JP4280826B2 - シスタチオニン−γ−シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents
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J.Mol. Biol. 1999 July.30;290(5):983-96 J. Biol. Chem. 2002 Sep 27;277(39):36380-6 Plant Physiol. 2002 Feb;128(2):454-62)
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、シスタチオニン−γ−シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii(JCM10545))をL培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、SSC溶液 (0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム)10mL、0.5M EDTA、100mg/ml ニワトリ卵白リゾチーム 0.1mLおよび10%非イオン性界面活性剤Brij-58を0.5mL加え、0℃で30分間放置した後、プロテイナーゼK(Merck社製)5mgを10%SDS 0.2mLに溶かした溶液を加え、37℃で2、3日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、37℃で1時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてDNAを沈殿濃縮した。このDNAの沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0))10mLに溶解し、リボヌクレアーゼ0.25mL(最終濃度0.25mg/mL)を加えて、37℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、DNAをTE溶液5mLに溶解した後、260nmの吸光度より、DNA濃度を決定した(Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408)。
1.発現プラスミドの構築
耐熱性シスタチオニン−γ−シンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素NdeIおよびBamHI、 NotIサイトを含むDNAを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたPCRで耐熱性シスタチオニン-γ-シンターゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。用いたDNAポリメラーゼはKOD Dash(東洋紡社製)であった。
Forward primer(配列番号3):5'-ATATCATATGCATGGGTTGCGTGAAGGGACTAAAGTTACA-3'
Reverse primer(配列番号4):5'-ATATGGATCCgcggccgcTTATTAattaagtgaagttagtgc-3'
大腸菌 Rosetta-gami(DE3)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移した。その中に上記1.の精製発現プラスミドの溶液0.002mLを加え氷中に20分間放置した後、42℃でヒートショックを90秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地(5mL)で18時間培養し、耐熱性シスタチオニン−γ−シンターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離(13,000G、10分)で集菌した。
実施例2と同様にして調製したプラスミドDNA(pET−11aベクター) を用いて、大腸菌DH5α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌DH5αからアルカリSDS法を用いてプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ(Rosetta-Gami)(DE3)株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを3白金耳量とり、5mLのLBL培地(1%ペプトン、0.5%酵母抽出液、0.5%NaCl、0.1%ラクトース、50μg/mLアンピシリン、40μg/mLクロラムフェニコール)に植菌して、培養開始直前まで約6時間、37℃で前培養した。この前培養液を全量、3Lの4×LBL培地(4%ペプトン、2%酵母抽出液、 2%NaCl、50μg/mLアンピシリン)に加え、高密度培養槽(ABLE社製)にて37℃、pH7.2、圧力0.02Paでコンピュータプログラム制御し、培養した。pHは、オートクレーブ済みの2M HCl(和光純薬社製)および2M NaOH(和光純薬社製)で調整した。集菌約21時間前および集菌約21時間前にオートクレーブ済みの300mL発現誘導液(10%ラクトース、20%グリセロール)を加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ(培養開始45時間後)で大型遠心分離機(Beckman社製AvantiHP-30I)を用い集菌した。回収した菌体は、−30℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8)、5mM β-メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕した。この溶液を2等分し、一方を9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製DryThermounit DTU-1C)で10分間、加熱した後、9100G 、4℃で10分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら4種の上清および沈殿(沈殿は、菌体破砕液にて再縣濁)に変性剤(62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、10%グリセロール、2%SDS、2.4%β−メルカプトエタノール、0.005% ブロムフェノールブルー(和光純薬社製))を加え、95℃で5分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を12.5%または15%(発現させるタンパク質の分子量により異なる)ポリアクリルアミドゲルに加え、SDS−PAGEにて電気泳動を行った。染色液(Quick-CBB、和光純薬社製)を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
実施例3において、−30℃で保存してあった菌体を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8)、5mM β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置(TOMY社製UD-201)で破砕し、75℃に設定した恒温槽(TAITEC社製、DryThermoUnit DTU-1C)で、10分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機(Beckman社製Avanti HP-30I)を用いて、100,000Gで1時間、遠心分離し、上清を回収した。
1.測定方法
以下に、実施例4において精製したタンパク質によるγ−脱離反応を、下記に示す種々の条件下、乳酸デヒドロゲナーゼ(以下、LDH)カップリングアッセイ系を用いることにより測定した。この測定方法は、つぎのとおりである。すなわち、まず、12.5μMのピリドキサル5’−リン酸 (PLP)(Sigma社製)と、1.25mMのO−サクシニル−L−ホモセリン(OSHS) (Sigma社製)と、2.1μMの実施例4において精製したタンパク質とを含む50mMの緩衝溶液(後述のとおり、各測定によって種類が異なる)250μLを10分間反応させた後、24.6%のトリクロロ酢酸を50μL加えて5分間室温で保持することにより反応を停止した。その後、NaOHを加えることにより溶液を中和し、3mMのNADHとLDHを加え、生成物である2−オキソ酪酸の還元反応を行った。この溶液の340nmの吸光度を定量することにより、反応の進行度(実施例4において精製したタンパク質の活性に対応する)を観測した。進行度の指標として見かけの速度定数kappを用いた。前記LDHカップリング系の反応を下記に示す。
45、60、75、88、95℃の各温度において、前記測定を行い、kappを求めた。緩衝溶液には、N, N’-Bis(2-hydroxyethyl)glycine (Bicine)(pH8.2)(ナカライテスク社製)を用いた。測定結果を、図3のグラフに示す。図示のとおり、75〜85℃において最大活性を示した。
前記測定に先立ち、2.1μMの実施例4において精製したタンパク質を、75℃および95℃で、0.5、1、1.5、2、2.5、3時間前処理した。前記前処理物を用いて、前記測定を行い、kappを求めた。緩衝溶液には、N, N’-Bis(2-hydroxyethyl)glycine (Bicine)(pH8.2)(ナカライテスク社製)を用い、反応温度は、75℃とした。なお、前処理時間0時間は、前処理を行っていないものである。測定結果を、図4のグラフに示す。図示のとおり、前処理を行うことで、活性の低下は見られるものの、完全に活性を失うことはないことが分かった。
pH5.89、6.14、6.55、6.99、7.4、7.87、8.42、8.87、9.37の各条件で、前記測定を行い、kappを求めた。緩衝溶液には、pH5.89ではMES(同仁堂社製)を、pH6.14、6.55、6.99、7.4ではTris(ナカライテスク社製)−HClを、pH7.87、8.42、8.87、9.37ではNaHCO3(和光純薬社製)−NaOH(ナカライテスク社製)を用い、反応温度は、75℃とした。測定結果を、図5のグラフに示す。図示のとおり、アルカリ性領域では活性の低下が見られたが、酸性領域では比較的安定な活性を示した。
配列番号2:耐熱性シスタチオニン−γ−シンターゼの塩基配列
配列番号3:耐熱性シスタチオニン−γ−シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeIおよびBamHI、NotIを導入するための順方向プライマーを示す。
配列番号4:耐熱性シスタチオニン−γ−シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeIおよびBamHI、NotIを導入するための逆方向プライマーを示す。
配列番号5:N末端アミノ酸配列
Claims (2)
- 酵素反応により、O−サクシニル−L−ホモセリン及びL−システインからシスタチオニン及びコハク酸を製造する方法であって、超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)(JCM10545)由来の下記(a)又は(b)の耐熱性タンパク質を用い、温度75〜85℃、pH6.5〜7.5の条件で前記酵素反応を行うことを含む、製造方法。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、シスタチオニン−γ−シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 酵素反応により、ピリドキサル5’−リン酸(PLP)の存在下、O−サクシニル−L−ホモセリンから、2−オキソ酪酸を製造する方法であって、超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)(JCM10545)由来の下記(a)又は(b)の耐熱性タンパク質を用い、温度75〜85℃、pH6.5〜7.5の条件で前記酵素反応を行うことを含む、製造方法。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、シスタチオニン−γ−シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
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