JP3017019B2 - 新規制限酵素 - Google Patents
新規制限酵素Info
- Publication number
- JP3017019B2 JP3017019B2 JP6194602A JP19460294A JP3017019B2 JP 3017019 B2 JP3017019 B2 JP 3017019B2 JP 6194602 A JP6194602 A JP 6194602A JP 19460294 A JP19460294 A JP 19460294A JP 3017019 B2 JP3017019 B2 JP 3017019B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- restriction enzyme
- dna
- enzyme
- streptomyces
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、二重鎖デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）中の特定の７塩基配列を特異的に認識、切
断するII型制限酵素に関する。
酸（ＤＮＡ）中の特定の７塩基配列を特異的に認識、切
断するII型制限酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】制限酵素とはある特定のＤＮＡ塩基配列
を特異的に認識し、切断することのできるエンド型ヌク
レアーゼであり、数多くの制限酵素が見出されている。
分子遺伝学や、生化学の発展により、ＤＮＡが遺伝をつ
かさどる本体であることが明らかになって以来、制限酵
素は遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作での利用等
現在幅広く用いられている有用な酵素である。このうち
特にＤＮＡ塩基配列を特異的に認識し、特異的にＤＮＡ
を切断するII型制限酵素が重要かつ必要とされて用いら
れてきている。現在までにII型制限酵素は３００種類以
上単離されているが、これらのII型制限酵素が認識でき
ないＤＮＡ塩基配列の組合せはまだまだ存在する。すな
わち、実験者が目的とする位置でＤＮＡを切断する機会
を更に増やすためには、新規のII型制限酵素が継続的に
必要とされている。更には、近年の各種ゲノム解析プロ
ジェクト等のように巨大なＤＮＡを解析する場合、ＤＮ
Ａの切断部位の出現頻度があまり多くないことが望まし
く、そのためには６塩基より長いＤＮＡ塩基配列を特異
的に認識し、特異的に切断するII型制限酵素（レアカッ
ター）が要望されている。
を特異的に認識し、切断することのできるエンド型ヌク
レアーゼであり、数多くの制限酵素が見出されている。
分子遺伝学や、生化学の発展により、ＤＮＡが遺伝をつ
かさどる本体であることが明らかになって以来、制限酵
素は遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作での利用等
現在幅広く用いられている有用な酵素である。このうち
特にＤＮＡ塩基配列を特異的に認識し、特異的にＤＮＡ
を切断するII型制限酵素が重要かつ必要とされて用いら
れてきている。現在までにII型制限酵素は３００種類以
上単離されているが、これらのII型制限酵素が認識でき
ないＤＮＡ塩基配列の組合せはまだまだ存在する。すな
わち、実験者が目的とする位置でＤＮＡを切断する機会
を更に増やすためには、新規のII型制限酵素が継続的に
必要とされている。更には、近年の各種ゲノム解析プロ
ジェクト等のように巨大なＤＮＡを解析する場合、ＤＮ
Ａの切断部位の出現頻度があまり多くないことが望まし
く、そのためには６塩基より長いＤＮＡ塩基配列を特異
的に認識し、特異的に切断するII型制限酵素（レアカッ
ター）が要望されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
のＤＮＡ塩基配列を特異的に認識し、かつ特異的に切断
する能力を有し、巨大なＤＮＡの解析等の遺伝子工学の
分野で有用な新規II型制限酵素を提供することにある。
のＤＮＡ塩基配列を特異的に認識し、かつ特異的に切断
する能力を有し、巨大なＤＮＡの解析等の遺伝子工学の
分野で有用な新規II型制限酵素を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は制限酵素に関する発明であって、下
記の理化学的性質を有することを特徴とする、ストレプ
トミセス エスピーＹＨ８４６７（Streptomyces sp.YH
8647）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２２）より取得可能な制
限酵素に関する。 （イ）作用： 二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式（化
１）：
発明の第１の発明は制限酵素に関する発明であって、下
記の理化学的性質を有することを特徴とする、ストレプ
トミセス エスピーＹＨ８４６７（Streptomyces sp.YH
8647）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２２）より取得可能な制
限酵素に関する。 （イ）作用： 二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式（化
１）：
【０００５】
【化１】
【０００６】（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔ
はチミン、Ｃはシトシンを示す）で表される塩基配列を
特異的に認識し、かつこれを矢印の位置で特異的に切断
する能力を有する。 （ロ）至適温度：約３０℃ （ハ）至適ｐＨ：ｐＨ７．５〜９．５ （ニ）密度勾配沈降速度法による分子量：６〜７．５万 また、本発明の第２の発明は、第１の発明の制限酵素の
製造方法に関し、ストレプトミセス エスピーＹＨ８４
６７（Streptomyces sp.YH8647）（ＦＥＲＭＢＰ−５０
２２）を培養し、培養物より該制限酵素を採取すること
を特徴とする。
はチミン、Ｃはシトシンを示す）で表される塩基配列を
特異的に認識し、かつこれを矢印の位置で特異的に切断
する能力を有する。 （ロ）至適温度：約３０℃ （ハ）至適ｐＨ：ｐＨ７．５〜９．５ （ニ）密度勾配沈降速度法による分子量：６〜７．５万 また、本発明の第２の発明は、第１の発明の制限酵素の
製造方法に関し、ストレプトミセス エスピーＹＨ８４
６７（Streptomyces sp.YH8647）（ＦＥＲＭＢＰ−５０
２２）を培養し、培養物より該制限酵素を採取すること
を特徴とする。
【０００７】本発明のII型制限酵素としては上記塩基配
列を特異的に認識し、かつ切断する能力を有する酵素で
あれば良く、これらの酵素は上記二重鎖ＤＮＡの７塩基
を認識する制限酵素生産能を有する菌株、あるいは、こ
れらの菌株の変異株、あるいはこれら菌株より、通常の
遺伝子操作手法を用いて、本酵素生産能をコードする遺
伝子を単離し、他の生物に導入した組換体のいずれによ
っても生産することができる。
列を特異的に認識し、かつ切断する能力を有する酵素で
あれば良く、これらの酵素は上記二重鎖ＤＮＡの７塩基
を認識する制限酵素生産能を有する菌株、あるいは、こ
れらの菌株の変異株、あるいはこれら菌株より、通常の
遺伝子操作手法を用いて、本酵素生産能をコードする遺
伝子を単離し、他の生物に導入した組換体のいずれによ
っても生産することができる。
【０００８】上記７塩基認識制限酵素生産能を有する菌
株の具体例としては、例えば、ストレプトミセス エス
ピーＹＨ８６４７（ Streptomyces sp. YH8647 )が挙げ
られる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに検索し
て得た菌株で、その菌学的性質は下記表１に示すとおり
である。
株の具体例としては、例えば、ストレプトミセス エス
ピーＹＨ８６４７（ Streptomyces sp. YH8647 )が挙げ
られる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに検索し
て得た菌株で、その菌学的性質は下記表１に示すとおり
である。
【０００９】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 細胞壁タイプ Ｉ 型 ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ＋ ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸 − ジアミノ酪酸 − グリシン ＋ アスパラギン酸 − オルニチン − リジン − アラビノース*1 − ガラクトース*1 ＋ キノン系 ＭＫ−９（Ｈ8 ）、ＭＫ−９（Ｈ6 ） 気生菌糸の存在*2 ＋ 胞子連鎖の有無*2 ＋ ───────────────────────────────────
【００１０】＊１ 全菌体の硫酸加水分解物を用いて推
定。 ＊２ 顕微鏡観察による。
定。 ＊２ 顕微鏡観察による。
【００１１】細胞壁成分の分析は、下記３つの刊行物、
日本放線菌研究会編：“放線菌の同定実験法”、（第１
版）（１９８５）日本放線菌研究会事務局発行、駒形和
男編：“微生物の化学分類実験法”、（初版）（１９８
２）学会出版センター発行、及び藪内英子ほか共著：
“新しい分類学に伴走する細菌同定法”、（第１版）
（１９８７）菜根出版に従い行い、本菌株の細胞壁タイ
プはＩ型である。キノン系分析では、マルチプレニール
側鎖の飽和水素数が６又は８でイソプレノイド側鎖のイ
ソプレンユニットの数が９であるメナキノンを有してい
る。更に形態学的観察により、気生菌糸の存在と、胞子
連鎖が観察され、以上の結果より、本菌株はストレプト
ミセス属に属する放線菌と同定される。
日本放線菌研究会編：“放線菌の同定実験法”、（第１
版）（１９８５）日本放線菌研究会事務局発行、駒形和
男編：“微生物の化学分類実験法”、（初版）（１９８
２）学会出版センター発行、及び藪内英子ほか共著：
“新しい分類学に伴走する細菌同定法”、（第１版）
（１９８７）菜根出版に従い行い、本菌株の細胞壁タイ
プはＩ型である。キノン系分析では、マルチプレニール
側鎖の飽和水素数が６又は８でイソプレノイド側鎖のイ
ソプレンユニットの数が９であるメナキノンを有してい
る。更に形態学的観察により、気生菌糸の存在と、胞子
連鎖が観察され、以上の結果より、本菌株はストレプト
ミセス属に属する放線菌と同定される。
【００１２】本菌株は Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ．ＹＨ８６４７と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２
２として寄託されている。
ｐ．ＹＨ８６４７と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２
２として寄託されている。
【００１３】ストレプトミセス エスピー ＹＨ８６４
７株の生産する７塩基認識制限酵素は、前記の酵素作用
を有し、Ｓｓｅ ８６４７Ｉと命名されている。
７株の生産する７塩基認識制限酵素は、前記の酵素作用
を有し、Ｓｓｅ ８６４７Ｉと命名されている。
【００１４】本発明による制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉ
の製造方法について更に詳細に説明する。まず、培養の
際、培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、Ｓｓ
ｅ ８６４７Ｉを生産するものであればよく、炭素源と
しては、例えばグルコース、マルトース、グリセリンな
どが利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当であ
る。そのほかにリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩
などの無機質及び金属塩類を加えても良い。Ｓｓｅ ８
６４７Ｉの生産量は、培養条件により変動するが、一般
に培養温度２０〜３５℃、培地のｐＨ６〜８が良く、１
〜３日間の通気かくはん培養で制限酵素Ｓｓｅ ８６４
７Ｉの生産は最高に達する。培養条件は使用する菌株、
培地組成などに応じ、生産量が最大になるよう設定する
のは当然のことである。本発明の菌株の培養によって生
成された制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉは主に菌体内に存
在する。培養液からの菌体の分離は、例えば遠心分離に
よって行うことができる。本酵素の抽出、精製は、一般
の制限酵素精製法に従った方法で実施しうる。例えば菌
体を緩衝液に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内
酵素の抽出を行う。次に、細胞残渣を超遠心分離により
除去後、例えば、得られた上清の抽出液を緩衝液Ａ（１
０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２−
メルカプトエタノール、５％グリセリン）に溶解し、同
緩衝液にて透析後、イオン交換クロマト方法、分子ふる
いクロマト方法、及びアフィニティークロマト方法等に
よる精製を行い、本制限酵素の酵素標品を得ることがで
きる。また、例えば得られた上清の抽出物を硫酸アンモ
ニウムで塩析する。これにより生じた沈殿物を、緩衝液
Ａ（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセリン）に溶解
し、同緩衝液にて透析後、イオン交換クロマト方法、分
子ふるいクロマト方法、及びアフィニティークロマト方
法等による精製を行い、本制限酵素の酵素標品を得るこ
とができる。
の製造方法について更に詳細に説明する。まず、培養の
際、培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、Ｓｓ
ｅ ８６４７Ｉを生産するものであればよく、炭素源と
しては、例えばグルコース、マルトース、グリセリンな
どが利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当であ
る。そのほかにリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩
などの無機質及び金属塩類を加えても良い。Ｓｓｅ ８
６４７Ｉの生産量は、培養条件により変動するが、一般
に培養温度２０〜３５℃、培地のｐＨ６〜８が良く、１
〜３日間の通気かくはん培養で制限酵素Ｓｓｅ ８６４
７Ｉの生産は最高に達する。培養条件は使用する菌株、
培地組成などに応じ、生産量が最大になるよう設定する
のは当然のことである。本発明の菌株の培養によって生
成された制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉは主に菌体内に存
在する。培養液からの菌体の分離は、例えば遠心分離に
よって行うことができる。本酵素の抽出、精製は、一般
の制限酵素精製法に従った方法で実施しうる。例えば菌
体を緩衝液に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内
酵素の抽出を行う。次に、細胞残渣を超遠心分離により
除去後、例えば、得られた上清の抽出液を緩衝液Ａ（１
０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２−
メルカプトエタノール、５％グリセリン）に溶解し、同
緩衝液にて透析後、イオン交換クロマト方法、分子ふる
いクロマト方法、及びアフィニティークロマト方法等に
よる精製を行い、本制限酵素の酵素標品を得ることがで
きる。また、例えば得られた上清の抽出物を硫酸アンモ
ニウムで塩析する。これにより生じた沈殿物を、緩衝液
Ａ（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセリン）に溶解
し、同緩衝液にて透析後、イオン交換クロマト方法、分
子ふるいクロマト方法、及びアフィニティークロマト方
法等による精製を行い、本制限酵素の酵素標品を得るこ
とができる。
【００１５】制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉの活性測定法
を以下に示す。下記表２に示す組成の反応液４８μｌを
あらかじめ３７℃で予熱した後、本酵素２μｌを加え全
量５０μｌにし酵素反応を進める。１０分後に酵素反応
停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセリン、０．０２％ブ
ロムフェノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止さ
せる。
を以下に示す。下記表２に示す組成の反応液４８μｌを
あらかじめ３７℃で予熱した後、本酵素２μｌを加え全
量５０μｌにし酵素反応を進める。１０分後に酵素反応
停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセリン、０．０２％ブ
ロムフェノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止さ
せる。
【００１６】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── １０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ９．１ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール １．０μｇ ＡＤ−２ＤＮＡ ───────────────────────────────────
【００１７】反応液を０．７％アガローススラブゲルに
重層し、１０Ｖ／ｃｍの定電圧下で約１時間から２時
間、電気泳動を行う。電気泳動用緩衝液は９０ｍＭ ト
リス−ほう酸緩衝液（ｐＨ８．３）２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａを用いる。ゲルに前もって０．５μｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロマイドを含ませておくことにより、ＵＶ照射で
ＤＮＡのバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメント
のバンドの数と量が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は３７℃で１時間に１μｇのＡＤ−２ＤＮＡ
〔Adenovirus−２ＤＮＡ、ベセスダ リサーチ ラボラ
トリー（Bethesda Research Laboratories）社製〕を完
全に切断する酵素活性を１単位とする。
重層し、１０Ｖ／ｃｍの定電圧下で約１時間から２時
間、電気泳動を行う。電気泳動用緩衝液は９０ｍＭ ト
リス−ほう酸緩衝液（ｐＨ８．３）２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａを用いる。ゲルに前もって０．５μｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロマイドを含ませておくことにより、ＵＶ照射で
ＤＮＡのバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメント
のバンドの数と量が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は３７℃で１時間に１μｇのＡＤ−２ＤＮＡ
〔Adenovirus−２ＤＮＡ、ベセスダ リサーチ ラボラ
トリー（Bethesda Research Laboratories）社製〕を完
全に切断する酵素活性を１単位とする。
【００１８】制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉは、以下のよ
うな理化学的性質を持っている。
うな理化学的性質を持っている。
【００１９】（１）作用及び基質特異性 本酵素は二本鎖ＤＮＡ配列中の式（化１）で表される塩
基配列を認識し、かつ矢印の位置で切断する酵素であ
る。本発明の制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉの認識部位の
決定は以下のように行った。制限酵素Ｓｓｅ ８６４７
Ｉは、ＡＤ−２ＤＮＡを８カ所切断した。しかし、λ−
ＤＮＡ、ｐＵＣ１８ＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、Ｓ
Ｖ４０ＤＮＡ、Ｃｏｌ ＥＩ ＤＮＡ、ｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ、φＸ１７４ＤＮＡは切断しなかった。この結果、
及び得られたＤＮＡ断片の鎖長を検索したところ、この
酵素は、ＤＮＡ配列中の下記式（化２）：
基配列を認識し、かつ矢印の位置で切断する酵素であ
る。本発明の制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉの認識部位の
決定は以下のように行った。制限酵素Ｓｓｅ ８６４７
Ｉは、ＡＤ−２ＤＮＡを８カ所切断した。しかし、λ−
ＤＮＡ、ｐＵＣ１８ＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、Ｓ
Ｖ４０ＤＮＡ、Ｃｏｌ ＥＩ ＤＮＡ、ｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ、φＸ１７４ＤＮＡは切断しなかった。この結果、
及び得られたＤＮＡ断片の鎖長を検索したところ、この
酵素は、ＤＮＡ配列中の下記式（化２）：
【００２０】
【化２】
【００２１】を認識していることが示唆された。この７
塩基配列には、内部に、５塩基認識制限酵素ＡｖａII
〔式（化３）〕：
塩基配列には、内部に、５塩基認識制限酵素ＡｖａII
〔式（化３）〕：
【００２２】
【化３】
【００２３】を含んでいることにより、ＡＤ−２ＤＮＡ
を、ＡｖａIIで切断後、更にＳｓｅ８６４７Ｉで切断を
行ったが、得られるＤＮＡ断片のパターンに全く変化が
なく、制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉは、式（化２）を認
識していると結論された。
を、ＡｖａIIで切断後、更にＳｓｅ８６４７Ｉで切断を
行ったが、得られるＤＮＡ断片のパターンに全く変化が
なく、制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉは、式（化２）を認
識していると結論された。
【００２４】制限酵素Ｓｓｅ ８６４７Ｉの切断部位の
決定のため、該酵素の認識配列を有する、配列表の配列
番号１で示すＡＤ−２ＤＮＡのＨｐａＩ−ＢｇｌIIフラ
グメントをＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社製）のＳｍａＩ−
ＢａｍＨＩサイトに挿入して使用した。この切断決定用
プラスミドから、通常の方法を用いて一本鎖ＤＮＡをそ
れぞれ調製した。マルチクローニングサイトの隣接部位
に結合する、配列表の配列番号２で示すＭ１３プライマ
ーＭ４（宝酒造社製）の５′末端を蛍光標識したものを
調製した。上記プライマーを、切断決定用プラスミドよ
り調製した一本鎖ＤＮＡとそれぞれアニールさせた後、
バチルス カルドテナックス(Bacilluscaldotenax）Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（BcaBEST DNA polymerase、宝酒造社
製）により、二本鎖を合成し、その二本鎖ＤＮＡを本酵
素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、切断断片の鎖長を測定する方法を用い行った。
この時、生成物として得られた鎖長は下記式（化４）：
決定のため、該酵素の認識配列を有する、配列表の配列
番号１で示すＡＤ−２ＤＮＡのＨｐａＩ−ＢｇｌIIフラ
グメントをＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社製）のＳｍａＩ−
ＢａｍＨＩサイトに挿入して使用した。この切断決定用
プラスミドから、通常の方法を用いて一本鎖ＤＮＡをそ
れぞれ調製した。マルチクローニングサイトの隣接部位
に結合する、配列表の配列番号２で示すＭ１３プライマ
ーＭ４（宝酒造社製）の５′末端を蛍光標識したものを
調製した。上記プライマーを、切断決定用プラスミドよ
り調製した一本鎖ＤＮＡとそれぞれアニールさせた後、
バチルス カルドテナックス(Bacilluscaldotenax）Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（BcaBEST DNA polymerase、宝酒造社
製）により、二本鎖を合成し、その二本鎖ＤＮＡを本酵
素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、切断断片の鎖長を測定する方法を用い行った。
この時、生成物として得られた鎖長は下記式（化４）：
【００２５】
【化４】
【００２６】の矢印の所で切断されたバンドとして検出
され、またＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ＤＮＡ Poly
merase、宝酒造社製) によるブランティング処理により
３ｂｐ長いバンドとして検出されたことより、本酵素
は、式（化１）で表される塩基配列を認識し、矢印の位
置で切断していると結論された。
され、またＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ＤＮＡ Poly
merase、宝酒造社製) によるブランティング処理により
３ｂｐ長いバンドとして検出されたことより、本酵素
は、式（化１）で表される塩基配列を認識し、矢印の位
置で切断していると結論された。
【００２７】（２）至適酵素活性条件 Ｉ） 至適温度 Ｓｓｅ ８６４７Ｉの至適温度は約３０℃であった。 II） 至適ｐＨ Ｓｓｅ ８６４７Ｉの至適ｐＨは、ｐＨ７．５〜９．５
の範囲にある。 III) 塩濃度 Ｓｓｅ ８６４７Ｉの至適塩濃度は、ＫＣｌ又はＮａＣ
ｌの場合でも０ｍＭであった。 IV） ＭｇＣｌ2 濃度 Ｓｓｅ ８６４７ＩはＭｇＣｌ2 濃度が５ｍＭ〜２０ｍ
Ｍの存在下で酵素反応が活性化された。
の範囲にある。 III) 塩濃度 Ｓｓｅ ８６４７Ｉの至適塩濃度は、ＫＣｌ又はＮａＣ
ｌの場合でも０ｍＭであった。 IV） ＭｇＣｌ2 濃度 Ｓｓｅ ８６４７ＩはＭｇＣｌ2 濃度が５ｍＭ〜２０ｍ
Ｍの存在下で酵素反応が活性化された。
【００２８】（３）分子量の決定 分子量の決定は、密度勾配沈降速度法によって行った。
密度勾配は下記表３の組成の緩衝液中でグリセリン濃度
を変化させて作製した。
密度勾配は下記表３の組成の緩衝液中でグリセリン濃度
を変化させて作製した。
【００２９】
【表３】 表 ３ ──────────────────────── １０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５ １０ｍＭ ２−メルカプトエタノール １００ｍＭ ＫＣｌ １０〜２５％ グリセリン ────────────────────────
【００３０】２本の５ｍｌ容の遠心管に最下層が２５
％、最上層が１０％グリセリンになるように直線密度勾
配液をそれぞれ４．８ｍｌ作成した。更にその上層に１
本は、分子量マーカーロウレンジ（Low Range ）（バイ
オ ラッド社製）１０μｌを上記緩衝液で２００μｌに
希釈し、グリセリンを１０％にしたものを重層し、もう
１本は、Ｓｓｅ ８６４７Ｉ酵素標品４０μｌを同様に
希釈したものを重層した。これらの遠心管を、４℃にお
いてスイングローターを用い、４５０００rpm 、２１時
間、遠心を行った。遠心後の遠心管の上層から順に２５
０μｌずつ緩衝液を抜き取り、フラクションＮｏ. １〜
２０とした。分子量マーカーロウレンジのフラクション
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、酵素標品のフラクション
は活性測定を行った。酵素活性のピークは、フラクショ
ンＮｏ. １２に検出され、それは分子量マーカーのフラ
クションと照らし合せて、６〜７．５万と推定された。
よってＳｓｅ ８６４７Ｉの分子量は、約６〜７．５万
と推定される。
％、最上層が１０％グリセリンになるように直線密度勾
配液をそれぞれ４．８ｍｌ作成した。更にその上層に１
本は、分子量マーカーロウレンジ（Low Range ）（バイ
オ ラッド社製）１０μｌを上記緩衝液で２００μｌに
希釈し、グリセリンを１０％にしたものを重層し、もう
１本は、Ｓｓｅ ８６４７Ｉ酵素標品４０μｌを同様に
希釈したものを重層した。これらの遠心管を、４℃にお
いてスイングローターを用い、４５０００rpm 、２１時
間、遠心を行った。遠心後の遠心管の上層から順に２５
０μｌずつ緩衝液を抜き取り、フラクションＮｏ. １〜
２０とした。分子量マーカーロウレンジのフラクション
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、酵素標品のフラクション
は活性測定を行った。酵素活性のピークは、フラクショ
ンＮｏ. １２に検出され、それは分子量マーカーのフラ
クションと照らし合せて、６〜７．５万と推定された。
よってＳｓｅ ８６４７Ｉの分子量は、約６〜７．５万
と推定される。
【００３１】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００３２】実施例１ （１）制限酵素Ｓｓｅ ８６４７１の精製 １００ｍｌ容の三角フラスコに下記表４に示す培地２０
ｍｌを、また、２リットル容の三角フラスコ４本に同培
地５００ｍｌをそれぞれ仕込み、常法により培地を滅菌
した。上記１００ｍｌ容の三角フラスコに仕込んだ培地
で、３０℃４８時間振とう培養したストレプトミセスエ
スピーＹＨ８６４７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２２）の培
養液を上記２リットル容の三角フラスコに仕込んだ培地
に各５ｍｌずつ加えて、３０℃で４８時間培養した。こ
の培養液から冷却遠心分離により４３．３ｇの菌体を得
た。
ｍｌを、また、２リットル容の三角フラスコ４本に同培
地５００ｍｌをそれぞれ仕込み、常法により培地を滅菌
した。上記１００ｍｌ容の三角フラスコに仕込んだ培地
で、３０℃４８時間振とう培養したストレプトミセスエ
スピーＹＨ８６４７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２２）の培
養液を上記２リットル容の三角フラスコに仕込んだ培地
に各５ｍｌずつ加えて、３０℃で４８時間培養した。こ
の培養液から冷却遠心分離により４３．３ｇの菌体を得
た。
【００３３】
【表４】 表 ４ ─────────────────────────── グリセリン １７．５ｇ ポリペプトン ３．５ｇ 肉エキス ３．５ｇ 酵母エキス ３．５ｇ 食 塩 ２．０ｇ リン酸水素二カリウム １．０ｇ 硫酸マグネシウム ０．５ｇ 水 道 水 １リットル ─────────────────────────── ｐＨ ７．２〜７．４
【００３４】得られた４３．３ｇの菌体を１３０ｍｌの
緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波
破砕機を用いて破砕後、１０００００×Ｇで１時間遠心
分離を行い、残渣を除去、抽出液１４８ｍｌを得た。得
られた上清にＫＣｌを０．２Ｍになるように加え、あら
かじめＫＣｌを０．２Ｍ含む緩衝液Ａで平衡化させてお
いたホスホセルロースＰ１１（ワットマン社製）７０ｍ
ｌのカラムに吸着させ、ＫＣｌを０．２Ｍ含む緩衝液Ａ
で洗浄後、０．２〜０．８Ｍ ＫＣｌの直線濃度勾配を
持つ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性画分を合せ、
緩衝液Ａで４時間透析後、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン社製）
８．５ｍｌのカラムに吸着させ、緩衝液Ａで十分洗浄
後、０〜０．８Ｍ ＫＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液
Ａで溶出させた。更に、得られた活性画分を合せ、緩衝
液Ａで４時間透析後、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化した
ヘパリン−セファロース（ファルマシア社製）２ｍｌの
カラムに吸着させ、緩衝下記Ａで十分洗浄後、０〜０．
８ＭのＫＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出し、
本酵素の標品を得た。この酵素標品には非特異的なＤＮ
Ａ分解酵素及びホスファターゼは混入していなかった。
以上述べた方法により４３．３ｇの湿菌体より約６００
単位の活性が得られた。
緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波
破砕機を用いて破砕後、１０００００×Ｇで１時間遠心
分離を行い、残渣を除去、抽出液１４８ｍｌを得た。得
られた上清にＫＣｌを０．２Ｍになるように加え、あら
かじめＫＣｌを０．２Ｍ含む緩衝液Ａで平衡化させてお
いたホスホセルロースＰ１１（ワットマン社製）７０ｍ
ｌのカラムに吸着させ、ＫＣｌを０．２Ｍ含む緩衝液Ａ
で洗浄後、０．２〜０．８Ｍ ＫＣｌの直線濃度勾配を
持つ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性画分を合せ、
緩衝液Ａで４時間透析後、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン社製）
８．５ｍｌのカラムに吸着させ、緩衝液Ａで十分洗浄
後、０〜０．８Ｍ ＫＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液
Ａで溶出させた。更に、得られた活性画分を合せ、緩衝
液Ａで４時間透析後、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化した
ヘパリン−セファロース（ファルマシア社製）２ｍｌの
カラムに吸着させ、緩衝下記Ａで十分洗浄後、０〜０．
８ＭのＫＣｌの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出し、
本酵素の標品を得た。この酵素標品には非特異的なＤＮ
Ａ分解酵素及びホスファターゼは混入していなかった。
以上述べた方法により４３．３ｇの湿菌体より約６００
単位の活性が得られた。
【００３５】
【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明によ
り二重鎖ＤＮＡの７塩基配列を認識し、切断する制限酵
素が提供された。本発明の酵素は遺伝子工学の分野にお
いて、長鎖ＤＮＡの解析等に非常に有用である。
り二重鎖ＤＮＡの７塩基配列を認識し、切断する制限酵
素が提供された。本発明の酵素は遺伝子工学の分野にお
いて、長鎖ＤＮＡの解析等に非常に有用である。
【００３６】
【００３７】配列番号：1 配列の長さ：253 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： AACCTACACC AGTGTAAAAG AGGTATCTTT TGTGTGGTCA AGCAGGCCAA ACTTACCTAC 60 GAAAAAACCA CTACCGGCAA CCGCCTCAGC TACAAGCTAC CCACCCAGCG CCAAAAACTG 120 GTGCTTATGG TGGGAGAAAA ACCTATCACC GTCACCCAGC ACTCGGCAGA AACAGAGGGC 180 TGCCTGCACT TCCCCTATCA GGGTCCAGAG GACCTCTGCA CTCTTATTAA AACCATGTGT 240 GGTATTAGAG ATC 253
【００３８】配列番号：2 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする、ストレプトミセス エスピーＹＨ８４６７（St
reptomyces sp.YH8647）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２２）
より取得可能な制限酵素。（イ）作用： 二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式（化
１）： 【化1】 （式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃ
はシトシンを示す）で表される塩基配列を特異的に認識
し、かつこれを矢印の位置で特異的に切断する能力を有
する。 （ロ）至適温度：約３０℃ （ハ）至適ｐＨ：ｐＨ７．５〜９．５ （ニ）密度勾配沈降速度法による分子量：６〜７．５万 - 【請求項２】 ストレプトミセス エスピーＹＨ８４６
７（Streptomyces sp.YH8647）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０
２２）を培養し、培養物より請求項１記載の制限酵素を
採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6194602A JP3017019B2 (ja) | 1994-07-28 | 1994-07-28 | 新規制限酵素 |
| DE69516060T DE69516060T2 (de) | 1994-07-28 | 1995-07-03 | Eine neue Restriktionsendonuklease |
| EP95304654A EP0698663B1 (en) | 1994-07-28 | 1995-07-03 | A novel restriction endonuclease |
| US08/507,615 US5726052A (en) | 1994-07-28 | 1995-07-26 | Restriction endonuclease |
| CN95108991A CN1062904C (zh) | 1994-07-28 | 1995-07-27 | 限制性核酸内切酶 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6194602A JP3017019B2 (ja) | 1994-07-28 | 1994-07-28 | 新規制限酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838171A JPH0838171A (ja) | 1996-02-13 |
| JP3017019B2 true JP3017019B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=16327284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6194602A Expired - Fee Related JP3017019B2 (ja) | 1994-07-28 | 1994-07-28 | 新規制限酵素 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5726052A (ja) |
| EP (1) | EP0698663B1 (ja) |
| JP (1) | JP3017019B2 (ja) |
| CN (1) | CN1062904C (ja) |
| DE (1) | DE69516060T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7989184B2 (en) * | 2005-07-26 | 2011-08-02 | Takara Bio Inc. | Endoribonuclease |
| CN103108950B (zh) * | 2010-09-16 | 2015-04-01 | 独立行政法人海洋研究开发机构 | 新的细胞外分泌型核酸酶 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3420298A1 (de) * | 1984-05-30 | 1985-12-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Restriktionsendonuklease dra ii, ihre gewinnung und verwendung |
| US4935357A (en) * | 1986-02-05 | 1990-06-19 | New England Biolabs, Inc. | Universal restriction endonuclease |
| SU1532583A1 (ru) * | 1988-03-15 | 1989-12-30 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 |
| US4975376A (en) * | 1988-04-02 | 1990-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Class II restriction endonuclease KspI and a process for obtaining it |
| JPH02255086A (ja) * | 1989-03-29 | 1990-10-15 | Nisshin Seito Kk | 新規制限酵素及びその製造法 |
| SU1650697A1 (ru) * | 1989-05-11 | 1991-05-23 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I |
| DE3938143A1 (de) * | 1989-11-16 | 1991-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Typ ii-restriktionsendonuklease sgrai |
| US5192675A (en) * | 1990-03-20 | 1993-03-09 | Life Technologies, Inc. | Cloned KpnI restriction-modification system |
| JPH0669373B2 (ja) * | 1990-06-25 | 1994-09-07 | 寳酒造株式会社 | 新規制限酵素 |
| US5300432A (en) * | 1991-10-18 | 1994-04-05 | Stratagene | Octanucleotide restriction endonuclease, Srf I, and method for producing the same |
| US5292651A (en) * | 1992-05-12 | 1994-03-08 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the NaeI restriction endonuclease and methylase |
| US5391487A (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-21 | Promega Corporation | Restriction endonuclease SgfI from Streptomyces griseoruber |
| EP0655496A3 (en) * | 1993-11-30 | 1996-07-17 | Takara Shuzo Co | Restriction endonuclease Sse 1825I. |
-
1994
- 1994-07-28 JP JP6194602A patent/JP3017019B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-03 DE DE69516060T patent/DE69516060T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-03 EP EP95304654A patent/EP0698663B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-26 US US08/507,615 patent/US5726052A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-27 CN CN95108991A patent/CN1062904C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0698663B1 (en) | 2000-04-05 |
| DE69516060T2 (de) | 2001-01-11 |
| CN1062904C (zh) | 2001-03-07 |
| JPH0838171A (ja) | 1996-02-13 |
| CN1120069A (zh) | 1996-04-10 |
| EP0698663A1 (en) | 1996-02-28 |
| DE69516060D1 (de) | 2000-05-11 |
| US5726052A (en) | 1998-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Catterall et al. | Isolation and properties of a thermostable restriction endonuclease (ENDO R-Bst1503) | |
| JP3017019B2 (ja) | 新規制限酵素 | |
| US5354669A (en) | Type II restriction endonuclease SexAI | |
| US4886756A (en) | Novel restriction endonuclease SplI and process for the production of the same | |
| EP0076696A2 (en) | A restriction enzyme and a method for production thereof | |
| US6238904B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HpyCH4III, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same | |
| EP0464990B1 (en) | New restriction enzyme | |
| JP3498806B2 (ja) | 新規制限酵素 | |
| US5496717A (en) | Restriction endonuclease | |
| US5196330A (en) | Type ii restriction endonuclease, pme i, obtainable from pseudomonas mendocina and a process for producing the same | |
| JPH10127279A (ja) | 制限酵素 | |
| US4833082A (en) | New restriction enzyme and process for producing the same | |
| US4588689A (en) | Restriction endonuclease XcyI | |
| US6258583B1 (en) | Type II restriction endonuclease, Hpy188I, obtainable from helicobacter pylori J188 and a process for producing the same | |
| JPS594115B2 (ja) | 新核酸分解酵素及びその製造法 | |
| US6238901B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HPY 188 III, obtainable from Helicobacter pylori J188 and a process for producing the same | |
| US6194188B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HpyCH4IV, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same | |
| JPH0667318B2 (ja) | クラスｉｉ−制限酵素、その作成法及び、相補的二本鎖ｄｎａ−配列の認識及び切断法 | |
| JP3092817B2 (ja) | 制限酵素の製造方法 | |
| JPH04258290A (ja) | Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法 | |
| US5470732A (en) | Restriction enzyme from Brevibacterium linens | |
| US4724209A (en) | Process for producing restriction enzyme | |
| US6280992B1 (en) | Type II restriction endonuclease, Hpy99I, obtainable from Helicobacter pylori J99 and a process for producing the same | |
| KR0147778B1 (ko) | 제한효소 | |
| GB2183657A (en) | New restriction enzyme and process for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |