tggtactctt ttgctgccgt tttgaaatct accgctctat ataatccacg 846 accgacaatc ataaaatcgg tatggtaatt tttgaataca atctctggcg tattatattg 906 ttgtcctttg ttgtccctga caccgaaata ttaacacctg gtgtaaataa taacaattta 966 ttacccactt tacgttgcgc tacacacccc caaaacatta ggtt 1010 <210> 15 <211> 1296 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 15 cgcaaaaatt taagaatgag aaagataaat cagaagattt gaagaaaata aaaccttcga 60 taatgtagtg caaccgactc gcgaagaaac cataaatgct tttcatttga aaggaaaatg 120 gcgcgaaaag tttttcaaaa acgataatcc aattgttttg gaattgggtt gtggaaaagg 180 cgaatatact gttgccatgg cgcgtcgaga tgcccatcgt aattttatag gtgttgatat 240 aaaaggtgca cgattttggc gaggtgcaaa aactgccatc gaagaaggat tgaataatgt 300 tggttttata cgtacacaaa ttgaattgat tgatcatttg tttgaccaaa acgaggtgga 360 cgaaatttgg attacttttc cagatccaca aatcaaattt agacgtacca aacaccgttt 420 gactcaccca gattttttga atcgatatgc taaaatttta aaaccagaag gaactgttaa 480 tttgaaaacc gattcagaat ttttacatgg ctatacacat ggtgttatac agcttttagg 540 tcacaaagtt ttgaaatcat cacatgacgt ttaccatcca gatcgtgctg atatacctgc 600 agttgtaact gaggtgcaaa ctttttacga atcaaaattt ttacaagaaa ataaaaaaat 660 tacgtacatt agtttttcat taacacctta aaaatcaaga aa atg ctt ctg aac 714 Met Leu Leu Asn 1 aaa att tta cta ctt tca ctt tct cta tta aat gtt ggt ctc ttt gca 762 Lys Ile Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Asn Val Gly Leu Phe Ala 5 10 15 20 caa cat tcg cac aaa cta cca aaa gat act ccc aaa agt tac ttt tat 810 Gln His Ser His Lys Leu Pro Lys Asp Thr Pro Lys Ser Tyr Phe Tyr 25 30 35 gca acg atg aat gct gat cag gcc gat aaa tta aag gtt tta cat ccc 858 Ala Thr Met Asn Ala Asp Gln Ala Asp Lys Leu Lys Val Leu His Pro 40 45 50 aat gat gtt aaa att tta gcc atc aac aaa aat gaa gct gta gtc aac 906 Asn Asp Val Lys Ile Leu Ala Ile Asn Lys Asn Glu Ala Val Val Asn 55 60 65 atg agc aat tat gct gct gca gat tta cat caa ttt gta ttg tcg cat 954 Met Ser Asn Tyr Ala Ala Ala Asp Leu His Gln Phe Val Leu Ser His 70 75 80 ggt cca ggt ttt ata ctt cat acg gat gaa aaa atc gct aaa aat tat 1002 Gly Pro Gly Phe Ile Leu His Thr Asp Glu Lys Ile Ala Lys Asn Tyr 85 90 95 100 tta caa aga cca caa acc aaa act tca agt gtt ctt gat ttt aac att 1050 Leu Gln Arg Pro Gln Thr Lys Thr Ser Ser Val Leu Asp Phe Asn Ile 105 110 115 agc gaa gat gaa att gta aaa gat tac atc aca caa gtt aaa gaa gga 1098 Ser Glu Asp Glu Ile Val Lys Asp Tyr Ile Thr Gln Val Lys Glu Gly 120 125 130 aac ata caa acg acc ata caa gct tta gaa gca att cat aca cga ttt 1146 Asn Ile Gln Thr Thr Ile Gln Ala Leu Glu Ala Ile His Thr Arg Phe 135 140 145 cat ttg tca aac act cga aat gtc ggc atg gaa tac atc aaa aat ttg 1194 His Leu Ser Asn Thr Arg Asn Val Gly Met Glu Tyr Ile Lys Asn Leu 150 155 160 tgg caa tcc att att gat gaa tcg gga aga gat gat ttg aaa gtc gag 1242 Trp Gln Ser Ile Ile Asp Glu Ser Gly Arg Asp Asp Leu Lys Val Glu 165 170 175 180 ttt tat acc cac aat aac aca cct caa tat tca gtt att ttc acg atc 1290 Phe Tyr Thr His Asn Asn Thr Pro Gln Tyr Ser Val Ile Phe Thr Ile 185 190 195 gaa ggc 1296 Glu Gly <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 16 gttgtggaaa aggcgaatat ac 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 17 cttaggttgg attgcttatt tg 22 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 18 atcaagacca tggttctgaa caaaatttta c 31 cgccgccatg gcggcagaac agg 23 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 19 gtcctaaagg atccgttgtt taatgaatta ag 32 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 20 agtgttccca tggttaacat tagcgaagat g 31 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Flabovacterium breve T-382 <400> 21 gctcttggat ccgttttat agacctaaat catc 34

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:20）

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
   するアミノペプチダーゼ前駆体の遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載のアミノペプチダーゼ前駆
   体遺伝子を含むプラスミド。
3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌（ＦＥＲＭＰ−１７１７８）。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２記載の塩基配列を有
   するアミノペプチダーゼの遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項４記載のアミノペプチダーゼ遺伝
   子を含むプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌。