DE69731315T2

DE69731315T2 - Fehlpaarungen erkennende endonukleasen und deren verwendung zur erkennung von mutationen in ziel-polynukleotidsträngen

Info

Publication number: DE69731315T2
Application number: DE69731315T
Authority: DE
Inventors: T. Anthony YEUNG
Original assignee: Fox Chase Cancer Center
Current assignee: Fox Chase Cancer Center
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-05-21
Also published as: ES2231872T3; AU3284597A; CA2256526A1; JP2000511774A; DE69731315D1; EP0964929A1; JP4213214B2; AU721493B2; WO1997046701A1; EP0964929A4; ATE280245T1; CA2256526C; EP0964929B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zur Detektion von Mutationen in Ziel-Nucleinsäuren. Insbesondere stellt die Erfindung neue, fehlgepaarte spezifische Nucleasen und Verfahren zur Verwendung des Enzyms bereit, die das genetische Screenen von Erbkrankheiten und Krebs erleichtern. Das Verfahren ist auch zur Detektion von genetischen Polymorphismen nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In dieser Anmeldung wird durch Zahlen in Klammern auf einige Veröffentlichungen verwiesen, um den Stand der Technik, auf die sich auch diese Erfindung bezieht, genauer zu beschreiben. Die vollständigen Zitate zu diesen Verweisen sind am Ende der Beschreibung zu finden. Die Offenbarung jeder dieser Veröffentlichungen ist durch Verweis in der vorliegenden Beschreibung aufgenommen.
Die Sequenz von Nucleotiden innerhalb eines Gens kann auf zahlreiche verschiedene Arten durch Mutation geändert oder "fehlgepaart" werden, wobei die häufigste Art Basenpaar-Substitutionen, Rahmenverschiebungs-Mutationen und Deletionen oder Insertionen darstellen. Diese Mutationen können durch Umweltfaktoren induziert werden, wie beispielsweise durch Strahlung und mutagene Chemikalien; auch werden gelegentlich von DNA-Polymerasen während der Replikation Fehler begangen. Zahlreiche menschliche Krankheitszustände treten aufgrund von mangelnder Zuverlässigkeit bei DNA-Replikation auf. Mukoviszidose, Sichelzellanämie und manche Karzinome werden durch einzelne Basenveränderungen in der DNA hervorgerufen, was zur Synthese von abnormen oder nicht funktionellen Proteinen führt.
Die hohe Wachstumsrate von Pflanzen und der Überfluss an DNA-Interkalatoren in Pflanzen lässt auf eine verstärkte Neigung zur Fehlpaarungs- und Rahmenverschiebungsläsionen schließen. Von Pflanzen und Pilzen ist bekannt, dass sie über einen Überfluss an einzelsträngigen, spezifischen Nucleasen verfügen, die sowohl DNA als auch RNA angreifen (9–14). Von manchen von diesen, wie beispielsweise von der Nuclease α von Ustilago maydis, wird angenommen, dass sie an Genkonversion während DNA-Rekombination beteiligt sind (15, 16). Von diesen Nucleasen sind S1-Nuclease aus Aspergillus oryzue (17), P1-Nuclease aus Penicillium citrinum (18) und Mungbohne-Nuclease (Grüne-Sojabohnen-Nuclease) aus den Sprösslingen von Vigna radiata (19–22) diejenigen, die am besten charakterisiert sind. S1-, P1- und die Mungbohne-Nuclease sind Zn-Proteine, die hauptsächlich nahe bei pH 5,0 aktiv sind, während Nuclease α bei pH 8,0 aktiv ist. Die Eigenschaft der Einzelsträngigkeit von DNA-Läsionen scheint vom Pflanzenenzym, der SP-Nuclease, für voluminöse Adduktreparatur genutzt worden zu sein. Die Nuclease SP, aus Spinat gereinigt, ist eine einzelsträngige DNase, eine RNase, und ist in der Lage, DNA an TC_6-4-Dimeren und Cisplatin-Läsionen zu schneiden, und dies alles bei neutralem pH (23, 24). Bisher ist nicht bekannt, ob SP DNA an Fehlpaarungen schneiden kann.
Bei Escherichia coli werden Läsionen von Basen-Substitution und ungepaarte DNA-Schleifen durch ein Methylierungs-gerichtetes Langbereichsreparatursystem repariert. Die Proteine in diesem Multienzym-System umfassen MutH, MutL und MutS (1, 2). Dieses System ist effizient, doch die C/C-Läsion und DNA-Schleifen, die mehr als 4 Nucleotide umfassen, werden nicht repariert. Die MutS- und MutL-Proteine sind von Bakterien bis hin zu Menschen konserviert und scheinen auch in höheren Organismen ähnliche Reparaturfunktionen übernehmen zu können. Bei manchen der durch das MutS/MutL-System nicht gut reparierten Läsionen und bei Genkonversion, bei denen Kurzbereichsreparatursysteme möglicherweise wünschenswerter sind, werden andere Fehlpaarungs-Reparatursysteme mit neuen Fähigkeiten benötigt.
Zur Zeit ist das direkteste Verfahren zur Mutationsanalyse DNA-Sequenzieren ist, jedoch ist es das arbeitsintensivste und teuerste Verfahren. Üblicherweise ist es nicht praktisch, alle potentiell relevanten Regionen jeder Experimentsprobe zu sequenzieren. Anstelle dessen wird üblicherweise eine Art von vorläufigem Screening-Verfahren verwendet, um nur jene Proben zu identifizieren und zum Sequenzieren zu richten, die Mutationen enthalten. Einzelsträngiger Konformationspolymorphismus (SSCP = Single stranded conformational polymorphism) ist ein weitverbreitetes Screening-Verfahren, das auf Mobilitätsunterschieden zwischen einzelsträngigen Wildtyp-Sequenzen und mutierten Sequenzen auf nativen Polyacrylamid-Gelen basiert. Andere Verfahren basieren auf Mobilitätsunterschieden in Wildtyp/Mutanten-Heteroduplexen (im Vergleich zu Kontroll-Homoduplexen) auf nativen Gelen (Heteroduplex-Analyse) oder denaturierenden Gelen (denaturierende Gradientengel-Elektrophorese). Während die Vorbereitung der Proben in diesen Tests relativ einfach ist, sind äußerst exakte Bedingungen für die Elektrophorese erforderlich, um die oft sehr subtilen Mobilitätsunterschiede hervorzubringen, die die Grundlage zur Identifikation der Targets, die Mutationen enthalten, bilden. Ein anderer maßgeblicher Parameter ist die Größe der gescreenten Zielregion. Im Allgemeinen wird SSCP verwendet, um Zielregionen zu screenen, die nicht länger als etwa 200–300 Basen sind. Die Zuverlässigkeit von SSCP zur Detektion einzelsträngiger Mutationen ist nicht 100%ig gegeben, doch sie liegt wahrscheinlich im Bereich von 70–90% für Targets, die kürzer als 200 Basen lang sind. Steigt die Größe der Zielregion, so sinkt die Detektionsrate, in einer Studie beispielsweise von 87% bei 183-bp-Targets auf 57% bei 307-bp-Targets (35). Die Fähigkeit, längere Regionen in einem einzigen Schritt zu screenen, würde die Nützlichkeit jedes Mutations-Screeningverfahrens erheblich steigern.
Eine andere Art von Screeningverfahren, das gegenwärtig eingesetzt wird, basiert auf dem Spalten von ungepaarten Basen in Heteroduplexen, die zwischen Wildtyp-Sonden gebildet sind, die an experimentelle, Punktmutationen enthaltende Targets hybridisiert sind. Die Spaltprodukte werden auch durch Gel-Elektrophorese untersucht, da sich Teilfragmente, die sich durch Spalten der Sonde an einer Fehlpaarung bilden, hinsichtlich der Größe im Allgemeinen signifikant von nicht gespalteten Volllängen-Sonden unterscheiden und mit einem Standard-Gelsystem leicht zu detektieren sind. Das Spalten von Fehlpaarungen wurde bisher entweder chemisch (Osmiumtetroxid, Hydroxylamin) oder mittels einer weniger toxischen, enzymatischen Alternative unter Verwendung von RNase A durchgeführt. Auch der RNase-A-Spaltungs-Test wurde eingesetzt, wenn auch nicht so häufig, um endogene mRNA-Targets auf Mutationen zu screenen, um Mutationen in durch PCR amplifizierte DNA-Targets zu detektieren. Eine Mutationsdetektionsrate von über 50% wurde für das originale RNase-Screeningverfahren berichtet (36).
Ein neueres Verfahren zur Detektion von Mutationen in DNA beruht auf DNA-Ligase, die sich kovalent an zwei benachbarte Oligonucleotide bindet, die an eine komplementäre Zielnucleinsäure hybridisiert sind. Die Fehlpaarung muss an der Stelle der Ligation auftreten. Wie bei anderen Verfahren, die mit Oligonucleotiden arbeiten; spielen Salzkonzentration und Temperatur bei der Hybridisierung eine zentrale Rolle. Ein weiterer Aspekt, der in Betracht gezogen werden muss, ist die Menge an zugesetztem Enzym im Verhältnis zur DNA-Konzentration.
Die zuvor erwähnten Verfahren können eine Basenveränderung in einer Nucleinsäure, die mit mehr als 80% einer Hintergrund-Nucleinsäure, wie normaler oder Wildtyp-Sequenzen, verunreinigt ist, nicht zuverlässig detektieren. Probleme der Verunreinigung sind bei der Detektion von Krebs maßgeblich, bei der eine maligne Zelle, beispielsweise im Blutkreislauf, in äußerst geringen Mengen vorhanden ist. Den derzeit in Verwendung stehenden Verfahren mangelt es an angemessener Empfindlichkeit, um im Rahmen solcher klinischen Untersuchungen praktisch angewendet werden zu können.
Ein Verfahren zur Detektion von Genmutationen mit Fehlpaarungs-Reparaturenzymen wird von Lu-Chang und Hsu beschrieben. Siehe WO 93/20.233. Das Produkt des MutY-Gens, das fehlgepaarte A/G-Reste erkennt, wird in Verbindung mit einem anderen Enzym verwendet, das in dem Literaturhinweis als ein "all type enzyme" (Enzym aller Typen) beschrieben wird, das an allen Basenpaar-Fehlpaarungen nicken kann. Das Enzym detektiert jedoch keine Insertionen und Deletionen. Auch erkennt das Enzym aller Typen verschiedene Fehlpaarungen nur mit unterschiedlicher Effizienz, und seine Aktivität kann durch flankierende DNA-Sequenzen beeinträchtigt werden. Dieses Verfahren beruht daher auf einem Mix aus Fehlpaarungs-Reparaturenzymen und DNA-Glykosylasen, um die Vielzahl von Mutationen zu detektieren, die in einem bestimmten DNA-Molekül auftreten können.
Die US 5.459.039 beschreibt ein Verfahren zur Detektion von Basensequenzunterschieden innerhalb homologer Regionen zweier DNA-Moleküle, umfassend das Kontaktieren von DNA-Duplexen mit einem Protein, das im Wesentlichen alle Basenpaar-Fehlpaarungen erkennt. Das Fehlpaarungs-Erkennungsprotein ist das Produkt des mutS-Gens von E. coli.
In der US 5.571.676 ist ein High-Throughput-Verfahren zur Identifikation einer oder mehrerer genetischer Veränderungen in einer Ziel-DNA-Sequenz beschrieben. Das beschriebene Verfahren verwendet zahlreiche Proteine, um Fehlpaarungen zu detektieren, und resultiert in der Bildung eines Gapped-Heteroduplex, in dem die Lücke in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 2.000 Basen in der Länge liegen kann.
In "Biochemical properties and hormonal regulation of barley nuclease", Brown et al., Eur. J. Biochem. 168, 357–364 (1987), werden die biochemischen Eigenschaften und die hormonelle Regulierung einer aus Gerste isolierten Nuclease erläutert. Brown et al. beschreiben für Gersten-Nuclease, dass sie in der Lage ist, RNA > denaturierte DNA > native DNA zu hydrolysieren, und gibt für Gersten-Nuclease an, dass sie endonucleolytische Aktivität besitzt.
Die Eigenschaften von Mungbohne-Nuclease werden in "Mung Bean Nuclease I. Physical, Chemical, and Catalytic Properties", Kowalski et al., Biochemistry 15(20), 4457–4463 (1976), und "Mung Bean Nuclease I. Terminally Directed Hydrolysis of Native DNA", Kroeker et al., Biochemistry 15(20), 4463–4467 (1976), erläutert. In diesen Literaturhinweisen wird angegeben, dass Mungbohne-Nuclease als eine einzelsträngige spezifische Nuclease funktioniert, jedoch bei einem pH über 6 inaktiv ist.
In "Changes in site specificity of single-strand-specific endonucleases on supercoiled PM2 DNA with temperature and ionic environment", Kowalski et al., Nucleic Acids Research 12(18) (Sept. 1984), wird von Veränderungen an der Ortsspezifität von Mungbohne-Nuclease als ein Resultat von Umwelteinflüssen auf die Konformation von superspiralisierter DNA berichtet.
Eine aus Weizen isolierte Nuclease, für die herausgefunden wurde, dass sie die Hydrolyse von denaturierter DNA, rRNA und 3'-AMP katalysiert, wird in "Enzymes of Nucleic Acid Metabolism from Wheat Seedlings", Hanson and Fairley, The Journal of Biological Chemistry 244(9), 2240–2249, erläutert.
Oft ist im Rahmen klinischer Anwendungen die Beschaffenheit der Mutation oder Fehlpaarung nicht bekannt, sodass die Verwendung spezifischer DNA-Glykosylasen ausgeschlossen ist. So besteht Bedarf an einem Einzelenzymsystem, das in der Lage ist, unabhängig von den flankierenden DNA-Sequenzen alle Fehlpaarungen mit gleicher Effizienz zu erkennen und auch Insertionen und Deletionen zu detektieren. Es wäre von Vorteil, über einen empfindlichen und exakten Test zur Detektion von Einzel-Basenpaar-Fehlpaarungen zu verfügen, der keine große Menge an Probe erfordert, der nicht die Verwendung toxischer Chemikalien erfordert, weder arbeitsintensiv noch kostspielig ist und in der Lage ist, nicht nur Fehlpaarungen, sondern auch Deletionen und Insertionen von DNA zu detektieren.
Solch ein System wäre in Verbindung mit einem Verfahren, das die Identifikation der Stelle der Mutation in einem bestimmten DNA-Molekül erleichtern würde, für genetische Screening-Anwendungen ganz eindeutig von Vorteil. Zweck der vorliegenden Erfindung ist, dieses neue Mutationsdetektionssystem bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Materialien und Verfahren zur Detektion von Mutationen oder Fehlpaarungen in einem Ziel-Polynucleotidstrang bereit. Die Detektion wird unter Verwendung neuer Endonucleasen in Kombination mit einem Geltestsystem durchgeführt, das das Screenen und die Identifikation veränderter Basenpaarungen in Ziel-Nucleinsäuresträngen erleichtert.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine neue Nuclease auf Pflanzenbasis bereitgestellt, die zur Detektion von Mutationen oder Fehlpaarungen in Ziel-DNA oder -RNA nützlich ist. Die bereitgestellte Nuclease ist ein fehlgepaartes Endonucleaseenzym zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielsequenz von einzelsträngigem Säugetier-Polynucleotid mit Bezug auf eine nichtmutierte Sequenz in einem Polynucleotid, das mit dem die Zielsequenz enthaltenden Polynucleotid hybridisierbar ist, wobei das Enzym aus einer pflanzlichen Quelle isoliert ist und für Folgendes wirksam ist:

a) die Detektion aller Fehlpaarungen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden, wobei die Detektion über einen pH-Bereich von 5–9 erfolgt und das Enzym über den gesamten pH-Bereich Aktivität zeigt;
b) das Erkennen von Polynucleotidschleifen und Insertionen in den hybridisierten Polynucleotiden;
c) die Katalyse der Bildung eines Einzelstrangbruchs an der eine Fehlpaarung enthaltenden DNA-Stelle;
sd) das Erkennen einer Mutation in einer Ziel-Polynucleotidsequenz ohne nachteilige Auswirkung durch flankierende DNA-Sequenzen; und
e) das Erkennen von Sequenzunterschieden in Polynucleotidsträngen mit einer Länge zwischen etwa 100 bp und etwa 3 kb.

Sellerie beispielsweise (Apium graveolens var. ducle) enthält ergiebige Mengen der Nuclease der Erfindung, die für Insertions-/Deletions-DNA-Schleifenläsionen und Fehlpaarungen hochspezifisch ist. Dieses Enzym, das hierin als CEL I bezeichnet wird, schneidet an der Phosphodiester-Bindung an Stelle 3' des fehlgepaarten Nucleotids. CEL I wurde etwa 10.000fach gereinigt, sodass es im Wesentlichen homogen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielsequenz von einzelsträngigem Säugetier-Polynucleotid in Bezug auf eine nichtmutierte Sequenz eines Polynucleotids bereitgestellt, das mit dem die Zielsequenz umfassenden Polynucleotid hybridisierbar ist. Die Sequenzen werden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, mit einem detektierbaren Marker markiert, aneinander hybridisiert, der CEL I der Erfindung ausgesetzt und auf Gelen auf das Vorliegen der Mutation untersucht. Das Verfahren stellt darin eine Verbesserung bereit, dass es die Verwendung eines Fehlpaarungs-Endonucleaseenzyms pflanzlichen Ursprungs umfasst, worin das Enzym die Fähigkeit aufweist:

a) alle Fehlpaarungen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden zu detektieren, wobei die Detektion über einen ph-Bereich von 5–9 erfolgt und das Enzym über den gesamten pH-Bereich Aktivität zeigt;
b) die Bildung eines Einzelstrangbruchs an einer eine Fehlpaarung enthaltenden Zielsequenz zu katalysieren;
c) eine Mutation in einer Ziel-Polynucleotidsequenz ohne nachteilige Auswirkungen durch flankierende Polynucleotidsequenzen zu erkennen; und
d) Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen mit einer Länge von etwa 100 bp bis etwa 3 kb zu erkennen.

Die Endonuclease auf pflanzlicher Basis der Erfindung weist eine einzigartige Kombination an Eigenschaften auf. Diese umfassen die Fähigkeit, alle möglichen Fehlpaarungen zwischen den hybridisierten Sequenzen zu detektieren, die bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung gebildet werden; Polynucleotidschleifen und Insertionen zwischen solchen hybridisierten Sequenzen zu erkennen; Polymorphismen zwischen solchen hybridisierten Strängen zu detektieren; Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen mit einer Länge zwischen etwa 100 bp und 3 kb zu erkennen und solche Mutationen in einer Ziel-Polynucleotidsequenz ohne wesentliche nachteilige Auswirkungen durch flankierende DNA-Sequenzen zu erkennen.
Die Endonuclease auf pflanzlicher Basis, CEL I, der Erfindung ist nicht nur in Sellerie vorhanden. Funktionell ähnliche enzymatische Aktivitäten wurden in vierzehn verschiedenen Pflanzenspezies nachgewiesen. Daher ist das Enzym wahrscheinlich im Pflanzenreich konserviert und kann auch aus anderen Pflanzen als aus Sellerie gereinigt werden. Das Verfahren zur Reinigung dieser Endonuclease-Aktivität aus einer Pflanze, die nicht Sellerie ist, ist Fachleuten bekannt und wird als vom Schutzumfang dieser Erfindung umfasst erachtet. Solche Enzyme wurden bis zu wesentlicher Homogenität beispielsweise aus der Pflanzenspezies Arabidopsis thaliana gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt. Dieses neue Enzym, bezeichnet als ARA I, gleicht hinsichtlich seiner enzymatischen Aktivitäten dem Enzym CEL I und kann daher in den genetischen Mutations-Screening-Tests der Erfindung vorteilhaft verwendet werden.
Die Endonuclease auf pflanzlicher Basis muss nicht auf das Pflanzenreich beschränkt sein, sondern kann ebenfalls in anderen Lebensformen gefunden werden. Solche Enzyme können ähnliche Funktionen wie CEL I in Sellerie übernehmen oder aber an andere spezielle Schritte des DNA-Metabolismus angepasst werden. Solche Enzyme oder die für diese Enzyme kodierenden Gene können verwendet oder modifiziert werden, um enzymatische Aktivitäten zu produzieren, die gleich oder ähnlich wie CEL I funktionieren können.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das zuvor beschriebene Verfahren in Verbindung mit dem Zusatz von DNA-Ligase, DNA-Polymerase oder einer Kombination davon eingesetzt, wodurch nichtspezifische DNA-Spaltung reduziert wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die gleichzeitige Untersuchung zahlreicher Proben unter Verwendung des zuvor beschriebenen Enzyms und des Verfahrens der Erfindung durch ein Verfahren, das hierin als Mehrfachanalyse bezeichnet wird, durchgeführt.
Um die Parameter der vorliegenden Erfindung noch eindeutiger darzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt:
Die Bezeichnung "Endonuclease" bezieht sich auf ein Enzym, das DNA intern spalten kann.
Die Bezeichnung "isolierte Nucleinsäure" bezieht sich auf ein DNA- oder RNA-Molekül, das von Sequenzen getrennt ist, mit denen es normalerweise im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem es stammt, unmittelbar zusammenhängt (in den Richtungen 5' und 3').
Die Bezeichnung "Basenpaar-Fehlpaarung" bezieht sich auf eine Basenpaarkombination, die sich im Allgemeinen gemäß den Basenpaarungsregeln nach Watson und Crick in Nucleinsäuren nicht bildet. Wenn man sich beispielsweise auf Basen bezieht, die in DNA üblicherweise zu finden sind, nämlich Adenin, Guanin, Cytosin und Thymidin, so sind Basenpaar-Fehlpaarungen jene Basenkombinationen, die nicht den A-T- und G-C-Paaren entsprechen, die normalerweise in DNA vorkommen. Wie hierin beschrieben kann eine Fehlpaarung beispielsweise als C/C angegeben werden, was bedeutet, dass ein Cytosin-Rest gegenüber einem anderen Cytosin anstatt des passenden Bindungspartners Guanin gefunden wird.
Der Ausdruck "DNA-Insertion oder -Deletion" bezieht sich auf die Gegenwart oder Abwesenheit von "gepaarten" Basen zwischen zwei DNA-Srängen, sodass Komplementarität über die Region insertierter oder deletierter Basen nicht aufrechterhalten wird.
Die Bezeichnung "Komplementarität" bezieht sich auf zwei DNA-Stränge, die im Wesentlichen normale Basenpaarungs-Eigenschaften aufweisen. Komplementäre DNA kann dennoch eine oder mehrere Fehlpaarungen enthalten.
Die Bezeichnung "Hybridisierung" bezieht sich auf die Wasserstoffbindung, die zwischen zwei komplementären DNA-Strängen eintritt.
Der Ausdruck "flankierende Nucleinsäuresequenzen" bezieht sich auf jene zusammenhängenden Nucleinsäuresequenzen, die sich 5' und 3' zu den Endonuclease-Spaltstellen befinden.
Die Bezeichnung "Mehrfachanalyse" bezieht sich auf einen gleichzeitigen Test von gepoolten DNA-Proben gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren.
Die Bezeichnung "im Wesentlichen rein" bezieht sich auf ein Präparat, das zumindest 50–60 Gew.-% des Materials von Interesse umfasst. Noch bevorzugter umfasst das Präparat zumindest 75 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 90–99 Gew.-%, des Materials von Interesse. Reinheit wird mittels Verfahren gemessen, die für das zu reinigende Material geeignet sind, wobei dies im Fall von Protein Chromatographieverfahren, Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese, HPLC-Analyse und dergleichen umfasst.
C > T bezeichnet die Substitution eines Thymidin-Rests durch einen Cytosin-Rest, wodurch eine Fehlpaarung zu Tage tritt. Ungeeignete Substitutionen einer Base durch eine beliebige andere, die zu einer Fehlpaarung oder einem Polymorphismus führt, können auf diese Weise angegeben werden.
N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der verwendet wird, um DNA-Molekulargewichts-Standards zu markieren, die wiederum als ein innerer Standard für DNA, die mittels automatisierter DNA-Sequenzierung analysiert wird, eingesetzt werden.
Primer können mit 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) fluoreszenzmarkiert werden. Alternativ dazu können Primer mit 4,7,2',7'-Tetrachlor-6-carboxyfluorescein (TET) markiert werden. Andere alternative DNA-Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im Schutzumfang der Erfindung inbegriffen.
CEL I wurde gereinigt, sodass es im Wesentlichen homogen ist, und so wird Peptidsequenzierung des Amino-Terminus erwogen, um die entsprechenden spezifischen Oligonucleotidsonden bereitzustellen, um das Klonieren des Enzyms aus Sellerie zu erleichtern. Nach dem Klonieren und Sequenzieren des Gens kann dieses in zahlreichen rekombinanten DNA-Systemen exprimiert werden. Dieses Verfahren ist Fachleuten bekannt und ist im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung inbegriffen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Resultate von Natriumdodecylsulfat- (SDS-) Polyacrylamid-Gelanalyse des gereinigten Enzyms, CEL I. Die Positionen von Molekulargewichtsmarkern sind am Rand dargestellt. T bezeichnet das obere Ende des auflösenden Gels.
2 stellt bestimmte Heteroduplex-DNA-Substrate dar, die zur Durchführung von Nucleinsäureanalysen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. 2A stellt ein 64-mer dar, das terminal entweder am 5'-P oder am 3'-OH markiert sein kann. Die Nucleotidpositionen, die in dieser Analyse als Bezugspunkte herangezogen werden, sind unabhängig von der Anzahl an Nucleotidinsertionen bei X im oberen Strang angegeben. Die insertierten Sequenzen und Substrat-Nr. sind in der Tabelle angegeben. 2B veranschaulicht in dieser Analyse eingesetzte, fehlgepaarte Basenpaarsubstrate, wobei die Identitäten der Nucleotide Y und Z wie in der beigefügten Tabelle variiert werden, um unterschiedliche fehlgepaarte Substrate herzustellen.
3 ist ein Autoradiogramm, das die Auswirkung von Temperatur auf CEL-I-Schnitte in unterschiedlichen Substraten demonstriert.
4 ist ein Autoradiogramm, das die relativen Schnitt-Präferenzen von CEL I an DNA-Schleifen eines Nucleotids veranschaulicht. 4A zeigt, dass zusätzlich zu X = G auch X = C zwei verschiedene Basenpaarungs-Konformationen ermöglicht. 4B demonstriert, dass der Basisstrang des Substrats zum CEL-I-Schnitt wie in der C/C-Fehlpaarung, Nr. 10 in Bahn 16, fähig ist.
5 ist ein Autoradiogramm von denaturierenden, 15%igen Polyacrylamid-Gelen, das die von AmpliTaq-DNA-Polymerase vermittelte Stimulation des gereinigten CEL-I-Schnitts bei DNA-Fehlpaarungen eines einzelnen extrahelikalen Nucleotids zeigt. F bezeichnet das Volllängen-Substrat, das 64 Nucleotide lang und am 5'-Terminus (*) des oberen Strangs markiert ist. In den Schautafeln 5A, 5B und 5C wurden Substrate mit unterschiedlichen Mengen an CEL 1 in Gegenwart oder Abwesenheit von DNA-Polymerase behandelt.
6 ist ein Autoradiogramm, das den optimalen pH zum CEL-I-Schnitt am extrahelikalen G-Rest in Gegenwart oder Abwesenheit von AmpliTaq-DNA-Polymerase zeigt. Die obere Schautafel zeigt die CEL-I-Aktivität in Abwesenheit von AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die untere Schautafel zeigt CEL-I-Aktivität in Gegenwart von Polymerase.
7 ist ein Autoradiogramm, das das Erkennen von Basensubstitutions-Fehlpaarungen durch gereinigtes CEL I in Gegenwart von AmpliTaq-DNA-Polymerase zeigt. (1) bezeichnet die primäre Schnittstelle an der Phosphodiesterbindung 3' eines fehlgepaarten Nucleotids. Schautafel 7A veranschaulicht das Spalten des Substrats in Gegenwart von sowohl CEL I als auch DNA-Polymerase. In Schautafel 7B wurde CEL I weggelassen.
8 ist ein Autoradiogramm, das die Fähigkeit von CEL I veranschaulicht, Mutationen in gepoolten DNA-Proben in Gegenwart von überschüssiger Wildtyp-DNA zu erkennen. Die Bahnen 3, 5, 6, 10, 11, 12 und 13 enthalten einzelne Proben, die Wildtyp-Heteroduplexe enthalten. Die Bahnen 4 und 6 enthalten eine AG-Deletion. Die Bahnen 8 und 9 enthalten ein Substrat mit einer 11-Basenpaar-Schleife. Die zuvor beschriebenen Proben wurden gepoolt und mit CEL I behandelt. Die Resultate dieser "Mehrfachanalyse" sind in Bahn 14 dargestellt.
9 ist ein Autoradiogramm, das weiters die Fähigkeit von CEL I veranschaulicht, Mutationen in Gegenwart von überschüssiger Wildtyp-DNA zu erkennen. 1, 2, 3, 4, 10 oder 30 radiomarkierte Heteroduplex-PCR-Produkte (amplifiziert von Exon 2 des BRCA1-Gens) wurden CEL I in einem einzelnen Reaktionsröhrchen ausgesetzt, und die Produkte wurden auf einem 6%igen Polyacrylamidgel laufen gelassen. Die Bahnen 1 und 2 sind negative Kontrollen, die in Abwesenheit von CEL I laufen gelassen wurden. Die Bahnen 3 bis 11 enthalten 1 Probe mit der AG-Deletion in Gegenwart ansteigender Mengen an nicht-mutierten Wildtyp-Heteroduplexen.
10 zeigt ein schematisches repräsentatives Diagramm des BRCA1-Gens und der Exonbegrenzungen im Gen.
11 ist ein Histogramm einer Probe, das die Anordnung einer 5-Basen-Deletion im 11D-Exon von BRCA1 nach PCR-Amplifikation und Behandlung mit CEL I zeigt. Eine Spitze bezeichnet ein DNA-Fragment von spezifischer Größe, das durch Spalten durch CEL I an der Stelle der Fehlpaarung entstand. Schautafel A zeigt die Ergebnisse, die mit einem 6-FAM-markierten Primer, der an Nucleotid 3.177 von BRCA1 anelliert war, erhalten wurden. Schautafel B zeigt die Ergebnisse, die mit einem TET-markierten Primer, der 73 Basen in das Intron zwischen Exon 11 und Exon 12 anellierte, erhalten wurden. Schautafel C stellt den inneren TAMRA-Bahngrößenstandard dar. Zu beachten ist, dass die Position der Mutation auf beiden Strängen der DNA ermittelt werden kann.
12 ist ein Histogramm einer Probe, das die Anordnung von Nonsense-Mutation A > T an Position 2.154 und einen Polymorphismus C > T bei Nucleotid 2.201 im 11 C-Exon von BRCA1 im Anschluss an PCR-Amplifikation und Behandlung mit CEL I zeigt. Schautafel A zeigt eine Spitze bei Base Nr. 700, und Schautafel B zeigt eine Spitze bei Nr. 305, was der Stelle der Nonsense-Mutation entspricht. Schautafel C ist der interne TAMRA-Bahnstandard.
13 zeigt die Ergebnisse, die von vier verschiedenen Proben erhalten wurden, die auf die Gegenwart von Mutationen in Exon 11A unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert wurden. Ergebnisse der 6-FAM-Proben werden gezeigt. Schautafel A zeigt einen Polymorphismus T > C am Nucleotid 2.430 und eine zweite Spitze bei Position Nr. 483, die der Stelle eines anderen Polymorphismus C > T am Nucleotid 2.731 entspricht. Schautafel B zeigt nur den zweiten, in Schautafel A beschriebenen Polymorphismus. Schautafel C zeigt weder Polymorphismus noch Mutation. Schautafel D zeigt die zwei in Schautafel A gesehenen Polymorphismen.
14 stellt ein Gel dar, das das Reinigungsschema von ARA-I-Fehlpaarungs-Endonuclease von Arabidopsis thaliana zeigt. Bahn 1: Roh-Extrakt aus Zellen, die mittels French-press zerstört wurden; Bahn 2: 25% – 85% gesättigte Ammoniumsulfat-Fraktionierung; Bahn 3: Con-A-Sepharose-Affinitätssäule, ARA I wurde durch α-Methylmannosid eluiert; Bahn 4: Phosphocellulose-P-11-Säule-ARA-I-Peak; Bahn 5: DEAE-Sephacel-Anionenaustausch-Säule-ARA-I-Peak. Die Molekulargewichtsstandards sind in den Bahnen mit "S" bezeichneten Bahnen angegeben.
15 zeigt ein Autoradiogramm einer denaturierenden DNA-Sequenzierungs-Gelanalyse, die zeigt, dass ARA I fehlgepaarte Substrate im gesamten Reinigungsschema schneidet. Die Bahnnummern entsprechen jenen aus den Reinigungsschritten in 14. Schautafeln A, B und C veranschaulichen das ARA-I- Schneiden von Substrat Nr. 2, Substrat Nr. 4 bzw. Substrat Nr. 18 (Kontrollsubstrat mit keinen Fehlpaarungen). F = volle Länge, I = ARA-I-Schnitt.
16 ist ein schematisches Diagramm des ARA-I-basierten Fehlpaarungs-Detektionstest.
17 ist eine Veranschaulichung von Daten, die aus der GeneScan-Analyse endonucleolytischer Aktivität von ARA I an einem Heteroduplex erhalten wurden, der eine Fehlpaarung enthielt.
18 zeigt einen Vergleich der GeneScan-Mutationsdetektion von ARA I gegenüber CEL I, der eine Reihe von Kontrollreaktionen unter Verwendung des Wildtyp-Allels von Exon 19 des BRCA1-Gens umfasst. Dieses DNA-Fragment enthält keinerlei Mutationen, und demgemäß wurde kein Fehlpaarungsnicking beobachtet. Die Schautafeln A und B zeigen die zwei Stränge, die mit 7 ng CEL I behandelt und beim Fehlpaarungsschneiden durch AmpliTaq-DNA-Polymerase stimuliert wurden. B = (6-FAM); G = (TET). Die Schautafeln C und D sind die zwei Stränge, die mit 20 ng gereinigtem ARA I ohne Stimulierung durch AmpliTaq-DNA-Polymerase gereinigt wurden. Die Schautafeln E und F zeigen die zwei Stränge, die mit 20 ng ARA I behandelt und zum Fehlpaarungsschneiden durch die Gegenwart von AmpliTaq-DNA-Polymerase stimuliert wurden.
19 stellt eine Seite-an-Seite-GeneScan-Analyse von CEL-I- und ARA-I-Fehlpaarungs-Detektionsaktivität in Exon 19 des BRCA1-Gens dar. Die Schautafeln A und B zeigen Fehlpaarungsschnitte unter Verwendung von 7 ng CEL I in Gegenwart von 0,5 Einheiten von AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die Schautafeln C und D zeigen das Schneiden einer A-Nucleotid-Deletionsfehlpaarung durch 20 ng ARA I ohne AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die Schautafeln E und F zeigen das Schneiden desselben Substrats durch 2 ng ARA I, stimuliert zum Fehlpaarungs-Schneiden durch die Gegenwart von 0,5 ng Einheiten von AmpliTaq-DNA-Polymerase. Alle detektierten Mutationen und Polymorphismen wurden durch automatisiertes Sequenzieren bestätigt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ARA I, wie das CEL-I-Mutationsdetektionsverfahren, Mutationen identifizieren kann, die mittels SSCP oder DNA-Sequenzieren schwer nachzuweisen sind.
20 zeigt einen Vergleich der GeneScan-Mutationsdetektion von ARA I gegenüber CEL I, umfassend eine Reihe von Kontrollreaktionen unter Einsatz des Wildtyp-Allels von Exon 2 des BRCA1-Gens. Wie in 18 enthält dieses Gensegment keinerlei Mutationen, sodass kein Fehlpaarungsnicking beobachtet wird. Die Schautafeln A und B zeigen die zwei Stränge, die mit 7 ng CEL I, stimuliert zum Fehlpaarungsschneiden durch 0,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, behandelt wurden. Die Schautafeln C und D zeigen die zwei Stränge, die mit 20 ng gereinigtem ARA I ohne Stimulierung durch AmpliTaq-DNA-Polymerase behandelt wurden. Die Schautafeln E und F zeigen die zwei Stränge, die mit 20 ng ARA I, stimuliert zum Fehlpaarungsschneiden durch die Gegenwart von AmpliTaq-DNA-Polymerase, behandelt wurden. Die Schautafeln G und H zeigen die zwei Stränge, die mit 2 ng ARA I, stimuliert zum Fehlpaarungsschneiden durch die Gegenwart von 0,5 Einheiten von AmpliTaq-DNA-Polymerase, behandelt wurden.
21 stellt die GeneScan-Analyse von CEL-I- und ARA-I-Fehlpaarungsdetektion an Exon 2 des BRCA1-Gens dar. Die Schautafeln A und B zeigen ein AG-Deletions-Fehlpaarungsschneiden durch 7 ng CEL I in Gegenwart von 0,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die Schautafeln C und D zeigen das Schneiden der AG-Nucleotid-Deletionsfehlpaarung durch 20 ng ARA I ohne AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die Schautafeln E und F zeigen das Schneiden desselben Substrats durch 20 ng ARA I, stimuliert zum Fehlpaarungsschneiden durch die Gegenwart von 0,5 ng Einheiten an AmpliTaq-DNA-Polymerase. Die Schautafeln G und H zeigen das Schneiden desselben Substrats durch 2 ng ARA I, stimuliert zum Fehlpaarungsschneiden durch die Gegenwart von 0,5 Einheiten an AmpliTaq-DNA-Polymerase.
22 ist ein Autoradiogramm, das zeigt, dass die Aktivität der Fehlpaarungs-Endonuclease, die jener von ARA I und CEL I ähnlich ist, in den Extrakten von 10 anderen Pflanzen vorhanden ist.
23 ist ein Autoradiogramm, das zeigt, dass die Aktivität der Fehlpaarungs-Endonuclease, die jener von ARA I und CEL I ähnlich ist, in den Extrakten von 11 anderen Pflanzen vorhanden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die enzymatische Basis zur Aufrechterhaltung korrekter Basensequenzen während DNA-Replikation wurde an E. coli ausführlich studiert. Dieser Organismus hat einen Fehlpaarungs-Reparaturweg entwickelt, der eine Vielzahl von DNA-Basenpaar-Fehlpaarungen in halbmethylierter DNA sowie Insertionen/Deletionen bis hin zu einer Länge von vier Nucleotiden korrigiert. Zellen, die über diesen Weg nicht verfügen, mutieren häufiger, und so werden die Gene MutS, MutL und MutH usw. genannt. Das MutS-Protein bindet sich an die Fehlpaarung, und MutH ist die Endonuclease, die die DNA an einer GATC-Stelle an dem Strang schneidet, in dem der A-Rest nicht methyliert ist. MutL bildet einen Komplex mit MutH und MutS während des Reparaturprozesses. Homologe von MutS und MutL, jedoch nicht von MutH, existieren in zahlreichen Systemen. In Hefe kann sich MSH2 (MutS-Homolog) an eine Fehlpaarung selbst binden, wobei jedoch ein Komplex von zwei MutL-Homologen (MLH und PMS1) plus einem MSH2 beobachtet wurden. Das menschliche Homolog hMSH2 hat die Fähigkeit entwickelt, sich an größere DNA-Insertionen bis hin zu einer Länge von 14 Nucleotiden zu binden, was häufig durch Mechanismen wie Fehlabgleichung an den Mikrosatelliten-Wiederholungen in Menschen auftritt. Die Rolle, die hMLH1 bei der Schleifenreparatur spielt, ist nicht geklärt. Es wurde gezeigt, dass Mutationen an einem dieser menschlichen Homologe für die vererbbare Form des nicht polypösen Kolonkarzinoms verantwortlich ist (27, 28).
Sellerie enthält über 40 μg Psoralen, ein lichtreaktiver Interkalator, pro Gramm Gewebe (3). Notwendigerweise kann Sellerie über eine gute Fähigkeit zur Reparatur von Läsionen von Insertionen, Deletionen und anderen Psoralen-Photoaddukten verfügen. Einzelsträngigkeit an der Stelle der Läsion ist bei Basensubstitution und DNA-Schleifenläsionen üblich. Die Daten der folgenden Beispiele zeigen, dass Sellerie, Arabidopsis thaliana und andere Pflanzenspezies reichlich über Fehlpaarungs-spezifische Endonucleasen verfügen, um diesen potentiellen Mutationsereignissen zu begegnen.
Es wurde herausgefunden, dass der Schnitt an einer Fehlpaarungsstelle durch CEL I durch die Gegenwart einer DNA-Polymerase stark stimuliert wird. Für eine DNA-Schleife, die eine einzelne Nucleotid-Insertion enthält, entspricht die CEL-I-Substrats-Präferenz A ≥ G > T > C. Für durch Basensubstitution fehlgepaarte Basenpaare entspricht die CEL-I-Präferenz C/C ≥ C/A ~ C/T ≥ G/G > A/C ~ A/A T/C > T/G ~ G/T ~ G/A ~ A/G > T/T. CEL 1 weist einen breiten optimalen pH-Bereich von pH 6 bis pH 9 auf. Zu einem geringeren Ausmaß, verglichen mit Schleifenschnitten, ist CEL I auch eine einzelsträngige DNase und eine schwache Exonuclease. CEL I besitzt im Vergleich zu anderen Nucleasen neue biochemische Aktivitäten. Mungbohne-Nuclease ist eine 39-kd-Nuclease, die eine einzelsträngige DNase und RNase ist und die Fähigkeit hat, DNA in destabilisierten Regionen und DNA-Schleifen zu nicken (19–22). Dennoch weist sie ein pH-Optimum bei 5,0 auf. Es ist nicht bekannt, ob Mungbohne-Nuclease-Aktivität durch eine DNA-Polymerase wie im Fall von CEL I aktiviert werden kann. Somit scheinen CEL I und Mungbohne-Nuclease unterschiedliche Enzyme zu sein; dennoch ist dies bis heute noch nicht endgültig bestätigt worden.
Der für die Stimulierung der CEL-I-Aktivität durch die AmpliTaq-DNA-Polymerase verantwortliche Mechanismus ist bis heute unbekannt. Eine Möglichkeit ist, dass die DNA-Polymerase eine hohe Affinität zur 3'-OH-Gruppe aufweist, die durch den CEL-I-Schnitt an der Fehlpaarung gebildet wird, und CEL I einfach durch Konkurrenz um die Stelle verdrängt. CEL I kann unterschiedliche Affinitäten zu den 3'-OH-Termini aufweisen, die durch Schnitte an verschiedenen Fehlpaarungen gebildet werden, wodurch das Ausmaß abgeschwächt wird, mit dem AmpliTaq-DNA-Polymerase seine Aktivität stimulieren kann. Die Verwendung einer DNA-Polymerase, um eine Reparatur-Endonuclease bei der DNA-Reparatur zu verdrängen, wurde auch beim UvrABC-Endonuclease-Mechanismus beobachtet (25). Es wurde gezeigt, dass sich die UvrABC-Endonuclease erst umsetzt, wenn sie sich nicht in Gegenwart von DNA-Polymerase I befindet. Die Proteinfaktoren in vivo, die die CEL-I-Aktivität stimulieren können, müssen nicht auf DNA-Polymerasen beschränkt sein. Es ist möglich, dass DNA-Helikasen, DNA-Ligasen, 3'-5'-Exonucleasen oder Proteine, die sich an DNA-Termini binden, diese Funktion auch ausführen können.
Es ist wichtig anzumerken, dass ein 5'-markiertes Substrat verwendet werden kann, um eine CEL-I-Schnittbande in einem denaturierendem Polyacrylamidgel darzustellen. Erst jüngst wurde für eine mutmaßliche menschliche Fehlpaarungs-Schnittaktivität aller Typen (24) gezeigt, dass sie mit der menschlichen Topoisomerase I verwandt ist. Dieses Enzym ist aufgrund der Bildung eines kovalenten Enzym-DNA-Zwischenprodukts mit dem 3'-Terminus des DNA-Nicks (26) nicht in der Lage, sich selbst aus einem 5'-markierten Substrat nach dem Nicken der Fehlpaarung freizusetzen. Dieser kovalente Protein-DNA-Komplex kann nicht in das denaturierende Polyacrylamidgel wandern, um eine Bande zu bilden. CEL-I-Fehlpaarungsnicken wurde mit 5'-markierten Substraten gezeigt. Daher ist CEL I nicht ein Pflanzenäquivalent der menschlichen Topoisomerase-I-ähnlichen Fehlpaarungs-Reparaturaktivität aller Typen.
CEL I scheint ein Mannopyranosyl-Glykoprotein zu sein, wie aufgrund seiner starken Bindung an Concanavalin-A-Sepharose-Harz und durch das Färben von CEL I mit dem Periodsäure-Schiff-Glykoprotein-Farbstoff festgestellt werden kann. Soweit bekannt wurde für kein Reparatur-Enzym nachgewiesen, dass es ein Glykoprotein ist. Für Glykoproteine wird oft erkannt, dass sie von Zellen, auf Zellmembranen ausgeschieden oder in Organellen sekretiert werden. Auch wurde gezeigt, dass Glykoproteine für wichtige Funktionen im Kern existieren. Es wurde herausgefunden, dass das Niveau eines 100-kDa-Belastungs-Glykoproteins im Kern zunimmt, wenn Gerbil-Fibrom-Zellen Hitzeschockbehandlung unterzogen werden (27). Von Transkriptionsfaktoren für RNA-Polymerase II in menschlichen Zellen ist bekannt, dass sie mit N-Acetylglucosamin-Resten modifiziert werden (28, 29). Erst jüngst wurde für Lactoferrin, ein Eisen-bindendes Glykoprotein, herausgefunden, dass es sich im Kern menschlicher Zellen an DNA bindet und dass es Transkription auf eine Sequenz-spezifische Weise aktiviert (30). Für die Zellkerne, die mit manchen Viren infiziert sind, ist bekannt, dass sie virale Glykoproteine enthalten (31–33). Diese Beispiele, bei denen bekannt ist, dass Glykoproteine innerhalb des Kerns existieren, und nicht nur auf der Kernmembran oder an den Kernporen, zeigen tendenziell, dass glykosylierte Proteine im Kern wichtig sein könnten. CEL I scheint ein Beispiel für, ein Glykoprotein zu sein, das an DNA-Reparatur beteiligt sein könnte.
Die Eigenschaften der Sellerie-Fehlpaarungs-Endonuclease CEL I gleicht jenen von einzelsträngigen Nucleasen. Die am besten geeigneten Substrate für CEL I sind DNA-Schleifen und Basen-Substitutions-Fehlpaarungen wie die C/C-Fehlpaarung. Im Gegensatz dazu sind Schleifen, die länger als 4 Nucleotide lang sind, und die CIC-Fehlpaarung die am schlechtesten geeigneten Substrate für das Reparatursystem für E.-coli-mutHLS-Fehlpaarung (1, 2). So ist CEL I ein Enzym, das über neue Fehlpaarungs-Endonuclease-Aktivität verfügt.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung noch detaillierter zu beschreiben. Diese Beispiele, die den derzeit als die beste Art der Durchführung der Erfindung angesehenen Modus beschreiben, sind als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung der Erfindung anzusehen.
BEISPIEL 1
Reinigung von CEL I
Zwei verschiedene CEL-I-Präparate wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt. Deren Eigenschaften sind einander ähnlich, mit der Ausnahme, dass das weniger reine Präparat (Mono-Q-Fraktion) Proteinfaktoren enthalten kann, die die CEL-I-Aktivität stimulieren können.
(i) Herstellung von CEL-I-Mono-Q-Fraktion
100 g Stangensellerie wurde in einem Waring-Mixer mit 100 ml eines Puffers aus 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0 mit 10 μM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) (Puffer A) bei 4°C 2 Minuten lang homogenisiert. Das Gemisch wurde durch Zentrifugieren geklärt, und der Überstand wurde bei –70°C gelagert. Der Extrakt wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie an einer FPLC-Mono-Q-HR5/10-Säule fraktioniert. Die gebundene CEL-I-Nuclease-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten aus Salz bei etwa 0,15 M KCl eluiert.
(ii) Herstellung von hochgereinigtem CEL
7 kg Sellerie wurde bei 4°C mit einem Entsafter extrahiert und mit 10× Puffer A eingestellt, um eine Endkonzentration von 1× Puffer A zu erlangen. Der Extrakt wurde in einem Ammoniumsulfat-Ausfällungsschritt mit 25%iger bis 85%iger Sättigung konzentriert. Die Endpellets wurden in 250 ml Puffer A gelöst und gegen 0,5 M KCl in Puffer A dialysiert. Die Lösung wurde mit 10 ml Concanavalin-A-Sepharose-Harz (Sigma) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Aufschlämmung wurde in eine Säule mit 2,5 cm Durchmesser gepackt und mit 0,5 M KCl in Puffer A gewaschen. Das gebundene CEL I wurde mit 60 ml von 0,3 M α-D-Mannose, 0,5 M KCl in Puffer A bei 65°C eluiert. Das CEL I wurde gegen eine Lösung von 25 mM KPO₄, 10 μM PMSF, pH 7,4 (Puffer B), dialysiert und auf eine Phosphocellulose-Säule aufgetragen, die im Puffer B äquilibriert worden war. Das gebundene Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von KCl in Puffer B eluiert. Der Peak von CEL-I-Aktivität dieser Säule wurde nach Größe an einer Superose-12-FPLC-Säule in 0,2 M KCl, 1 mM ZnCl₂, 10 μM PMSF, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, weiter fraktioniert. Das Zentrum des CEL-I-Peaks aus diesem Gel-Filtrations-Schritt wurde als das gereinigte CEL 1 in dieser Studie verwendet. Eine Proteinbande von etwa 34.000 Da ist sichtbar, wenn 5 μg CEL I der Superose-12-Fraktion mit Coomassie-Blaufärbung oder Kohlenhydratfärbung (Periodsäure-Schiff-Basen-vermitteltes Färbungsset, SIGMA Chemicals (5)) auf einem 15%igen Polyacrylamid-SDS-PAGE-Gel sichtbar gemacht wurde, wie in 1 dargestellt. Eine zweite Bande von etwa 36.000 Da war im Gel auch sichtbar. Beide Banden wurden mit dem Glykoprotein-spezifischen Farbstoff gefärbt. Die subtilen Mobilitätsunterschiede, die in den beiden Banden beobachtet wurden, können auf unterschiedliche Glykosylierung zurückzuführen sein. Alternativ dazu kann ein Kontaminant im Präparat vorhanden sein, der sich mit CEL I co-reinigt.
Proteinbestimmung
Proteinkonzentrationen der Proben wurden durch den Bicinchoninsäure-Protein-Test bestimmt (4, Pierce).
Nach der Reinigung von Enzym CEL 1 wurden eine Mutationsanalyse an experimentellen und klinischen DNA-Substraten in einem geeigneten Gelsystem durchgeführt. CEL I erkannte und spaltete DNA an zahlreichen Fehlpaarungen, Deletionen und Insertionen. Die folgenden Beispiele beschreiben im Detail die Art und Weise, auf die Mutationsanalyse gemäß dieser Erfindung praktiziert wird.
BEISPIEL II
Herstellung von Heteroduplexen, die verschiedene Fehlpaarungen enthalten
DNA-Heteroduplex-Substrate mit einer Länge von 64 Basenpaaren, die fehlgepaarte Basenpaare oder DNA-Schleifen enthielten, die unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie jener in Jones and Yeung erläuterten (34) hergestellt wurden, wurden konstruiert. Die DNA-Schleifen bestanden aus verschiedenen Nucleotiden und unterschiedlichen Schleifengrößen, wie in 2 veranschaulicht wird. Die DNA-Duplexe wurden an einem der vier Termini markiert, sodass DNA-Endonuclease- Schnitte an den fehlgepaarten Nucleotiden als eine trunkierte DNA-Bande auf einem denaturierenden DNA-Sequenzierungsgel identifiziert werden konnten. Die Oligonucleotide wurden an einem DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert und unter Verwendung eines denaturierenden PAGE-Gels in Gegenwart von 7 M Harnstoff bei 50°C gereinigt. Die gereinigten, einzelsträngigen Oligonucleotide wurden mit geeigneten entgegengesetzten Strängen hybridisiert. Der DNA-Duplex, unabhängig davon, ob er Fehlpaarung enthielt oder nicht, wurde unter Verwendung eines nicht-denaturierenden PAGE-Gels gereinigt. DNA wurde aus der Gelscheibe unter Einsatz von Elektro-Elution in einer Centricon-Einheit in einem AMICON-Elektroeluierer des Modells 57005 eluiert. Der obere Behälter dieser Einheit war dafür bestimmt, die wasserdichten Trennwände einzuschließen, die eine Kreuz-Kontamination unterbinden.
BEISPIEL III Fehlpaarungs-Endonucleasen-Test
50 bis 100 fmol von 5'-[³²P]- markiertem Substrat, das in Beispiel II beschrieben ist, wurden mit dem Mono-Q-CEL-I-Präparat in 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂ 30 Minuten lang bei Temperaturen von 0°C bis 80° inkubiert. 0,5 bis 2,5 Einheiten von AmpliTaq-DNA-Polymerase wurden der Nuclease-Testreaktion zugesetzt. 10 μM dNTP wurden in das Reaktionsgemisch, sofern angegeben, eingebunden (2 & 5). Die 20-μl-Reaktion wurde durch Zusetzen von 10 μl 1,5%igern SDS, 47 mM EDTA und 75% Formamid plus Elektrophorese-Farbmarker abgeschlossen und auf einem denaturierenden, 15%igen PAGE-Gel in 7 M Harnstoff bei 50°C analysiert. Ein Autoradiogramm wurde verwendet, um die radioaktiven Banden sichtbar zu machen. Chemische DNA-Sequenzierungsleitern wurden als Größenmarker eingebunden. Schnittstellen wurden durch Co-Elektrophorese der Schnittbande und der DNA-Sequenzierungsleiter in derselben Bahn exakt bestimmt.
BEISPIEL IV
Die Auswirkung von Temperatur auf CEL-I-Schnittaktivität bei Einzel-Nucleotid-DNA-Schleifen und Nucleotidsubstitutionen
Für die CEL-I-Fraktion, die aus der Mono-Q-Chromatographie des Sellerieextrakts eluiert worden war, wurde herausgefunden, dass sie DNA-Heteroduplexe, die DNA-Schleifen mit einem einzelnen extrahelikalen Guanin- (Substrat Nr. 2) oder Thymin-Rest (Nr. 3) enthalten, spezifisch nickt, jedoch nicht den fehlerlos basengepaarten DNA-Duplex Nr. 1, wie in 3 dargestellt. In diesen Experimenten wurden 50 fmol von Heteroduplex Nr. 2 (Bahnen 3–9), Nr. 3 (Bahnen 10–16), fehlerlos basengepaartem Duplex Nr. 1 (Bahnen 17–23) und einzelsträngigem DNA-Substrat (Bahnen 24–30), die jeweils am 5'-Terminus mit γ-[³²P]-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase bei etwa 6.000 Ci/mmol markiert waren, mit 0,5 μl (10 μg) der Mono-Q-Fraktion des CEL-I-Präparats in 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl und 10 mM MgCl₂ 30 Minuten lang bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Jede 20-μl-Reaktion wurde durch Zusetzen von 10 μl 1,5%igem SDS, 47 mM EDTA und 75% Formamid, das Xylolcyanol und Bromphenolblau enthielt, abgeschlossen. 10 μl der Probe wurden auf ein denaturierendes, 7 M Harnstoff enthaltendes, 15%-Polyacrylamid-DNA-Sequenzierungsgel bei etwa 50°C geladen und Elektrophorese-Trennung und Autoradiographie, wie zuvor berichtet, unterzogen (7). Die chemischen G+A- und die chemischen T-Sequenzierungsreaktionen wurden wie in (7) beschrieben durchgeführt und als Größenmarker verwendet. CEL-I-Schnitte bildeten Banden mit einer Länge von etwa 35 Nucleotiden. Es wurden Linien von den Positionen der Schnittbanden zu den Phosphodiester-Bindungen (I und II), die durch die Endonuclease in den Bezugs-Sequenzierungsleitern genickt wurden, gezogen. Bei einem 5'-markierten Substrat, wenn eine Nuclease 5' eines Nucleotids nickt und einen 3'-OH-Terminus bildet, läuft die trunkierte Bande um einen halben Nucleotidabstand langsamer als die Bande für dieses Nucleotid in der Bahn des chemischen DNA-Sequenzierungs-Reaktionsprodukts (34).
Substrat Nr. 2 kann in zwei Konformationen basengepaart sein, da das insertierte G innerhalb einer CGCG-Sequenz liegt. Daher kann der G-Rest entweder in der zweiten oder der dritten Nucleotidposition zu einem ungepaarten Rest mit möglicherweise extrahelikalen Konformation werden, wenn dieser Duplex hybridisiert wird:
5'-CGGCG-3' oder 5'-CGGCG-3'
3'-G-CGC-5' 5'-GC-GC-5'
Demgemäß wurden zwei Fehlpaarungsschnittbanden beobachtet, wobei jede mit der Phoshpodiesterbindung unmittelbar 3' des ungepaarten Nucleotids korreliert. Siehe 3, Bahnen 3–9. Dieser Schlupf kann in der Zielsequenz nur auftreten, wenn G oder C im. fehlgepaarten oberen Strang liegt. Daher gab der nichtgepaarte T-Rest in Substrat Nr. 3 eine Schnittbande an derselben relativen Position wie die obere Bande, das von Substrat Nr. 2 abgeleitet war. Siehe 3, Bahnen 10–16. Diese Gelmobilitäten stimmen mit der Bildung einer 3'-OH-Gruppe an der Desoxyribose-Gruppierung überein (6). CEL I erhöht seine Aktivität mit steigender Temperatur bis zu 45°C, wie durch das Ansteigen der Bandenintensität veranschaulicht wird, siehe 3. Dennoch sinkt die Spezifität von 65°C bis 80°C aufgrund der DNA-Duplexdenaturierung.
BEISPIEL V
Relative Schnittpräferenzen von CEL 1
Um festzustellen, ob es einen einzelnen Endonuclease-Schnitt an jedem DNA-Duplex gibt, wurde das in 3 beschriebene Experiment mit DNA wiederholt, die am 3'-Terminus des oberen Strangs markiert war. Gab es nur eine Schnittstelle, sollten anfängliche Schnittpositionen, die durch die an 5'- oder 3'-Termini markierten Substrate aufgezeigt wurden, an derselben Phosphodiesterbindung liegen. In diesen Experimenten wurden Substrate an den 3'-Termini mit [³²P]-α-dCTP, kaltem dGTP und dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 zu etwa 6.000 Ci/mmol markiert.
Die Probenherstellung, Denaturierungsgel-Auflösung und Autoradiogramm-Analyse sind dieselben wie in 3 beschrieben, abgesehen von der Inkubation von 50 fmol Substrat mit 10 μg der CEL-f-Mono-Q-Fraktion, die 30 Minuten lang bei einer gleichförmigen Temperatur von 37°C durchgeführt wurde. Die DNA-Sequenzierungsleitern für Substrate Nr. 4 und Nr. 5 sind in den Bahnen 1–4 dargestellt, um die verwendeten DNA-Sequenzen zu veranschaulichen. Bahnen 5–8 hatten kein Enzym während der Inkubation. Bahnen 9–12 sind Fehlpaarungs-Endonuclease-Schnitte der Substrate Nr. 2, Nr. 4, Nr. 5 bzw. Nr. 3. Eine Linie wurde von der Position der Schnittbande zur Phosphodiesterbindung (1) gezogen, die durch die Endonculease in der Bezugssequenzierungsleiter genickt war. Bahnen 13 und 14 zeigen die Co-Elektrophorese der CEL-I-Schnittbande mit einer chemischen DNA-Sequenzierungsleiter, um die Schnittposition exakt zu bestimmen. Relative Schnittpräferenzen für die Substrate Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 sind in 4 für die 3'-markierten Substrate gezeigt. Die Beweglichkeiten der Schnittbanden in den Bahnen 9–12 von 4 geben an, dass die Schnittreaktionen an der Phosphodiesterbindung unmittelbar 3' des ungepaarten Nucleotids aufgetreten sind. Daher ist die Schnittstelle dieselbe für Substrate, die entweder am 5'- oder am 3'-Terminus markiert sind. Die Tatsache, dass für den DNA-Schnitt festgestellt wurde, dass er an derselben Bindungsposition auftritt, ob nun die Substrat-DNA an den 5'-Termini oder den 3'-Termini markiert war, zeigt, dass CEL I keine DNA-Glykosylase ist. Ein DNA-Glykosylase-Mechanismus würde verursachen, dass die DNA Schnittposition in den zwei DNA-Substraten um eine Base beabstandet ist, da eine Base durch die DNA-Glykosylase ausgeschnitten wird.
Präzise Bestimmung der Schnittstelle wurde wie im Beispiel in Bahn 14 durchgeführt, in der die chemische T-Rest-Sequenzierungsreaktion des markierten oberen Strangs von Substrat Nr. 2 (Bahn 13) mit dem CEL-I-Schnittprodukt von Bahn 9 vermischt und in derselben Bahn analysiert wurde. Bei einem 3'-markierten Substrat, wenn eine Nuclease 3' eines Nucleotids nickt und einen 5'-PO₄-Terminus bildet, läuft die trunkierte Bande mit der Bande für dieses Nucleotid in der Bahn des chemischen DNA-Sequenzierungs-Reaktionsprodukts (7). Weiters zeigte die Gelbeweglichkeit in Bezug auf die Größenstandards chemischer DNA-Sequenzierung, dass der DNA-Nick einen 5'-phosphorylierten Terminus bildete (6). Für eine DNA-Schleife mit einer einzelnen Nucleotidinsertion ist die Nuclease-Spezifität A ≥ G > T > C. Aus 4A ist ersichtlich, dass eine geringe Menge an 5' --> 3'-Exonucleaseaktivität in diesem CEL-I-Präparat vorhanden ist.
Um zu testen, ob CEL I in den unteren Strang auf der anderen Seite einer DNA-Schleife eines Nucleotids im oberen Strang schneiden kann oder ob das Nicken des die Schleife enthaltenden Strangs zu einem sekundären CEL-I-Schnitt auf der anderen Seite des Nicks führen kann, wurde der untere Strang in Substrat Nr. 2, der keine ungepaarten Nucleotide enthält, am 3'-Ende markiert und in Gegenwart von CEL I inkubiert. Das extrahelikale Nucleotid im oberen Strang oder der DNA-Nick, der durch CEL I im oberen Strang von Substrat Nr. 2 gebildet wurde, was in Bahn 9 von 4 ersichtlich ist, führte nicht zu signifikantem Nicken des unteren Strangs (Bahn 18). Als Kontrolle für die Möglichkeit, dass DNA-Sequenz-Wirkung CEL-I-Schnitte im oberen Strang und nicht im unteren Strang begünstigen könnte, wurde CEL I auf einen Schnitt im unteren Strang im C/C-Fehlpaarungssubstrat in den Bahnen 15 und 16 getestet. Ein Fehlpaarungsschnitt wurde gebildet, wenn CEL I in Bahn 16 vorhanden war.
Bei der Charakterisierung der Schnittstelle einer Reparatur-Endonuclease ist es wichtig, zu bestimmen, ob ein oder mehrere Schnitte für jede Läsion gemacht wurden. Dies erfolgt üblicherweise unter Verwendung von Läsions-hältigen Substraten, die ihrerseits an den vier Termini eines DNA-Duplex markiert wurden. Diesem Test wurde in der Analyse von Substrat Nr. 2 unter Verwendung drei markierter Substrate aufgrund der annähernden Abwesenheit von Schnitten im unteren Strang entsprochen. In 3, Bahn 4–7, und 4, Bahn 9, wurden jeweils der Schnitt dieses Substrats sowohl in den 5'-markierten als auch 3'-markierten Substraten verglichen. Für die Schnittstelle wurde erkannt, dass sie in beiden Fällen an der 3'-Stelle des fehlgepaarten Nucleotids lag. Das Fehlen des Schnitts im unteren Strang von Substrat Nr. 2 wurde in Bahn 18 von 4 dargestellt. Nur das 5'-markierte Substrat war in diesem Fall erforderlich, da kein signifikanter Schnitt im unteren Strang auftrat.
BEISPIEL VI
Auswirkung von AmpliTaq-DNA-Polymerase auf die Schnitte an DNA-Schleifen-Fehlpaarungen
CEL-I-Aktivität wird durch die Gegenwart einer DNA-Polymerase stimuliert. In 5 wurden die CEL-I-Schnitte an Einzel-Nucleotid-Schleifen-Substraten durch AmpliTaq-DNA-Polymerase in unterschiedlichem Ausmaß, je nachdem, welche Nucleotide in der Schleife vorhanden sind, stimuliert. Es war notwendig, unterschiedliche Mengen an CEL I zu verwenden, um die AmpliTaq-DNA-Polymerase-Stimulierung zu veranschaulichen. Die Stimulierung des Schnitts an den extrahelikalen C- und extrahelikalen T-Substraten ist am besten aus den 5A & B ersichtlich (vergleiche Bahn 4 mit Bahn 9 und Bahn 5 mit Bahn 10 in den jeweiligen Schautafeln), worin höhere CEL-I-Konzentrationen erforderlich sind, um einen guten Schnitt an diesen Fehlpaarungen zu zeigen. Bei extrahelikalen G- und A-Substraten, die unter den besten Substraten für CEL I zu finden sind, können AmpliTaq-DNA-Polymerase-Substrate am besten mittels Verwendung einer stark niedrigeren Konzentration an CEL I als in 5 veranschaulicht werden. Die Mengen der AmpliTaq-Stimulierung von CEL I in 5 wurden quantifiziert und in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Quantifizierung der CEL-I-Schnittbanden, die in den Autoradiogrammen in 5 gezeigt sind
BEISPIEL VII
Optimaler pH von CEL-I-Aktivität
Der optimale pH von CEL I für das extrahelikale G-Substrat wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit der AmpliTaq-DNA-Polymerase untersucht. CEL I (9,5 ng) wurde mit 100 fmol des Substrats in einer 20-μl-Reaktion in Puffern mit pH 5–6,5 (Imidazol) und pH 7–9,5 (Tris-HCl) 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Sofern verwendet, waren 0,5 Einheiten von AmpliTaq-DNA-Polymerase in der Inkubation in den oberen (– Polymerase) bzw. unteren (+ Polymerase) Schautafeln gegenwärtig. Wie in 6 gezeigt wurde für CEL I erkannt, dass es in einem pH-Bereich von 5,0 bis 9,5 aktiv war, und ein breites pH-Optimum wurde rund um etwa 7,5 gezeigt (obere Schautafel). Wenn AmpliTaq-DNA-Polymerase vorhanden war, wurde der Schnitt über den gesamten pH-Bereich stimuliert (untere Schautafel). Das Testverfahren verwendete keine anfängliche Kinetik und schloss so quantitative Schlussfolgerungen an diesem pH-Profil von CEL I aus. Dennoch ist eindeutig, dass das Enzym in neutralen pH-Bereichen sehr gut wirkt.
BEISPIEL VIII
Schnitte durch CEL I an Basenpaar-Substitutionen
Andere Kombinationen von fehlgepaarten Substraten werden auch durch CEL I erkannt und an einem der beiden DNA-Stränge eines jeden DNA-Duplex geschnitten. Manche dieser Substrate sind im Vergleich mit jenen, die DNA-Schleifen enthalten, weniger effizient geschnitten; daher wurden statt 37°C 45°C zur Inkubation verwendet. Substrate, die die 5'-Termini der oberen Stränge markiert hatten, wurden in dieser Studie verwendet. Das Autoradiogramm aus 7 zeigt, dass Fehlpaarungen, die einen C-Rest enthalten, die bevorzugten Fehlpaarungssubstrate sind, wobei C/C häufig besser als C/A und C/T ist. Die Schnitte an diesen Fehlpaarungen neigen dazu, zwei verschiedene Schnittpositionen hervorzubringen, eine an der Phosphodiesterbindung 3' des fehlgepaarten C-Rests und eine an der Phosphodiesterbindung ein Nucleotid weiter entfernt in der 3'-Richtung. Ob verschiedene Schnittstellen für diese Fehlpaarungen innerhalb eines anderen DNA-Sequenz-Kontextes beobachtet werden können, wurde bisher noch nicht untersucht. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen kann eine größere Basenpaar-Destabilisierung in der Nähe einer Fehlpaarung, die einen C-Rest enthält, als im Falle anderer Basensubstitutionen sein. Alternativ dazu kann sich das spezifisch fehlgepaarte Nucleotid um eine Position Richtung 3'-Stelle verschieben, da das nächste Nucleotid auch ein C-Rest ist und die zwei Reste ihre Rollen in der Paarbildung mit dem G-Rest im entgegengesetzten DNA-Strang tauschen können. Bei Basen-Substitutions-fehlgepaarten Basenpaaren ist die CEL-I-Spezifität in Gegenwart von AmpliTaq-DNA-Polymerase in Bezug auf den oberen Strang C/C ≥ C/A ~ C/T ≥ G/G > A/C ~ A/A ~ T/C > T/G ~ G/T ~ G/A ~ A/G > T/T (7A). Da eubakterielle DNA-Polymerasen dafür bekannt sind, an ungewöhnlichen DNA- Strukturen zu schneiden (8), wurde ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob AmpliTaq-DNA-Pofymerase selbst an den in 7 verwendeten 13 Substraten schneidet. Auch wenn es dem Autoradiogramm über eine längere Zeitspanne ausgesetzt wurde, konnte kein Fehlpaarungsschnitt durch die AmpliTaq-DNA-Polymerase festgestellt werden (7B).
BEISPIEL IX
Detektion von DNA-Mutationen unter Verwendung von CEL I und Mehrfachanalyse
Die Empfindlichkeit von CEL I zur Fehlpaarungsdetektion wird durch seine Fähigkeit illustriert, Mutationen in gepoolten DNA-Proben zu detektieren. DNA wurde aus peripheren Blutlymphozyten von Personen erhalten, die im Fox Chase Cancer Center genetischem Screenen unterzogen wurden. Proben wurden von Familien mit nur Brustkrebs-, nur Eierstockkrebs-, Brust- und Eierstockkrebssyndrom oder von Nicht-Brust- oder -Eierstockkrebs-Kontrollproben erhalten. Nicht markierte, für Exon 2 von BRCA1 spezifische Primer wurden verwendet, um diese Region des Gens zu PCR-amplifizieren. Die Wildtyp-PCR-Produkte von Exon 2 wurden mit Gamma-³²P-ATP markiert. Kurz beschrieben wurden 10 pmol PCR-Produkt mittels des Wizard-Verfahrens (Promega) gereinigt. Exon-2-Wildtyp-Produkte wurden dann unter Verwendung von T4-Kinase und 15 pmol Gamma ³²P-ATP bei 6.000 Ci/mmol in 30 μl 1× Kinase-Puffer (70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit) bei 37°C 1 Stunde lang phosphoryliert. Die Reaktionen wurden mit 1 μl 0,5 M EDTA gestoppt. Das Reaktionsvolumen wurde auf 50 μl mit 1× STE-Puffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA) gebracht und durch eine Pharmacia-ProbeQuant-Säule verarbeitet. Markierte DNA (1 pmol/μl in 100 μl) wurde anschließend zur Hybridisierung mit einzelnen, nicht markierten, PCR-amplifizierten, experimentellen Proben verwendet. Für jede einzelne Probe wurden 100 fmol des nicht markierten, PCR-amplifizierten Produkts mit 200 fmol des ³²P-markierten Wildtyp-PCR-Produkts in CEL-I-Reaktionspuffer (25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) inkubiert. Anschließend an Denaturierung und Renaturierung wurden radiomarkierte Heteroduplex-PCR-Produkte CEL I 30 Minuten lang bei 37°C in 1× CEL-Reaktionspuffer ausgesetzt und durch das Zusetzen von 10 μl Stoppgemisch (75% Formamid, 47 mM EDTA, 1,5% SDS, Xylolcyanol und Bromphenolblau) gestoppt. Die Heteroduplexe wurden mit dem Enzym einzeln behandelt (Bahnen 4–13) oder in einem Probenröhrchen (Bahn 14) gepoolt und behandelt. Die Produkte der Reaktion wurden auf ein 15%iges Polyacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, geladen, und die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Aus 10 untersuchten Proben enthielten 2 eine AG-Deletion (Bahnen 4 und 7), 2 enthielten eine 11-Basenpaar-Schleife (Bahnen 8 und 9), und die anderen 6 waren vom Wildtyp (Bahnen 5, 6, 10, 11, 12 und 13). Das Spalten durch CEL I an der AG-Deletion resultierte in der Bildung von zwei Banden, eine bei etwa 151 Nucleotiden am oberen Strang und die andere bei 112 Nucleotiden am unteren Strang (Bahnen 4 und 7). Das Spalten durch CEL I an den 11-Basenpaar-Schleifen resultierte in der Bildung einer Bande bei 147 Nucleotiden am oberen Strang und bei 109 Nucleotiden am unteren Strang (Bahnen 8 und 9). Bahnen 1, 2 und 3 enthalten DNA, die nicht CEL I ausgesetzt wurde, als Negativkontrolle, Bahn 15 enthält 64- und 34-bp-Nucleotidmarker. Wie aus Bahn 14 des Gels ersichtlich ist, spaltete das Enzym, wenn die Proben gepoolt und gleichzeitig CEL I ausgesetzt wurden, an allen der zuvor aufgelisteten Mutationen ohne Verlust an Spezifität. Auch zeigten die PCR-Produkte der Wildtyp-Proben kein nichtspezifisches DNA-Nicking.
Um die Fähigkeit von CEL-I zur Detektion von Mutationen in gepoolten DNA-Proben weiter zu veranschaulichen, wurden 1, 2, 3, 5, 10 oder 30 radiomarkierte Heteroduplex-PCR-Produkte (wieder von Exon 2 des BRCA1-Gens amplifiziert) CEL I in einem einzelnen Reaktionsröhrchen ausgesetzt, und die Produkte wurden auf einem 6%igen, 7 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamidgel laufen gelassen. Die Proben wurden wie zuvor beschrieben amplifiziert und radiomarkiert. Jeder Pool enthielt nur eine Probe, die eine Mutation (AG-Deletion) aufwies. Die anderen Proben in jedem Pool waren Wildtyp-Proben. Bahnen 1 und 2 enthalten Kontrollproben, die nicht CEL I ausgesetzt wurden. In den gepoolten Proben, in denen eine Mutation vorhanden war, spaltete CEL I konsequent die PCR-Produkte, was die Empfindlichkeit des Enzyms in Gegenwart übermäßiger nicht-mutierter Wildtyp-DNA (Bahnen 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 11) veranschaulicht. Als Kontrolle wurden Heteroduplex-PCR-Produkte, die keine Mutationen enthielten, untersucht, wobei keine Schnittbande, die einer Mutation entspräche, zu Tage trat (9, Bahnen 3 und 10).
BEISPIEL X
Detektion von Mutationen und Polymorphismen durch CEL I in Proben von Hochrisiko-Familien
PCR-Primer-Sets, die für die Exone im BRCA1-Gen spezifisch sind, wurden im Fox Chase Cancer Center synthetisiert. Die Gensequenz von BRCA1 ist bekannt. Die Exonbegrenzungen und die entsprechenden Basenzahlen sind in Tabelle II gezeigt. Primer zur Amplifikation erwünschter Sequenzen können durch Fachleute gemäß der Methodologie aus Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley and Sons, Inc., (1995), leicht gebildet werden. Diese Primer wurden so gestaltet, dass in jeder PCR-Reaktion ein Primer an den 5'-Termini mit einer fluoreszierenden Markierung, 6-FAM, markiert ist, während der andere Primer mit einer Markierung einer anderen Farbe, TET, ähnlich markiert ist. Ein PCR-Produkt ist also mit zwei Farben markiert, sodass DNA-Nick-Ereignisse in jedem Strang unabhängig voneinander beobachtet und die Messungen bestätigt werden können. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse liegt in Tabelle III vor.
TABELLE II EXON-BEGRENZUNGEN UND ENTSPRECHENDE BASENZAHLEN IN BRCA1
10 ist eine schematische Darstellung der im BRCA1-Gen vorhandenen Exons. Periphere Blutproben aus Personen aus Risiko-Familien wurden gesammelt und die DNA isoliert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von Elongase (BRL) amplifiziert und mittels Wizard-PCR-Präparaten (Promega) gereinigt. Die DNA wurde auf 94°C erhitzt und langsam in 1× CEL-I-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂) gekühlt, um Heteroduplexe zu bilden. Die Heteroduplexe wurden in 20 μl 1× CEL-I-Puffer mit 0,2 μl CEL I und 0,5 Einheiten von AmpliTaq bei 45°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 1 mM Phenanthrolin gestoppt und zusätzliche 10 Minuten lang bei 45°C inkubiert. Die Probe wurde durch eine Centricep-Säule (Princeton Separations) verarbeitet und getrocknet. 1 μl ABI-Beladungspuffer (25 mM EDTA, pH 8,0, 50 mg/ml Dextranblau), 4 μl entionisiertes Formamid und 0,5 μl innerer TAMRA-Bahnstandard wurden dem getrockneten DNA-Pellet zugesetzt. Die Probe wurde auf 90°C 2 Minuten lang erhitzt und anschließend vor dem Laden auf Eis gequencht. Die Probe wurde dann auf ein gut lesbares, 4,25%iges denaturierendes 34-cm-Acrylamidgel geladen und auf einem ABI-373-Sequenzierungsautomat unter Verwendung von GENESCAN-672-Software analysiert. Der 6-FAM-markierte Primer in dieser experimentellen Probe lag bei Nucleotid 3.177 der BRCA1-cDNA (Region 11 D), der TET-markierte Primer lag bei 73 Nucleotiden in den Intron hinein zwischen Exon 11 und Exon 12. Jede Spitze bezeichnet die Gegenwart einer DNA-Bande, die durch Spalten des Heteroduplex durch CEL I, wo eine Mutation oder ein Polymorphismus vorhanden ist, gebildet wird. Eine Spitze bezeichnet die Größe des durch CEL-I gebildeten Fragments von der 3'-Seite der Fehlpaarungsstelle zur 5'-6-FAM-Markierung des oberen Strangs. Die andere Spitze bezeichnet das entsprechende Fragment im unteren Strang von der 3'-Seite der Fehlpaarung zur 5'-TET-Markierung. Die Summe der zwei Fragmente entspricht einer Base länger als die Länge des PCR-Produkts. Die Schautafel zu 6-FAM zeigt eine Spitze an Base Nr. 645 von der 6-FAM-Markierung aus, und die Schautafel zu TET zeigt eine Spitze an Base Nr. 483 von der TET-Markierung aus, wobei beide der Stelle der 5-Basen-Deletion an Nucleotid 3.819 der BRCA1-cDNA entsprechen (11).
Eine Analyse von Exon 11 an einer anderen Person wurde unter Verwendung eines 6-FAM-markierten Primers an Nucleotid 1.454 der BRCA1-cDNA durchgeführt 12). Der TET-markierte Primer lag an Nucleotid 2.459 (Region 11 C). Die PCR-amplifizierten Produkte wurden wie zuvor beschrieben amplifiziert und hergestellt. Bei dieser Person zeigte die Schautafel zu 6-FAM eine Spitze an Base Nr. 700, und die Schautafel zu TET zeigte eine Spitze an Base Nr. 305, wobei jede Spitze der Stelle des CEL-I-Schnitts in dem jeweiligen DNA-Strang bei einer Nonsense-Mutation von A > T an Nucleotid 2.154 der BRCA1-cDNA entsprach. Die Schautafel zu 6-FAM zeigt ebenfalls eine Spitze an Base Nr. 747, und die Schautafel zu TET zeigt eine Spitze an Base Nr. 258, entsprechend der Stelle eines Polymorphismus C > T an Nucleotid 2.201 der BRCA1-cDNA. Die Nonsense-Mutation und der Polymorphismus wurden durch Sequenzieren dieser bestimmten Probe (KO-11) unter Verwendung des ABI-377-Sequenzierungsautomaten bestätigt. Spitzen, die mit einem Sternchen versehen sind, sind auch in der Kein-Enzym-Kontrollbahn vorhanden und stellen einen PCR-Produkt-Hintergrund dar.
Bestimmte Personen haben Mutationen in einer anderen Region von Exon 11, in Region 11A, wie schematisch in 10 dargestellt ist. Ein 6-FAM-markierter Primer an Nucleotid 2.248 der BRCA1-cDNA und ein TET-markierter Primer an Nucleotid 3.290 wurden verwendet, um diese Region von Exon 11 zu amplifizieren. Nach der Amplifikation wurden diese Proben wie zuvor beschrieben verarbeitet. Die vier 6-FAM-Schautafeln zeigen CEL-I-Reaktionen mit Proben von 4 unterschiedlichen Personen. Die erste Schautafel in 13A, Probe Nr. KO-2, zeigt eine Spitze an Nr. 182, was der Stelle eines Polymorphismus T > C an Nucleotid 2.430 entspricht, und eine zweite Spitze an Nucleotid Nr. 483, was der Stelle eines anderen Polymorphismus C > T an Nucleotid 2.731 entspricht. Die zweite Schautafel, 13B, Probe Nr. KO-3, zeigt nur den zweiten Polymorphismus. Die dritte Schautafel, 13C, Probe Nr. KO-7, zeigt keinen Polymorphismus. Die vierte Schautafel, 13D, Probe Nr. KO-11, zeigt zwei Spitzen, die den zwei Polymorphismen entsprechen. Es ist interessant anzumerken, dass diese Probe, KO-11, positive Ergebnisse für eine Nonsense-Mutation und einen Polymorphismus in der Region von Exon 11 C, die wie zuvor beschrieben den Nucleotiden 1.454–2.459 entspricht, zeigt.
TABELLE III ZUSAMMENFASSUNG VON DURCH CEL I DETEKTIERTE BRCA1-MUTATIONEN UND POLYMORPHISMEN
Tabelle IV legt die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen, die die durch CEL I in der vorliegenden Erfindung detektieren Mutationen umgeben, dar. Wenn diese Darstellung auch nicht erschöpfend ist, so kann aus der Vielfalt der flankierenden Sequenzen, die diese Mutationen und die Polymorphismen umgeben, doch ersehen werden, dass die CEL-I-Empfindlichkeit und das Erkennen fehlgepaarter DNA-Heteroduplexe durch flankierende Sequenzen nicht nachteilig beeinflusst zu sein scheint.
TABELLE IV AUSWIRKUNGEN FLANKIERENDER SEQUENZEN AUF DIE ENDONUCLEASE-AKTIVITÄT VON CEL I
Wie aus den oben beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, hat die Verwendung von CEL I bestimmte Vorteile gegenüber Verfahren, die andere Fehlpaarungs- Reparatursysteme während der Analyse von Mutationen im Rahmen klinischer Untersuchungen einsetzen. Diese Vorteile sind in Tabelle V zusammengefasst.
BEISPIEL XI
Wie zuvor erwähnt synthetisieren zahlreiche Pflanzenspezies effiziente Endonuclease-Enzyme. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine neue Endonuclease, ARA I, aus Arabidopsis thaliana isoliert. Diese Endonuclease ist CEL I in zahlreichen Aspekten sehr ähnlich. Von Arabidopsis thaliana wird angenommen, dass sie ein Modellsystem für Studien der Pflanzen-Molekularbiologie und -biochemie liefert. Vorteile des Arabidopsis-Systems umfassen einen kurzen Lebenszyklus von etwa 26 Tagen, die kleine Größe der Pflanze, die diploide Beschaffenheit des Genoms und insbesondere die kleine Größe des Genoms im Vergleich mit den meisten höheren Pflanzen und Tieren. Das Arabidopsis-Genom, mit 7 × 10⁷ Basenpaaren, ist nur etwa 10-mal größer als das von E. coli (4 × 10⁶ Basenpaare), was genetisches Klonieren der fehlgepaarten Endonuclease und genetische Manipulation wesentlich einfacher macht als bei höheren Pflanzen oder Menschen, die beide etwa 2 × 10⁹ Basenpaare enthalten. So sind das Finden der Fehlpaarungs-Endonuclease ARA I in Arabidopsis und die Fähigkeit, ARA I zu verwenden, um Mutationsdetektion zu vollziehen, wichtige Schritte, die zur Anwendung dieser Fehlpaarungs-Endonuclease bei Mutationsdetektion führen.
Herstellung von hochgereinigtem ARA I
Das Reinigungsverfahren von ARA I ist dem für CEL I offenbarten sehr ähnlich. Dies ist nicht unerwartet, da die Daten angeben, dass sich die zwei Enzyme wesentlich ähnlich sind.
250 g Kallus von Arabidopsis thaliana Ökotypus Columbia wurden auf minimalem Salzagar gezüchtet und gefroren gelagert. Der Kallus wurde in einem Waring-Mixer in Puffer A (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 mit 10 μM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)) resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden durch zwei Durchgänge durch eine French-press-Zelle bei 20.000 PSIG zerstört, um das Rohlysat herzustellen. Das Rohlysat wurde durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wurde auf 25% Sättigung in Ammoniumsulfat mit festem Ammoniumsulfat bei 4°C eingestellt. Nach zwei Stunden wurde die Lösung zentrifugiert, und der Überstand wurde auf 85% Sättigung in Ammoniumsulfat eingestellt. Die Lösung wurde wieder zentrifugiert, und das Pellet wurde in 160 ml Puffer A, der 0,5 M NaCl enthielt, gelöst. 5 ml von Con-A-Harz wurden dieser Lösung zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C 3 Stunden lang geschleudert. Die Aufschlämmung wurde in eine Säule mit 2,5 cm Durchmesser gepackt und mit 0,5 M KCl in Puffer A gewaschen. Das gebundene ARA I wurde mit etwa 60 ml von 0,5 M Alpha-Methylmannosid und 0,5 M NaCl in Puffer A bei 4°C eluiert. Das eluierte ARA I wurde gegen eine Lösung von Puffer B (25 mM KPO₄, 10 μM PMSF, pH 7,4) dialysiert und auf eine in Puffer B äquilibrierte Phosphocellulose-Säule aufgetragen. Das gebundene Enzym wurde mit einem Gradienten von KCl in Puffer B eluiert. Der eluierte Peak von P-11 wurde gegen Puffer A dialysiert und mittels Durchführen durch eine Säule von Mono-Q-Anionenaustauscher konzentriert. Das aus dem Mono-Q-Schritt eluierte ARA I wurde mehrere tausendmal gereinigt, wobei das Präparat jedoch dennoch nicht homogen war.
Die Proteinzusammensetzung der verschiedenen Reinigungsschritte wurde durch eine 4- bis 20%ige Polyacrylamidgradienten-SDS-Gel-Elektrophorese analysiert. Im Gel, das in 14 dargestellt ist, zeigen die Bahnen Folgendes: 1. Extraktherstellung, 2. Ammoniumsulfatausfällung, 3. Con-A-Sepharose-Affinitäts-Säulenchromatographie, 4. Phosphocellulose-P-11-Chromatographie; und 5. Endreinigung über eine DEAE-Sephacel-Anionenaustauschsäule führt zu einer noch intensiveren als 10.000fachen Reinigung von ARA 1. Protein im Gel wurde durch Färben mit Coomassie-Blau R-250 sichtbar gemacht.
PCR-Produkte wurden unter Verwendung von AmpliTaq (Perkin-Elmer) amplifiziert und mittels Wizard-PCR-Präparaten (Promega) gereinigt. Die DNA wurde auf 94°C erhitzt und langsam in 1× ARA-I-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂) gekühlt, um Heteroduplexe zu bilden. Die Heteroduplexe wurden in 20 μl 1× ARA-I-Puffer mit 0,2 μl ARA I (0,01 μg) und 0,5 Einheiten von AmpliTaq (Perkin- Elmer) bei 45°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 1 mM Phenanthrolin gestoppt und zusätzliche 10 Minuten lang bei 45°C inkubiert. Die Proben wurden durch eine Centricep-Säule (Princeton Separations) verarbeitet und getrocknet. 1 μl AB1-Beladungspuffer (25 mM EDTA, pH 8,0, 50 mg/ml Dextranblau), 4 μl entionisiertes Formamid und 0,5 μl innerer TAMRA-Bahnstandard wurden dem getrockneten DNA-Pellet zugesetzt. Die Probe wurde auf 90°C 2 Minuten lang erhitzt und anschließend vor dem Beladen auf Eis gequencht. Die Probe wurde dann auf ein gut lesbares, 4,25%iges, denaturierendes 34-cm-Acrylamidgel geladen und auf einem AB1-373-Sequenzierungsautomat unter Verwendung von GeneScan-672-Software analysiert. Die senkrechte Achse des Elektropherogramms stellt relative Fluoreszenz-Einheiten dar. Die waagrechte Achse des Elektropherogramms stellt DNA-Länge in Nucleotiden dar.
Über die Reinigung hinweg war die Gegenwart von Fehlpaarungs-Endonuclease-Aktivität, die durch ARA I katalysiert wurde, leicht zu beobachten. 15 zeigt ein Autoradiogramm denaturierender DNA-Sequenzierungs-Gel-Analyse von ARA-I-geschnittenen fehlgepaarten Substraten. Die Bahnen im Gel entsprechen den Bahnen, die verschiedene Stadien von gereinigtem ARA I, wie in 14 abgebildet, enthalten. In 15 illustrieren die Schautafeln A, B und C das ARA-I-Schneiden von Substrat Nr. 2 mit dem extrahelikalen G-Nucleotid, von Substrat Nr. 4 mit dem extrahelikalen A-Nucleotid bzw. von Substrat Nr. 18, einem Kontrollsubstrat ohne Fehlpaarungen. F bezieht sich auf Volllängen-Substrate, während sich I auf ARA-I-geschnittene Substrate bezieht, die ein 35 Nucleotide langes Fragment bildeten.
Herstellung von GeneScan-Targets
GeneScan-Targets wurden wie für die CEL-I-Studie beschrieben hergestellt.
Periphere Blutproben von Personen mit hohem Erkrankungsrisiko für Brust- oder Eierstockkarzinome wurden gesammelt, und die isolierte DNA wurde als PCR-Matrizen verwendet. Für die Exons in den BRCA1-Genen spezifische PCR-Primer wurden mit einem 6-FAM-Farbstoff am 5'-Ende des Vorwärts-Primers und mit einem TET-Farbstoff am 5'-Ende am reversen Primer synthetisiert. PCR-Produkte für ein Exon wurden hybridisiert, um Heteroduplexe zu bilden, und mit ARA I umgesetzt. Die Produkte wurden durch den automatisierten ABI-373-DNA-Sequenzierungsautomaten aufgelöst und mittels GeneScan-672-Software analysiert.
Ein schematisches Diagramm des ARA-I-Fehlpaarungsdetektionstests ist in 16 abgebildet. Die PCR-Produkte eines Wildtyp-BRCA1-Allels und eines mutierten BRCA1-Allels (mit einer AG-Deletion in diesem Beispiel) wurden vermischt. Nach Denaturierung durch Hitze und DNA-Re-Annealing wurden Heteroduplexe gebildet, sodass in manchen von ihnen sich die zusätzlichen AG-Basen zu einer Schleife im unteren Strang bildeten. Die schleifenförmigen Stränge wurden durch einen Farbstoffmarker an den 5'-Termini eines jeden PCR-Primers, der zur Bildung des DNA-Fragments verwendet wurde, farbmarkiert. ARA-I schneidet, ähnlich den Fehlpaarungsschnitten durch CEL I, die Schleifen an der 3'-Seite der Fehlpaarung. Als Resultat werden eine trunkierte blaue (6-FAM) Bande und eine trunkierte grüne (TET) Bande gebildet. Die Längen dieser zwei Banden bestimmen unabhängig voneinander exakt die Steile der Mutation im Fragment.
Eine Veranschaulichung der aus der GeneScan-Analyse erhaltenen Daten, die auf ARA-I-Schneiden eines eine Fehlpaarung enthaltenden Heteroduplex basieren, ist in 17 bereitgestellt. Das Auflösen der ARA-I-behandelten DNA-Fragmente erfolgt in einem denaturierenden Polyacrylamidgel in einem automatisierten DNA-Sequenzierungsgerät des Modells 373 von Perkin Elmer. Im denaturierenden Polyacrylamidgel sind die am schnellsten laufenden fluoreszierenden Signale die verbleibenden PCR-Primer. Die zwei ARA-I-Fragmente, ein blaues (6-FAM) und ein grünes (TET), folgen an ihren jeweiligen Größenpositionen. Die am langsamsten wandernde Bande ist das nicht geschnittene Volllängen-PCR-Produkt. Diese Banden werden von der GeneScan-Software als Peaks im Fluorigramm im unteren Teil von 17 dargestellt. Die GeneScan-Software identifiziert unter Verwendung von Molekulargewichts-Standards in roter Farbe (TAMRA), die innerhalb derselben Bahn laufen, die Größen der blauen und der grünen Bande. Die Länge der durch ARA I gebildeten Fragmente von den zwei gefärbten Enden des PCR-Produkts bestimmen unabhängig voneinander exakt die Stelle der Mutation.
Die 18–21 liefern einen simultan durchgeführten Vergleich von GeneScan-Mutationsdetektion von ARA I gegenüber CEL I unter Verwendung derselben BRCA1-Gen-PCR-Produkte, die in den obigen Beispielen beschrieben wurden. Aus den Daten ist ersichtlich, dass CEL I und ARA I identische enzymatische Aktivität auf den getesteten Substraten aufzuweisen scheinen. So ist ARA I gleich wie CEL feine wichtige neue Endonuclease, die eingesetzt werden kann, um die Identifikation von Mutationen in DNA zu erleichtern. Als solches stellt das Enzym einen wertvollen Zusatz zur Palette an Reagenzien bereit, die in genetischen Screening-Tests zum Einsatz kommen.
BEISPIEL XII
Um die Behauptung zu untermauern, dass die Fehlpaarungs-Endonucleasen in Arabidopsis, und tatsächlich in den meisten Pflanzen, der für CEL I von Sellerie im Wesentlichen ähnlich sind, werden die Daten für die Fehlpaarungsdetektion durch die Extrakte von 10 Pflanzen, zusätzlich zu Arabidopsis, dargebracht. Die angegeben Pflanzenextrakte, nämlich Luzerne, Mungbohne, Kohl, Karfiolö (Blumenkohl), Chá-há, Kopfsalat, Petersilie, Selleriekohl, Tomate und Brokkoli, wurden durch Homogenisieren von einem Teil Pflanze mit einem Teil Puffer A in einem Warning-Mixer hergestellt. Wie in 22 gezeigt wurde 1 μl des Roh-Homogenisats mit Substrat Nr. 4 mit 5'-³²P-markiertem oberem Strang (extrahelikales A-Substrat) getestet. Die Bahnen G + A und T sind Maxam- und Gilben-DNA-Sequenzierungsleitern, die verwendet werden, um die exakte Schnittstelle im oberen Strang zu bestimmen. Der Fehlpaarungs-Endonuclease-Schnitt bildete ein 35 Nucleotide langes Fragment, das in den Bahnen 1 bis 11 sichtbar ist. Die Aktivität wurde in den Wurzeln, Trieben, Stengel, Blättern, Blüten und Früchten dieser Pflanzen gesehen, was ein eindeutiges Zeichen für ihre Allgegenwärtigkeit ist. Die Bahnen 12–22, die den Bahnen 1–11 entsprechen, dienen als Negativkontrollen, die Substrat Nr. 1 ohne Fehlpaarungen einsetzen. Chá há ist ein vietnamesisches Gemüse, das Stangensellerie ähnlich und reich an Nucleasen ist.
Um die allgegenwärtige Beschaffenheit von Fehlpaarungs-Endonuclease-Aktivität, die ARA I und CEL I ähnlich ist, weiter zu veranschaulichen, wurden Extrakte aus einer Gruppe von 11 Pflanzen (alle Pflanzen aus 22 plus Spargel umfassend) auf enzymatische Aktivität untersucht. Siehe 23. Die in 22 identifizierten Pflanzenextrakte wurden eingesetzt, um ein Fehlpaarungssubstrat Nr. 2 (extrahelikales G-Substrat) zu schneiden. 1 μl des Roh-Homogenisats wurde mit Substrat 2 mit 5'-³²P-markiertem oberem Strang getestet. Die Bahnen G, G + A, C und T sind Maxam- und Gilben-DNA-Sequenzierungsleitern, die verwendet werden, um die exakte Schnittstelle im oberen Strang zu bestimmen. Der Fehlpaarungs-Endonuclease-Schnitt bildete 34 und 35 Nucleotide lange Fragmente, die in den Bahnen 1 bis 17 sichtbar sind. Zwei Banden wurden für den Fehlpaarungsschnitt aufgrund eines Fehlpaarungs-Schlupfs an den zwei aufeinander folgenden G-Resten im fehlgepaarten Substrat gesehen. Die Aktivität wurde in Wurzeln, Trieben, Stengel, Blättern, Blüten und Früchten dieser Pflanzen gesehen. Die Bahnen 12–22 entsprechen den Bahnen 2–11, wobei jedoch Substrat Nr. 1 ohne Fehlpaarung eingesetzt wurde. Die Bahnen 14–17 illustrieren, dass für die Fehlpaarungs-Endonuclease-Aktivitäten von vier der Pflanzen gezeigt wurde, dass sie Mannosyl-Proteine sind, die CEL I und ARA I gleichen. Diese Aktivitäten wurden an ein ConA-Sepharose-Harz gebunden und dann mit Mannose-Puffer eluiert. Die Bahnen 18–21 sind Kontrollbahnen zu Bahnen 14–17, außer dass Substrat Nr. 1 ohne Fehlpaarung verwendet wurde. Aus den 22 und 23 geht klar hervor, dass die CEL-I- und ARA-I-Fehlpaarungs-Endonucleasen im Wesentlichen ähnlich und unter Pflanzen konserviert sind, und zwar bezüglich der Fähigkeit zum Schneiden von Fehlpaarungen, übermäßiger Aktivität und der Mannsoyl-Beschaffenheit der Glykoproteine.
Die dargebrachte Beschreibung und die Beispiele beziehen sich auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Andere Ausführungsformen sind für Fachleute sicherlich vorstellbar.
LITERATURVERWEISE

1. Modrich, P. (1994) Science 266, 1959–1960.
2. Su, S.-S., Lahue, R. S., Au, K. G., and Moldrich, P. (1988) J. Biol. Chem. 263, 5057–5061.
3. Finkelstein, E., Afek U., Gross, E., Aharoni, N., Rosenberg, L., and Halevy, S. (1994) International Journal of Dermatology 33, 116–118 .
4. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., and Klenk, D. C. (1985) Analytical Chemistry 150, 76–85.
5. Gregory D. J., Culp, D. J., and Jahnke, M. R. (1990) Analytical Biochem. 185, 324–330.
6. Yeung, A. T., Mattes, W. B., Oh, E. Y., and Grossman, L. (1983) Proc. Nat. Acad Sci. USA, 80, 6157–6161.
7. Yeung, A. T., Dinehart, W. J. and Jones, B. K. (1988) Nucleic Acids Res, 16, 4539–4554.
8. Lyamichev, V., Brow, M. A. D., and Dahlberg, J. E. (1993) Science 260, 778–783.
9. Ramotar, D., Auchincloss, A. H., and Fraser, M. J. (1987) J. Biol. Chem. 262, 425–31.
10. Chow, T. Y.-K., and Resnick, M. A. (1987) J. Biol. Chem. 262, 17659–17667.
11. Wyen, N. V., Erdei, S., and Farkas, G. L. (1971) Biochem Biophys. Acta. 232, 472–83.
12. Brown, P. H., and Ho, D. T. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 357–364.
13. Hanson, D. M. and Fairley, J. L. (1969) J. Biol. Chem. 244, 2440–2449.
14. Nucleases, eds. Linn, S. M., Lloyd, R. S., and Roberts, R. J. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.
15. Holloman, W. K., Rowe, T. C., and Rusche, J. R (1981) J. Biol. Chem. 256, 5087–5094.
16. Badman, R. (1972) Genetic Res., Camb. 20, 213–229.
17. Shank T. E., Rhodes, C. Rigby, P. W. J., and Berg, P. (1975) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 989–993.
18. Maekawa, K., Tsunasawa, S., Dibo, G., and Saklyama, F. (1991) Eur. J. Biochem. 200, 651–661.
19. Kowalski, D., Kroeker, W. D., and Laskowski, M. Sr. (1976) Biochemistry 15, 4457–4462.
20. Kroeker, W. D., Kowalski, D., and Laskowski, M. Sr. (1976) Biochemistry 15, 4463–4467.
21. Ardelt, W., and Laskowski, M., Sr. (1971) Biochem. Biophys. Res., Commun. 44, 1205–1211.
22. Kowalski, D. (1984) Nucleic Acids. Res. 12, 7071–7086.
23. Strickland, J. A., Marzilli L. G., Puckett, Jr., J. M., and Doetsch, P. W. (1991) Biochemistry 30, 9749–9756.
24. Doetsch, P. W., McCray, W. H., Lee, K., Bettler, D. R., and Valenzuela, M. R. L. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 6935–6952.
25. Caren, P. R., Kushner, S. R., and Grossman, L, (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 4925–4929.
26. Yeh, Y.-C., Liu, H.-F., Ellis, C. A., and Lu, A.-L. (1994) J. Biol. Chem. 269, 15498–15504.
27. Welch, W. J., Gerrels, J. S., Thomas, G. P., Lin, J. J.-L., and Feramisco, J. R (1983) J. Biol. Chem. 258, 7102–7111.
28. Jackson, S. P., and Tjian, R (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 1781–1785.
29. Jackson, S. P., and Tjian, R (1988) Cell 55, 125–133.
30. He, J., and Furmanski, P. (1995) Nature 373, 721–724.
31. Peeples, M. E. (1988) Virology 162, 255–259.
32. Buckley, A., and Gould, E. A. (1988) J. Gen. Virology, 69, 1913–1920.
33. Gauffre, A., Viron, A., Barel, M., Hermann, J., Puvion, E., and Frade, R. (1992) Molecular Immunology 29, 1113–1120.
34. Jones, B. K. and Yeung, A. T. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci _ USA 85, 8410–8414.
35. Sarker, et al., (1992) Nucleic Acids Research 20: 871–878.
36. Meyers, R. M. et al., (1986) CSHSQB 52: 275.

Claims

Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielsequenz eines einsträngigen Polynucleotids in Bezug auf eine nichtmutierte Sequenz eines Polynucleotids, das mit dem die Zielsequenz enthaltenden Polynucleotid hybridisierbar ist, worin die Polynucleotide amplifiziert, mit einem detektierbaren Marken markiert, aneinander hybridisiert, der Aktivität einer Endonuclease ausgesetzt und auf das Vorliegen der Mutation untersucht werden, wobei die Verbesserung die Verwendung eines fehlgepaarten Endonucleasenenzyms pflanzlichen Ursprungs umfasst, worin das Enzym die Fähigkeit aufweist: a) alle Fehlpaarungen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden zu detektieren, wobei die Detektion über einen pH-Bereich von 5–9 erfolgt und das Enzym über den gesamten pH-Bereich Aktivität zeigt; b) die Bildung eines Einzelstrangbruchs an einer eine Fehlpaarung enthaltenden Zielsequenz zu katalysieren; c) eine Mutation in einer Ziel-Polynucleotidsequenz ohne nachteilige Auswirkungen durch flankierende Polynucleotidsequenzen zu erkennen; und d) Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen mit einer Länge von etwa 100 bp bis etwa 3 kb zu erkennen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Endonuclease von Sellerie stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polynucleotid DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Sequenzen, die der Endonucleaseaktivität ausgesetzt werden, weiters der Aktivität eines Proteins ausgesetzt werden, wobei das Protein aus der aus DNA-Ligase, DNA-Polymerase, DNA-Helikase, 3'-5'-DNA-Exonuclease, DNA-Bindungsproteinen, die an DNA-Termini binden, und Kombinationen dieser Proteine bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wodurch nichtspezifische DNA-Spaltung verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin Ziel-DNA in Gegenwart mehrerer gepoolter Proben analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Polynucleotid cDNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Polynucleotide auf einem DNA-Sequenzierungsgel analysiert werden, wodurch die Position der Mutation in einem Ziel-DNA-Strang in Bezug auf DNA-Sequenzierungs-Molekulargewichtsmarker identifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bestimmung als Test zum Nachweis von Krebs eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bestimmung als Test zum Nachweis von genetischen Veränderungen eingesetzt wird, die zu Geburtsfehlern führen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym auch Polynucleotidschleifen und Insertionen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden erkennt.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Sequenzen, die der Endonucleaseaktivität ausgesetzt werden, weiters der Aktivität eines Proteins ausgesetzt werden, wobei das Protein aus der aus DNA-Ligase, DNA-Polymerase, DNA-Helikase, 3'-5'-DNA-Exonuclease, DNA-Bindungsproteinen, die an DNA-Termini binden, und Kombinationen dieser Proteine bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wodurch der Umsatz der Endonuclease stimuliert wird.
Fehlgepaartes Endonucleasenenzym zur Bestimmung einer Mutation in einer Zielsequenz eines einsträngigen Säugetier-Polynucleotids in Bezug auf eine nichtmutierte Sequenz in einem Polynucleotid, das mit dem die Zielsequenz enthaltenden Polynucleotid hybridisierbar ist, wobei das Enzym aus einer pflanzlichen Quelle isoliert ist und in der Lage ist: a) alle Fehlpaarungen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden zu detektieren, wobei die Detektion über einen pH-Bereich von 5–9 erfolgt und das Enzym über den gesamten pH-Bereich Aktivität zeigt; b) Polynucleotidschleifen und Insertionen in den hybridisierten Polynucleotiden zu erkennen; c) die Bildung eines Einzelstrangbruchs an einer eine Fehlpaarung enthaltenden Zielsequenz zu katalysieren; d) eine Mutation in einer Ziel-Polynucleotidsequenz ohne nachteilige Auswirkungen durch flankierende DNA-Sequenzen zu erkennen; und e) Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen mit einer Länge von etwa 100 bp bis etwa 3 kb zu erkennen.
Enzym nach Anspruch 12, worin das Enzym CEL-I ist.
Enzym nach Anspruch 11, worin das Enzym in im Wesentlichen reiner Form vorliegt.
Enzym nach Anspruch 13, worin das Enzym in im Wesentlichen reiner Form vorliegt.
Enzym nach Anspruch 12, worin die pflanzliche Quelle Arabidopsis thaliana ist.