JP4974891B2 - 新規なエンドリボヌクレアーゼ - Google Patents
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Description
本発明は、遺伝子工学分野において有用な、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに関する。
いくつかの原核生物のプラスミドは、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺すｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ（ＰＳＫ）の機能を有することが報告されている。これらのプラスミドにはトキシン−アンチトキシン遺伝子が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合しトキシンを不活性化しているが、アンチトキシンはプロテアーゼに対して分解されやすく、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解されると安定なトキシンが活性化される（非特許文献１）。このようなトキシンーアンチトキシン遺伝子はほとんどの原核生物のクロモソームにも存在し、さまざまなストレスに対応し、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈの機能を担っている。これらのトキシンの機能はまだすべて明らかになっていないが、ＣｃｄＢおよびＰａｒＥはＤＮＡ ｇｙｒａｓｅをターゲットとして複製を制御し、ＲｅｌＥおよびＤｏｃは転写を制御している可能性が示唆されている（非特許文献１、２）。
大腸菌においては、ＲｅｌＥ、ＣｈｐＡＫ（ＭａｚＦ）、ＣｈｐＢＫ、ＹｏｅＢ、ＹａｆＱの少なくとも５つのトキシンが存在する（非特許文献２）。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎらは、ＲｅｌＥがリボソーム依存的に３塩基の特定のコドンを認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを報告している（非特許文献３、４）。またＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎらは、ＣｈｐＡＫ、ＣｈｐＢＫおよびＹｏｅＢも同様にリボソームおよびコドン依存的にｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを報告している（非特許文献５、６）。
一方、井上らは、ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）は、リボソーム非依存的にＡＣＡの特定の塩基を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している（非特許文献７、８）。また、Ｍｕｎｏｚ−Ｇｏｍｅｚらは、ｍａｚＦのＲＮＡ切断の特異性はＮＡＣであると報告している（非特許文献９）。さらに、井上らは、プラスミドＲ１００に存在するＰｅｍＫがＵＡＨ（ＨはＣ，ＡまたはＵ）の特定の塩基を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している（特許文献１、非特許文献１０）。以上のように、ＲｅｌＥやＰｅｍＫファミリーのトキシンは塩基特異的にｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼである可能性が示唆されてきた。特にＰｅｍＫファミリーのトキシンは、リボソーム非依存的に特定の塩基を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼである可能性がある。ＰｅｍＫファミリーのトキシンは、原核生物に多く存在し、その配列の比較はよく研究されている（非特許文献１、１１）。
また、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎらは、トキシンの遺伝子情報およびゲノム解析が終了した生物の遺伝子情報をもとにＧｅｎｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓを行い、トキシンを系統的に分類し、さらに未知の機能のタンパクについてもトキシン様プロテインを予測した（非特許文献１２）。さらに解析を通して、ＲｅｌＥやＰｅｍＫのみならず、ＤｏｃファミリーおよびＰＩＮドメインを有するタンパクがリボヌクレアーゼ活性を有する可能性を示唆している。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａには５種のＰｅｍＫファミリーのトキシンが見出されている（非特許文献１３）。
核酸を配列特異的に切断する酵素としては、二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素は数多く見出されており、遺伝子工学分野で広く利用されている。一本鎖ＲＮＡを配列特異的に切断する酵素は、Ｇ塩基を特異的に切断するリボヌクレアーゼＴ１が見出されており、遺伝子工学で利用されているが（非特許文献１４）、一本鎖ＲＮＡ内の複数の塩基を認識して特異的に切断する酵素は未だ数少なく、遺伝子工学分野ではそのようなエンドリボヌクレアーゼの開発が望まれている。ＭａｚＦのような３塩基配列あるいはそれ以上の塩基数を特異的に認識して切断するエンドリボヌクレアーゼが発見されれば、遺伝子工学分野で有用な酵素となると考えられる。
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みたものであり、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを見出すことであり、その新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼの切断配列の特異性を同定し、遺伝子工学への利用を提供することにある。
本発明者らは、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼをスクリーニングし、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａのＮＥ１１８１遺伝子にコードされるポリペプチドが新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼであることを見出した。さらに該酵素の切断配列の特異性を同定し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
〔１〕 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
〔２〕 〔１〕のポリペプチドをコードする核酸、
〔３〕 配列表の配列番号２記載の塩基配列を有することを特徴とする〔２〕の核酸、
〔４〕 〔２〕または〔３〕の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
〔５〕 〔２〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ、
〔６〕 〔５〕の組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体、
〔７〕 〔６〕の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より配列特異的なＲＮＡ切断活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕のポリペプチドの製造方法、
〔８〕 一本鎖ＲＮＡに〔１〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡ分解物の製造方法、および
〔９〕 一本鎖ＲＮＡに〔１〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡの分解方法、
に関する。
〔１〕 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
〔２〕 〔１〕のポリペプチドをコードする核酸、
〔３〕 配列表の配列番号２記載の塩基配列を有することを特徴とする〔２〕の核酸、
〔４〕 〔２〕または〔３〕の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
〔５〕 〔２〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ、
〔６〕 〔５〕の組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体、
〔７〕 〔６〕の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より配列特異的なＲＮＡ切断活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕のポリペプチドの製造方法、
〔８〕 一本鎖ＲＮＡに〔１〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡ分解物の製造方法、および
〔９〕 一本鎖ＲＮＡに〔１〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡの分解方法、
に関する。
本発明により、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを見出し、その新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼの切断配列の特異性を同定し、遺伝子工学への利用を提供することが可能となる。
１．本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことを特徴とする。
本発明のポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことを特徴とする。
本発明のポリペプチドが有している活性は、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性であり、構成塩基としてリボヌクレオチドを含有する一本鎖核酸中の、リボヌクレオチドの３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。前記活性により加水分解された核酸は、水酸基を有する３’末端とリン酸基を有する５’末端、リン酸基を有する３’末端と水酸基を有する５’末端、もしくは２’，３’サイクリックホスフェートと水酸基を有する５’末端を生じる。
本発明のポリペプチドの基質としては、少なくとも１分子のリボヌクレオチドを有する核酸であればよく、例えばＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドを含有するＲＮＡ、リボヌクレオチドを含有するＤＮＡ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。前記の基質は、本発明のポリペプチドの作用を阻害しない範囲で通常の核酸中に含有されているものとは異なるヌクレオチド、例えばデオキシイノシン、デオキシウリジン、ヒドロキシメチルデオキシウリジン等を含有していてもよい。
また、本願発明のポリペプチドは一本鎖核酸に特異的に作用する。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド等は切断することができない。
本発明のポリペプチドは核酸をその塩基配列特異的に切断する活性を有することを特徴とする。本発明を特に限定するものではないが、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、一本鎖ＲＮＡ分子中に５’−ＧＡＡＵ−３’または５’−ＡＡＡＵ−３’の配列が存在した場合、当該配列の２番目のＡ残基の５’側または３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解する。この活性は、例えば配列番号５に示される塩基配列のオリゴリボヌクレオチドであるｍａｚＧ１８＿１２を基質とし、前記オリゴリボヌクレオチドの１９番目と２０番目の塩基の間のリン酸ジエステル結合および２４番目と２５番目の塩基の間のリン酸ジエステル結合を加水分解する活性として確認することができる。本発明のポリペプチドのエンドリボヌクレアーゼ活性はリボソームの共存なしに発現されることから、前記活性はリボソーム非依存性である。
本発明のポリペプチドが有する一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性は、例えば一本鎖ＲＮＡを基質として測定することができる。具体的には、ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを鋳型として転写された一本鎖ＲＮＡや化学的に合成した一本鎖ＲＮＡに活性を測定しようとするポリペプチドを作用させ、ＲＮＡの切断が生じるかどうかを調べることで測定することができる。ＲＮＡの分解は、例えば電気泳動（アガロースゲル、アクリルアミドゲル等）により確認することができる。基質とするＲＮＡに適当な標識（例えば放射性同位体、蛍光物質等）を付しておけば電気泳動後の分解産物の検出が容易となる。
本発明のポリペプチドは、配列特異的に一本鎖ＲＮＡを加水分解するエンドリボヌクレアーゼ活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。このような変異を有するポリペプチドとしては、例えば配列番号１記載のポリペプチドに５０％以上のホモロジーを有するポリペプチド、好ましくは７０％以上のホモロジーを有するポリペプチド、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを有するポリペプチドが例示される。これらの変異を有するポリペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列のポリペプチドとは異なる配列を認識、切断するものであっても、本発明に包含される。
さらに、前記のポリペプチドはその活性には必須でないペプチド領域を有していてもよい、例えば翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジン−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるタンパクが付加されたものであっても、一本鎖ＲＮＡ特異的なＲＮＡ切断活性を示す限り本発明のポリペプチドに包含される。
２．本発明のポリペプチドをコードする核酸
本発明は、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。前記核酸としては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上、例えば１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ前記の配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。ここで、配列番号１記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号１記載のポリペプチドに５０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、好ましくは７０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列が例示される。
本発明は、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。前記核酸としては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上、例えば１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ前記の配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。ここで、配列番号１記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号１記載のポリペプチドに５０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、好ましくは７０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列が例示される。
さらに、本発明の核酸は、前記の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を包含する。前記のストリンジェントな条件としては、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｊ． サムブルック（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、０．０１％ 変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、プローブとともに６５℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダイズした核酸は、例えば０．５％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、３７℃で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、例えば下記のような手段により取得することができる。
特定の塩基配列を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＭａｚＦやＰｅｍＫのようなトキシンにアミノ酸配列上でホモロジーを有する遺伝子は、配列特異的なリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の候補である。このような候補遺伝子は、例えば細菌のゲノムより見出すことができる。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａには５種のＰｅｍＫファミリーのトキシンが見出されている。
候補遺伝子は、例えば塩基配列情報を基に設計されたプライマーを用いたＰＣＲにより細菌ゲノムから単離することができる。全塩基配列が既知であればＤＮＡ合成機を用いて候補遺伝子の全配列を合成することもできる。
候補遺伝子からのタンパク発現は、候補遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換した適当な宿主、例えば大腸菌で実施することができる。宿主のＲＮＡを分解する配列特異的リボヌクレアーゼの発現は宿主には致死的である可能性があり、誘導前まで候補遺伝子の発現は厳密に抑制される必要がある。例えば、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターを利用するｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、コールドショック発現制御系ｐＣｏｌｄシステム（タカラバイオ社製）のような発現システムを利用することが好適である。候補遺伝子からの発現産物を簡便に精製するためには、その精製を容易とするために前記のヒスチジン−タグのようなペプチドを発現産物に付加しておくことが有利である。そのためには、発現ベクターとしてこのようなペプチドのコード領域を含むものを使用すればよい。
エンドリボヌクレアーゼの活性の測定は、前記の、一本鎖ＲＮＡを基質とする方法により実施することができる。切断部位は、切断したＲＮＡを鋳型とし、該ＲＮＡに相補的なプライマーと逆転写酵素を用いたプライマー・エクステンションにより同定することができる。前記のプライマー・エクステンションでは切断部位で伸長反応が停止するため、伸長鎖の鎖長を電気泳動により決定すれば切断部位を同定することができる。さらに塩基配列特異性を厳密に同定するには、任意の配列を有するオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成し、候補遺伝子の発現産物を作用させた後、変性アクリルアミドゲル電気泳動等によって切断の有無を判定すればよい。
３．本発明のポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、例えば、（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物からの精製、等の方法により製造することができる。
本発明のポリペプチドは、例えば、（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物からの精製、等の方法により製造することができる。
本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、本発明を特に限定するものではないが、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属に属する細菌が例示される。例えば、Ｎ． ｅｕｒｏｐａｅａ、特に好適にはＮ． ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株より本発明のポリペプチドを取得することができる。前記微生物の培養はその微生物の生育に適した条件で行えばよい。菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法、例えば菌体の破砕、沈殿法（硫安塩析等）による分画、各種のクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー）等、あるいはこれらを組み合わせて精製することができる。
前記の、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。前記の組換えＤＮＡは、好ましくはポリペプチドをコードする核酸の上流に機能的に接続された適切なプロモーターが配置されている。なお、本発明のポリペプチドは宿主に対して致死的な作用を示すことがあるので、前記のプロモーター、ならびにプロモーターを含めた発現システムは本発明のポリペプチドをコードする核酸からの転写を厳密に制御しうるものであることが好ましい。このようなシステムとして、前記のｐＥＴシステム、ｐＣｏｌｄシステムが例示される。
宿主となる細胞へは前記の組換えＤＮＡがそのまま導入されてもよく、適切なベクター、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターに挿入されて導入されてもよい。さらに、前記の組換えＤＮＡが宿主の染色体に組み込まれていても構わない。形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
これらの形質転換体で産生された本発明のポリペプチドは、前記のような精製手法を利用して精製することができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸が、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチドが付加されたポリペプチドをコードするものであった場合には、精製は非常に容易となる。付加されたペプチドに応じた精製手法、例えば、ヒスチジン−タグに対しては金属キレート樹脂を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対してはグルタチオン固定化樹脂を、それぞれ使用することにより、高純度のポリペプチドを簡便な操作で得ることができる。
４．本発明のポリペプチドを用いた一本鎖ＲＮＡの分解
本発明のポリペプチドを用いることにより、一本鎖ＲＮＡを分解し、ＲＮＡ分解物を製造することができる。本発明のポリペプチドは塩基配列特異的にＲＮＡを切断しうることから、生成するＲＮＡ分解物の平均の鎖長は前記ポリペプチドに認識される塩基配列の出現頻度に相関する。すなわち、本発明によりある鎖長分布を有するＲＮＡ分解物が提供される。さらに、その配列特異性を利用してＲＮＡ中の特定の領域を切り出すことも可能である。
本発明のポリペプチドを用いることにより、一本鎖ＲＮＡを分解し、ＲＮＡ分解物を製造することができる。本発明のポリペプチドは塩基配列特異的にＲＮＡを切断しうることから、生成するＲＮＡ分解物の平均の鎖長は前記ポリペプチドに認識される塩基配列の出現頻度に相関する。すなわち、本発明によりある鎖長分布を有するＲＮＡ分解物が提供される。さらに、その配列特異性を利用してＲＮＡ中の特定の領域を切り出すことも可能である。
さらに、本発明のポリペプチドにより一本鎖ＲＮＡを選択的に分解することができる。本発明の一つの態様として、タンパク質合成系、例えば無細胞翻訳系や形質転換体中のｍＲＮＡを本発明のポリペプチドで分解し、タンパク質の合成を阻害することができる。この際、本発明のポリペプチドに認識される塩基配列を含有しないように人為的に作製した、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡを前記の系に存在させておくことにより、当該ｍＲＮＡのみが分解を免れ、系内では所望のタンパク質が特異的に生成される。本態様は、特に高純度のタンパク質の製造に有用である。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．）に記載の方法によった。
実施例１ Ｎ． ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１の単離と発現プラスミドの構築
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１遺伝子について、そこにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列および塩基配列をＮＣＢＩ データベースより入手した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿８４１２３７およびＮＣ＿００４７５７）。ＮＥ１１８１の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域のＤＮＡをＰＣＲで増幅できるように、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ（配列番号３）およびプライマーＮＥ１１８１−Ｒ（配列番号４）をそれぞれ合成した。
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１遺伝子について、そこにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列および塩基配列をＮＣＢＩ データベースより入手した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿８４１２３７およびＮＣ＿００４７５７）。ＮＥ１１８１の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域のＤＮＡをＰＣＲで増幅できるように、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ（配列番号３）およびプライマーＮＥ１１８１−Ｒ（配列番号４）をそれぞれ合成した。
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株のゲノムＤＮＡはＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣ Ｎｏ． １９７１８Ｄ）。
５０ｎｇのＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株ゲノムＤＮＡ、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ およびＮＥ１１８１−Ｒを使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを実施して３６２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してアガロース電気泳動に供し、泳動後のゲルより３４１ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたｐＥＴ２１ａベクター（ノバジェン社製）に上記の３４１ｂｐのＤＮＡ断片を接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメーションした。こうして得られた形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１と命名した。
５０ｎｇのＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株ゲノムＤＮＡ、プライマーＮＥ１１８１−Ｆ およびＮＥ１１８１−Ｒを使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを実施して３６２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してアガロース電気泳動に供し、泳動後のゲルより３４１ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化しておいたｐＥＴ２１ａベクター（ノバジェン社製）に上記の３４１ｂｐのＤＮＡ断片を接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメーションした。こうして得られた形質転換体のコロニーよりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１と命名した。
発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１に挿入されたＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１ポリペプチドをコードする塩基配列を配列番号２に、該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１にそれぞれ示す。なお、前記の発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１によれば配列番号１のアミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端に６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸残基からなるヒスチジン−タグが付加されたポリペプチドが発現される。
実施例２ Ｎ． ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７１８株由来ＮＥ１１８１ポリペプチドの調製
実施例１で得られた発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）をトランスフォーメーションし、発現用大腸菌ｐＥＴ−ＮＥ１１８１／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。前記の大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で培養し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６になったところで、ＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を最終濃度１ｍＭになるように加えてポリペプチドの発現を誘導した。誘導開始後２時間後に培養を終了し、菌体を遠心分離により回収した。菌体を３００μｌのリシスバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波破砕機（Ｈａｎｄｙ ｓｏｎｉｃ、トミー社製）を用いて菌体を破砕した。遠心分離により回収した上清に２０μｌのＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）を加え、４℃、３０分間放置した。遠心分離して回収した沈澱を１００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。洗浄後の沈殿に２０μｌの溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、遠心して上清を回収した。同じ溶出操作をさらに２回繰り返し、合計６０μｌのＮＥ１１８１ポリペプチドを含む試料を得た。この試料の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して予想されるサイズのポリペプチドが含有されていることを確認した。また、試料中のＮＥ１１８１タンパク濃度は約２５ｎｇ／μｌであった。
実施例１で得られた発現ベクターｐＥＴ−ＮＥ１１８１で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）をトランスフォーメーションし、発現用大腸菌ｐＥＴ−ＮＥ１１８１／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。前記の大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で培養し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６になったところで、ＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を最終濃度１ｍＭになるように加えてポリペプチドの発現を誘導した。誘導開始後２時間後に培養を終了し、菌体を遠心分離により回収した。菌体を３００μｌのリシスバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波破砕機（Ｈａｎｄｙ ｓｏｎｉｃ、トミー社製）を用いて菌体を破砕した。遠心分離により回収した上清に２０μｌのＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）を加え、４℃、３０分間放置した。遠心分離して回収した沈澱を１００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。洗浄後の沈殿に２０μｌの溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、遠心して上清を回収した。同じ溶出操作をさらに２回繰り返し、合計６０μｌのＮＥ１１８１ポリペプチドを含む試料を得た。この試料の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して予想されるサイズのポリペプチドが含有されていることを確認した。また、試料中のＮＥ１１８１タンパク濃度は約２５ｎｇ／μｌであった。
実施例３ オリゴリボヌクレオチドを基質としたＮＥ１１８１ポリペプチドの塩基配列特異性の同定
実施例２で得られたＮＥ１１８１ポリペプチドのリボヌクレアーゼ活性の塩基配列特異性を調べるために、オリゴリボヌクレオチドを合成し、切断アッセイを行った。
実施例２で得られたＮＥ１１８１ポリペプチドのリボヌクレアーゼ活性の塩基配列特異性を調べるために、オリゴリボヌクレオチドを合成し、切断アッセイを行った。
基質として、配列番号５〜１４に示したオリゴリボヌクレオチド１０種を合成した。１０μＭ オリゴリボヌクレオチド、５ｎｇ／μｌの実施例２で得たＮＥ１１８１ポリペプチド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）からなる５μｌの反応液を３７℃、３０分間インキュベートした。反応物を２０％変性アクリルアミドゲル（２０％アクリルアミド、７Ｍ尿素、０．５×ＴＢＥバッファー）電気泳動に供し、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯＩＩ Ｍｕｌｔｉｖｉｅｗ（タカラバイオ社製）を用いて、蛍光画像を解析した。各オリゴリボヌクレオチドの切断の状況を表１に示す。
切断の状況は完全切断を＋＋＋、部分切断を＋＋、ごく弱い切断を＋、完全未分解を−で示した。さらに、それぞれのオリゴリボヌクレオチドの切断の有無および切断の強さから、切断部位周辺の塩基配列を比較し、配列の特異性を評価した。この結果を表２に示す。
切断の状況は完全切断を＋＋＋、部分切断を＋＋、ごく弱い切断を＋、完全未分解を−で示した。さらに、それぞれのオリゴリボヌクレオチドの切断の有無および切断の強さから、切断部位周辺の塩基配列を比較し、配列の特異性を評価した。この結果を表２に示す。
以上の結果から、ＮＥ１１８１ポリペプチドは、５’−ＧＡ／ＡＵ−３’、５’−Ｇ／ＡＡＵ−３’、５’−ＡＡ／ＡＵ−３’または５’−Ａ／ＡＡＵ−３’の配列（／は切断部位を示す）を優先的に認識してＲＮＡを切断することが明らかになった。ＮＥ１１８１ポリペプチドは、ＭａｚＦとは全く異なる塩基配列特異性を有するエンドリボヌクレアーゼであることが明らかになった。
本発明により、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが提供される。前記酵素はＲＮＡ中の特定の配列を認識して切断することができることから、ＲＮＡ分子の解析、ＲＮＡ断片の作成、細胞内でのＲＮＡ切断を介した細胞の制御（例えばタンパク質生成の阻害）等に有用である。
SEQ ID NO:3; PCR primer NE1181-F to amplify a DNA fragment encoding NE1181 protein.
SEQ ID NO:4; PCR primer NE1181-R to amplify a DNA fragment encoding NE1181 protein.
SEQ ID NO:5; Oligoribonucleotide mazG18_12.
SEQ ID NO:6; Oligoribonucleotide MRI011.
SEQ ID NO:7; Oligoribonucleotide ABC005.
SEQ ID NO:8; Oligoribonucleotide MRI020.
SEQ ID NO:9; Oligoribonucleotide MRI026.
SEQ ID NO:10; Oligoribonucleotide MRI028.
SEQ ID NO:11; Oligoribonucleotide ABC018.
SEQ ID NO:12; Oligoribonucleotide MRI024.
SEQ ID NO:13; Oligoribonucleotide MRI013.
SEQ ID NO:14; Oligoribonucleotide ABC019.
SEQ ID NO:4; PCR primer NE1181-R to amplify a DNA fragment encoding NE1181 protein.
SEQ ID NO:5; Oligoribonucleotide mazG18_12.
SEQ ID NO:6; Oligoribonucleotide MRI011.
SEQ ID NO:7; Oligoribonucleotide ABC005.
SEQ ID NO:8; Oligoribonucleotide MRI020.
SEQ ID NO:9; Oligoribonucleotide MRI026.
SEQ ID NO:10; Oligoribonucleotide MRI028.
SEQ ID NO:11; Oligoribonucleotide ABC018.
SEQ ID NO:12; Oligoribonucleotide MRI024.
SEQ ID NO:13; Oligoribonucleotide MRI013.
SEQ ID NO:14; Oligoribonucleotide ABC019.
Claims (3)
- 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ５’−ＧＡＡＵ−３’または５’−ＡＡＡＵ−３’配列の２番目のＡ残基の５’側または３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを、５’−ＧＡＡＵ−３’または５’−ＡＡＡＵ−３’配列を有する一本鎖ＲＮＡに作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡ分解物の製造方法。
- 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、または該配列において１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、かつ５’−ＧＡＡＵ−３’または５’−ＡＡＡＵ−３’配列の２番目のＡ残基の５’側または３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを、５’−ＧＡＡＵ−３’または５’−ＡＡＡＵ−３’配列を有する一本鎖ＲＮＡに作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖ＲＮＡの分解方法。
- 請求項２記載の方法でｍＲＮＡを分解する工程を包含する、タンパク質の合成の阻害方法。
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