JP2004298189A - フマル酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの1種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種7(JCM10545)の遺伝子配列から、フマル酸ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。
【選択図】 図1
Description
Biochemistry, 1992 Oct 27;31(42):10331-7 Biotechnol.Prog.2002,May-Jun;18(3):445-50 Advances in Protetin Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996) Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44 Kawarabayashi,Y. et al., "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7", DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobustokodaii(JCM10545))をL培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、SSC溶液 (0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム)10mL、0.5M EDTA、100mg/ml ニワトリ卵白リゾチーム 0.1mLおよび10%非イオン性界面活性剤Brij-58を0.5mL加え、0℃で30分間放置した後、プロテイナーゼK(Merck社製)5mgを10%SDS 0.2mLに溶かした溶液を加え、37℃で2、3日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、37℃で1時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてDNAを沈殿濃縮した。このDNAの沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0))10mLに溶解し、リボヌクレアーゼ0.25mL(最終濃度0.25mg/mL)を加えて、37℃で一晩放置した後、へエタノールで沈殿させた。次いで、DNAをTE溶液5mLに溶解した後、260nmの吸光度より、DNA濃度を決定した(Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408)。
1.発現プラスミドの構築
耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素BamHI、NotIサイトを含むDNAを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたPCRで耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。用いたDNAポリメラーゼはKOD-plus-(東洋紡社製)であった。
Forward primer(配列番号3):5'-TGATGAAATATACCGAAACTGCACCAAAACTT-3'
Reverse primer(配列番号4):5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTATTTTGCAGGAAAACCTGG-3'
PCR反応後、増幅断片を制限酵素BamHIで切断し、その遺伝子断片を精製した。pET-11a(Novagen社製)を制限酵素NdeIで切断し、Klenow fragmentで末端を平滑化した後,制限酵素BamHIでさらに切断したものを精製し、上記の構造遺伝子とT4リガーゼで15℃、30分間反応させ連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地(18mL)で24時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は,BigDye Terminator kit(登録商標:Applied Biosystems社製)とABI PRISM 3700 DNA Analyzer(登録商標:Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。
大腸菌 Rosetta-gami(DE3)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移した。その中に上記1.の精製発現プラスミドの溶液0.002mLを加え氷中に20分間放置した後、42℃でヒートショックを90秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地(5mL)で18時間培養し、耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離(13,000G、10分)で集菌した。
実施例2と同様にして調製したプラスミドDNA(pET−11aベクター) を用いて、大腸菌DH5α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌DH5αからアルカリSDS法を用いてプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ(Rosetta-Gami)(DE3)株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを3白金耳量とり、5mLのLBL培地(1%ペプトン、0.5%酵母抽出液、0.5%NaCl、0.1%ラクトース、50μg/mLアンピシリン、40μg/mLクロラムフェニコール)に植菌して、培養開始直前まで約6時間、37℃で前培養した。この前培養液を全量、3Lの4×LBL培地(4%ペプトン、2%酵母抽出液、 2%NaCl、50μg/mLアンピシリン)に加え、高密度培養槽(ABLE社製)にて37℃、pH7.2、圧力0.02Paでコンピュータプログラム制御し、培養した。pHは、オートクレーブ済みの2M HCl(和光純薬社製)および2M NaOH(和光純薬社製)で調整した。集菌約25時間前にオートクレーブ済みの300mL発現誘導液(10%ラクトース、20%グリセロール)を加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ(培養開始48時間後)で大型遠心分離機(Beckman社製AvantiHP-30I)を用い集菌した。回収した菌体は、−30℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8)、5mM β-メルカプトエタノール(和光純薬社製)に溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕した。この溶液を2等分し、一方を9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製DryThermounit DTU-1C)で10分間、加熱した後、9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら4種の上清および沈殿(沈殿は、菌体破砕液にて再縣濁)に変性剤(62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、10%グリセロール、2%SDS、2.4%β−メルカプトエタノール、0.005% ブロムフェノールブルー(和光純薬社製))を加え、95℃で5分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を12.5%または15%(発現させるタンパク質の分子量により異なる)ポリアクリルアミドゲルに加え、SDS−PAGEにて電気泳動を行った。染色液(Quick-CBB、和光純薬社製)を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
実施例3において、−30℃で保存してあった菌体を、150mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8)、5mM β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕し、75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製、DryThermoUnit DTU-1C)で10分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機(Beckman社製Avanti HP-30I)を用いて、100,000Gで1時間、遠心分離し、上清を回収した。
1.測定方法
実施例4の精製タンパク質のフマル酸ヒドラターゼ活性を、下記の種々の条件下、L−リンゴ酸(Sodium L(-1)-Malate、和光純薬社製)からL−フマル酸への変換による240nmの吸光度の減少をU-3000 分光光度計(HITACHI社製)によってモニターすることで測定した。反応は、基質(L−リンゴ酸:濃度は後述)と、100mMのKClと、500nMの実施例4の精製タンパク質とを含む50mMの緩衝溶液(後述のとおり、測定によって種類が異なる)中において、得られた240nmの吸光度の減少量から、反応により分解されたリンゴ酸の濃度を求めた。濃度の計算には、各温度でのL−リンゴ酸のモル吸光係数を用いた。なお、反応は、実施例4で精製したタンパク質を溶液に加えることで開始した。
25、50、70、80、85、95℃の各温度での基質濃度−初速度v0プロットを作成した。基質濃度0.1、0.2、0.5、1、3、5、7、10mMで測定を行った。反応は、緩衝溶液には、95℃では50mM グリシン−NaOH(pH7.5)、95℃以外では50mMTris−HCl(pH=7.5)を用いた。反応時間は、25、50℃では20秒、それ以外の温度では10秒とした。図2に、作成した各温度での基質濃度−初速度v0プロットのグラフを示す。活性は80〜85℃で最大となった。なお、測定時間範囲内では、どの反応温度においても基質の自然分解は観測されなかった。
前記各温度での測定の際のKM、Vmaxおよびkcatを、表1に示す。
前記各温度での測定の際のkcatを、図3のグラフに示す。図示のとおり、80〜85℃で最大の活性を示した。
pH3.96、5.16、5.64、6.32、6.84、7.69、7.9、8.5の各条件で、前記測定を行った。緩衝溶液には、pH3.96、5.14、5.64ではMES−HClを、pH6.32、6.84、7.69ではTris−HClを、pH7.9、8.5ではグリシン−HClを用いた。反応温度は85℃、反応時間は10秒、基質濃度は10mMとした。測定結果を、図4のグラフに示す。図示のとおり、pH6.5〜8.5の範囲で一定の活性が認められ、至適pHが8程度であることが分かった。
前記測定に先立ち、実施例4において精製したタンパク質溶液を、80℃および90℃で、0.5、1、1.5、2、2.5、3時間前処理した。前記前処理物を用いて前記測定を行い、kappを求めた。反応温度は80℃、反応時間10秒、基質濃度は10mMとした。なお、前処理時間0時間は、前処理を行っていないものである。測定結果を、図5のグラフに示す。図示のとおり、80℃で前処理したものは、3時間処理したものでも活性を保持していたが、90℃で前処理したものでは、徐々に活性を失っていくことが分かった。
配列番号2:耐熱性フマル酸ヒドラターゼの塩基配列
配列番号3:耐熱性フマル酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位BamHIおよびNotIを導入するための順方向プライマーを示す。
配列番号4:耐熱性フマル酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位BamHIおよびNotIを導入するための逆方向プライマーを示す。
配列番号5:N末端アミノ酸配列
Claims (11)
- 下記の(a)または(b)の耐熱性タンパク質。
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 前記フマル酸ヒドラターゼ活性が、フマル酸を可逆的に加水分解してL−リンゴ酸を生成する機能である請求項1記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌由来である請求項1または2記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii) (JCM10545)である請求項3記載のタンパク質。
- 請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNAまたは配列番号2に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項5記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項6記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
- 酵素反応により、フマル酸を可逆的に加水分解してL−リンゴ酸を製造する方法であって、前記酵素として請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度80〜85℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
- 酵素反応により、L−リンゴ酸を可逆的に加水分解してフマル酸を製造する方法であって、前記酵素として請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度80〜85℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
- 前記酵素反応のpHが、pH6.5〜8.5の範囲である請求項8または9記載の製造方法。
- 一定時間酵素反応を行った後、温度を90℃以上にして前記酵素反応を停止させる請求項8から10のいずれかに記載の製造方法。
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