JP2019170225A - エンドリボヌクレアーゼ、およびその阻害物質 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第一は、RNAに含まれる5’−UGG−3’配列を認識し、当該配列の1番目の残基の3’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼである。
本発明の第二は、前記エンドリボヌクレアーゼと結合し、前記エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する、阻害物質である。
本発明で使用するエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸としては、’820遺伝子、すなわちネイティブMazFのDNA配列(配列番号1)で特定される核酸、または該配列、すなわち配列番号1の開始コドンGTGから終止コドンTGAにおいて1〜100個、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらに好ましくは1〜30個、特に好ましくは1〜15個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するDNAを含む核酸である。
ここで、配列番号1記載のDNA配列において、1〜100個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するDNAを含む核酸としては、クエリー配列が核酸で、それをアミノ酸配列に翻訳してから、タンパク質データベースに対して相同性検索を行うアルゴリズム、例えばBLASTXアルゴリズムで相同性を比較した場合に、配列番号1記載のDNA配列がコードするポリペプチドに50〜100%のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするDNA配列、好ましくは70〜100%の、特に好ましくは90〜100%の、特には95〜100%のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするDNA配列が例示される。
本発明の阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸としては、’825遺伝子、すなわちネイティブMazEのDNA配列(配列番号4)で特定される核酸であってもよく、または該配列、すなわち配列番号4の開始コドンATGから終止コドンTGAにおいて1〜100個、好ましくは1〜70個、より好ましくは1〜45個、さらに好ましくは1〜20個、特に好ましくは1〜10個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するDNAを含む核酸である。
ここで、配列番号4記載のDNA配列において、1〜100個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するDNAを含む核酸としては、クエリー配列が核酸で、それをアミノ酸配列に翻訳してから、タンパク質データベースに対して相同性検索を行うアルゴリズム、例えばBLASTXアルゴリズムで相同性を比較した場合に、配列番号4記載のDNA配列がコードするポリペプチドに50〜100%のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするDNA配列、好ましくは70〜100%の、特に好ましくは90〜100%の、特には95〜100%のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするDNA配列が例示される。
本発明のエンドリボヌクレアーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性は、例えば人工的に合成したRNAに本発明のエンドリボヌクレアーゼを作用させ、より小分子の分解物を生成するかを確認することで評価することができる。エンドリボヌクレアーゼとして作用する場合、RNAの認識配列や切断位置などは、非特許文献2に記載される超並列的シークエンシング解析などを利用して確認することができる。
本発明では、RNAを基質として、エンドリボヌクレアーゼを作用させてRNA分解物を製造する。基質のRNAとしては、塩基構成としてリボヌクレオチドを含有する核酸であり、リボヌクレオチドの3’側のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。本発明のエンドリボヌクレアーゼの基質としては、少なくとも1分子のリボヌクレオチドを有する核酸であればよく、例えばRNA、デオキシリボヌクレオチドを含有するRNA、リボヌクレオチドを含有するDNA等が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明のエンドリボヌクレアーゼの作用を阻害しない範囲で通常の核酸中に含有されているものとは異なるヌクレオチド、例えばデオキシイノシン、デオキシウリジン、ヒドロキシメチルデオキシウリジン等を含有していてもよい。
本発明のエンドリボヌクレアーゼの阻害物質の探索方法は、一本鎖RNAに本発明のエンドリボヌクレアーゼを作用させてRNAを分解し、この反応系にポリペプチドXを添加して前記エンドリボヌクレアーゼと結合させ、前記エンドリボヌクレアーゼによるRNAの分解反応が抑制された場合に、このポリペプチドXを前記エンドリボヌクレアーゼの阻害物質と評価することを特徴とする。
微生物のTA機構を構成するトキシンには、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するものが多く、TA機構の解析は、新たなエンドリボヌクレアーゼ開発の一助となる。特に、新たな活性を有するトキシンを見出した場合に、対応するアンチトキシンを見出すことができれば、前記トキシンに対する阻害物質として使用することができる。本発明では、エンドリボヌクレアーゼの活性を阻害する物質として上記した阻害物質が存在するが、これ以外にエンドリボヌクレアーゼの作用を抑制する物質が存在する可能性がある。このような阻害物質は、エンドリボヌクレアーゼとの新たな組み合わせとなる。具体的には、本発明のエンドリボヌクレアーゼを、配列が明確な合成RNAに作用させ、RNA分解量や分解速度などのエンドリボヌクレアーゼ活性を評価する。次いで、評価対象ペプチドであるポリペプチドXを前記反応系に添加する。ポリペプチドXがエンドリボヌクレアーゼに対して何らかの相互作用を発揮すると、エンドリボヌクレアーゼによるRNA分解量や分解速度などが変動する。このような変動を観察することで、ポリペプチドXが本発明のエンドリボヌクレアーゼの阻害物質であるかを評価することができる。ポリペプチドXが阻害物質である場合には、RNA分解活性が抑制される。
本発明のエンドリボヌクレアーゼを、プラスミドベクター、ウイルスベクター、その他の環状ベクターを用いて原核細胞や真核細胞で発現させると、RNAの5’−UGG−3’配列が切断される。したがって、当該配列を含む転写産物は本発明のエンドリボヌクレアーゼにより分解され、その翻訳が阻害されるため細胞の増殖を制御することができる。また、翻訳阻害の結果、細胞の増殖抑制、場合によっては細胞死を誘起することができる。阻害物質を同様の手法を用いて共発現させた際は、トキシンエンドリボヌクレアーゼとアンチトキシンが結合して複合体を形成することでトキシンの作用が抑制され、細胞の増殖抑制を制御することが出来る。
配列番号1のDNA配列において対応するアミノ酸を変えずにトリプレットを変更し、5’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、3’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、ヒスチジンタグ用コドン等を付加した配列番号7を設計し、その遺伝子合成と発現ベクターpET24aへの挿入をGenscript社に依頼した。このようにして入手した配列番号7が組み込まれた発現用プラスミドpET24aを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
配列番号4のDNA配列において対応するアミノ酸を変えずにトリプレットを変更し、5’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、3’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、ヒスチジンタグ用コドン等を付加した配列番号8を設計し、その遺伝子合成と発現ベクターpET24aへの挿入をGenscript社に依頼した。このようにして入手した配列番号8が組み込まれた発現用プラスミドpET24aを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
基質として、配列番号9に示す人工RNA(500−2)を調製し、100ngの人工RNA(500−2)、1pmolの実施例1で調製したエンドリボヌクレアーゼMazF、MazFリアクションバッファー(20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM ジチオトレイトール、0.01%(v/v) Triton X-100、Recombinant Rnase Inhibitor(TAKARA) 4U)を含む反応液を、37℃で90分間インキュベートした。また、エンドリボヌクレアーゼMazFの添加量1pmolを、3pmol、10pmolに代えて同様に操作した。更に、エンドリボヌクレアーゼMazF添加量を1pmolから10pmolに代え、更に実施例2で調製した阻害物質MazE50pmolを添加して同様に操作した。反応後RNAを精製し、95℃で5分間熱変性を行い、10%変性アクリルアミドゲル(10%アクリルアミド、1×TBE、7M 尿素、0.05%(w/v)過硫酸アンモニウム、0.1%(v/v)N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン)に供した。電気泳動後にRNAをSYBR Goldで染色し、バリアブルイメージアナライザー(GEヘルスケア製:Typhoon 9210イメージャー)にて蛍光画像を取得し、解析を行った。結果を図3に示す。人工RNA(500−2)は、エンドリボヌクレアーゼの添加量に依存して切断されることが確認された。また、エンドリボヌクレアーゼMazFに阻害物質MazEを添加すると人工RNA(500−2)の分解物が検出されず、エンドリボヌクレアーゼMazFによるRNA切断活性が阻害物質MazEによって抑制されることが確認された。
配列番号10〜配列番号14で示す配列既知の人工RNA(1000−1:配列番号10)、人工RNA(1000−2:配列番号11)、人工RNA(1000−3:配列番号12)、人工RNA(1000−4:配列番号13)、人工RNA(1000−5:配列番号14)を調製した。上記人工RNA1000−1、1000−2、1000−3、1000−4、1000−5を1pmolずつ混合して基質とした。
MazFリアクションバッファーに上記基質と50ngの実施例1で調製したエンドリボヌクレアーゼMazFを加え、37℃で30分間インキュベートした。得られたRNA分解物を精製キット(ザイモリサーチ製、RNA Clean & Concentrator)を用いて精製して精製RNA分解物を得た。これを、1mMのATPと20UのT4ポリヌクレオチドキナーゼを含むT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー中で37℃、1時間インキュベートし、RNA分解物の5’末端にATPのγ位のリン酸基を添加した。このリン酸基付加RNA分解物を精製キット(ザイモリサーチ製、RNA Clean & Concentrator)を用いて精製した。次いで、精製されたリン酸基付加RNA分解物を、50UのT4RNAリガーゼと125pmolのバーコードRNA(配列番号15)と共に、T4RNAリガーゼバッファー中において、15℃で18時間インキュベートした。次いで、得られたバーコード付加RNA分解物を精製キット(ザイモリサーチ製、RNA Clean & Concentrator)を用いて精製した。NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illuminaプロトコル(ニューイングランドバイオラブス)に従ってバーコード付加RNA分解物をcDNAに逆転写した。逆転写産物に対して、末端修復、アダプターライゲーション、エンリッチメントPCRを行い、ライブラリーを調製した。このライブラリーを次世代シーケンサー(Illumina社製、MiSeq 500 cycles reagent kit v2)を使用して、超並列的シークエンシング解析を行った。得られた配列情報を基に、CLC Genomics Workbenchを用いて切断箇所周辺の配列を解析した。得られたリードをリファレンスシーケンスにマッピングし、カバーレッジが上昇した塩基を同定した。これら塩基の周辺配列を抽出し、各ポジションにおける塩基の出現頻度をWeblogoにより可視化した結果、図4に示した通り、本エンドリボヌクレアーゼMazFの認識・切断配列が、5’−U/GG−3’であることが判明した。
表1に示すDNA/RNAのキメラ配列の5’末端に6−carboxyfluorescein(6−FAM)を、3’末端にBlack Hole Quencher(登録商標)1(BHQ−1)を付加した4種類の短鎖オリゴヌクレオチドを使用した。MazFリアクションバッファーに20pmolのDR−13−UGG(配列番号16)と0.568pmolの実施例1で調製したエンドリボヌクレアーゼMazFとを加えた反応液を調製し、トータル20μLとした。比較のために、エンドリボヌクレアーゼMazFに代えて一本鎖RNAのピリミジン残基を切断するリボヌクレアーゼA(ノバジェン製)を加えた反応液、エンドリボヌクレアーゼMazFと共に2.84pmolの実施例2で調製した阻害物質MazEを加えた反応液、エンドリボヌクレアーゼMazFに代えて阻害物質MazEのみを加えた反応液、およびエンドリボヌクレアーゼMazFに代えて同量のバッファーを添加した反応液を調製した。これらの反応液をLight cycler 480(ロシュ製)を用いて、37℃で60分間蛍光強度を測定した。結果を図5(A)に示す。6−FAMは、BHQ−1との距離が長くなると蛍光強度が増加する。図5(A)に示すように、エンドリボヌクレアーゼMazFの添加によって蛍光強度が上昇し、DR−13−UGGに含まれるUGG配列がエンドリボヌクレアーゼMazFによって開裂したことが確認された。また、この蛍光強度の増加は、阻害物質MazEの添加によって抑制されることも確認された。したがって、阻害物質MazEは、エンドリボヌクレアーゼMazFのエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害するタンパクであることが証明された。
実施例1で調製したエンドリボヌクレアーゼMazFは、DR−13−UGC、DR−13−UGU、DR−13−UGAを基質とした場合には、蛍光強度の増加が観察されなかった。このことは、エンドリボヌクレアーゼMazFが、RNA中の、5’−UGG−3’配列を特異的に認識し切断するが、5’−UGC−3’配列、5’−UGU−3’配列、5’−UGA−3’配列を強く切断するものではないことを示す。
Claims (11)
- 配列番号2記載のアミノ酸配列、または該配列において0〜10個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するアミノ酸配列で示され、RNAに含まれる5’−UGG−3’配列を認識し、当該配列の1番目の残基の3’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼ。
- 配列番号3記載のアミノ酸配列で示されることを特徴とする、請求項1記載のエンドリボヌクレアーゼ。
- 配列番号1記載のDNA配列において0〜100個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有し、かつ配列番号1記載のDNA配列がコードするポリペプチドと50〜100%のホモロジーを有する、請求項1または請求項2記載のエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸。
- 請求項1または請求項2記載のエンドリボヌクレアーゼと結合し、エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する、阻害物質。
- 配列番号5記載のアミノ酸配列、または該配列において0〜7個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するアミノ酸配列で示されることを特徴とする、請求項4記載の阻害物質。
- 配列番号6記載のアミノ酸配列で示される、請求項5記載の阻害物質。
- 配列番号4記載のDNA配列において0〜100個のDNA塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有し、かつ配列番号4記載のDNA配列がコードするポリペプチドと50〜100%のホモロジーを有する、請求項4または請求項5記載の阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸。
- 一本鎖RNAに請求項1または請求項2記載のエンドリボヌクレアーゼを作用させてRNAを分解することを特徴とする、RNA分解物の製造方法。
- 前記エンドリボヌクレアーゼに、請求項4または請求項5記載の阻害物質を結合させて前記RNA分解を停止することを特徴とする、請求項8記載のRNA分解物の製造方法。
- 請求項1または請求項2記載のエンドリボヌクレアーゼを、環状ベクターを用いて原核細胞および/または真核細胞で発現させ、前記エンドリボヌクレアーゼによる細胞内RNA分解反応を促進させ、細胞の増殖を阻害することを特徴とする、細胞制御方法。
- 請求項1または請求項2記載のエンドリボヌクレアーゼおよび請求項4または請求項5記載の阻害物質を、環状ベクターを用いて原核細胞および/または真核細胞で共に発現させ、細胞の増殖阻害を停止することを特徴とする、細胞制御方法。
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WO2005074986A2 (en) * | 2004-02-10 | 2005-08-18 | Genobiotix Aps | Bioactive species capable of interfering with a microbial toxin-antitoxin complex and methods for evaluation and use of said bioactive species |
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CHAIN P., ET AL., 'CONSERVED HYPOTHETICAL PROTEIN [NITROSOMONAS EUROPAEA ATCC 19718]', GENBANK [ONLI, JPN6021051458, ISSN: 0004672322 * |
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