JP3030457B1 - アミノペプチダ―ゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクタ―及び形質転換体 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 アミノペプチダーゼ前駆体を成熟型に変換す
る特異的な酵素の遺伝子をクローニングし、その大量生
産のためのシステムの開発を実現すること。 【解決手段】 アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
ングする酵素の前駆体をコードする遺伝子、該遺伝子を
含むプラスミドおよび形質転換体並びにアミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の遺伝子、該遺伝
子を含むプラスミドおよび形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノペプチダー
ゼ前駆体をプロセッシングする酵素の遺伝子、該遺伝子
を含むプラスミドベクターおよび形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノペプチダーゼは、タンパク質やペ
プチドのＮ末端側に作用し、アミノ酸単位で加水分解す
る酵素の１種である。この酵素は、食品産業の分野にお
いて、ペプチドやアミノ酸を主成分とする調味液の製造
等に活用されている。また、一部のものは、ペプチド性
の苦味を除去・低減する作用をも有している。

【０００３】アミノペプチダーゼの大量生産には、組換
え微生物が利用されるが、一部のアミノペプチダーゼ
は、組換え微生物における発現効率がさほど高くなく、
アミノペプチダーゼ前駆体として発現させる必要があ
る。しかし、アミノペプチダーゼ前駆体は酵素活性を有
していないため、前駆体中のプロペプチド領域を切断
し、活性型に変換することが必要である。この変換に
は、タンパク質分解酵素を用いればよいことが知られて
いるが（特開平８−１７３１６８号公報）、タンパク質
分解酵素には多くの種類があり、どの酵素がアミノペプ
チダーゼ前駆体に特異的に作用するかということは未だ
解明されておらず、ましてやアミノペプチダーゼ前駆体
を活性型に変換する作用を有する酵素の遺伝情報は全く
知られていない。このような特異的な酵素に関する情報
が明らかとなれば、アミノペプチダーゼの大量生産に非
常に有利である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミ
ノペプチダーゼ前駆体を活性型に変換する酵素の遺伝子
をクローニングし、これを大量生産する技術を確立する
ことである。この酵素の遺伝情報を明らかにすることに
より、食品産業におけるアミノペプチダーゼの幅広い活
用に貢献することができる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アミノペ
プチダーゼを活用するために、アエロモナス属微生物か
らアミノペプチダーゼ前駆体を活性型に変換する特異的
な酵素遺伝子のクローニングを計画し、該遺伝子のクロ
ーニングとそれを大量生産することに成功し、本発明を
完成させた。

【０００６】請求項１記載の本発明は、アミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の前駆体をコード
し、かつ配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺
伝子である。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の
遺伝子を含むプラスミドである。請求項３記載の本発明
は、請求項２記載のプラスミドで形質転換された大腸菌
である（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１７９）。

【０００７】請求項４記載の本発明は、アミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の前駆体をコード
し、かつ配列表の配列番号２記載の塩基配列を有する遺
伝子である。請求項５記載の本発明は、請求項４記載の
遺伝子を含むプラスミドである。請求項６記載の本発明
は、請求項５記載のプラスミドで形質転換された大腸菌
である。

【０００８】請求項７記載の本発明は、アミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の前駆体をコード
し、かつ配列表の配列番号３記載の塩基配列を有する遺
伝子である。請求項８記載の本発明は、請求項７記載の
遺伝子を含むプラスミドである。請求項９記載の本発明
は、請求項８記載のプラスミドで形質転換された大腸菌
である。

【０００９】請求項１０記載の本発明は、アミノペプチ
ダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素をコードし、か
つ配列表の配列番号４記載の塩基配列を有する遺伝子で
ある。請求項１１記載の本発明は、請求項１０記載の遺
伝子を含むプラスミドである。請求項１２記載の本発明
は、請求項１１記載のプラスミドで形質転換された大腸
菌である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下において本発明を詳しく説明
する。まず、各請求項記載の本発明の関連性について述
べると、請求項１、４および７記載の本発明は、いずれ
もアミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素
の前駆体をコードする遺伝子に関するものである。これ
らの遺伝子は、それぞれ異なった塩基配列を有してい
る。

【００１１】次に、これら前駆体遺伝子の具体的な構造
の違いについて説明する。請求項１記載の本発明の遺伝
子は、Ｎ末端プロ領域およびＣ末端プロ領域の間に、ア
ミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の活
性型の遺伝子配列が位置しており、このような３つの部
分からなっている。これに対し、請求項４記載の本発明
の遺伝子は、Ｃ末端プロ領域を欠失しているもので、Ｎ
末端プロ領域および活性型領域の２つの部分からなる。
さらに、各請求項７記載の本発明の遺伝子は、Ｎ末端プ
ロ領域を欠失しているもので、Ｃ末端プロ領域および活
性型領域の２つの部分からなる。

【００１２】請求項２、５、８記載の本発明は、それぞ
れ上記請求項１、４、７の発明に対応する各遺伝子のプ
ラスミドに関するものである。請求項３、６、９記載の
本発明は、それぞれ上記請求項２、５、８の発明に対応
する各プラスミドを形質転換して得られる大腸菌に関す
るものである。

【００１３】さらに、請求項１０記載の本発明は、アミ
ノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の活性
型の遺伝子である。請求項１１および１２記載の本発明
は、それぞれ請求項１０記載の発明の活性型遺伝子のプ
ラスミド、該プラスミドを形質転換して得られる大腸菌
である。

【００１４】次に、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素の前駆体の遺伝子について説明する。
本発明者らは、以下のようにして本発明のアミノペプチ
ダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の前駆体遺伝子
および活性型酵素の遺伝子を解明することに成功した。

【００１５】（１）アミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素遺伝子の部分塩基配列の決定 以下の実験は、高いアミノペプチダーゼ活性を有するア
エロモナス属の細菌の１種、Aeromonas caviae（アエロ
モナス・カビアエ）Ｔ−６４株を用いて、以下の操作を
行った。なお、本菌の他に、例えばAeromonas hydrophi
la（アエロモナス・ハイドロフィラ）、Aeromonas sobr
ia（アエロモナス・ソブリア）、Aeromonas salmonicid
a（アエロモナス・サルモニシダ）、Aeromonas shigell
oides（アエロモナス・シゲロイデス）等を用いても、
同様の結果を得ることができる。今回用いたアエロモナ
ス・カビアエＴ−６４株は、本発明者らによって土壌中
から分離された菌株である。

【００１６】アエロモナス・カビアエＴ−６４株を常法
により栄養培地で培養した後、培養物から菌体を分離し
て得た培養上清から、高度に精製したアミノペプチダー
ゼ前駆体をプロセッシングする酵素を得た。この精製酵
素のＮ末端のアミノ酸配列を決定し（配列表の配列番号
５に記載）、該配列をもとにフォーワードプライマー
（配列表の配列番号６に記載）およびリバースプライマ
ー（配列表の配列番号７に記載）を作成した。

【００１７】これらのプライマーと、アエロモナス・カ
ビアエＴ−６４株から、斎藤の方法（蛋白質核酸酵素,
11巻, 446 頁）により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、ＰＣＲ反応により増幅させた。その結果、４４０ｂ
ｐの明瞭なバンドが得られた。該バンドのＤＮＡ配列を
解読し、その塩基配列の情報をつなぎ合わせて、プライ
マー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番
号８に記載）を得た。この３６９ｂｐからなるＤＮＡ塩
基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたＮ末
端のアミノ酸配列（配列表の配列番号５に記載）の１８
番目からの配列が認められることから、アミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子の一部であ
ることが判明した。

【００１８】（２）５' 及び３' 側未知領域の塩基配列
の決定 上記（１）において得られた塩基配列の他のアミノペプ
チダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子の塩基
配列の特定を試みた。この実験にあたり、本発明者らは
Genomics、25号、674 頁、1995年に記載されたサーマル
・アシンメトリック・インターレースドＰＣＲ（ＴＡＩ
Ｌ−ＰＣＲ）を利用した。ＴＡＩＬ−ＰＣＲとは、既知
の配列に特異的なプライマーと非特異的プライマーとを
組み合わせて使用することにより、既知の配列に隣接す
る未知ＤＮＡ配列を特異的に増幅する方法である。すな
わち、鋳型ＤＮＡへのアニーリング温度が異なる２種類
のオリゴヌクレオチド、特異的プライマー及び非特異的
プライマーを用意し、ＰＣＲのアニーリング温度を変化
的に制御することにより、非特異的産物の増幅を抑制
し、目的配列を優先的に増幅する。

【００１９】上記（１）で得られた３６９ｂｐのＤＮＡ
塩基配列（配列表の配列番号８に記載）の情報をもと
に、３つのフォーワードプライマー（配列表の配列番号
９〜１１に記載）と３つのリバースプライマー（配列表
の配列番号１２〜１４に記載）を化学合成した。また、
未知領域に非特異的に結合する２つの混合プライマー
（配列表の配列番号１５および１６に記載）を化学合成
した。

【００２０】まず、３つのフォーワードプライマーのそ
れぞれ（配列表の配列番号９〜１１に記載）と混合プラ
イマー（配列表の配列番号１５に記載）との組合せを用
い、先に抽出したアエロモナス・カビアエＴ−６４株の
ゲノムＤＮＡを鋳型としたＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。
増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を解読し、解読し
た塩基配列の情報をつなぎ合わせたところ、プライマー
部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１
７に記載）が得られた。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸
に翻訳したところ、前記（１）で得られた３６９ｂｐの
ＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号８に記載）の一部
（１１７番目から１２３番目）が認められることから、
アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺
伝子の３' 下流部分であることが判明した。

【００２１】また、同様に、３つのリバースプライマー
のそれぞれ（配列表の配列番号１２〜１４に記載）と混
合プライマー（配列表の配列番号１６に記載）との組合
せを用いて、先に抽出したアエロモナス・カビアエＴ−
６４株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＴＡＩＬ−ＰＣＲを
行った。増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を解読
し、得られる塩基配列の情報をつなぎ合わせたところ、
プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の
配列番号１８に記載）が得られた。このＤＮＡ塩基配列
をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた３６９ｂｐ
のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号８に記載）の一部
（１番目から２３番目）が認められることから、アミノ
ペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子の
５' 上流部分であることが判明した。

【００２２】なお、本発明者らは、上記配列の解明に際
してＴＡＩＬ−ＰＣＲを用いたが、他の方法によること
もできる。他の方法の例としては、アエロモナス・カビ
アエ Ｔ−６４株のゲノムライブラリーから標識したプ
ローブを用いてスクリーニングする方法が挙げられる。
すなわち、アエロモナス・カビアエ Ｔ−６４株のゲノ
ムＤＮＡを適当な制限酵素で断片化した後、λファージ
ベクターに組み込み、ゲノムライブラリーを作成する。
続いて、このゲノムライブラリーの中から、天然酵素の
アミノ酸配列をもとに化学合成したオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズするクローンをスクリーニングする
と、上記配列を得ることができる。

【００２３】（３）請求項１記載の酵素前駆体遺伝子の
全塩基配列の決定 上記（１）および（２）で得られたＤＮＡ塩基配列か
ら、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵
素の前駆体の遺伝子の全塩基配列を決定した。すなわ
ち、（２）で得られた３' 下流および５' 上流のＤＮＡ
塩基配列（配列表の配列番号１７と１８に記載）の情報
を基に化学合成したフォーワードプライマーおよびリバ
ースプライマー（それぞれ配列表の配列番号１９および
２０に記載）を用いて、先に抽出したアエロモナス・カ
ビアエＴ−６４株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに
より、ＤＮＡ断片を増幅し、そのＤＮＡ塩基配列を解読
した。

【００２４】解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせ
て、最終的に、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
ングする酵素前駆体の遺伝子のＤＮＡ配列を決定した
（配列表の配列番号１参照）。すなわち、これが請求項
１記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆体をプロセッ
シングする酵素の前駆体の遺伝子である。請求項１記載
の本発明のアミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシング
する酵素の前駆体の遺伝子は、全長１９７７塩基からな
り、５９０個のアミノ酸をコードする。

【００２５】請求項１記載の本発明の酵素前駆体遺伝子
のうち、活性型酵素をコードする遺伝子の部分を特定す
るために、まず、前記（１）で解明した活性型酵素のＮ
末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号５参照）との比
較を行った。その結果、請求項１記載の本発明の遺伝子
のアミノ酸配列（配列表の配列番号１参照）中の１８５
番目以降の配列と一致したことから、請求項１記載の本
発明の遺伝子は、塩基配列（配列表の配列番号１参照）
中の５６６番目以降にアミノペプチダーゼ前駆体をプロ
セッシングする酵素遺伝子を有することが明らかとなっ
た。

【００２６】次に、活性型酵素遺伝子のＣ末端側を特定
するため、前記（１）で解明した活性型酵素のＮ末端ア
ミノ酸配列（配列表の配列番号５参照）をもとに、請求
項１記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素前駆体遺伝子から構成した。その際、
Ｃ末端プロ領域のプロセッシング部位はホモロジー検索
の結果から推定される領域とした。その結果得られた活
性型酵素の遺伝子は、配列表の配列番号４に示す配列を
有する。これが請求項１０記載の本発明の酵素遺伝子で
ある。活性型酵素の分子量が33,000ダルトンであるの
と、請求項１２記載の本発明の活性型酵素の遺伝子がコ
ードするタンパクの分子量33,131であるのとが良く一致
していたことからも、この請求項１０記載の本発明の遺
伝子が活性型酵素をコードすることが明らかである。つ
まり、請求項１記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆
体をプロセッシングする酵素の前駆体遺伝子は、活性型
酵素遺伝子を間にはさみ、活性化の際のプロセッシング
により除去されるＮ末端プロ領域およびＣ末端プロ領域
からなることが判明した。請求項１記載の本発明のアミ
ノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素の前駆
体遺伝子は、新規な塩基配列を有する遺伝子であり、Na
tional Center for Biotechnology Informationのpsi-B
LASTによるホモロジー検索の結果、平成１１年２月８日
現在、これと５４％以上の相同性が認められる遺伝子は
見当たらなかった。

【００２７】（４）請求項１記載の本発明の酵素前駆体
遺伝子のプラスミド作成および大腸菌への形質転換 次に、請求項１記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆
体をプロセッシングする酵素遺伝子のプラスミドへのク
ローニングと発現を実施した。まず、プラスミドpET26b
を制限酵素分解した。次に、請求項１記載の酵素前駆体
遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１参照）をもとに
化学合成したフォーワードプライマーおよびリバースプ
ライマー（それぞれ配列表の配列番号２１および２２に
記載）を用い、アエロモナス・カビアエＴ−６４株のゲ
ノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、アミノペプ
チダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体をコー
ドするＤＮＡを増幅した。

【００２８】増幅されたＤＮＡ断片を、プラスミドと同
様に制限酵素分解し、これを先に調製した酵素分解プラ
スミドと混合し、常法によりライゲーション反応を行
い、プラスミドpPSNMCを調製した。これが請求項２記載
の本発明のプラスミドである。この請求項２記載の本発
明のプラスミドを用い、大腸菌を形質転換し、形質転換
体を得た。これが、請求項３記載の本発明の形質転換さ
れた大腸菌である。この形質転換された大腸菌は、工業
技術院生命工学工業研究所に寄託されており、その受託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７１７９である。請求項３記載
の形質転換された大腸菌から発現するタンパク質は、後
述の実施例に示すように、アミノペプチダーゼ前駆体プ
ロセッシング活性を有することが証明されている。すな
わち、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする
酵素前駆体は、自己触媒的にＮ末端プロ領域及びＣ末端
プロ領域をプロセッシングし、活性型酵素となった結
果、酵素活性が発現することが明らかにされている。

【００２９】（５）請求項４記載の本発明の酵素前駆体
遺伝子のプラスミド作成および大腸菌への形質転換 また、請求項４記載の本発明の遺伝子のように、請求項
１記載の本発明の遺伝子（配列表の配列番号１参照）に
おいて、Ｃ末端プロ領域を欠失させたもの（配列表の配
列番号２参照）も、請求項１記載の本発明の遺伝子と同
様、活性型酵素を得るのに用いることができる。

【００３０】この請求項４記載の本発明の酵素前駆体を
コードする塩基配列（配列表の配列番号２に記載）をも
とに作成したプライマー（配列表の配列番号２３に記
載）と先に合成したプライマー（配列表の配列番号２１
に記載）を用いて、寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１
７１７９）から得られるプラスミドpPSNMCを鋳型とした
ＰＣＲ法により、Ｃ末端プロ領域を欠失させたアミノペ
プチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体をコ
ードするＤＮＡを増幅した。なお、本発明者らは、上記
ＰＣＲの鋳型にプラスミドpPSNMCを用いたが、アエロモ
ナス・カビアエ Ｔ−６４株のゲノムＤＮＡを用いるこ
ともできる。

【００３１】増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素分解し、
先述の制限酵素分解プラスミドと混合し、定法によりラ
イゲーション反応を行い、プラスミドpPSNM を調製し
た。このプラスミドが請求項５記載の本発明である。こ
の請求項５記載の本発明のプラスミドを用い、大腸菌を
形質転換した。この形質転換された大腸菌が、請求項６
記載の本発明の形質転換体である。この形質転換体から
は、微量ではあるが酵素活性が観察されることから、請
求項４記載の本発明のアミノペプチダーゼ前駆体をプロ
セッシングする酵素前駆体の遺伝子が、請求項１記載の
本発明の遺伝子と同様に、自己触媒的にＮ末端プロ領域
をプロセッシングすることにより活性型酵素となること
が明らかである。

【００３２】（６）請求項７記載の本発明の酵素前駆体
遺伝子のプラスミド作成および大腸菌への形質転換 さらに、請求項７記載の本発明の遺伝子のように、請求
項１記載の本発明の遺伝子（配列表の配列番号１参照）
において、Ｎ末端プロ領域を欠失させたもの（配列表の
配列番号３参照）も、請求項１記載の本発明の遺伝子と
同様に、活性型酵素を得るのに用いることができる。

【００３３】請求項７記載の本発明の酵素前駆体をコー
ドするＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号３に記載）を
もとに化学合成したフォーワードプライマー（配列表の
配列番号２４に記載）および先に作ったプライマー（配
列表の配列番号２２）とを用い、寄託した大腸菌（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１７１７９）から得られるプラスミドpPSNMC
を鋳型としたＰＣＲ法により、Ｎ末端プロ領域を欠失さ
せたアミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵
素前駆体をコードするＤＮＡを増幅した。なお、本発明
者らは、上記ＰＣＲの鋳型にプラスミドpPSNMCを用いた
が、アエロモナス・カビアエ Ｔ−６４株のゲノムＤＮ
Ａを用いることもできる。

【００３４】増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素分解し、
これを制限酵素分解したプラスミドと混合し、常法によ
りライゲーション反応を行い、プラスミドpPSMC を調製
した。これが、請求項８記載の本発明のプラスミドであ
る。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換した。こ
の形質転換された大腸菌が、請求項９記載の本発明の形
質転換体である。この形質転換体からは、微量ではある
が酵素活性が観察されることから、請求項７記載の本発
明の前駆体遺伝子は、請求項１記載の本発明の前駆体遺
伝子と同様に、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
ングする酵素前駆体が自己触媒的にＣ末端プロ領域をプ
ロセッシングし、活性型酵素となることがわかった。

【００３５】（７）請求項１０記載の本発明の酵素遺伝
子のプラスミド作成および大腸菌への形質転換 さらに、以下に示すように、請求項１０記載の本発明の
活性型酵素の遺伝子（配列表の配列番号４参照）も、請
求項１記載の本発明の遺伝子と同様、活性型酵素を得る
のに用いることができる。

【００３６】まず、寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１
７１７９）から得られるプラスミドpPSNMCを鋳型とし、
二つのプライマー（配列表の配列番号２３と２４）を用
いて、ＰＣＲ法により、活性型アミノペプチダーゼ前駆
体をプロセッシングする酵素をコードするＤＮＡを増幅
した。なお、本発明者らは、上記ＰＣＲの鋳型にプラス
ミドpPSNMCを用いたが、アエロモナス・カビアエ Ｔ−
６４株のゲノムＤＮＡを用いることもできる。増幅され
たＤＮＡ断片を制限酵素分解し、これを制限酵素分解し
たプラスミドと調製したＤＮＡ断片とを混合し、常法に
よりライゲーション反応を行い、プラスミドpPSMを調製
した。得られたプラスミドが請求項１１記載の本発明の
プラスミドである。このプラスミドで大腸菌を形質転換
した。これが、請求項１２記載の本発明の形質転換体で
ある。

【００３７】以上に説明したように、本発明はアミノペ
プチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体の遺
伝子並びに活性型酵素の遺伝子と、それらの大量発現系
を提供するものである。本発明の酵素前駆体遺伝子は、
自己触媒的作用によって自ら活性を有する活性型酵素に
変換する。活性型酵素は、以下の実施例の結果から明ら
かなとおり、アエロモナス・カビアエ、ビブリオ・プロ
テオリティカおよびフラボバクテリウム・ブレブ由来の
アミノペプチダーゼ前駆体を天然型と同様な活性を有す
る活性型アミノペプチダーゼに効率よく変換する能力を
有する。このことから、本発明の酵素前駆体遺伝子、活
性型酵素遺伝子およびその発現系は、調味料等としての
用途を有するアミノペプチダーゼの発現に不可欠である
ことから、食品産業等の分野において有用である。

【００３８】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ （１）アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする
酵素遺伝子の部分塩基配列の決定 アエロモナス・カビアエＴ−６４株を栄養培地に培養し
た後、菌体を除去して得られた培養上清から、イオン交
換クロマトグラフィーを活用し、高度に精製したアミノ
ペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素を得た。
この精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーG1005A
型（ヒューレットパッカード社製）により、そのＮ末端
のアミノ酸配列（配列表の配列番号５に記載）を決定し
た。

【００３９】解読できたアミノ酸配列の中から、コドン
の縮重の少ない領域を選び出し、１箇所のフォーワード
プライマー（配列表の配列番号６に記載）を化学合成し
た。リバースプライマー（配列表の配列番号７に記載）
は、Ｎ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号５に記
載）のホモロジー検索の結果から、データベースを活用
し、アミノ酸配列のアライメントを作成し、保存されて
いるアミノ酸配列領域を見出し、そのアミノ酸配列領域
の情報を基に作成した。

【００４０】アエロモナス・カビアエＴ−６４株から、
斎藤の方法（蛋白質核酸酵素，11巻，446 頁）によりゲ
ノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、
先の二つのプライマー（配列表の配列番号６と７）を用
いてＰＣＲ反応により増幅させた。その結果、４４０ｂ
ｐの明瞭なバンドが得られた。

【００４１】得られたバンドをクローニングし、ｄロー
ダミン・ターミネーター・サイクルシークエンシング・
キット（パーキンエルマー社製）を用いてＤＮＡ配列を
解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせて、
プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の
配列番号８に記載）を得た。この３６９ｂｐからなるＤ
ＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られ
たＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号５に記載）
の１８番目からの配列が認められることから、アミノペ
プチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子の一
部であることが判明した。

【００４２】（２）５' 及び３' 側未知領域の塩基配列
の決定 次に、Genomics、25号、674 頁、1995年に記載されたサ
ーマル・アシンメトリック・インターレースドＰＣＲ
（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）を実施するために、この３６９ｂ
ｐのＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号８に記載）の情
報をもとに、フォーワードプライマー１（配列表の配列
番号９に記載）、フォーワードプライマー２（配列表の
配列番号１０に記載）、フォーワードプライマー３（配
列表の配列番号１１に記載）、リバースプライマー１
（配列表の配列番号１２に記載）、リバースプライマー
２（配列表の配列番号１３に記載）、リバースプライマ
ー３（配列表の配列番号１４に記載）を化学合成した。
また、未知領域に非特異的に結合する混合プライマー１
（配列表の配列番号１５に記載）および混合プライマー
２（配列表の配列番号１６に記載）を化学合成した。

【００４３】次に、先に抽出したアエロモナス・カビア
エＴ−６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、先に化学合成
したフォーワードプライマー１（配列表の配列番号９に
記載）と混合プライマー１（配列表の配列番号１５に記
載）を用い、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。ＴＡ
ＩＬ−ＰＣＲの温度条件は、９７℃−１分間、９８℃−
１分間を１サイクル、９８℃−３０秒間、５６℃−１５
秒間、７２℃−３０秒間を５サイクル、９８℃−３０秒
間、３０℃−３分間、３０℃から７２℃まで３分間で昇
温、７２℃−１分間を１サイクル、９８℃−３０秒間、
５８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間、９８℃−３０秒
間、５８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間、９８℃−３
０秒間、３８℃−１５秒間、７２℃−３０秒間を１５サ
イクル、７２℃−５分間を１サイクルとした。

【００４４】続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したフォーワードプライマー２
（配列表の配列番号１０に記載）と混合プライマー１
（配列表の配列番号１５に記載）を用い、２回目のＴＡ
ＩＬ−ＰＣＲを行った。

【００４５】さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したフォーワードプライマー３
（配列表の配列番号１１に記載）と混合プライマー１
（配列表の配列番号１５に記載）を用いて３回目のＴＡ
ＩＬ−ＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩
基配列を解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合
わせて、プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列
（配列表の配列番号１７に記載）が得られた。このＤＮ
Ａ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた
３６９ｂｐのＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号８に記
載）の一部（１１７番目から１２３番目）が認められる
ことから、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシング
する酵素遺伝子の３' 下流部分であることが判明した。

【００４６】また、同様に、先に抽出したアエロモナス
・カビアエＴ‐６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、先に
化学合成したリバースプライマー１（配列表の配列番号
１２に記載）と混合プライマー２（配列表の配列番号１
６に記載）を用い、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行っ
た。

【００４７】続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したリバースプライマー２（配
列表の配列番号１３に記載）と混合プライマー２（配列
表の配列番号１６に記載）を用い、２回目のＴＡＩＬ−
ＰＣＲを行った。

【００４８】さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物を
鋳型とし、先に化学合成したリバースプライマー３（配
列表の配列番号１４に記載）と混合プライマー２（配列
表の配列番号１６に記載）を用いて３回目のＴＡＩＬ−
ＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を
解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせて、
プライマー部分以外に新たなＤＮＡ塩基配列（配列表の
配列番号１８に記載）が得られた。このＤＮＡ塩基配列
をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた３６９ｂｐ
のＤＮＡ塩基配列（配列表の配列番号８に記載）の一部
（１番目から２３番目）が認められることから、アミノ
ペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体遺
伝子の５' 上流部分であることが判明した。

【００４９】（３）請求項１記載の本発明の酵素前駆体
遺伝子の全塩基配列の決定 次に、ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより明らかになったＤＮＡ塩
基配列（配列表の配列番号１７と１８に記載）の情報を
もとに、フォーワードプライマー４（配列表の配列番号
１９に記載）とリバースプライマー４（配列表の配列番
号２０に記載）を化学合成した。先に抽出したアエロモ
ナス・カビアエＴ−６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、
先の二つのプライマー（配列表の配列番号１９と２０参
照）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、そのＤ
ＮＡ塩基配列を解読した。解読した塩基配列の情報をつ
なぎ合わせて、最終的に、アミノペプチダーゼ前駆体を
プロセッシングする酵素前駆体の遺伝子のＤＮＡ配列を
決定した（配列表の配列番号１参照）。

【００５０】一方、前記（１）ですでに解読したアミノ
ペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする活性型の酵素
のＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号５参照）
は、配列番号１に示したアミノ酸配列中の１８５番目以
降の配列と一致したしたことから、得られた前駆体酵素
遺伝子の塩基配列中の５６６番目以降にアミノペプチダ
ーゼ前駆体をプロセッシングする酵素遺伝子を見出し
た。

【００５１】活性型酵素の遺伝子は、アミノペプチダー
ゼ前駆体をプロセッシングする酵素のＮ末端アミノ酸配
列をもとに、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシン
グする酵素前駆体遺伝子から構成し、配列表の配列番号
４に示した。その際、Ｃ末端プロ領域のプロセッシング
部位はホモロジー検索の結果から推定される領域とし
た。また、活性型酵素の分子量は、島津製作所、レーザ
ーイオン化 TOF−MS KOMPACTMALDIIII型で測定したとこ
ろ、33,000ダルトンであり、本遺伝子でコードされるタ
ンパクの分子量33,131と良く一致していた。

【００５２】（４）酵素遺伝子の大腸菌における発現 次に、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする
酵素遺伝子のプラスミドへのクローニングと発現を実施
した。まず、プラスミドpET26bを制限酵素Nco I とHind
IIIで分解した（Ａ）。次に、この制限酵素切断プラス
ミド（Ａ）とＤＮＡの塩基配列が合致するよう、アミノ
ペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体
（Ｎ末端プロ領域、活性型領域およびＣ末端プロ領域）
をコードするＤＮＡ配列をもとに、フォーワードプライ
マー５（配列表の配列番号２１に記載）とリバースプラ
イマー５（配列表の配列番号２２に記載）を化学合成し
た。

【００５３】アエロモナス・カビアエＴ−６４株のゲノ
ムＤＮＡを鋳型とし、両プライマーを用いて、ＰＣＲ法
によりアミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする
酵素前駆体をコードするＤＮＡを増幅した。増幅された
ＤＮＡ断片を、制限酵素NcoI とHind IIIで分解した
（Ｂ）。制限酵素分解プラスミド（Ａ）と制限酵素分解
ＤＮＡ断片（Ｂ）を混合し、定法によりライゲーション
反応を行い、プラスミドpPSNMCを調製した。得られたプ
ラスミドを用い、大腸菌を形質転換した。この形質転換
された大腸菌は、工業技術院生命工学工業研究所に寄託
されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７１７９
である。得られた形質転換体を液体培養したのち、培養
物を遠心処理し上澄を得た（Ｃ）。一方、菌体を超音波
破砕した後、遠心処理により可溶性画分を得た（Ｄ）。

【００５４】上澄（Ｃ）と可溶性画分（Ｄ）のアミノペ
プチダーゼ前駆体プロセッシング活性を測定した。すな
わち、アミノペプチダーゼ前駆体に精製酵素を与え、反
応後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより切断活性を分析した。２０
ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．５）中で３０℃、１時
間反応させ、１００ｐｍｏｌのアミノペプチダーゼ前駆
体を活性型酵素に５０％変換する酵素量を１単位として
活性を算出した。その結果、上澄（Ｃ）と可溶性画分
（Ｄ）は、それぞれ２００単位／μＬ、２７０単位／μ
Ｌであり、両者とも高い酵素活性を有することがわかっ
た。

【００５５】また、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素前駆体は、自己触媒的にＮ末端プロ領
域およびＣ末端プロ領域をプロセッシングし、すべて活
性型酵素に変換された。

【００５６】（５）Ｃ末端プロ領域のない酵素前駆体遺
伝子の大腸菌における発現 次に、Ｃ末端プロ領域を欠失させたアミノペプチダーゼ
前駆体をプロセッシングする酵素前駆体をコードするＤ
ＮＡ配列（配列表の配列番号２に記載）を基に、リバー
スプライマー６（配列表の配列番号２３に記載）を化学
合成した。

【００５７】寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１７
９）から得られるプラスミドpPSNMCを鋳型とし、二つの
プライマー（配列表の配列番号２１と２３）を用い、Ｐ
ＣＲ法により、Ｃ末端プロ領域を欠失させたアミノペプ
チダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体をコー
ドするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を、制
限酵素Nco I とHind IIIで分解した（Ｅ）。先に調製し
た制限酵素分解プラスミド（Ａ）と制限酵素分解ＤＮＡ
断片（Ｅ）を混合し、常法によりライゲーション反応を
行い、プラスミドpPSNM を調製した。得られたプラスミ
ドを用い、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体
を液体培養した後、培養物を遠心処理して上澄を得た
（Ｆ）。一方、菌体を超音波破砕し、遠心処理により可
溶性画分を得た（Ｇ）。

【００５８】これら上澄（Ｆ）と可溶性画分（Ｇ）のア
ミノペプチダーゼ前駆体プロセシング活性を測定したと
ころ、それぞれ極微量（１単位／μＬ程度）の活性が得
られた。また、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
ングする酵素前駆体は、自己触媒的にＮ末端プロ領域を
プロセッシングし、一部が活性型酵素に変換された。ま
た、大腸菌体内において発現した大半の酵素は封入体を
形成した。

【００５９】（６）Ｎ末端プロ領域のない酵素前駆体遺
伝子の大腸菌における発現 次に、Ｎ末端プロ領域を欠失させたアミノペプチダーゼ
前駆体をプロセッシングする酵素前駆体をコードするＤ
ＮＡ配列（配列表の配列番号３に記載）を基に、フォー
ワードプライマー６（配列表の配列番号２４に記載）を
化学合成した。寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１
７９）から得られるプラスミドpPSNMCを鋳型とし、二つ
のプライマー（配列表の配列番号２２と２４参照）を用
いてＰＣＲ法により、Ｎ末端プロ領域を欠失させたアミ
ノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵素前駆体
をコードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片
を、制限酵素Nco I とHind IIIで分解した（Ｈ）。

【００６０】先に調製した制限酵素分解プラスミド
（Ａ）と制限酵素分解ＤＮＡ断片（Ｈ）とを混合し、常
法によりライゲーション反応を行い、プラスミドpPSMC
を調製した。得られたプラスミドを用いて大腸菌を形質
転換した。得られた形質転換体を液体培養し、得られた
培養物を遠心処理し上澄を得た（Ｉ）。一方、菌体を超
音波破砕し、遠心処理により可溶性画分を得た（Ｊ）。

【００６１】上澄（Ｉ）と可溶性画分（Ｊ）のアミノペ
プチダーゼ前駆体プロセッシング活性を測定したとこ
ろ、それぞれ極微量（１単位／μＬ程度）の活性が得ら
れた。また、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシン
グする酵素前駆体は、自己触媒的にＣ末端プロ領域をプ
ロセッシングし、ごく一部が活性型酵素に変換された。
また、大腸菌体内において発現した大半の酵素は封入体
を形成した。

【００６２】（７）Ｎ末端プロ領域およびＣ末端プロ領
域のない、すなわち酵素遺伝子の大腸菌における発現 次に、寄託した大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１７９）か
ら得られるプラスミドpPSNMCを鋳型とし、二つのプライ
マー（配列表の配列番号２３と２４参照）を用いてＰＣ
Ｒ法により、活性型アミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素をコードするＤＮＡを増幅した。

【００６３】増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素Nco I
とHind IIIで分解した（Ｋ）。先に調製した制限酵素分
解プラスミド（Ａ）とＤＮＡ断片（Ｋ）とを混合し、常
法によりライゲーション反応を行い、プラスミドpPSMを
調製した。得られたプラスミドを用い、大腸菌を形質転
換した。得られた形質転換体を液体培養し、培養物を遠
心処理し上澄を得た（Ｌ）。一方、菌体を超音波破砕
し、遠心処理により可溶性画分を得た（Ｍ）。このよう
にして得た上澄（Ｌ）と可溶性画分（Ｍ）のアミノペプ
チダーゼ前駆体プロセッシング活性を測定したところ、
それぞれ極微量（１単位／μＬ程度）の活性が得られ
た。また、大腸菌体内において発現した大半の酵素は封
入体を形成した。

【００６４】（８）精製酵素のアミノペプチダーゼ前駆
体プロセッシング活性 次に、前記（４）〜（７）の試験において得られた上澄
（それぞれ（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）、（Ｌ））および可
溶性画分（それぞれ（Ｄ）、（Ｇ）、（Ｊ）、（Ｍ））
を、それぞれイオン交換カラムクロマトグラフィーにか
け、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシングする酵
素を精製した。

【００６５】精製酵素をそれぞれ、Ｎ末端プロ領域およ
び活性型領域から構成されるアエロモナス・カビアエＴ
−６４株由来のアミノペプチダーゼ前駆体に作用させ
た。その結果、いずれの酵素も天然型アミノペプチダー
ゼのＮ末端より１７アミノ酸残基上流位置でプロセッシ
ングし、活性型アミノペプチダーゼ（Ｎ）を生成した。
活性型アミノペプチダーゼ（Ｎ）の酵素活性（Ｋｍ，0.
14±0.030 ｍＭ；kcat，40±4.7 ｓ^-1）を測定したとこ
ろ、天然型アミノペプチダーゼの酵素活性（Ｋｍ，0.14
±0.030 ｍＭ；kcat，44±5.3 ｓ^-1）とほぼ等しい値を
示した。

【００６６】次に、精製酵素を、Ｎ末端プロ領域、活性
型領域、及びＣ末端プロ領域から構成されるビブリオ・
プロテオリティカ由来のアミノペプチダーゼ前駆体に作
用させた。その結果、Ｎ末端プロ領域及びＣ末端プロ領
域をプロセッシングし、天然型アミノペプチダーゼと同
様な活性型アミノペプチダーゼ（Ｏ）を生成した。得ら
れる活性型アミノペプチダーゼ（Ｏ）の酵素活性を測定
したところ、いずれの精製酵素を用いた場合も、等しい
酵素活性を示した。そのうち、（４）酵素遺伝子の大腸
菌における発現で得られ上澄（Ｃ）から得られる活性型
アミノペプチダーゼ（Ｏ）の酵素活性（Ｋｍ，0.15±0.
030 ｍＭ；kcat，99±10ｓ^-1）は、天然型アミノペプチ
ダーゼの酵素活性（Ｋｍ，0.14±0.030 ｍＭ；kcat，10
2 ±10ｓ^-1）とほぼ等しい値を示した。

【００６７】次に、精製酵素を、Ｎ末端プロ領域および
活性型領域から構成されるビブリオ・プロテオリティカ
由来のＣ末端プロ領域を欠失させたアミノペプチダーゼ
前駆体に作用させたところ、Ｎ末端プロ領域をプロセッ
シングし、天然アミノペプチダーゼと同様な活性型アミ
ノペプチダーゼ（Ｐ）を生成した。得られる活性型アミ
ノペプチダーゼ（Ｐ）の酵素活性を測定したところ、い
ずれの精製酵素を用いた場合も、等しい酵素活性を示し
た。そのうち、（４）酵素遺伝子の大腸菌における発現
で得られ上澄（Ｃ）から得られる活性型アミノペプチダ
ーゼ（Ｐ）の酵素活性（Ｋｍ，0.15±0.030 ｍＭ；kca
t，96±10ｓ^-1）は、天然型アミノペプチダーゼの酵素
活性（Ｋｍ，0.14±0.030 ｍＭ；kcat，102 ±10ｓ^-1）
とほぼ等しい値を示した。

【００６８】次に、精製酵素を、Ｎ末端プロ領域、活性
型領域、及びＣ末端プロ領域から構成されるフラボバク
テリウム・ブレブ Ｔ−３８２株由来のアミノペプチダ
ーゼ前駆体に作用させた。その結果、Ｎ末端プロ領域及
びＣ末端プロ領域をプロセッシングし、天然型アミノペ
プチダーゼと同様な活性型アミノペプチダーゼを生成し
た。

【００６９】（９）まとめ 以上の実施例から、アミノペプチダーゼ前駆体をプロセ
ッシングする酵素は、アエロモナス・カビアエ、ビブリ
オ・プロテオリティカおよびフラボバクテリウム・ブレ
ブ由来のアミノペプチダーゼ前駆体を天然型と同様な活
性を有する活性型アミノペプチダーゼに変換することが
判明した。

【００７０】

【発明の効果】本発明によれば、各種のアミノペプチダ
ーゼ前駆体に作用し、活性型アミノペプチダーゼに変換
する酵素およびその前駆体の遺伝子ならびにその発現系
が提供される。本発明の遺伝子を発現させることによ
り、調味料の製造や脱苦味に有用なアミノペプチダーゼ
の大量生産に供することが可能であり、この酵素は食品
産業等の分野において有用である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> Gene of aminopeptidase precursor processing enzyme, and vector con taining said gene and transformat <130> P111016K <160> 24 <210> 1 <211> 1977 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 1 aaggaaagac aag atg aac aaa gtc tat ttg gcc gtg gta ctg gcc tgc 49 Met Asn Lys Val Tyr Leu Ala Val Val Leu Ala Cys 1 5 10 tgg gga agc gcc gcc atg gcg gca gaa cag gtg gaa gtg aat cag gca 97 Trp Gly Ser Ala Ala Met Ala Ala Glu Gln Val Glu Val Asn Gln Ala 15 20 25 ggg ggg ctg gcg ggt ctc ctg gga gcg ccg agc gcc ggt atc agc acg 145 Gly Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Pro Ser Ala Gly Ile Ser Thr 30 35 40 ctg gcc ggg gat ggc gag ttt cgc cag gta cgg gtc gtc aag ctg ccc 193 Leu Ala Gly Asp Gly Glu Phe Arg Gln Val Arg Val Val Lys Leu Pro 45 50 55 60 aac ggc caa cag cga gtg cgt tat gag cag acc tgg caa ggc atc ccg 241 Asn Gly Gln Gln Arg Val Arg Tyr Glu Gln Thr Trp Gln Gly Ile Pro 65 70 75 gtc tgg ggt cag gta gtg gtg gca gag caa tct ccc acg ggc cag gtc 289 Val Trp Gly Gln Val Val Val Ala Glu Gln Ser Pro Thr Gly Gln Val 80 85 90 aat caa gtc tcc ggc agg gtg ctg cgc cag ata ggc gcc gac gtc gcc 337 Asn Gln Val Ser Gly Arg Val Leu Arg Gln Ile Gly Ala Asp Val Ala 95 100 105 agc ccc acg gcg gcg ctc tcc ccc gcc gac gcc gct ctc aag gcg cgc 385 Ser Pro Thr Ala Ala Leu Ser Pro Ala Asp Ala Ala Leu Lys Ala Arg 110 115 120 gcc ggt gcc aag ggc agc aac gag cag gtc aag ctg ttc gtg ata cag 433 Ala Gly Ala Lys Gly Ser Asn Glu Gln Val Lys Leu Phe Val Ile Gln 125 130 135 140 gac gac gcc ggt cag gcc cgc ctg gtc tat ctg gtc tcc tgg ctg gcg 481 Asp Asp Ala Gly Gln Ala Arg Leu Val Tyr Leu Val Ser Trp Leu Ala 145 150 155 gcg agc gaa cag ccg agc cgt ccc ttc gtc atg atc gat gcc cag agc 529 Ala Ser Glu Gln Pro Ser Arg Pro Phe Val Met Ile Asp Ala Gln Ser 160 165 170 ggc acc gag ctc aag cgc tgg gag ggg att aac cac cag gac gcc acc 577 Gly Thr Glu Leu Lys Arg Trp Glu Gly Ile Asn His Gln Asp Ala Thr 175 180 185 ggc ccg ggt ggc aac ctc aag acc ggc aag tat ttc tac ggc gcg gac 625 Gly Pro Gly Gly Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly Ala Asp 190 195 200 ttc ggc ccg ctg cag gtg gat ggc aac tgc cgc atg agc agc acc aac 673 Phe Gly Pro Leu Gln Val Asp Gly Asn Cys Arg Met Ser Ser Thr Asn 205 210 215 220 gtg gac acc atc aac ctc aac cac gcc acc tcg ggc ggg gcc gtg cac 721 Val Asp Thr Ile Asn Leu Asn His Ala Thr Ser Gly Gly Ala Val His 225 230 235 cag ttc agc tgc ccg gag aac acg gtc aag gag atc aac ggc gcc tac 769 Gln Phe Ser Cys Pro Glu Asn Thr Val Lys Glu Ile Asn Gly Ala Tyr 240 245 250 tcg ccg ctc aac gat gcc cac tac ttc ggc aac gtg gtg ttc gac atg 817 Ser Pro Leu Asn Asp Ala His Tyr Phe Gly Asn Val Val Phe Asp Met 255 260 265 tac cgc aac tgg tac aac acg gcg cca ctg agc ttc aag ctc aag atg 865 Tyr Arg Asn Trp Tyr Asn Thr Ala Pro Leu Ser Phe Lys Leu Lys Met 270 275 280 cgg gtg cac tac agc cgc aac tac gag aac gcc ttc tgg gac ggc agc 913 Arg Val His Tyr Ser Arg Asn Tyr Glu Asn Ala Phe Trp Asp Gly Ser 285 290 295 300 cag atg acc ttc ggt gac ggt gcc acc acc ttc tat ccc ctg gtg agc 961 Gln Met Thr Phe Gly Asp Gly Ala Thr Thr Phe Tyr Pro Leu Val Ser 305 310 315 ctg gac gtg gcg gcc cac gag gtg agc cac ggc ttc acc gag cag aac 1009 Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His Gly Phe Thr Glu Gln Asn 320 325 330 tcg gga ctg gtc tac tcg ggt cag tcg ggc ggc atc aac gag gcc ttc 1057 Ser Gly Leu Val Tyr Ser Gly Gln Ser Gly Gly Ile Asn Glu Ala Phe 335 340 345 tcc gac atg gcg ggg gaa gcg gcc gag aac tac atg aag ggc agc aac 1105 Ser Asp Met Ala Gly Glu Ala Ala Glu Asn Tyr Met Lys Gly Ser Asn 350 355 360 gac tgg ctg gtg ggg gcc cag atc ttc aag ggc aac ggc tcc ctg cgc 1153 Asp Trp Leu Val Gly Ala Gln Ile Phe Lys Gly Asn Gly Ser Leu Arg 365 370 375 380 tac ttc gag gac ccg acc cgg gac ggc agc tcc atc ggc cat gcc agc 1201 Tyr Phe Glu Asp Pro Thr Arg Asp Gly Ser Ser Ile Gly His Ala Ser 385 390 395 gat tac tat gat ggc atc gac gtg cat cac agt tcg ggg gtc tac aac 1249 Asp Tyr Tyr Asp Gly Ile Asp Val His His Ser Ser Gly Val Tyr Asn 400 405 410 cgc gcc ttc tac ctg ctg gcc aac acc agc ggc tgg aat acc cgc aag 1297 Arg Ala Phe Tyr Leu Leu Ala Asn Thr Ser Gly Trp Asn Thr Arg Lys 415 420 425 gcc ttt gag gtg ttc gtg ctg gcc aac cgc ctc tac tgg ggg gcc aac 1345 Ala Phe Glu Val Phe Val Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Ala Asn 430 435 440 acc acc ttc gat cag ggc gcc tgc ggc gtg acc aag gcg gcc acg gat 1393 Thr Thr Phe Asp Gln Gly Ala Cys Gly Val Thr Lys Ala Ala Thr Asp 445 450 455 460 ctg ggc tac agc ctg acc gac gtt gcg gcg gcc ttt acc act gtg ggg 1441 Leu Gly Tyr Ser Leu Thr Asp Val Ala Ala Ala Phe Thr Thr Val Gly 465 470 475 gtc aat gcc tcc tgt ggt ggc acc acg ccg caa ccc ggc agc gtg ctg 1489 Val Asn Ala Ser Cys Gly Gly Thr Thr Pro Gln Pro Gly Ser Val Leu 480 485 490 caa aac ggg gta ccg gtg agc ggt ctc tcc gcc gcc aag ggt ggc aag 1537 Gln Asn Gly Val Pro Val Ser Gly Leu Ser Ala Ala Lys Gly Gly Lys 495 500 505 ctg aac ttc acc atc gag gtt ccc gcc ggc aag agc cag ctg gtg atc 1585 Leu Asn Phe Thr Ile Glu Val Pro Ala Gly Lys Ser Gln Leu Val Ile 510 515 520 gcc agc agc ggc ggc agc ggg gat gcg gat ctc tac gtg aaa ttc ggc 1633 Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Lys Phe Gly 525 530 535 540 tcg gcc ccg acc agc agc agc tat gac tgc cgc cct tac aag agc ggc 1681 Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Tyr Asp Cys Arg Pro Tyr Lys Ser Gly 545 550 555 aac gcc gag acc tgc acc ctg aac gcg ccc aag gcc gga acc tgg cac 1729 Asn Ala Glu Thr Cys Thr Leu Asn Ala Pro Lys Ala Gly Thr Trp His 560 565 570 gtg cag ttg agc ggt ttc agt gcc ttc tcg ggg gtg agc ctc aag gcc 1777 Val Gln Leu Ser Gly Phe Ser Ala Phe Ser Gly Val Ser Leu Lys Ala 575 580 585 agc tac tga tcccgaatgt cagtgaagag agagcgccgg acttgtccgg cgctttttt 1835 Ser Tyr Stop 590 catgcagact tgcccgacca gcgccgggcc agggtgcgcg ccgcctccag cacccgctcc 1895 ttggcgggat tgggccgctt gccgctgcgc caggccatca tctacatccc agtgatccgg 1955 cggcagatcc gtcacatcca gt 1977 <210> 2 <211> 1489 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 2 aaggaaagac aag atg 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tcg ggt cag tcg ggc ggc atc aac gag gcc ttc 1057 Ser Gly Leu Val Tyr Ser Gly Gln Ser Gly Gly Ile Asn Glu Ala Phe 335 340 345 tcc gac atg gcg ggg gaa gcg gcc gag aac tac atg aag ggc agc aac 1105 Ser Asp Met Ala Gly Glu Ala Ala Glu Asn Tyr Met Lys Gly Ser Asn 350 355 360 gac tgg ctg gtg ggg gcc cag atc ttc aag ggc aac ggc tcc ctg cgc 1153 Asp Trp Leu Val Gly Ala Gln Ile Phe Lys Gly Asn Gly Ser Leu Arg 365 370 375 380 tac ttc gag gac ccg acc cgg gac ggc agc tcc atc ggc cat gcc agc 1201 Tyr Phe Glu Asp Pro Thr Arg Asp Gly Ser Ser Ile Gly His Ala Ser 385 390 395 gat tac tat gat ggc atc gac gtg cat cac agt tcg ggg gtc tac aac 1249 Asp Tyr Tyr Asp Gly Ile Asp Val His His Ser Ser Gly Val Tyr Asn 400 405 410 cgc gcc ttc tac ctg ctg gcc aac acc agc ggc tgg aat acc cgc aag 1297 Arg Ala Phe Tyr Leu Leu Ala Asn Thr Ser Gly Trp Asn Thr Arg Lys 415 420 425 gcc ttt gag gtg ttc gtg ctg gcc aac cgc ctc tac tgg ggg gcc aac 1345 Ala Phe Glu Val Phe Val Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Trp Gly Ala Asn 430 435 440 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ggg ggg ctg gcg ggt ctc ctg gga gcg ccg agc gcc ggt atc agc acg 145 Gly Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Ala Pro Ser Ala Gly Ile Ser Thr 30 35 40 ctg gcc ggg gat ggc gag ttt cgc cag gta cgg gtc gtc aag ctg ccc 193 Leu Ala Gly Asp Gly Glu Phe Arg Gln Val Arg Val Val Lys Leu Pro 45 50 55 60 aac ggc caa cag cga gtg cgt tat gag cag acc tgg caa ggc atc ccg 241 Asn Gly Gln Gln Arg Val Arg Tyr Glu Gln Thr Trp Gln Gly Ile Pro 65 70 75 gtc tgg ggt cag gta gtg gtg gca gag caa tct ccc acg ggc cag gtc 289 Val Trp Gly Gln Val Val Val Ala Glu Gln Ser Pro Thr Gly Gln Val 80 85 90 aat caa gtc tcc ggc agg gtg ctg cgc cag ata ggc gcc gac gtc gcc 337 Asn Gln Val Ser Gly Arg Val Leu Arg Gln Ile Gly Ala Asp Val Ala 95 100 105 agc ccc acg gcg gcg ctc tcc ccc gcc gac gcc gct ctc aag gcg cgc 385 Ser Pro Thr Ala Ala Leu Ser Pro Ala Asp Ala Ala Leu Lys Ala Arg 110 115 120 gcc ggt gcc aag ggc agc aac gag cag gtc aag ctg ttc gtg ata cag 433 Ala Gly Ala Lys Gly Ser Asn Glu Gln Val Lys Leu Phe Val Ile Gln 125 130 135 140 gac gac gcc ggt cag gcc cgc ctg gtc tat ctg gtc tcc tgg ctg gcg 481 Asp Asp Ala Gly Gln Ala Arg Leu Val Tyr Leu Val Ser Trp Leu Ala 145 150 155 gcg agc gaa cag ccg agc cgt ccc ttc gtc atg atc gat gcc cag agc 529 Ala Ser Glu Gln Pro Ser Arg Pro Phe Val Met Ile Asp Ala Gln Ser 160 165 170 ggc acc gag ctc aag cgc tgg gag ggg att aac cac cag gac gcc acc 577 Gly Thr Glu Leu Lys Arg Trp Glu Gly Ile Asn His Gln Asp Ala Thr 175 180 185 ggc ccg ggt ggc aac ctc aag acc ggc aag tat ttc tac ggc gcg gac 625 Gly Pro Gly Gly Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly Ala Asp 190 195 200 ttc ggc ccg ctg cag gtg gat ggc aac tgc cgc atg agc agc acc aac 673 Phe Gly Pro Leu Gln Val Asp Gly Asn Cys Arg Met Ser Ser Thr Asn 205 210 215 220 gtg gac acc atc 685 Val Asp Thr Ile <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 19 aaggaaagac aagatgaaca aagtctattt g 31 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 20 actggatgtg acggatctgc cgccg 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 21 cgccgccatg gcggcagaac agg 23 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 22 acataagctt tcagtagctg gccttgaggc tcacc 35 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 23 ccccaagctt tcacacgctg ccgggttgcg gcgtgg 36 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Aeromonas caviae T-64 <400> 24 ggggaccatg gcgcaggacg ccaccggccc gggtg 35

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 韮澤 悟 茨城県つくば市天久保１−８−15タカノ Ｇパレス404号 (72)発明者 中島 芳晃 茨城県つくば市観音台１−38−３サニー ハイツノグチ204 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
   ングする酵素の前駆体をコードし、かつ配列表の配列番
   号１記載の塩基配列を有する遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子を含むプラスミ
   ド。
3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌（ＦＥＲＭＰ−１７１７９）。
4. 【請求項４】 アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
   ングする酵素の前駆体をコードし、かつ配列表の配列番
   号２記載の塩基配列を有する遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項４記載の遺伝子を含むプラスミ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項５記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌。
7. 【請求項７】 アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッシ
   ングする酵素の前駆体をコードし、かつ配列表の配列番
   号３記載の塩基配列を有する遺伝子。
8. 【請求項８】 請求項７記載の遺伝子を含むプラスミ
   ド。
9. 【請求項９】 請求項８記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌。
10. 【請求項１０】 アミノペプチダーゼ前駆体をプロセッ
    シングする酵素をコードし、かつ配列表の配列番号４記
    載の塩基配列を有する遺伝子。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の遺伝子を含むプラス
    ミド。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のプラスミドで形質転
    換された大腸菌。