JP2005296009A

JP2005296009A - クエン酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質

Info

Publication number: JP2005296009A
Application number: JP2005080333A
Authority: JP
Inventors: Shigenori Kuramitsu; 成紀倉光; Ryoji Masui; 良治増井
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: University of Osaka NUC
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2005-10-27

Abstract

【課題】クエン酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。
【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、クエン酸シンターゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列から、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。図１は、前記タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【選択図】図１

Description

本発明は、クエン酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託の成果に係る出願である。

クエン酸シンターゼは、水およびアセチル補酵素Ａの存在下、オキサロ酢酸に作用し、クエン酸と補酵素Ａとを生成する反応を触媒する機能を有する酵素であり、クエン酸回路におけるクエン酸生成の最終反応に関与する酵素である。また、クエン酸シンターゼの工業的利用も提案されている（例えば、特許文献１参照）。クエン酸シンターゼとしては、様々の生物由来のものが知られているが、その中で、耐熱性菌由来のものも知られている。前記耐熱性菌としては、超好熱性古細菌（hyperthermophlic archaeum）に属する菌である、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）と、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）とがあり、これらの菌由来のクエン酸シンターゼが知られている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。このような耐熱性菌由来のクエン酸シンターゼは、工業的用途を広げるものと期待されているが、前記２種類の菌由来のものだけでは、未だ不十分である。

他方、前記の菌以外の超好熱性古細菌（例えば、非特許文献３参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）（例えば、非特許文献４参照）は、その遺伝子が既に解析されている（例えば、非特許文献５参照）。したがって、この超好熱古細菌が、クエン酸シンターゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想され、これによって工業的用途さらに広がる可能性がある。
特表２００２−５０８５１９号公報 Journal of Molecular Biology, 304(4), 657-668, 2000 Biochemistry, 39(9), 2283-2296, 2000 Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996) Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44 Kawarabayashi,Y. et al., "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7", DNA Res. 8(4), 123-140 (2001)

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、クエン酸シンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。

前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、クエン酸シンターゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、クエン酸シンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。

すなわち、本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、クエン酸シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。

なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。

スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。

本発明のタンパク質の酵素反応の温度条件は、好ましくは、５５〜９５℃の範囲であり、より好ましくは、６５〜８５℃の範囲である。

前記クエン酸シンターゼ活性は、水およびアセチル補酵素Ａの存在下、オキサロ酢酸に作用し、クエン酸と補酵素Ａとを生成する機能である。

前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii)（ＪＣＭ１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。

つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。

つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。

つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。

つぎに、本発明の製造方法は、酵素反応により、オキサロ酢酸、アセチル補酵素Ａおよび水からクエン酸および補酵素Ａを製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度５５〜９５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。なお、前記温度条件は、６５〜８５℃の範囲であることがより好ましい。このように、前記本発明のタンパク質を用いれば、温度５５〜９５℃の高温領域で酵素反応を実施でき、この結果、工業的な用途が広がる。なお、この製造方法において、前記酵素反応のｐＨは、ｐＨ７以上の範囲が好ましい。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列からクエン酸シンターゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りとおりであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の耐熱性タンパク質は、クエン酸シンターゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ以上若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。

本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。

本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii)（ＪＣＭ１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。

本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。

ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。

前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。

本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。

染色体ＤＮＡの調製
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii（ＪＣＭ１０５４５））をＬ培地中で３７℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）１０ｍＬ、０．５ＭＥＤＴＡ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを１０％ＳＤＳ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68, 396-408）。

発現プラスミドの構築と遺伝子発現
１．発現プラスミドの構築
耐熱性クエン酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性クエン酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤＤａｓｈ（東洋紡社製）であった。
Forward primer（配列番号３）：5'-ATATCATATGGAAATCAAAAAAGGGCTTGAAGACGTTTAT-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTACCTACTATCAATTGGAAT-3'

ＰＣＲ反応後、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて増幅断片の３’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、ｐＧＥＭ-ＴＥａsｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と、Ｔ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液からプラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。プラスミド中に期待される大きさのインサートが存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｋｉｔ（登録商標：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＡＢＩＰＲＩＳＭ３７００ＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ(登録商標：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が、耐熱性クエン酸シンターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するプラスミドの一部を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロース電気泳動により、耐熱性クエン酸シンターゼ遺伝子を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。

２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性クエン酸シンターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。集菌した菌体に、破砕液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
耐熱性クエン酸シンターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性クエン酸シンターゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、耐熱性クエン酸シンターゼであることを確認できた。このタンパク質は、３７３アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は４３．１ｋＤであり、図１の結果とほぼ一致した。

組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−１１ａベクター）を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αからアルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ（Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ）（ＤＥ３）株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌して、培養開始直前まで約６時間、３７℃で前培養した。この前培養液を全量、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）にて３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａでコンピュータプログラム制御し、培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２ＭＨＣｌ（和光純薬社製）および２ＭＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌約１９時間前にオートクレーブ済みの３００ｍＬ発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を加えた。集菌約１９時間前に培養温度を３０℃とし、以降は３０℃とした。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始４３時間後）で大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用い集菌した。回収した菌体は、−３０℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール（和光純薬社製）に溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間、加熱した後、９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら４種の上清および沈殿（沈殿は、菌体破砕液にて再懸濁）に変性剤（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を１２．５％または１５％（発現させるタンパク質の分子量により異なる）ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。

組換えタンパク質の精製
実施例３において、−３０℃で保存してあった菌体を、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕し、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔＤＴＵ−１Ｃ）で、１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。
つぎに、この上清をタンパク質精製装置（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＡＫＴＡ^TM ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、１．２Ｍ硫安、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、疎水交換カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥ^TMＰｈｅ６ｍＬ）に通した。１．２Ｍ→０の硫安濃度勾配で溶出させ、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を、２０ｍＭＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）（ｐＨ６．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、陽イオン交換カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥ^TM Ｓ６ｍＬ）に通した。塩化ナトリウムで溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を、１０ｍＭのリン酸緩衝溶液に置換した後、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏｓｃａｌｅ社製、商品名ＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、ＴｙｐｅＩＣｏｌｕｍｎ、ＣＨＴ−１０１）に通した。高濃度リン酸緩衝溶液で溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパクの画分を回収した。
つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮ^TM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、タンパク質精製装置（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１５０ｍＭＮａＣｌで平衡化したゲルろ過カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＨｉＬｏａｄ^TM １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^TM ２００）に通した。溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮ^TM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、活性測定に供した。

活性測定
１．測定方法
実施例４において精製したタンパク質は、クエン酸シンターゼであり、クエン酸シンターゼは、生体内で、オキサロ酢酸＋アセチル補酵素Ａ＋Ｈ₂Ｏ→クエン酸＋補酵素Ａ＋Ｈ⁺の反応を触媒する酵素である。前記実施例４において精製したタンパク質について、下記の種々条件下で、その活性を測定した。この活性測定は、つぎの通りである。すなわち、１００ｍＭのＫＣｌ（和光純薬社製）と、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０、ナカライテスク社製）と、０．２ｍＭのオキサロ酢酸（ナカライテスク社製）と、０．２ｍＭのアセチル補酵素Ａ（ＳＩＧＭＡ社製）と、９．３２ｎＭの前記実施例４において精製したタンパク質とを含む５０ｍＭの緩衝溶液（後述のとおり、各測定によって種類が異なる）を３分間反応させた。この反応系に０．１ｍＭのＤＴＮＢ（５，５'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（和光純薬社製））を共存させておき、これと反応生成物である補酵素Ａとが反応してできる化合物の４１２ｎｍでの吸光度（モル吸光係数１３，６００Ｍ^-1ｃｍ^-1）を定量することにより、反応の進行度（前記実施例４において精製したタンパク質の活性に対応する）を観測した。進行度の指標として見かけの速度定数ｋ_appを用いた。各測定値は、前記実施例４において精製したタンパク質を加えず、緩衝溶液に５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ９．０）、１５０ｍＭＮａＣｌを用いて前記測定を行ったコントロール実験結果を差し引いた値である。なお、分光光度計には、ＨＩＴＡＣＨＩ社製、商品名Ｕ−３３００を、インキュベータには、ＮＥＳＬＡＢ社製、商品名ＲＴＥ−１１１を用いた。

２．至適温度
２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５℃の各温度において、前記測定を行い、ｋ_appを求めた。緩衝溶液には、各温度でｐＨが７．５になるように調製したＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いた。測定結果を、下記表１および図２のグラフに示す。図示のとおり、６５〜８５℃において特に高い活性を示した。

（表１）
温度（℃）ｋ _app （ｓ ^-1 ）
２５４．５４
３５７．３７
４５９．７９
５５１２．２
６５１４．３
７５１５．１
８５１４．６
９５１２．５

３．至適ｐＨ
ｐＨ２．２、４．７、６．７、７．５、８．６、９．７、１２．２の各条件で、前記測定を行い、ｋ_appを求めた。反応温度は、５５℃とした。測定に用いた緩衝溶液と目的のｐＨとの関係を下記表２に示す。

（表２）
ｐＨ緩衝溶液
２．２Ｇｌｙ−ＨＣｌ
４．７ＭＥＳ−ＮａＯＨ
６．７ＭＥＳ−ＮａＯＨ
７．５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
８．６Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
９．７Ｇｌｙ−ＮａＯＨ
１２．２ＫＣｌ−ＮａＯＨ

前記ｋ_appの測定結果を、下記表３および図３のグラフに示す。図示のとおり、ｐＨ９．７付近で活性の低下が見られるが、これは基質の自然分解が原因と考えられた。この点を除外して考えると、高いｐＨ領域（ｐＨ７以上）において強い活性を示していることが分かる。

（表３）
ｐＨｋ _app （ｓ ^-1 ）
２．２０．２６３
４．７２．５４
６．７１１．６
７．５１３．４
８．６１０．９
９．７３．８０
１２．２９．９５

４．熱安定性
前記測定に先立ち、前記実施例４において精製したタンパク質を、９５℃で、３時間および６時間前処理した。前記前処理物を用いて、前記測定を行い、ｋ_appを求めた。反応温度は、５５℃、ｐＨ７．５とした。なお、前処理時間０時間は、前処理を行っていないものである。測定結果を、下記表４に示す。

（表４）
前処理時間（時間）ｋ _app （ｓ ^-1 ）
０１３．４
３２．３７
６１．６４

前処理時間０時間のｋ_appを基準（１００％）として各前処理時間での残存活性を求めた。測定結果を、図４のグラフに示す。図示のとおり、前処理を行うことで、活性の低下は見られるものの、完全に活性を失うことはないことが分かった。

５．アセチル補酵素Ａに対するｋ _cat 、Ｋ _M 、ｋ _cat ／Ｋ _M の算出
前記測定において、オキサロ酢酸の濃度は、０．２ｍＭのまま固定して、アセチル補酵素Ａの濃度を変えることで、アセチル補酵素Ａの濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃、ｐＨ７．５とした。測定結果を、下記表５および図５のグラフに示す。

（表５）
アセチル補酵素Ａの濃度（μＭ）ｖ（μＭ／ｓ）
００
１００．０１１８
５００．０７７２
１０００．１０４
２０００．１４１
５０００．２０６
１００００．２２９

上記測定結果より、ＩＧＯＲＰｒｏ（ヒューリンクス社製）を用いて、アセチル補酵素Ａに対するｋ_cat、Ｋ_M、ｋ_cat／Ｋ_Mを算出した。算出結果を、下記表６に示す。

（表６）
ｋ _cat （ｓ ^-1 ）Ｋ _M （μＭ）ｋ _cat ／Ｋ _M （ｓ ^-1 ／Ｍ）
２８．０（５８．４）１４６１．９２×１０⁵（４．００×１０⁵）

上記表６において、括弧内の数値は、オキサロ酢酸に対する動力学定数（ｋ_cat）を用いたときのアセチル補酵素Ａに対する動力学定数である。

６．オキサロ酢酸に対するｋ _cat 、Ｋ _M 、ｋ _cat ／Ｋ _M の算出
前記測定において、アセチル補酵素Ａの濃度を、１．５ｍＭに固定して、オキサロ酢酸の濃度を変えることで、オキサロ酢酸の濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃、ｐＨ７．５とした。この測定においては、前記コントロール実験におけるオキサロ酢酸塩濃度を０μＭとした。測定結果を、下記表７および図６のグラフを示す。

（表７）
オキサロ酢酸の濃度（μＭ）ｖ（μＭ／ｓ）
００
１００．００９１７
５００．０５８３
１０００．２４０
２０００．３４２
５０００．４２４
１００００．４５９

上記測定結果より、ＩＧＯＲＰｒｏ（ヒューリンクス社製）を用いて、オキサロ酢酸に対するｋ_cat、Ｋ_M、ｋ_cat／Ｋ_Mを算出した。算出結果を、下記表８に示す。

（表８）
ｋ _cat （ｓ ^-1 ）Ｋ _M （μＭ）ｋ _cat ／Ｋ _M （ｓ ^-1 ／Ｍ）
５８．４３１５１．８５×１０⁵

７．二次構造の熱安定性
この測定では、前記測定方法に代えて、５μＭの前記実施例４において精製したタンパク質、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（２５℃でのｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌからなる反応溶液を用意し、下記の種々条件下、前記タンパク質溶液のＣＤ（円偏光二色性）の測定を行った。測定には、円偏光二色性分散計（日本分光社製、商品名Ｊ−７２０Ｗ）および光路長０．１ｃｍのセルを用いた。

７−１．温度変化測定
前記反応溶液を、ｐＨ７．０で２５℃から９５℃まで１℃／ｍｉｎで温度変化させたときの２２２ｎｍの円偏光二色性スペクトルの変化を測定した。なお、ここで用いた２２２ｎｍは、α−へリックス由来の吸収波長である。測定結果を、図７のグラフに示す。図示のとおり、２５℃から９５℃までの連続温度変化を見ても、前記実施例４において精製したタンパク質の二次構造がほぼ保持されていることが分かった。

７−２．スペクトル測定
前記反応溶液の９５℃、ｐＨ７．０での遠紫外部（２００〜２５０ｎｍ）のスペクトルの測定を行った。測定結果を、図８のグラフに示す。なお、図８における残基モル楕円率[θ]（ｄｅｇ・ｃｍ²／ｄｍｏｌ）は、[θ]＝１００θ／（ｌ・ｃ）により求めた。ここで、θは、実測値（ｍｄｅｇ）、ｌは、光路長（ｃｍ）、ｃは、残基モル濃度（Ｍ）である。図示のとおり、２０９ｎｍ、２２０ｎｍで負の極大値を示したことから、前記実施例４において精製したタンパク質の二次構造は、９５℃でも保持されていることが分かった。

本発明により、クエン酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。

図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ写真である。図２は、本発明の一実施例における温度とｋ_appとの関係を示すグラフである。図３は、本発明の一実施例におけるｐＨとｋ_appとの関係を示すグラフである。図４は、本発明の一実施例における９５℃での前処理時間と残存活性との関係を示すグラフである。図５は、本発明の一実施例におけるアセチル補酵素Ａの濃度−反応速度ｖプロットである。図６は、本発明の一実施例におけるオキサロ酢酸の濃度−反応速度ｖプロットである。図７は、本発明の一実施例における精製タンパク質を２５℃から９５℃まで温度変化させたときの円偏光二色性スペクトルの変化を示すグラフである。図８は、本発明の一実施例における精製タンパク質の９５℃での遠紫外部（２００〜２５０ｎｍ）の円偏光二色性スペクトルを示すグラフである。

配列番号１：耐熱性クエン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性クエン酸シンターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性クエン酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性クエン酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列

Claims

下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、クエン酸シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
前記クエン酸シンターゼ活性が、アセチル補酵素Ａ、オキサロ酢酸および水に作用して、クエン酸および補酵素Ａを生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。
超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
酵素反応により、オキサロ酢酸、アセチル補酵素Ａおよび水からクエン酸および補酵素Ａを製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度５５〜９５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
前記酵素反応のｐＨが、ｐＨ７以上の範囲である請求項８記載の製造方法。