DE3420298A1 - Restriktionsendonuklease dra ii, ihre gewinnung und verwendung - Google Patents

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die neue Typ II-Restriktionsendonuklease Dra II, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung.

Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang eine. Typ II-Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.

Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ II-Restriktionsendonukleasen, die für DNA-Sequenzen spezifisch sind, die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist durch die palindrome Erkennungssequenz

5' Pu g|"G N C C Py 3¹ 3¹ Py CC N GIG Pu 5¹

Vorzugsweise weist dieses Enzym die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle auf, jedoch sind auch andere Spaltstellen innerhalb dieser Sequenz möglich.

Die erfindungsgemäße neue Typ-II-Restriktionsendonuklease, die im folgenden als Dra II bezeichnet wird, besitzt ein Temperaturoptimum bei 37⁰C und ein pH-Optimum bei 8,2. Weitere optimale Reaktionsparameter sind 25 iriM

2+
NaCl, 8 bis 12 mM Mg und 1 mM DDT. Die Anwesenheit

2+
von Mg ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.

Ein zu Dra II isoschizomeres Enzym ist nicht bekannt.

Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des Doppelstrangs die identische Sequenz in gegenläufiger Richtung aufweist.

Die Erkennungssequenz läßt sich durch vollständigen Verdau der DNAs des Plasmids pBR 322, des Virus SV40 und des Phagen Lambda mit Dra II bestätigen.

Dra II spaltet pBR 322 DNA an den Positionen 523, 1438, 1480 und 4343 innerhalb der Sequenzen AGGCCCC, GGGTCCT,AGGACCC und AGGCCCT. Dadurch entstehen Fragmente der Länge 2863, 915, 543 und 42 Basenpaare (bp).

Dra II spaltet SV40 DNA an den Positionen 523, 2194 und 2753 innerhalb der Sequenzen GGGACCT, GGGCCCT und GGGGCCT. Dadurch entstehen Fragmente der Länge 3033, 1671 und 539 bp.

Dra II spaltet Lambda DNA an den Positionen 2815, 28797 und 48473 innerhalb der Sequenzen GGGACCT, GGGTCCC und GGGTCCT. Dadurch entstehen Fragmente der Länge 22982, 19640, 2815 und 29 bp.

Die durch Dra Il-Verdau der drei analysierten DNAs spezifisch erhaltenen und in Agarose- und Polyacrylamidgelen eindeutig nachgewiesenen Fragmente zeigen, daß Dra II die Spaltstelle Pu G G N C C C Py erkennt.

Die Erkennungssequenz und Schnittstelle innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms läßt sich wie folgt feststellen: Die DNA des Plasmids pBR 322 wird mit EcoRI durch Spaltung an Position 4361 (Positionsangabe bezogen auf den (+)-Strang) linearisiert. Beide Stränge dieser linearisierten DNA werden in zwei parallelen, unterschiedlichen Reaktionen terminal markiert. Der (-)-Strang wird am 5'-Ende an Position 2 mit gamma-(³²P)-ATP und T4 Polynucleotid Kinase phosphoryliert. In der zweiten Reaktion wird der komplementäre (+)-Strang an 3'Ende an Position 4361 mit alphä-(³²P)-dATP und Klenow-Polymerase um 2 Nucleotide verlängert. Um eine einheitliche Länge des markierten (+)-Stranges zu erzielen, wird noch mit unmarkiertem dATP und Klenow-Polymerase nachinkubiert. Der (+)-Strang endet somit an Position 4363. Beide unterschiedlich markierten DNAs werden anschließend mit Bam HI an Position 378 nachgespalten.

Aus den jeweils entstehenden 5'- und 3'-terminal markierten Fragmenten (3986 (5¹) / 3988 (3¹) und 377 (5¹)/ 379 (3¹); Länge der markierten Einzelstränge) wird das 3986 (5¹) bzw. 3988 (3¹) Fragment (Position 380 bis einschließlich Position 2 (5¹), Position 376 bis einschließlich Position 4363 (3¹) isoliert. Das 3' markierte Fragment wird sequenziert. Zusätzlich wird jeweils ein Aliquot der isolierten 3986 (5¹) bzw. 3988 (3') Fragmente mit dem erfindungsgemäßen Enzym Dra II gespalten und die Länge der 5' bzw. 3¹ markierten

Einzelstränge in dem Sequenzgel durch Vergleich mit der 3·-Sequenzleiter bestimmt. Dabei ergibt sich auf dem 5'-terminal markierten Strang die Spaltposition 4348 und auf dem 3'-terminal markierten Strang die Spaltposition 4344.

Die Längenbestimmung des 5'-markierten (-)-Einzelstranges des Dra II-Eco RI-Fragmentes erfolgt folgendermaßen:

Der an Position 2 5'-markierte (-)-Einzelstrang läuft identisch mit dem inneren also 3'-ständigen G an Position 4345 der 3'-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungs sequenz en 5' AGGCCCTS'. Der 5'-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des (-)-Stranges an Position 4348 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Dra II auf dem 5'-markierten (-)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 4348 und G an Position 4347.

Analog wird die Länge des komplementären 3'-markierten (+)-Einzelstranges des Dra II Eco RI Fragmentes bestimmt. Der an Position 4363 3'-markierte (+)-Einzelstrang läuft identisch mit dem äußeren, also 5' ständigen G an Position 4344 der 3'-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz 5' AGGCCCT 3'. der 3'-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des (+)-Stranges an Position 4345 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Dra II auf dem 3·-markierten (+)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 4344 und G an Position 4345.

Erfindungsgemäß wird Dra II gewonnen, indem man Deinococcus radiophilus DSM 20551 züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung können die üblichen

biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet werden,
wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das
Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner
Erkennungssequenz leicht nachgewiesen werden kann. Als Substrat eignet sich beispielsweise pBR 322-DNA. Die
erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch
aufgetrennt.

Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Mikroorganismus Deinococcus radiophilus, DSM 20551 wächst aerob im TGYM-Medium ATCC 679. Die Zellen kommen einzeln oder paarweise, in uneinheitlichen Tetraedern oder kubischen Verbänden in mehr als einer Ebene vor. Der Durchmesser der Zellen liegt bei 1,0 bis 2,5 μΐΐι. Auf Agar werden
rosa bis rote, glatte, schwach konvexe Kolonien mit
gleichmäßigem Rand gebildet. Der Organismus ist
grampositiv. Die Zellwand besteht aus Galaktose,
Glucose, Mannose, Alanin, Glutaminsäure, Lysin,
Glucosamin und Muraminsäure. Der Hauptbestandteil ist
ein Peptidoglycan.

Optimale Wachstumsbedingungen 10 bis 30⁰C, pH 7,0, die Verdoppelungszeit beträgt etwa 2 Stunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der Extrakt wird bei 13000 Upm für 45^! zentrifugiert. Für
den Aufschluß eigenen sich die üblichen mechanischen
Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion oder Ultraschall.

Feinreinigung der das neue Enzym enthaltenden Ammonsulfatfraktion kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie, Chromatographie über Anionenaustauscher und Rechromatographie an einer Affinitätssäule erfolgen. Als Anionenaustauscher eignen sich mit Diethylaminoethylgruppen modifizierte Trägermaterialien auf Basis Sepharose, Cellulose oder synthetischen Polymeren.

Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Deinococcus radiophilus ATCC 27603 wird in TGYM-Medium bei 30⁰C 20 Stunden gezüchtet und in der spaten Log- bzw. stationären Phase geerntet.

TGYM-Medium hat folgende Zusammensetzung: Trypton 5,0g, Glucose 1,0 g, Hefeextrakt 3,0 g, DL-Methionin 0,5 g ad 1 1 mit H₂O dest. Ausbeute ca. 150 g Trockenmasse/1001 Medium.

24 g Zellpaste werden in 60 ml Aufschlußpuffer = TEMG-Puffer: (40 mmol/1 Tris/HCl), pH 8,0/4⁰C; 0,1 mmol/1 EDTA, 7 mmol/1 2-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin) suspendiert. Dann werden die Zellen durch Hochdruckdispersion in einer vorgekühlten Druckzelle bei 1100 bar einmal aufgeschlossen. Aktivität etwa 100 000 U Dra II. Die AufSchlußsuspension wird anschließend für 45 Minuten bei 13000 Upm und 4⁰C zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Das Enzym befindet sich im überstand.

Beispiel 2

Der nach Beispiel 1 erhaltene Überstand wird über die Heparin-Sepharose-Säule (2x18cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 1,0 mol/1 NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen 0,1 bis 0,3 mol/1 NaCl. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird über eine mit TEMG-Puffer äquilibrierte Anionenaustauschersäule (DEAE-Cellulose DE 52 (Whatman) 1x18 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 0,4 mol/1 NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen 0,15 bis 0,35 mol/1 NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird über eine Heparin-Sepharose-Säule (1x10 cm) rechromatographiert.

Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 0,5 mol/1 NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen mit 0,1 bis- 0,3 mol/1 NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 20 mmol/1 Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,1 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 2-Mercaptoethanol, 100 mmol/1 NaCl, 50 % Glycerin, 0,01 % Thesit dialysiert.

Man erhält so ca. 70 000 U.
Aktivitätsbestimmung:
Einheitendefinition:

1 U Dra II spaltet 1 ng pBR 322-DNA innerhalb 1 Stunde bei 37°C in 25 μΐ vollständig.

In eine Mischung aus 12,5 μΐ Inkubationspuffer, enthaltend 0,02 mol/1 Tris HCl pH 8,2/37°C, 0,02 MgCl₃, 0,05 mol/1 NaCl, 0,002 mol/1 Dithioerythrit werden 6,5 μΐ H₂O und 5*ul pBR 322-DNA (4 OD/ml Extinktion (Optical Density) E=4 bei 260 nm und entspricht einer Konzentration von ca. c=0,2 mg/ml) sowie 1 μΐ Drall Lösung (lu/μΐ) gegeben. Die Lösung wird eine Stunde bei 37⁰C gehalten, auf Eis abgekühlt und mit 5 μΐ kalter Stoplösung, enthaltend 7 M Harnstoff, 20 Gew.-/V-% Saccharose, 0,06 mol/1 EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau versetzt. Dann wird auf l%igem Agarosegel 3 bis 4 Stunden bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die erhaltenen Banden werden gegenüber DNA-Längenstandard identifiziert.

Claims (8)

Patentansprüche

1. Restriktionsendonuklease, gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz

5' Pu GGNCC Py 3¹ 3¹ Py CCNGG Pu 5'.

2. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle

5' Pu g|g N C C Py 3' 3¹ Py CCN GiG Pu 5¹.

3. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Temperaturoptimum bei 37⁰C und ein pH-Optimum bei 8,2.

4. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man Deinococcus radiophilus DSM 20551 (ATCC 27603) züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt bei 13000 Upm für 45' zentrifuiert und den überstand gewinn.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Feinreinigung den überstand einer Affinitätschromatographie, einer Chromatographie über schwach basischen Anionenaustauscher und einer Rechromatographie an einer Affinitätssäule unterzieht.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.

8. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 oder 2 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz 5'-PuGGNCCPy-S'.