JP2006288389A - Ｇｍｐシンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ＧＭＰシンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるＧＭＰシンターゼ活性を有するタンパク質。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性hyperthermophilic archaeonの１種であるアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）種Ｋ１（ＪＣＭ９８２０）の遺伝子配列から、ＧＭＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＧＭＰシンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託に係る成果の出願である。

ＧＭＰシンターゼは、例えば、ＡＴＰおよび水の存在下、キサントシン５’−リン酸（ＸＭＰ）およびＬ−グルタミンに作用して、ＡＭＰ（アデノシン５’−リン酸）、ＧＭＰ（グアノシン５’−リン酸）およびＬ−グルタミン酸を生成する機能を有する。この機能を利用して、ＧＭＰシンターゼは、調味料等の原料として有用なグアノシン５’−リン酸等の核酸系物質の製造に利用されている（例えば、特許文献１参照）。

ＧＭＰシンターゼとしては、様々な生物由来のものが知られているが、その中でも、耐熱性菌由来のものが知られている。前記耐熱性菌としては、好熱性メタン細菌であるメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）があげられる（例えば、非特許文献１参照）。このような耐熱性菌由来のＧＭＰシンターゼは、工業的用途を広げるものと期待されているが、前記１種類の菌由来のものだけでは、いまだ不十分である。

他方、前記の菌以外の超好熱性古細菌（非特許文献２参照）についての研究があり、アエロパイラム属細菌の１種であるアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）（非特許文献３参照）は、その遺伝子が既に解析されている（非特許文献４参照）。したがって、この超好熱古細菌が、ＧＭＰシンターゼ活性を有するタンパク質を産生するとすれば、それは優れた耐熱性および安定性を有すると予想され、これによって工業的用途がさらに広がる可能性がある。

特開２０００−３００２７２号公報 J. Bacteriol. 172, 3328-3334 (1990) Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M. W. W. Adams ed.), Academic Press (1996) Int. J. Syst. Bacteriol. 1996 October; 46(4):1070-1077 DNA Res. 1999 April 30; 6(2):83-101, 145-152

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ＧＭＰシンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。

前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、ＧＭＰシンターゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、ＧＭＰシンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。

すなわち本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質である。
（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ＧＭＰシンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。

なお、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。

アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）の最適生育温度は９０〜９５℃であり、生育限界温度が１００℃であるから、本発明のタンパク質は、９０〜１００℃の高温であっても活性がある。したがって、本発明のタンパク質は、高温下で使用することができ、かつ、高温下で安定性が高く、工業的用途の拡大が可能となる。

前記ＧＭＰシンターゼは、ＡＴＰおよび水の存在下において、ＸＭＰおよびＬ−グルタミンに作用して、ＡＭＰ、ＧＭＰおよびＬ−グルタミン酸を生成する機能、ＸＭＰおよびＮＨ₃に作用して、ＡＭＰ、ＧＭＰおよびピロリン酸を生成する機能を有する。また、前記ＧＭＰシンターゼは、ＡＭＰ、ＧＭＰおよびＬ−グルタミン酸に作用して、ＸＭＰ、ＡＴＰおよびＬ−グルタミンを生成する機能、ＡＭＰ、ＧＭＰおよびピロリン酸に作用して、ＸＭＰ、ＡＴＰおよびＮＨ₃を生成する機能を有する。

前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、例えば、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。

つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。

つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明の発現ベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。

つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。

つぎに、本発明のＧＭＰの製造方法は、ＸＭＰ、ＡＴＰ及びＮＨ₃から酵素反応によりＧＭＰを製造する方法であって、酵素として前記本発明のタンパク質を使用する方法である。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

本発明者らは、子宝島の海岸の硫気孔から採取された超好熱性古細菌であって、好気性hyperthermophilic archaeonの１種であるアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）種Ｋ１（ＪＣＭ９８２０）の遺伝子配列からＧＭＰシンターゼ活性を示すタンパク質をコードすると推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後述する実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の新規耐熱性タンパク質は、ＧＭＰシンターゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施できる。

本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば、配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製できる。

本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後述する実施例２に示すように超好熱性古細菌アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）のゲノムから、例えば、配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法、あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製できる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、本発明は、これらに限定されない。

本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製できる。また、市販の発現ベクターとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のベクターなどを用いてもよい。これらのベクターは、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。

ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明のタンパク質をコードする遺伝子のほか、例えば、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。

前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用できるが、これらの方法に限定されない。

本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製できる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。

本発明のＧＭＰの製造方法は、前述のように、ＸＭＰ、ＡＴＰ及びＮＨ₃から酵素反応によりＧＭＰを製造する方法であって、酵素として前記本発明の耐熱性タンパク質を使用する方法である。前記本発明の耐熱性タンパク質を用いれば、高温領域で酵素反応を実施できる。前記酵素反応は、例えば、７０〜９５℃の温度条件下で行うことができ、好ましくは７０〜９０℃である。前記酵素反応は、例えば、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺及びＣｏ²⁺等の２価金属イオン存在下で行うことが好ましく、それぞれ１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。中でも、Ｍｇ²⁺存在下がより好ましい。前記酵素反応は、例えば、ＭｇＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、ＣａＣｌ₂及びＣｏＣｌ₂等を含む酵素反応液を使用できる。前記反応液は、さらに、例えば、Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）及びメルカプトエタノール等を含んでいてもよい。前記酵素反応に使用する緩衝液は特に制限されないが、例えば、クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液及びＧｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液等が挙げられる。温度条件下が８５℃である場合、例えば、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液及びＧｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液等が好ましい。中でも、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液がより好ましく、そのｐＨは、ｐＨ６．０〜９．０の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ５．５である。前記ＮＨ₃源としては、例えば、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄及びＬ−グルタミン等があげられる。前記反応液中の本発明のタンパク質の濃度は、特に制限されないが、例えば、３．７〜２９Ｕ／ｍｇであり、ＸＭＰの濃度は、例えば、０．３〜１４．４ｍＭである。

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。

染色体ＤＮＡの調製
アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）をＬ培地で３７℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ニワトリ卵白リゾチーム溶液０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８溶液０．５ｍＬを加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを０．２ｍＬの１０％ＳＤＳ溶液に溶かしたものを加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。ついで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68, 396-408）。

発現ベクターの構築と遺伝子発現
１．発現ベクターの構築
耐熱性ＧＭＰシンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性ＧＭＰシンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を使用した。
Forward primer（配列番号３）：5'- ATATCATATGGCTAAAACCTTGGACTCCCCCGGCGTCTTG -3'
Reverse primer（配列番号４）：5'- ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTACTCCCACTCTATCGTAGA -3'

ＰＣＲ反応後、Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて増幅断片の３’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現ベクターを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。ベクター中に期待される大きさの挿入ＤＮＡ断片が存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製ベクターの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列が耐熱性ＧＭＰシンターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するベクターの一部を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロース電気泳動により、耐熱性ＧＭＰシンターゼ遺伝子を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断・精製した後、Ｔ４リガーゼで反応させ、上記の構造遺伝子と連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現ベクターを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。

２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．１ｍＬをファルコンチューブに移した。その中に上記１．の精製発現ベクター溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性ＧＭＰシンターゼ遺伝子を発現させた。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。

集菌した菌体に、菌体破砕液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は前記菌体破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（８０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は前記菌体破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。

耐熱性ＧＭＰシンターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性ＧＭＰシンターゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように８残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性ＧＭＰシンターゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、５１２アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は５６．２ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。

ＤＮＡ組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして発現ベクターを精製し、この発現ベクターを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ（ＤＥ３）を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌して約６時間３７℃で前培養した。この前培養液の全量を、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、所定の条件（３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａ）にコンピュータプログラム制御して高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）で培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ ＨＣｌ（和光純薬社製）および２Ｍ ＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌約１３時間前（培養開始約２７時間後）に、前記培地にオートクレーブ済みの発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を３００ｍＬ加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところで（培養開始４０時間後）、大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用いて集菌した。回収した菌体のうち少量を分取し、残りの菌体は−３０℃で保存した。前記分取した菌体を、破砕液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ β−メルカプトエタノール（和光純薬社製））に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９，１００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清と沈殿に分けた。他方は、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間加熱した後、９，１００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清と沈殿に分けた。得られた沈殿は、前記破砕液に再懸濁した。これら４種の上清および沈殿懸濁液に変性剤（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱して変性させた。各変性タンパク質液を１２．５％ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色した結果、目的タンパク質（ＧＭＰシンターゼ）の発現が確認できた。

１．ＤＮＡ組換えタンパク質の精製
実施例３において−３０℃で保存した菌体を破砕液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５ｍＭ β−メルカプトエタノール（和光純薬社製））に懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この菌体破砕液を７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間加熱した後、すばやく冷却した。ついで、大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−３０Ｉ）を用いて１００，０００Ｇで１時間遠心分離し、上清を回収した。

つぎに、この上清を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＲＥＳＯＵＲＣＥ^TM Ｑ ６ｍＬ）に通した。０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、０．１９Ｍ塩化ナトリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。

つぎに、回収した画分を、１０ｍＭのリン酸緩衝溶液に置換した後、ヒドロキシアパタイトカラム（ＢＩＯＲＡＤ社製、商品名Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｕｍｎ、ＣＨＴ−１０Ｉ）に通した。１０〜２５０ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝溶液で溶出を行い、７５〜１０５ｍＭリン酸カリウム濃度で溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパクの画分を回収した。

つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ザルトリウス社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮ^TM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、タンパク質精製装置（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、平衡化溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品名ＨｉＬｏａｄ^TM １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^TM ７５）に通した。溶出した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。

つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ザルトリウス社製、商品名ＶＩＶＡＳＰＩＮ^TM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、これを以下の測定にサンプルとして使用した。

２．至適温度の決定
２．４ｍＭ ＸＭＰ（ＳＩＧＭＡ製）、４ｍＭ ＡＴＰ（オリエンタル酵母製）、１６ｍＭ ＭｇＣｌ₂（和光純薬製）、３２０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（ナカライテスク製）及び１６０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（ナカライテスク製）を含む反応液を準備し、前記反応液を所定の温度（２５、４５、５５、６５、７５、８５及び９５℃）とした（商品名ＤＴＵ−Ｎ：ＴＡＩＴＥＣ製）。ついで、精製した前記サンプルを前記反応液に加えて酵素反応を開始させ、反応開始から３分後に、反応溶液５０μＬに対して１１倍量の３．５％ ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ（和光純薬）（５５０μＬ）を加えて酵素反応を停止させた。反応溶液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分、ＳＡＫＵＭＡ製、商品名：Ｍ１５０−ＩＶＤ）し、その上清の波長２９０ｎｍにおける吸光度（ＧＭＰに由来。ε_GMP＝６０００）を測定した（商品名Ｕ−３０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ：ＨＩＴＡＣＨＩ製）。前記吸光度から生成したＧＭＰ量を算出し、耐熱性タンパク質１ｍｇが１分あたりに生成したＧＭＰ量（μｍｏｌ）を比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）として算出した。その結果を図２に示す。同図に示すように、９５℃で最も高い活性を示した。なお、なお、前記サンプルのタンパク質量は、吸光度法により定量した。

３．至適ｐＨの決定
温度条件を８５℃とし、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液に代えて下記の表１に示す緩衝液を使用し、様々なｐＨで酵素活性の測定を行った以外は、前記「２．至適温度の決定」と同様に測定を行った。その結果を図３に示す。同図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、ｐＨ５．５〜８．０の幅広いｐＨ範囲で高い活性を示し、中でもｐＨ５．５で最も高い活性を示した。

４．熱安定性
（１）ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｕｍ
前記耐熱性タンパク質のサンプルを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた後、９５℃から１５℃に下降させるか、又は、溶液温度を１５℃から９５℃に上昇させながらθ₂₂₂値を測定した。なお、測定には、商品名Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ Ｊ−７２０−Ｗ（日本分光製）を用いた。この結果を図４に示す。同図において、上のグラフが、温度を下降させた場合のθ₂₂₂値の変化を示すグラフであり、下のグラフが、温度を上昇させた場合のθ₂₂₂値の変化を示すグラフである。同図に示すように、本発明のタンパク質は、１５〜９５℃の範囲で安定であった。なお。高温側になるにつれて吸光度の上昇が見られたが、９５℃に達した際にセル内には沈殿は発生していなかったことから、この上昇は、測定時の誤差又はベースラインのシフトによるものと考えられる。

（２）活性測定
前記耐熱性タンパク質のサンプルを所定の温度（７０、８５、９０及び９５℃）でインキュベーションし（商品名ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、その残存活性を経時的に測定した。なお、緩衝液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．０）緩衝液を使用し、活性測定は、前記「２．至適温度の決定」と同様に測定を行った。その結果を図５に示す。図５（ａ）は、比活性を示し、図５（ｂ）は、０分の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、９５℃では、２時間のインキュベーションで、ほぼ完全に失活したものの、７０、８５及び９０℃では、２４時間後であっても高い活性を示し、安定であった。

５．ｐＨ安定性
前記耐熱性タンパク質のサンプルを下記表２に示す所定のｐＨの緩衝液で、３７℃１２時間インキュベーションした後（商品名ＭＩＲ−２６２：ＳＡＮＹＯ製）、温度条件を３７℃とし、前記「２．至適温度の決定」と同様にして活性を測定した。その結果を図６に示す。図６（ａ）は、比活性を示し、図６（ｂ）は、ＭＥＳ（ｐＨ５．５）緩衝液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、全ての範囲のｐＨ（ｐＨ４．５〜１０．５）で高い活性を示し、全ての範囲のｐＨで安定であった。

前記耐熱性タンパク質のサンプルを、下記表３に示す所定のｐＨの緩衝液で８５℃３０分間インキュベーションした後（商品名ＤＴＵ−Ｎ：ＴＡＩＴＥＣ製）、温度条件を３７℃とし、前記「２．至適温度の決定」と同様にして活性を測定した。その結果を図７に示す。図７（ａ）は、比活性を示し、図７（ｂ）は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ５．５）緩衝液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、前記耐熱性タンパク質は、中でも、ｐＨ６．０〜９．０の広い範囲で高い活性値を示したことから、ｐＨ６．０〜９．０の範囲で特に安定であるといえる。

６．Ｋｍ値及びＶｍａｘ値の算出
ＡＴＰ、ＸＭＰ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＭｇＣｌ₂及びＬ−グルタミンについてＫｍ及びＶｍａｘを求めた。その結果を下記表４に示す。なお、活性測定は、前記「２．至適温度の決定」と同様にして測定し、Ｌ−グルタミンは、前記反応液の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄に代えて測定した。

７．２価金属、ＥＤＴＡ、メルカプトエタノール及びＰＭＳＦの阻害効果
ＮｉＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、ＣａＣｌ₂、ＣｏＣｌ₂、ＰＭＳＦ（以上、全て和光純薬製）、ＣｕＣｌ₂（以下、全てナカライテスク製）、メルカプトエタノール（Ｍｅｒ−ＥｔＯＨ）及びＥＤＴＡをそれぞれ反応液に加え、これらの耐熱性タンパク質の酵素活性への影響を調べた。なお、活性測定は、温度条件を８５℃とし、前記「２．至適温度の決定」と同様にして活性を測定し、ＥＤＴＡの終濃度は５ｍＭ又は２０ｍＭ、その他の終濃度は１ｍＭとした。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、比活性を示し、図８（ｂ）は、ＭｇＣｌ₂（終濃度１６ｍＭ）を含む反応液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、Ｍｇ²⁺を含まない反応液では酵素活性を示さず、２価金属のキレーターであるＥＤＴＡを大量に（２０ｍＭ）加えた時に活性が大幅に低下したため、耐熱性タンパク質の酵素活性には、Ｍｇ²⁺が必須であることがわかった。なお、Ｍｇ²⁺以外の２価金属、ＰＭＳＦ、メルカプトエタノール及び５ｍＭのＥＤＴＡを加えた場合には、大きな影響はなかった。

８．金属依存性
ＭｇＣｌ₂に代えて、その他の２価金属（ＮｉＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、ＣａＣｌ₂、ＣｏＣｌ₂及びＣｕＣｌ₂）を反応液に加えた以外は、温度条件を８５℃とし、前記「２．至適温度の決定」と同様にして酵素活性を測定した。その結果を図９に示す。図９（ａ）は、比活性を示し、図９（ｂ）は、ＭｇＣｌ₂を含む反応液を使用した場合の比活性を１００とした場合の相対活性（％）を示す。これらの図に示すように、Ｎｉ²⁺及びＣｕ²⁺を含む反応液では活性を示さなかったが、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺及びＣｏ²⁺を含む反応液では活性を示した。したがって、本発明のタンパク質は、Ｍｇ²⁺の他にＭｎ²⁺、Ｃａ²⁺及びＣｏ²⁺存在下において酵素反応を行うことができる。

本発明により、ＧＭＰシンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。

図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。 図２は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。 図３は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフである。 図４は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の熱安定性を示すグラフである。 図５（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定の温度条件下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図５（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。 図６（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図６（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。 図７（ａ）は、本発明のその他の実施例における所定のｐＨでのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図７（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。 図８（ａ）は、本発明のその他の実施例における各種金属等を添加した反応液でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図８（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。 図９（ａ）は、本発明のその他の実施例における各種金属の存在下でのタンパク質の酵素活性を示すグラフであり、図９（ｂ）は、その相対活性を示すグラフである。

配列番号１：耐熱性ＧＭＰシンターゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性ＧＭＰシンターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性ＧＭＰシンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性ＧＭＰシンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列

Claims (12)

1. 下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質。
   （ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
   （ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、ＧＭＰシンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
2. 前記ＧＭＰシンターゼが、ＡＴＰおよび水の存在下、キサントシン５’−リン酸（ＸＭＰ）およびＬ−グルタミンに作用して、アデノシン５’−リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン５’−リン酸（ＧＭＰ）およびＬ−グルタミン酸を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
3. 前記ＧＭＰシンターゼが、ＡＴＰおよび水の存在下、キサントシン５’−リン酸（ＸＭＰ）およびＮＨ₃に作用して、アデノシン５’−リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン５’−リン酸（ＧＭＰ）およびピロリン酸を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
4. 前記ＧＭＰシンターゼが、アデノシン５’−リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン５’−リン酸（ＧＭＰ）およびＬ−グルタミン酸に作用して、キサントシン５’−リン酸（ＸＭＰ）、ＡＴＰおよびＬ−グルタミンを生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
5. 前記ＧＭＰシンターゼが、アデノシン５’−リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン５’−リン酸（ＧＭＰ）およびピロリン酸に作用して、キサントシン５’−リン酸（ＸＭＰ）、ＡＴＰおよびＮＨ₃を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
6. 超好熱性古細菌由来である請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質。
7. 超好熱性古細菌が、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（ＪＣＭ９８２０）である請求項６記載のタンパク質。
8. 請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
9. 請求項８記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
10. 請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項７記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
11. ＸＭＰ、ＡＴＰ及びＮＨ₃から酵素反応によりＧＭＰを製造する方法であって、酵素として請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質を使用するＧＭＰの製造方法。
12. Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺及びＣｏ²⁺からなる群から選択される２価金属イオン存在下で前記酵素反応を行う請求項１１記載の製造方法。