DE60314902T2 - Fehlpaarungsendonukleasen und verwendungsverfahren - Google Patents

Fehlpaarungsendonukleasen und verwendungsverfahren Download PDF

Info

Publication number
DE60314902T2
DE60314902T2 DE60314902T DE60314902T DE60314902T2 DE 60314902 T2 DE60314902 T2 DE 60314902T2 DE 60314902 T DE60314902 T DE 60314902T DE 60314902 T DE60314902 T DE 60314902T DE 60314902 T2 DE60314902 T2 DE 60314902T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sequence
dna
polynucleotide
heteroduplex
res
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60314902T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60314902D1 (de
Inventor
Hal S. Vacaville PADGETT
Andrew A. Vacaville VAEWHONGS
Fakhrieh S. Davis VOJDANI
Mark L. Davis SMITH
John A. Vacaville LINDBO
Wayne P. Vacaville FITZMAURICE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Large Scale Biology Corp
Original Assignee
Large Scale Biology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/098,155 external-priority patent/US20030157495A1/en
Application filed by Large Scale Biology Corp filed Critical Large Scale Biology Corp
Publication of DE60314902D1 publication Critical patent/DE60314902D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60314902T2 publication Critical patent/DE60314902T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Molekularbiologie und spezieller Fehlpaarungsendonucleaseenzyme und deren Verwendungen in Verfahren zur Herstellung von Populationen verwandter Nucleinsäuremoleküle oder in der Detektion von Einzelnucleotidpolymorphismen.
  • HINTERGRUNDINFORMATION
  • DNA-Neukombination ist ein wichtiges Instrument zur Gewinnung von Rekombinanten zwischen zwei oder mehreren DNA-Sequenzen, um diese schneller zu entwickeln. Die Eltern- oder Input-DNAs für das Verfahren der DNA-Neukombination sind typischerweise Mutanten oder Varianten eines bestimmten Gens, das eine gewisse verbesserte Eigenschaft im Vergleich zum Wildtyp aufweist. Die Produkte der DNA-Neukombination repräsentieren einen Pool von im Wesentlichen willkürlichen Neuordnungen von Gensequenzen aus den Elternnucleinsäuren, die auf additive oder synergistische Wirkungen aus neuen Sequenzkombinationen analysiert werden können.
  • Rekursive Sequenzneuordnung ist analog zu einem Evolutionsverfahren, wo nur Varianten mit geeigneten Eigenschaften ihr genetisches Material zur Produktion der nächsten Generation beitragen dürfen. Optimierte Varianten werden durch DNA-Neukombination-vermittelte Sequenzneuordnung erzeugt, gefolgt von Testen auf zunehmende Verbesserung der Leistung. Zusätzliche Zyklen von Neuordnung und Testen führen zur Produktion von Genen, die neue Kombinationen von genetischen Verbesserungen enthalten, die in vorherigen Verfahrensrunden identifiziert worden sind. Neuordnung und Kombination vorteilhafter genetischer Veränderungen ermöglichen die Entstehung einer optimierten Sequenz ohne alle möglichen Sequenzkombinationen individuell herstellen und screenen zu müssen.
  • Neukombination unterscheidet sich stark von willkürlicher Mutagenese, wo spätere Verbesserungen einer schon verbesserten Sequenz großteils vom glücklichen Zufall abhängen. Um ein Protein zu erhalten, das eine erwünschte Reihe von verbesserten Eigenschaften aufweist, kann es z.B. notwendig sein, eine Mutante zu identifizieren, die eine Kombination aus verschiedenen vorteilhaften Mutationen enthält. Wenn für die Kombination dieser vorteilhaften genetischen Veränderungen kein Verfahren verfügbar ist, ist eine weitere willkürliche Mutagenese erforderlich. Jedoch erfordert willkürliche Mutagenese wiederholte Zyklen von Produktion und Screening großer Anzahlen von Mutanten, was zu einem Verfahren führt, das langwierig und höchst arbeitsintensiv ist. Weiters erhöht die Geschwindigkeit, mit welcher Sequenzen Mutationen mit unerwünschten Wirkungen erfahren, den Informationsgehalt einer Sequenz. Da der Informationsgehalt, die Bibliotheksgröße und Mutagenesegeschwindigkeit zunehmen, nimmt das Verhältnis von schädlichen Mutationen zu vorteilhaften Mutationen zu, was die Auswahl von weiteren Verbesserungen zunehmend maskiert. Letztlich haben einige Computersimulationen vermuten lassen, dass Punktmutagenese alleine oft zu langsam ist, um Blockveränderungen in großem Umfang zu ermöglichen, die zur kontinuierlichen und drastischen Sequenzentwicklung erforderlich sind.
  • Fehlerauslösende PCR verwendet Polymerisierungsbedingungen mit geringer Genauigkeit, um ein geringes Ausmaß an Punktmutationen willkürlich über einer Sequenz einzuführen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist jedoch, dass veröffentlichte fehlerauslösende PCR-Protokolle unter einer geringen Verarbeitbarkeit der Polymerase leiden, was diesen Ansatz in der Produktion von zufälliger Mutagenese in einem durchschnittlich großen Gen ineffizient macht.
  • Bei oligonucleotidgerichteter Zufallsmutagenese wird eine kurze Sequenz durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonucleotid ersetzt. Zur Erzeugung von Kombinationen von entfernten Mutationen müssen verschiedene Stellen gleichzeitig durch verschiedene Oligonucleotide angesteuert werden. Die eingeschränkte Bibliotheksgröße, die auf diese Weise erhalten wird, im Vergleich zur Bibliotheksgröße, die erforderlich ist, um alle Stellen zu sättigen, macht viele Auswahlrunden zur Optimierung erforderlich. Mutagenese mit synthetischen Oligonucleotiden macht Sequenzierung von einzelnen Klonen nach jeder Auswahlrunde, gefolgt von Gruppierung dieser in Familien, erforderlich, wobei willkürlich eine einzelne Familie ausgewählt wird und sie auf ein Consensusmotiv reduziert wird. Ein solches Motiv wird resynthetisiert und in ein einzelnes Gen, gefolgt von zusätzlicher Selektion, reinsertiert. Dieser Schritt schafft einen statistischen Engpass, ist arbeitsintensiv und für viele Mutageneserunden unpraktisch.
  • Aus diesen Gründen können fehlerauslösende PCR und oligonucleotidgerichtete Mutagenese für Mutageneseprotokolle verwendet werden, die relativ wenige Zyklen von Sequenzänderung erfordern, wie z.B. zur Sequenz-Feinabstimmung, sind aber in ihrer Nützlichkeit auf Verfahren eingeschränkt, die zahlreiche Mutagenese- und Selektionszyklen erfordern, insbesondere auf großen Gensequenzen.
  • Wie zuvor beschrieben sind Verfahren nach dem Stand der Technik zur Produktion von verbesserten Genprodukten von willkürlich mutierten Genen von eingeschränkter Nützlichkeit. Ein anerkanntes Verfahren zur Produktion von willkürlich neu angeordneten Gensequenzen verwendet Enzyme, um eine lange Nucleotidkette in kleine Stücke zu spalten. Die Spaltmittel werden dann aus dem genetischen Material getrennt und das Material auf solche Weise amplifiziert, dass das genetische Material sich als Ketten von Polynucleotiden neu anordnen kann, wobei ihre Neuordnung entweder zufällig oder gemäß einer spezifischen Anordnung erfolgt. Das Verfahren erfordert mehrere Amplifikationsrunden, um Varianten von Genen zu assemblieren, die in willkürliche Fragmente gebrochen wurden (Stemmer, P.N.A.S. 91, 10747-10751 (1994), Stemmer, Nature 370, 389-391 (1994), US-Patent Nr. 5.605.793 , US-Patent Nr. 5.811.238 , US-Patent Nr. 5.830.721 , US-Patent Nr. 5.928.905 , US-Patent Nr. 6.096.548 , US-Patent Nr. 6.117.679 , US-Patent Nr. 6.165.793 , US-Patent Nr. 6.153.410 ). Eine Variation dieses Verfahrens verwendet Primer und eingeschränkte Polymeraseextensionen, um vor Neuordnung Fragmente zu erzeugen ( US-Patent Nr. 5.965.408 , US-Patent Nr. 6.159.687 ).
  • Jedoch sind beide Verfahren eingeschränkt. Diese Verfahren leiden darunter, technisch komplex zu sein. Dies schränkt die Anwendbarkeit dieser Verfahren auf Einrichtungen ein, die über ausreichend erfahrenes Personal verfügen. Zusätzlich daszu gibt es Komplikationen, die aus der Neuordnung von Molekülen aus Fragmenten entstehen, einschließlich unbeabsichtigter Mutagenese und zunehmender Schwierigkeit der Neuordnung großer Targetmoleküle steigender Größe, welche die Nützlichkeit dieser Verfahren zur Neuordnung langer Polynucleotidstränge einschränken.
  • Eine andere Einschränkung dieser Verfahren zur Fragmentation und auf Neuordnung basierenden Gen-Neukombination tritt auf, wenn die Eltern-Matrizen-Polynucleotide zunehmend heterogen sind. Im Annealingschritt dieser Verfahren hängen die kleinen Polynucleotidfragmente von stabilisierenden Kräften ab, die aus Basenpaarungswechselwirkungen resultieren, um sich wieder geeignet zu anellieren. Da die kleinen Annealing-Regionen aufgrund ihrer kurzen Länge eingeschränkte stabilisierende Kräfte aufweisen, ist Annealing von höchst komplementären Sequenzen gegenüber abweichenderen Sequenzen bevorzugt. In solchen Fällen haben diese Verfahren eine starke Tendenz dazu, die Eltern-Matrizen-Polynucleotide aufgrund des Annealings komplementärer Einzelstränge aus einer besonderen Elternmatrize zu regenerieren. Deshalb ordnen sich die Elternmatrizen im Wesentlichen so neu an und erzeugen einen Hintergrund unveränderter Polynucleotide in der Bibliothek, welche die Schwierigkeit der Detektion rekombinanter Moleküle erhöht. Dieses Problem wird zunehmend ernst, da die Elternmatrizen heterogener werden, d.h. da der Prozentsatz der Sequenzidentität zwischen den Elternmatrizen abnimmt. Dieses Ergebnis wurde von Kikuchi et al., Gene 243, 133-137 (2000), gezeigt, die versuchten, Rekombinanten zwischen xy1E und nahes zu erzeugen, unter Verwendung der Verfahren der Familienneukombination, die von Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8, 724-723 (1997); Crameri et al., Nature 391, 288-291 (1998); Harayama, Trends Biotechnol. 16, 76-82 (1998); Kumamaru et al., Nat. Biotechnol. 16, 663-666 (1998); Chang et al., Nat. Biotechnol. 17, 793-797 (1999); Hansson et al., J. Mol. Biol. 287, 265-276 (1999), berichtet wurden. Kichuchi et al. stellten fest, dass im Wesentlichen keine Rekombinanten (<1 %) erzeugt wurden. Sie offenbarten auch ein Verfahren zur Verbesserung der Bildung von chimären Genen durch Fragmentation und Neuordnung von einzelsträngigen DNAs. Unter Verwendung dieses Verfahrens erhielten sie chimäre Gene in einer Rate von 14 Prozent, wobei die anderen 86 Prozent Elternsequenzen waren.
  • Die Eigenschaft von Gewinnung mit niedriger Effizienz von Rekombinanten schränkt die Nützlichkeit dieser Verfahren zur Erzeugung neuer Polynucleotide aus Elternmatrizen mit einem geringeren Prozentsatz von Sequenzidentität, d.h. Elternmatrizen, die vielfältiger sind, ein.
  • Dementsprechend besteht Bedarf an einem Verfahren zur Erzeugung von Gensequenzen, die diese Bedürfnisse erfüllen. Es ist ein Verfahren entwickelt worden, um Mutationen unter verwandten Polynucleotiden in vitro durch die Bildung von Heteroduplexmolekülen und Ansteuern der Fehlpaarungen neu anzuordnen, sodass Sequenzinformation an Stellen von Fehlpaarungen von einem Strang zum anderen transferiert wird. Die Fehlpaarungen werden durch Inkubation der Heteroduplexmoleküle in einer Rektion angesteuert, die (a) ein Enzym, das einen Sequenzstrang an einer Fehlpaarungsstelle erkennt und nickt, b) eine Polymerase mit einer Korrekturaktivität in Gegenwart von dNTPS und c) eine Ligase enhält. Die jeweiligen Aktivitäten wirken zusammen, sodass an einer bestimmten Stelle einer Fehlpaarung der Heteroduplex genickt wird, ungepaarte Basen aus einem der Stränge herausgeschnitten werden, dann unter Verwendung des entgegengesetzten Strangs als Matrize ersetzt werden und Nicks versiegelt werden. Entstehende Polynucleotide können vor Klonierung amplifiziert werden oder direkt kloniert werden und auf verbesserte Eigenschaften getestet werden. Zusätzliche Zyklen von Fehlpaarungsauflösungs-Neuordnung und Testen können zu weiterer Verbesserung führen.
  • Dieses Verfahren verwendet eine Fehlpaarungsendonuclease, die in der Lage ist, an der Stelle einer Fehlpaarung zwischen einer Base oder einer Sequenz von Basen entlang entgegengesetzten Strängen einer Nucleinsäuresequenz zu erkennen und zu nicken.
  • WO 02/079468 A beschreibt ein Verfahren zur Neuordnung von Sequenzinformation zwischen verwandten Nucleinsäuresequenzen durch Auflösung von Fehlpaarungen in einem Heteroduplex.
  • WO 99/29902 A beschreibt ein Verfahren zur Entwicklung eines Polynucleotids zum Erwerb einer gewünschten funktionellen Eigenschaft durch Transformation eines Heteroduplexmoleküls in eine kompetente DNA-Reparaturzelle oder einen Zellextrakt und Screening und Selektion der neu kombinierten Polynucleotidvarianten für die gewünschte funktionelle Eigenschaft.
  • Solaro et al. (J. Molec. Biol. 230, 868-877 (1993)) beschreiben die Neubildung des Bakteriophagen-T4-Fehlpaarungskorrektursystems in vitro zur Korrektur einer DNA-Fehlpaarung.
  • Um den Bedarf an Enzymen zu decken, die eine Fehlpaarung erkennen, haben die Erfinder das Gen für das CEL-I-Enzym und ein neues Enzym kloniert, das RES I genannt wird. Beide dieser Enzyme sind Fehlpaarungsendonucleasen und beide sind besonders geeignet, um eine Basenpaarfehlpaarung entlang einer Nucleinsäuresequenz zu erkennen, wie z.B. eines Chromosoms, eines Plasmids, eines Gens, eines Abschnitts eines Gens oder einer beliebigen künstlichen Sequenz von Nucleinsäuren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt das Enzym RES I bereit, das in der Lage ist, eine Basenfehlpaarung in einer Nucleotidsequenz zu detektieren und die Sequenz an der Stelle der Basenfehlpaarung zu nicken. Es ist auch CEL I mit derselben Nützlichkeit beschrieben. Diese Enzyme können aus den nativen Pflanzen erhalten werden, in welchen sie auftreten. Es sind hierin Verfahren bereitgestellt, um sie als rekombinante Enzyme in einem Wirtsorganismus herzustellen, indem sie in den Wirtsorganismus kloniert werden.
  • CEL I und RES I sind in Genshufflingtechnologie zur Entwicklung neuer Gene und der Detektion eines Einzelnucleotidpolymorphismus (SNP) für z.B. Detektion von Beweisen für Krebsanfälligkeit nützlich.
  • Es ist auch ein Verfahren zum Klonieren von Res-I-Genen in ein Plasmid oder einen Virusvektor zum Transfer zu einem Wirtsorganismus bereitgestellt, der die Anzahl von Kopien des Gens amplifiziert oder das Enzym, für welches im Plasmid oder Virusvektor kodiert wird, herstellt.
  • Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Pflanzenwirts aus Res-I-Enzymen bereitgestellt.
  • Die CeI-I- und Res-I-Nucleinsäuresequenzen sind bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
  • Es ist auch eine vollständige Beschreibung eines Verfahrens bereitgestellt, bei welchem RES I zur In-vitro-Neuordnung von Mutationen unter verwandten Polynucleotiden verwendet wird, indem Heteroduplex-Moleküle gebildet werden und dann die Fehlpaarungen angesteuert werden, sodass Sequenzinformationen an Stellen der Fehlpaarung von einem Strang auf einen anderen transferiert werden. Die Fehlpaarungen werden durch Inkubation der Heteroduplex-Moleküle in einer Reaktion angesteuert, die RES-I-Fehlpaarungsendonucleaseenzym, das eine Fehlpaarung erkennt und einen der Stränge an der Fehlpaarungsstelle nickt, eine Polymerase mit einer Korrekturaktivität in Gegenwart von dNTPs und eine Ligase enthält. Diese jeweiligen Aktivitäten wirken zusammen, sodass an einer bestimmten Fehlpaarungsstelle der Heteroduplex genickt wird, ungepaarte Basen aus einem der Stränge herausgeschnitten werden, dann unter Verwendung des entgegengesetzten Strangs als Matrize ersetzt werden und Nicks versiegelt werden. Entstehende Polynucleotide können vor Klonierung amplifiziert werden oder direkt kloniert werden und auf verbesserte Eigenschaften getestet werden. Weitere Zyklen von Fehlpaarungsauflösungs-Neuordnung und Testen können zu weiterer Verbesserung führen.
  • Das Verfahren ist auch als Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von komplementären Basenpaaren in einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz beschrieben, wo die Heteroduplexpolynucleotidsequenz zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist, das Verfahren umfasst die Mischung der Heteroduplexpolynucle otidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, die von RES-I-Enzym bereitgestellt wird, Korrekturaktivität und Ligaseaktivität und die Bereitstellung von ausreichend Zeit für eine Reihe an nicht-komplementären Nucleotidbasenpaaren, in komplementäre Basenpaare umgewandelt zu werden, worin die Homogenität zwischen den Strängen um zumindest ein komplementäres Basenpaar erhöht wird.
  • Das Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Herstellung einer Population von Sequenzvarianten aus einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz beschrieben, worin die Heteroduplexpolynucleotidsequenz zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist, wobei das Verfahren die Mischung von Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, die von RES-I bereitgestellt ist, Proof-Reading-Aktivität und Ligaseaktivität und Bereitstellung von ausreichend Zeit für eine Anzahl von nicht-komplementären Nucleotidbasenpaaren umfasst, um in komplementäre Basenpaare überführt zu werden, worin sich eine vielfältige Population von Polynucleotidsequenzen ergibt.
  • Das Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Gewinnung einer Polynucleotidsequenz, die für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, beschrieben, umfasst die Herstellung von zumindest einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz, Mischung von Kopien von Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, die durch RES-I-Enzym bereitgestellt ist, Proof-Reading-Aktivität und Ligaseaktivität und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität zwischen Strängen der Heteroduplexpolynucleotidsequenz steigt, worin Sequenzvielfalt in der Population erhöht wird, und Screening oder Selektion einer Population von Varianten auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft.
  • Das Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids beschrieben, das für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, umfasst die Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Mischung von Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, Proof-Reading-Aktivität und Ligaseeaktivität, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass einige oder alle fehlgepaarte(n) Nucleotidbasenpaare in der Heteroduplexpolynucleotidsequenz in komplementäre Basen überführt werden, worin eine vielfältige Population von Polynucleotidsequenzen resultiert, Screening oder Selektion einer Population von Varianten mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft, Denaturierung der Population von Varianten, um eine Population einzelsträngiger Polynucleotidsequenzen zu erhalten, Annealing der Population von einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen, um eine vielfältige Population von Heteroduplexpolynucleotidsequenzen zu bilden, Mischung der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, Proof-Reading-Aktivität und Ligaseaktivität, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass einige oder alle fehlgepaarte(n) Nucleotidbasenpaare in der Heteroduplexpolynucleotidsequenz in gepaarte Basenpare überführt werden, worin eine vielfältige Population von Polynucleotidsequenzen resultiert, und Screening oder Selektion einer Population von Varianten mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft. DNA kann in RNA vor Screening durch Transkription der DNA überführt werden. Eine Ligaseaktivität kann hinzugefügt werden, um die Stränge nach Proof-Reading zu versiegeln.
  • Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist, dass die Sequenz entweder zirkulär oder linear ist. Dies ermöglicht eine Neukombination von nahezu unbegrenzter Sequenzlänge. Die Variantenpolynucleotidsequenzen weisen verschiedene Ausmaße an Komplementärität auf. Die Erfinder berichten von Erhöhung der Komplementarität in einem Polynucleotidheteroduplex zwischen zwei Polynucleotiden mit einer geringen Sequenzhomologie von 47 %.
  • Dieses Verfahren kann gleichzeitig an mehreren Stellen und an beiden Strängen eines bestimmten Heteroduplex-DNA-Moleküls stattfinden. Das Ergebnis ist eine Randomisierung von Sequenzunterschieden unter Inputsträngen, um eine Population von Sequenzvarianten zu ergeben, die vielfältiger ist als die Population von Startsequenzen.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Identifikation eines neu angeordneten DNA-Moleküls, das für ein Protein mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft kodiert, die Bereitstellung von zumindest einem einzelsträngigen uracilenthaltenden DNA-Molekül, dessen einzelsträngiges uracilenthaltendes DNA-Molekül oder ein komplementärer Strang dazu für ein Protein kodiert; die Bereitstellung eines oder einer Vielzahl von nicht-identischen einzelsträngigen DNA-Molekülen, die in der Lage sind, an ein einzelsträngiges uracilenthaltendes DNA-Molekül zu hybridisieren, worin die DNA-Moleküle für zumindest eine zusätzliche Variante des Proteins kodieren; Kontaktieren des einzelsträngigen uracilenthaltenden DNA-Moleküls mit zumindest einem einzelsträngigen DNA-Molekül aus Schritt (b), wodurch ein anelliertes DNA-Molekül produziert wird; Inkubieren des anellierten DNA-Moleküls mit einer Fehlpaarungsendonuclease, Proof-Reading-Poylmerase und einer Ligase, wodurch ein sequenzneuanordnender DNA-Strang hergestellt wird, der an das uracilenthaltende DNA-Molekül anelliert ist; Amplifizieren des neu angeordneten DNA-Strangs unter Bedingungen, worin das uracilenthaltende DNA-Molekül nicht amplifiziert wird, wodurch eine Population von neu angeordneten DNA-Molekülen produziert wird; und Screening oder Selektion der Population von neu angeordneten DNA-Molekülen, um jene zu identifizieren, die für ein Polypeptid kodieren, das die gewünschte funktionelle Eigenschaft aufweist, wodurch ein oder mehrere DNA-Molekül(e) identifiziert werden, die für ein Polypeptid mit der gewünschten funktionellen Eigenschaft kodieren. Dieses Verfahren kann auch unter Verwendung eines RNA-Moleküls als Matrize erfolgen.
  • Jedes der oben beschriebenen Verfahren kann alternativ mit dem Enzym CEL I wie hierin beschrieben durchgeführt werden.
  • Wie hierin beschrieben ist Cel I ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleinsäuresequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4 umfasst.
  • Es ist ebenfalls ein rekombinantes Virus beschrieben, das eine Nucleinsäuresequenz von Cel I, repräsentiert durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4, umfasst.
  • Es ist ebenfalls ein rekombinantes Plasmid beschrieben, das eine Nucleinsäuresequenz von Cel I, repräsentiert durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4, umfasst.
  • Es ist ebenfalls eine Pflanze oder Pflanzenzelle beschrieben, die ein rekombinantes Virus umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz von Cel I,. repräsentiert durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4, kodiert.
  • Es ist ebenfalls eine Pflanze oder Pflanzenzelle beschrieben, die ein rekombinantes Plasmid umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz von Cel I, repräsentiert durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4, kodiert.
  • Das rekombinante Virus kann ein Pflanzenvirus, ein Tiervirus, ein Pilzvirus, oder ein bakterielles Virus sein.
  • Es ist auch ein Verfahren zur Expression von CEL-I-Endonuclease beschrieben, das ein rekombinantes Virus verwendet.
  • Es ist auch ein Verfahren zur Verwendung von CEL I in einem In-vitro-Verfahren zur Herstellung von Sequenzvarianten von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid beschrieben, wo der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • a. Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid;
    • b. Mischung des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge von CEL I, T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität steigt, worin eine oder mehrere Varianten hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform ist Res I ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleinsäuresequenz von Seq.-ID Nr. 16 umfasst. Es ist die RES-I-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 34 dargestellt.
  • In einer anderen Ausführungsform ein rekombinantes Virus, das eine Nucleinsäuresequenz von RES I umfasst, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
  • In einer anderen Ausführungsform ein rekombinantes Plasmid, das eine Nucleinsäuresequenz von RES I umfasst, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
  • In einer anderen Ausführungsform eine Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein rekombinantes Virus umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz von RES I kodiert, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
  • In einer anderen Ausführungsform eine Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein rekombinantes Plasmid umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz von RES I kodiert, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das rekombinante Virus ein Pflanzenvirus, ein Tiervirus, ein Pilzvirus oder ein bakterielles Virus sein.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Verfahren zur Expression von RES-I-Endonuclease unter Verwendung eines rekombinanten Virus dargestellt.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein Verfahren zur Verwendung von RES I in einem In-Vitro-Verfahren zur Herstellung von Sequenzvarianten aus zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid dargestellt, wo der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • a. Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid;
    • b. Kombination von Heteroduplexpolynucleotid mit einer wirksamen Menge von RES I, T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase und
    • c. Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität erhöht werden kann, worin eine oder mehrere Varianten hergestellt werden können.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt das Verfahren der genetischen Neuordnung von Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR). Neuordnung wird zwischen zwei hypothetischen Polynucleotiden erreicht, die sich in zumindest zwei Nucleotidpositionen unterscheiden. Annealing zwischen dem oberen Strang von A und dem unteren Strang von B ist dargestellt, was zu Fehlpaarungen an den zwei Positionen führt. Nach dem Verfahren zur Neuordnung von Fehlpaarungsauflösung sind vier verschiedene Produktpolynucleotide zu sehen, die Elterntypen A und B und die neugeordneten Produkte X und Y.
  • 2 zeigt eine exemplarische teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation von zwei Molekülen, 2A zeigt die Sequenz von zwei Nucleinsäuremolekülen „X" und „Y" mit komplett komplementären Ober- und Untersträngen 1+/2- bzw. 3+/4-. Die Positionen von sich unterscheidenden Nucleotiden zwischen den Nucleinsäuren X und Y sind angezeigt (*). 2B zeigt mögliche Kombinationen von Einzelsträngen, die aus Nucleinsäuren X und Y nach Denaturierung und Annealing gewonnen werden, und zeigt, welche dieser Kombinationen eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation von zwei umfasst.
  • 3 zeigt eine Nucleinsäuresequnez, die für RES-I-Endonuclease (Seq.-ID Nr. 16) kodiert, wie in Beispiel 8 beschrieben.
  • 4 zeigt eine entsprechende Aminosäuresequenz für RES I (Seq.-ID Nr. 34).
  • 5 zeigt die Nucleinsäuresequenz für Plasmid pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32), wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • 6 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-Cg (Seq.-ID Nr. 18), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 7 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-Ob (Seq.-ID Nr. 19), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 8 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-U2 (Seq.-ID Nr. 20), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 9 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-Cg und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 21), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 10 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus TMV-Cg und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 22), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 11 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-Ob und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 23), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 12 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus TMV-Ob und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 24), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 13 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-U2 und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 25), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 14 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus TMV-U2 und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 26), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 15 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-U1 und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 27), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 16 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus TMV-U1 und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 28), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 17 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV (Seq.-ID Nr. 9), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • 18 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von ToMV (Seq.-ID Nr. 10), wie in Beispiel 15 beschrieben.
  • Definitionen
  • Um ein klares und logisches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche bereitzustellen, einschließlich des Schutzumfangs, der hierin solchen Begriffen verliehen wird, sind folgende Definitionen bereitgestellt:
    Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Amplifikation" auf ein Verfahren, in welchem die Anzahl von Kopien eines Polynucleotids erhöht wird.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Annealing" die Bildung von zumindest teilweise doppelsträngiger Nucleinsäure durch Hybridisierung von zumindest teilweise komplementären Nucleotidsequenzen. Eine teilweise doppelsträngige Nucleinsäure kann auf Hybridisierung eines kleineren Nucleinsäurestrangs an einen längeren Nucleinsäurestrang zurückzuführen sein, wo die kleinere Nucleinsäure 100% identisch mit einem Abschnitt der größeren Nucleinsäure ist. Eine teilweise doppelsträngige Nucleinsäure kann auch auf die Hybridisierung von zwei Nucleinsäuresträngen zurückzuführen sein, die keine 100 % Identität teilen, aber ausreichend Homologie aufweisen, um unter einer bestimmten Reihe von Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Klemme" eine einzigartige Nucleotidsequenz, die an ein Ende eines Polynucleotids hinzugefügt wird, wie z.B. durch Inkorporation der Klemmensequenz in einen PCR-Primer. Die Klemmensequenzen sollen Amplifikation nur von Polynucleotiden ermöglichen, die aus Hybridisierung von Strängen verschiedener Eltern entstehen (d.h. Heteroduplexmoleküle), wodurch die Produktion von Hybridprodukten voller Länge wie zuvor beschrieben sichergestellt wird (Skarfstad, J. Bact., Band 182, Nr. 11, 3008-3016).
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Spalten" den Verdau des Polynucleotids mit Enzymen oder aber das Aufbrechen von Phosphodiester-Bindungen mit dem Polynucleotid. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Strangspaltungsaktivität" oder „Spaltung" das Aufbrechen einer Phosphodiesterbindung in der Hauptkette des Polynucleotidstrangs, wie durch die Bildung eines Nicks. Strangspaltungsaktivität kann durch ein enzymatisches Mittel bereitgestellt werden. Solche Mittel umfassen CEL 1, RES 1 und ihre Varianten.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „komplementäres Basenpaar" die Entsprechung von DNA-(oder RNA-)Basen in der Doppelhelix, sodass Adenin in einem Strang gegenüber Thymin (oder Uracil) im anderen Strang liegt und Cytosin in einem Strang gegenüber Guanin im anderen Strang liegt.
  • Wie hierin verwendet, wird der Begriff „komplementär zu" dazu verwendet, zu beschreiben, dass die komplementäre Sequenz mit dem Umkehrkomplement aller oder eines Abschnitts einer Referenzpolynucleotidsequenz identisch ist oder dass jedes Nucleotid in einem Strang in der Lage ist, ein Basenpaar mit einem Nucleotid oder einem Analogon davon im entgegengesetzten Strang zu bilden. Zur Veranschaulichung ist die Nucleotidsequenz „TATAC" komplementär zur Referenzsequenz „GTATA".
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „denaturierend" oder „denaturiert", wenn er zur Bezeichnung von Nucleinsäuren verwendet wird, die Überführung einer doppelsträngigen Nucleinsäure an eine einzelsträngige Nucleinsäure. Verfahren zum Denaturieren von doppelsträngigen Nucleinsäuren sind fachbekannt und umfassen zum Beispiel die Hinzufügung von Mitteln, die Basenpaarung destabilisieren, Erhöhen der Temperatur, Verringerung der Salzkonzentration oder Kombinationen davon. Diese Faktoren werden gemäß der Komplementarität der Stränge angewendet, d.h. die Stränge sind 100 % komplementär oder weisen ein oder mehrere nicht-komplementäre Nucleotide auf.
  • Wie hierin verwendet steht der Begriff „gewünschte funktionelle Eigenschaft" für eine phänotypische Eigenschaft, die unter anderem das Kodieren für ein Polypeptid, die Förderung der Transkription von verbundenen Polynucleotiden, die Bindung eines Proteins, die Verbesserung der Funktion eines Virusvektors und dergleichen umfasst, die ausgewählt werden kann und auf die gescreent werden kann. Polynucleotide mit solchen gewünschten funktionellen Eigenschaften können auf verschiedenste Weise verwendet werden, die unter anderem die Expression aus einer/m geeigneten Pflanze, Tier, Pilz, Hefe oder Bakterienexpressionsvektor, Integration zur Bildung einer/s transgenen Pflanze, Tiers oder Mikroorganismus, Funktion eines Ribozyms und dergleichen umfassen.
  • Wie hierin verwendet, wird der Begriff „DNA-Neukombination" dazu verwendet, eine Neuordnung von Sequenzinformation zwischen im Wesentlichen homologen, aber nicht-identischen Sequenzen anzugeben.
  • Wie hierin verwendet, wird der Begriff „wirksame Menge" dazu verwendet, die Menge eines Mittels zu beschrieben, die notwendig ist, um zu erreichen, dass das Mittel seine gewünschte Aktivität bereitstellt. Für die vorliegende Erfindung liegt diese Bestimmung innerhalb des Wissensbereichs von Fachleuten.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Wirt" eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, die/das/der in der Lage ist, einen Vektor oder eine Pflanzenvirusnucleinsäure zu replizieren, und in der Lage ist, mit einem Virus infiziert zu sein, das den Virusvektor oder die Pflanzenvirusnucleinsäure umfasst. Der Begriff soll, wo geeignet, prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen umfassen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Infektion" die Fähigkeit eines Virus, seine Nucleinsäure zu einem Wirt zu transferieren oder Virusnucleinsäure in einen Wirt einzuführen, worin die Virusnucleinsäure repliziert wird, Virusproteine werden synthetisiert und neue Viruspartikel assembliert werden. In diesem Kontext werden die Begriffe „transmissibel" und „infektiös" hierin austauschbar verwendet.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "nicht-nativ" eine beliebige RNA-Sequenz, welche die Produktion von subgenomischer mRNA, einschließlich aber nicht ausschließlich von 1) Pflanzenviruspromotoren, wie z.B. ORSV und Trespenmosaik-Virus, 2) Viruspromotoren aus anderen Organismen, wie z.B. menschliche Sindbis-Viruspromotoren, und 3) synthetische Promotoren, umfasst.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „phänotypisches Merkmal" eine beobachtbare Eigenschaft, die aus der Expression eines Gens resultiert.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzenzelle" eine strukturelle und physiologische Einheit von Pflanzen, bestehend aus einem Protoplasten und der Zellwand.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzenorgan" einen anderen und sichtbar differenzierten Teil einer Pflanze, wie eine Wurzel, Stamm, Blatt oder Embryo.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzengewebe" eine beliebiges Gewebe einer Pflanze in planta oder in Kultur. Dieser Begriff soll eine gesamte Pflanze, Pflanzenzelle, Pflanzenorgan, Protoplasten, Zellkultur oder eine beliebige Gruppe von Pflanzenzellen umfassen, die in einer strukturellen und funktionellen Einheit organisiert sind.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Produktionszelle" eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, die/das/der in der Lage ist, einen Vektor oder Virusvektor zu replizieren, aber nicht notwendigerweise einen Wirt für das Virus ist. Dieser Begriff soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen umfassen, wie z.B. Bakterien-, Hefe-, Pilz- und Pflanzengewebe.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Promotor" die 5'-flankierende, nicht-kodierende Sequenz, die an eine kodierende Sequenz angrenzt, die in den Beginn der Transkription der kodierenden Sequenz involviert ist.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Protoplast" eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwände mit dem Potential zur Regeneration in Zellkultur oder eine gesamte Pflanze.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure" Pflanzenvirusnucleinsäure, die modifiziert worden ist, um nicht-native Nucleinsäuresequenzen zu erhalten.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinantes Pflanzenvirus" ein Pflanzenvirus, das die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure enthält.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „subgenomischer Promotor" einen Promotor einer subgenomischen mRNA einer Virusnucleinsäure.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „wesentliche Sequenzhomologie" Nucleotidsequenzen, die zueinander im Wesentlichen funktionell äquivalent sind. Nucleotidunterschiede zwischen solchen Sequenzen, die wesentliche Sequenzhomologie aufweisen, sind de minimus in der Beeinflussung der Funktion der Genprodukte oder einer RNA, für welche eine solche Sequenz kodiert.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Transkription" die Produktion eines RNA-Moleküls durch RNA-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNA-Sequenz.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Vektor" ein selbst-replizierendes DNA-Molekül, das ein DNA-Segment zwischen Zellen transferiert.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Virus" ein infektiöses Mittel, bestehend aus einer Nucleinsäure, die in einem Protein eingekapselt ist. Ein Virus kann wie oben beschrieben ein mono-, di-, tri- oder mehrteiliges Virus sein.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „genetische Neuordnung durch Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR)" ein Verfahren zur Neuordnung von Sequenzvariationen unter verwandten Polynucleotiden durch ein In-vitro-Verfahren zur Neuverteilung von Sequenzvariationen zwischen nicht-identischen Polynucleotidsequenzen, indem aus zwei nicht-identischen Polynucleotiden ein Heteroduplexpolynucleotid hergestellt wird; Einführung eines Nicks in einem Strang an oder nahe einer Basenpaarfehlpaarungsstelle; Entfernen von fehlgepaarter/n Base(n) aus der Fehlpaarungsstelle, wo der Nick auftrat; und Verwenden des entgegengesetzten Strangs als Matrize, um die entfernte(n) Base(n) durch Basen zu ersetzen, die Base(n) im ersten Strang komplementieren. Durch dieses Verfahren wird die Information von einem Strang auf einen anderen an Stellen der Fehlpaarung transferiert.
  • Mehrere Stellen in einem teilweise komplementären Molekül können unabhängig und gleichzeitig in diesem Verfahren angesteuert werden. Das Ergebnis ist ein Anstieg des Prozentsatzes von komplementären Basenpaaren in der Polynucleotidsequenz.
  • Eine oder mehrere Basenpaarfehlpaarungen zwischen zwei Strängen der Heteroduplexpolynucleotidsequenz werden in einem In-vitro-Verfahren durch Mischung der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einer wirksamen Menge einer fehlpaarungsgerichteten Strangspaltungsaktivität aufgelöst, die durch CEL-I- oder RES-I-Enzym bereitgestellt ist, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität, um eine oder mehrere der Fehlpaarungen aufzulösen. Durch dieses Verfahren wird Information von einem Strang zum anderen an Stellen der Fehlpaarung transferiert.
  • Eine Fehlpaarung kann das Ergebnis zweier nicht-komplementärer Basen sein, die einander gegenüberliegend auftreten. Eine Fehlpaarungsstelle kann aus einem Cluster einer Reihe von ungepaarten Nucleotiden bestehen, einschließlich Nucleotid-Basenpaare, die durch benachbarte Fehlpaarung instabil gemacht werden. Eine Fehlpaarung kann auch das Ergebnis einer oder mehrerer Basen sein, die auf einem Strang auftreten, die kein numerisches Gegenüber auf dem entgegengesetzten Strang aufweisen. Zum Beispiel können an der Stelle der Fehlpaarung 1 ungepaarte Base auf einem Strang und keine ungepaarte Basen auf dem anderen Strang vorliegen. Dies führt an einer Stelle der Sequenzlängenheterogenität, an welcher ein einzelnes ungepaartes Nucleotid in einem Strang an jener Stelle enthalten ist. Abhängig vom Strang, der anfänglich an dieser Fehlpaarungsstelle genickt wird, resultiert das Verfahren der Erfindung entweder in der Insertion einer einzelnen Base, in Bezug auf den kürzeren Strang, oder in der Deletion einer einzelnen Base in Bezug zum Strang, der ursprünglich das zusätzliche ungepaarte Nucleotid aufwies. Dieses Prinzip des Transfers von Sequenzlängeninformation von einem Strang auf den anderen kann auf eine Stelle der Fehlpaarung angewendet werden, wo die Anzahl der fehlgepaarten Basen auf den zwei Strängen einander nicht gleichkommt.
  • Für gewöhnlich sind viele Kopien des Heteroduplexpolynucleotids in der Reaktion vorhanden. In dieser Situation kann Sequenzinformation an einer Fehlpaarungsstelle auf dem oberen Strang auf einer Kopie des Polynucleotids und aus dem unteren Strang in einer anderen Kopie als Matrize dargestellt werden. Angenommen, eine ausreichende Anzahl an Kopien ist verfügbar, wenn eine einzelne Fehlpaarung gegenwärtig ist, dann sind zwei entstehende Varianten möglich. Wenn zwei Fehlpaarungsstellen gegenwärtig sind, dann können 2 mal 2 Varianten resultieren, wenn n Fehlpaarungsstellen gegenwärtig sind, dann sind zumindest 2 zur n-ten Potenz oder 2n genetische Neuordnungen durch Fehlpaarungsauflösung möglich. Das mögliche Ergebnis sind zumindest 2n Variantenpolynucleotide. Die Erfinder sagen zumindest, da der exakte Mechanismus nicht völlig klar ist. Es kann spekuliert werden, dass für eine Fehlpaarungsstelle, die zwei oder mehrere Basen lang ist, ein besonderes Ereignis für 1, 2 oder mehrere der fehlgepaarten Basen eine Matrize darstellen kann. Wenn das der Fall ist, dann kann das Ergebnis ein Anstieg der möglichen Anzahl von Varianten sein.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „GENEWARE" oder „GENEWARE®" einen Virusvektor, der zumindest teilweise von einem Tobamovirus abstammt und mo difiziert wird, um einen zusätzlichen (üblicherweise heterologen) subgenomischen Promotor zu enthalten. Ein Tobamovirus, das in der Natur anzutreffen ist, enthält typischerweise subgenomische Promotoren für das Bewegungsprotein und das Hüllprotein. GENEWARE® ist eine eingetragene Marke der Large Scale Biology Corporation.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Granularität" die Menge der Nucleinsäuresequenzinformation von einer bestimmten Elternpolynucleotidsequenz, die als zusammenhängende Sequenz in einem bestimmten Nachkommenpolynucleotid auftritt.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Matrizensequenz" eine erste einzelsträngige Polynucleotidsequenz, die teilweise zu einer zweiten Polynucleotidsequenz komplementär ist, sodass Behandlung durch GRAMMR zu einem Transfer der genetischen Information vom Matrizenstrang zum zweiten Strang führt.
  • Je größer die Einheiten der Sequenzinformation, die von einem Matrizenstrang transferiert werden, desto höher die Granularität. Je kleiner die Blöcke der Sequenzinformation, die vom Matrizenstrang transferiert werden, desto geringer oder feiner die Granularität. Geringere Granularität zeigt, dass ein DNA-Neukombinations- oder -Neuordnungsverfahren in der Lage ist, kleinere diskrete Blöcke genetischer Information vom Matrizenstrang zum zweiten Strang zu transferieren. Der Vorteil eines DNA-Neukombinations- oder -Neuordnungsverfahrens mit geringerer Granularität ist es, dass es in der Lage ist, kleinere Nucleinsäuresequenzen von anderen aufzulösen und die Sequenzinformation zu transferieren. DNA-Neukombinations- oder -Neuordnungsverfahren, die primär hohe Granularität zurückbringen, sind nicht einfach in der Lage, kleine Nucleinsäuresequenzen von anderen aufzulösen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Heteroduplexpolynucleotid" ein doppelsträngiges Polynucleotid, das durch Annealing von Einzelsträngen gebildet wird, typischerweise separater Stränge, wo die Stränge nicht-identisch sind. Ein Heteroduplexpolynucleotid kann ungepaarte Regionen aufweisen, die als Einzelstrangschleifen oder -blasen bestehen. Eine Heteroduplexpolynucleotidregion kann auch durch ein einzelsträngiges Polynucleotid gebildet werden, worin eine teilweise Selbst-Komplementarität die Bildung einer Stamm-Schleifenstruktur ermöglicht, wo der Annealingabschnitt des Strangs nicht-identisch ist.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Heteroduplex-DNA" eine doppelsträngige DNA, die durch Annealing von Einzelsträngen gebildet wird, typischerweise separater Stränge, wobei die Stränge nicht-identisch sind. Eine Heteroduplex-DNA kann ungepaarte Regionen aufweisen, die als Einzelstrangschleifen oder -blasen bestehen. Eine Heteroduplex-DNA-Region kann auch durch ein einzelsträngiges Polynucleotid gebildet werden, worin eine teilweise Selbst-Komplementarität die Bildung einer Stamm-Schleifenstruktur ermöglicht, wobei der Annealingabschnitt des Strangs nicht-identisch ist.
  • Wie hierin verwendet beschreibt der Begriff „homolog", dass eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz an eine zumindest teilweise komplementäre einzelsträngige Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann. Der Grad der Hybridisierung kann von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich des Ausmaßes der Identität zwischen den Sequenzen und der Hybridisierungsbedingungen, wie z.B. Temperatur und Salzkonzentrationen, wie nachstehend beschrieben.
  • Nucleinsäuren sind „homolog", wenn sie natürlich oder künstlich von einer gemeinsamen Vorgängersequenz abstammen. Im Verlauf der natürlichen Evolution tritt dies auf, wenn zwei oder mehrere von einer Elternsequenz abstammende Sequenzen sich im Verlauf der Zeit unterscheiden, d.h. aufgrund von Mutation und natürlicher Selektion. Unter künstlichen Bedingungen tritt Divergenz auf, z.B. auf eine von zwei Grundarten. Erstens kann eine bestimmte Sequenz künstlich mit einer anderen Sequenz rekombiniert werden, wie das z.B. bei typischem Klonieren auftritt, um eine abstammende Nucleinsäure zu produzieren, oder eine bestimmte Sequenz kann chemisch modifiziert oder auf andere Weise manipuliert werden, um das resultierende Molekül zu modifizieren. Alternativ dazu kann eine Nucleinsäure de novo synthetisiert werden, indem eine Nucleinsäure synthetisiert wird, die sich in der Sequenz von einer ausgewählten Elternnucleinsäuresequenz unterscheidet. Wenn es kein ex plizites Wissen über die Vorfahren zweier Nucleinsäuren gibt, wird Homologie typischerweise durch Sequenzvergleich zwischen zwei Sequenzen abgeleitet. Wo zwei Nucleinsäuresequenzen Sequenzähnlichkeit über einen bestimmten Abschnitt jeder der Nucleinsäuren zeigen, wird davon ausgegangen, dass zwei Nucleinsäuren einen gemeinsamen Vorfahren haben. Das genaue Ausmaß der Sequenzähnlichkeit, das Homologie herstellt, variiert im Fachgebiet abhängig von einer Vielzahl von Faktoren.
  • Für Zwecke dieser Offenbarung werden zwei Nucleinsäuren als homolog angesehen, wenn sie ausreichend Sequenzidentität teilen, um GRAAMR-vermittelten Informationstransfer zu ermöglichen, der zwischen den Nucleinsäuremolekülen auftritt.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „identisch" oder „Identität", dass zwei Nucleinsäuresequenzen dieselbe Sequenz oder eine komplementäre Sequenz aufweisen. Daher bedeutet „Identitätsbereiche", dass Regionen oder Bereiche eines Polynucleotids oder das gesamte Polynucleotid zu Bereichen eines anderen Polynucleotids identisch sind oder dazu komplementär sind.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „Anstieg der prozentuellen Komplementarität", dass der Prozentsatz der komplementären Basenpaare in einem Heteroduplexmolekül größer gemacht wird.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Ligase" ein Enzym, das eine Phosphodiesterbindung zwischen angrenzenden Nucleotiden in einer Nucleinsäure schafft.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Fehlpaarung" auf ein Basenpaar, das nicht in der Lage ist, normale Basenpaar-Wechselwirkungen zu bilden (d.h. andere als „A" mit „T" (oder „U") oder „G" mit „C").
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Fehlpaarungsauflösung" die Überführung eines fehlgepaarten Basenpaars in ein komplementäres Basenpaar.
  • Wie hierin verwendet steht der Begriff „Mutationen" für Veränderungen der Sequenz einer Wildtyp- oder Referenznucleinsäuresequenz oder Veränderungen in der Sequenz eines Polypeptids. Solche Mutationen können Punktmutationen sein, wie z.B. Transitionen oder Transversionen. Die Mutationen können Deletionen, Insertionen oder Duplikationen sein.
  • Wie hierin verwendet steht der Begriff „Nucleinsäure" oder „Nucleinsäuremolekül" für ein Polynucleotid, wie Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA), und umfasst einzelsträngige und doppelsträngige Nucleinsäuren sowie ein Oligonucleotid. Nucleinsäuren, die in der Erfindung nützlich sind, umfassen genomische DNA, cDNA, mRNA, Plasmide, Cosmide, PCR-Produkte und synthetische Oligonucleotide und können den Sense-Strang, den Anti-Sense-Strang oder beides repräsentieren. Eine Nucleinsäure umfasst im Allgemeinen die vier natürlich auftretenden Nucleotide Adenin, Guanin, Cytosin und Thymidin/Uridin. Eine Nucleinsäure der Erfindung kann auch andere natürlich auftretende oder nicht natürlich auftretende Nucleotide inkorporieren, einschließlich Derivate davon, solange die Nucleotidderivate durch eine Polymerase bei einer Wirksamkeit, die ausreichend ist, um ein gewünschtes Polynucleotidprodukt zu erzeugen, in ein Polynucleotid inkorporiert werden können.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „eine Elternnucleinsäure" eine doppelsträngige Nucleinsäure mit einer Sequenz, die zu 100 % identisch mit einer ursprünglichen einzelsträngigen Nucleinsäure in einer Ausgangspopulation von teilweise komplementären Nucleinsäuren ist. Elternnucleinsäuren umfassen zum Beispiel in der Abbildung von 2 Nucleinsäuren X und Y, wenn eine teilweise komplementäre Nucleinsäurekombination 1+14- oder 2-/3+ als Ausgangspopulation in einem Erfindungsverfahren verwendet wurde.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „teilweise komplementär" eine Nucleinsäure mit einer im Wesentlichen komplementären Sequenz zu einer anderen Nucleinsäure, die sich aber von der anderen Nucleinsäure durch zumindest zwei oder mehrere Nucleotide unterscheidet.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation" eine Population von Nucleinsäuren, die einzelne Gruppen von Nucleinsäuren umfasste, die im Wesentlichen komplementäre Sequenzen aufweisen, aber keine Nucleinsäuren, die zu einer besonderen Gruppe gehören, die eine exakte komplementäre Sequenz für eine andere Gruppe von Sequenzen in der Population aufweisen.
  • Wie hierin verwendet unterscheidet sich ein beliebiges Element einer teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation von einer anderen Nucleinsäure der Population oder dem Komplement dazu durch zwei oder mehrere Nucleotide. Als solches schließt eine teilweise komplementäre Nucleinsäure speziell eine Population aus, die Sequenzen enthält, die genau komplementär sind, d.h. eine komplementäre Sequenz, die 100 % Komplementarität aufweist. Deshalb unterscheidet sich jedes Element einer solchen teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation von anderen Elementen der Population durch zwei oder mehrere Nucleotide, einschließlich beider Stränge. Ein Strang wird oberer Strang und sein Komplement unterer Strang genannt.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „oberer Strang" ein Polynucleotid, das in der 5'-zu-3'-Richtung gelesen wird, und der „untere Strang" ist sein Komplement. Es versteht sich, dass, während eine Sequenz als unterer oder oberer Strang bezeichnet wird, eine solche Bezeichnung komplementäre Stränge unterscheiden soll, da es in Lösung keine Orientierung gibt, die einen Strang als oberen oder unteren Strang fixiert.
  • Zum Beispiel kann eine Population, die zwei Nucleinsäureelemente enthielt, von zwei doppelsträngigen Nucleinsäuren abgeleitet werden, mit einem Potenzial, einen beliebigen der vier Stränge dazu zu verwenden, eine einzelsträngige teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation zu erzeugen. Ein Beispiel für potenzielle Kombinationen von Strängen zweier Nucleinsäuren, die verwendet werden können, um eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation der Erfindung zu erhalten, ist in 2 dargestellt. Die zwei Nucleinsäuresequenzen, die potenzielle Elemente einer teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation sind, werden „X" (AGATCAATTG) und „Y" (AGACCGATTG) (2A) genannt. Die Nucleinsäuresequenzen unterscheiden sich an zwei Positionen (Positionen 4 und 6, durch „*" angezeigt). Der „obere Strang" der Nucleinsäuren X und Y wird als „1+" bzw. „3+" bezeichnet, und der „untere Strang" der Nucleinsäuren X und Y wird „2-" bzw. „4-" genannt.
  • 2B zeigt die möglichen Kombinationen der vier Nucleinsäurestränge. Von den sechs möglichen Strangkombinationen umfasst nur die Kombination von 1+/2-, 1+/4-, 2-/3+ oder 3+/4- den erforderlichen oberen und unteren Strang einer teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation. Von diesen Ober-/Untersequenzkombinationen umfassen nur 1+/4- oder 2-/3+ ein Beispiel für eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation von zwei verschiedenen Molekülen, weil nur diese Kombinationen komplementäre Sequenzen aufweisen, die sich durch zumindest ein Nucleotid unterscheiden. Die übrigen Kombinationen 1+/2- und 2+/4- enthalten exakt komplementäre Sequenzen und umfassen deshalb keine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation der Erfindung.
  • Im obigen Beispiel einer Population von zwei verschiedenen Molekülen schloss eine teilweise komplementäre Population von Nucleinsäuremolekülen Kombinationen von Strängen aus, die sich durch eine oder mehrere Nucleotide unterschieden, aber die vom selben Sense sind, z.B. 1+/3+ oder 2-14-. Jedoch ist es verständlich, dass eine solche Kombination von gleichsträngigen Nucleinsäuren in eine größere Population aufgenommen werden kann, solange die Population zumindest einen Unterstrang und zumindest einen Oberstrang umfasst. Wenn z.B. eine dritte Nucleinsäure „Z" mit Strängen 5+ und 6- enthalten ist, umfassen die Kombinationen 1+/3+/6- oder 2-/4-/5+ eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation. Ähnlich kann eine Anzahl von Nucleinsäuren und ihre entsprechenden Ober- und Unterstränge kombiniert werden, um eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation der Erfindung zu erzeugen, solange die Population zumindest einen Oberstrang und zumindest einen Unterstrang enthält und solange die Population keine Elemente enthält, die das exakte Komplement sind.
  • Die Populationen von Nucleinsäuren der Erfindung können etwa 3 oder mehr, etwa 4 oder mehr, etwa 5 oder mehr, etwa 6 oder mehr, etwa 7 oder mehr, etwa 8 oder mehr, etwa 9 oder mehr, etwa 10 oder mehr, etwa 12 oder mehr, etwa 15 oder mehr, etwa 20 oder mehr, etwa 25 oder mehr, etwa 30 oder mehr, etwa 40 oder mehr, etwa 50 oder mehr, etwa 75 oder mehr, etwa 100 oder mehr, etwa 150 oder mehr, etwa 200 oder mehr, etwa 250 oder mehr, etwa 300 oder mehr, etwa 350 oder mehr, etwa 400 oder mehr, etwa 450 oder mehr, etwa 500 oder mehr oder sogar etwa 1000 oder mehr verschiedene Nucleinsäuremoleküle sein. Eine Population kann auch etwa 2000 oder mehr, etwa 5000 oder mehr, etwa 1 × 104 oder mehr, etwa 1 × 105 oder mehr, etwa 1 × 106 oder mehr, etwa 1 × 107 oder mehr oder sogar etwa 1 × 108 oder mehr verschiedene Nucleinsäuren enthalten. Ein Fachmann kann eine gewünschte Population einfach bestimmen, um in Erfindungsverfahren abhängig vom Wesen des gewünschten Neuordnungsversuchsergebnisses und der verfügbaren Screeningverfahren, wie hierin offenbart, enthalten zu sein.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Polymerase" ein Enzym, das die Bildung von Polymeren von Nucleotiden katalysiert, d.h. Polynucleotide in einer matrizengerichteten Form. Eine Polymerase, die in der Erfindung nützlich ist, kann von einem beliebigen Organismus oder Quelle abstammen, einschließlich Tier-, Pflanze-, Bakterien- und Viruspolymerasen. Eine Polymerase kann eine DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder eine reverse Transkriptase sein, die in der Lage sind, RNA in DNA zu transkribieren.
  • Wie hierin verwendet beschreibt der Begriff „Proof-Reading" die Eigenschaft eines Enzyms, wo ein Nucleotid, wie z.B. ein fehlgepaartes Nucleotid, in einer 3'-zu-5'-Richtung entfernt werden kann und typischerweise durch ein basengepaartes Nucleotid ersetzt werden kann. Im Fall des Ansteuerns einer Schleife, die durch Insertion oder Deletion verursacht ist, kann Proof-Reading nur die Entfernung von fehlgepaartem/n Nucleotid(en) oder nur die Hinzufügung von basengepaartem/n Nucleotid(en) umfassen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinantes" Polynucleotid ein Polynucleotid, das Sequenzinformation von zumindest zwei verschiedenen Polynucleotiden umfasst.
  • Wie hierin verwendet beschreibt der Begriff „verwandte Polynucleotide", dass Regionen oder Bereiche der Polynucleotide identisch sind und Regionen oder Bereiche der Polynucleotide nicht-identisch sind.
  • Wie hierin verwendet wird der Begriff DNA-„Neuordnung” hierin verwendet, um eine Neuverteilung von Sequenzvariationen zwischen nicht-identischen Sequenzen anzugeben.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Replikon" eine genetische Einheit von Replikation, die eine Länge von Polynucleotid und seine Stelle zu Initiation von Replikation umfasst.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Sequenzvielfalt" die Häufigkeit von nicht-identischen Polynucleotiden. Der Begriff „zunehmende Sequenzvielfalt in einer Population" bedeutet, die relative Häufigkeit von nicht-identischen Polynucleotiden in einer Population zu erhöhen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Sequenzvariante" ein Molekül (DNA-, RNA-Polypeptid und dergleichen) mit einem oder mehreren Sequenzunterschieden im Vergleich zu einem Referenzmolekül. Zum Beispiel führt die Summe der getrennten unabhängigen Fehlpaarungsauflösungsereignisse, die im gesamten Heteroduplexmolekül im GRAMMR-Verfahren auftreten, zu einer Neuordnung von Sequenzinformation im gesamten Molekül. Die Sequenzinformation ordnet sich in einer Reihe von Kombinationen neu an, um eine komplexe Bibliothek von „Sequenzvarianten" zu erzeugen.
  • Wie hierin verwendet steht der Begriff „fehlpaarungsgerichtete Strangspaltung" für eine Strangspaltungsaktivität durch ein Mittel, das eine Stelle eines fehlgepaarten Basenpaars, Gruppe von fehlgepaarten Basenpaaren oder Extrahelixbasen oder Basen auf einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz erkennt und einen Strang an der Stelle der Fehlpaarung spaltet.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „ausreichend Zeit" den Zeitraum, der notwendig ist, sodass eine Reaktion oder ein Verfahren ein gewünschtes Produkt ergibt. Für die vorliegende Erfindung liegt die Bestimmung der ausreichenden Zeit innerhalb des Wissens jener Fachleute. Es versteht sich, dass „ausreichend Zeit" stark variieren kann, abhängig von den Wünschen der Fachleute, ohne Einfluss auf die Funktionalität der Reaktion oder die Qualität des gewünschten Produkts zu nehmen.
  • Wie hierin verwendet steht der Begriff „Wildtyp" dafür, dass ein Nucleinsäurefragment keine beliebigen Mutationen enthält. Ein „Wildtyp"-Protein steht dafür, dass das Protein in einem Ausmaß von Aktivität aktiv sein wird, das in der Natur gefunden wird, und typischerweise die Aminosäuresequenz ist, die in der Natur zu finden ist. In einem Aspekt kann der Begriff „Wildtyp" oder „Elternsequenz" eine Start- oder Referenzsequenz vor einer Manipulation der Erfindung angeben.
  • In der Polypeptidbezeichnung, die hierin verwendet wird, ist die linke Richtung die aminoterminale Richtung und die rechte Richtung die carboxyterminale Richtung gemäß Standardverwendung und Konvention. Ähnlich, wenn nicht anders angegeben, ist das linke Ende der einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen das 5'-Ende, die linke Richtung der doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen wird als 5'-Richtung angegeben. Die Richtung der 5'-zu-3'-Addition von entstehenden RNA-Transkripten wird als Transkriptionsrichtung bezeichnet.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Nucleinsäuremoleküle, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4 umfasst, sind als Vektoren oder Plasmide für die Expression von CEL-I-Endonuclease nützlich. Die Nucleinsäuremoleküle von Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 sind offene CEL-I-Lesegerüste, die in Seq-ID Nr. 1 bzw. Seq.-ID Nr. 2 enthalten sind. Die Herstellung und Verwendung der Nucleinsäuremoleküle von Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 werden in Beispiel 2 hierin weiter unterrichtet. Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle bereit, welche die Nucleinsäuresequenzen von 3 (Seq.-ID Nr. 16) umfassen, die als Vektoren oder Plasmide für die Expression von RES-I-Endonuclease nützlich sind. Fehlpaarungsendonucleasen von Pflanzen haben die Fähigkeit, Fehlpaarung zwischen hybridisierten Nucleinsäuresträngen zu detektieren, Schleifen und Insertionen zwischen solchen hybridisierten Strängen zu detektieren, Polymorphismen zwischen solchen hybridisierten Strängen zu detektieren, Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen zu detektieren und solche Mutationen in einer Targetpolynucleotidsequenz ohne wesentliche Nebenwirkungen von flankierenden DNA-Sequenzen zu detektieren (T. Anthony Yeung und Patrick J. Hagan, Internationale Patentanmeldung Nr. WO 97/46701 ). Diese Endonucleasen sind in einer Vielzahl von Pflanzen und wahrscheinlich im gesamten Pflanzenreich zu finden. Sie sind in den Alfalfa-Spösslingen, Spargel, Mungobohnensprösslingen, Stangensellerie, Cha ha, Eisbergsalat, Petersilie, Sellerie, Broccoli-Rosen, Kohl, Karfiol-Rosen (Blumenkohl-Rosen) und Paradeisern (Tomaten) zu finden [C.A. Oleykowski et al., Nucleic Acids Research, Band 26, Nr. 20, 4597-4602 (1998)].
  • Endonucleasen von Pflanzen können nun in einem Verfahren zur Entwicklung von Reihen von Nucleotidsequenzvarianten aus hybridisierten Sequenzen verwendet werden. Im Verfahren detektiert die Fehlpaarungsendonuclease fehlgepaarte Basen und nickt zumindest einen der hybridisierten Stränge. Ein Polymeraseenzym ersetzt dann eine oder mehrere fehlgepaarte Basen durch eine oder mehrere Basen, welche die Basen auf dem entgegengesetzten Strang komplementieren. Der Nick wird dann durch ein Ligaseenzym versiegelt. Wenn zwei oder mehrere Fehlpaarungsstellen auf dem Hybrid gegenwärtig sind, resultiert eine Population von Variantensequenzen, abhängig von der Zahl und Position der Fehlpaarungen, bei welchen Ersetzen durchgeführt wird, und dem Strang, auf welchem ein Ersetzen der Base durchgeführt wurde. In der Entwicklung von Sequenzvarianten ist es nicht notwendigerweise wünschenswert, für alle Fehlpaarungen auf allen Kopien der Sequenz aufgelöst zu werden. Aus einer Reihe von Sequenzvarianten können eine oder mehrere Varianten, die bevorzugte Aktivität aufweisen, ausgewählt werden. RES I und CEL I geben ein Beispiel für Fehlpaarungsendonucleasen, die in diesem Verfahren nützlich sind. Andere von Pflanzen abstammende Fehlpaarungsendonucleasen sind auch in einer GRAMMR-Reaktion nützlich.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Expression von RES-I-Endonuclease unter Verwendung von rekombinanter Pflanzenvirusnucleinsäure bereit, die eine Nucleinsäuresequenz aus 3 (Seq.-ID Nr. 16) umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereit, die zumindest einen subgenomischen Promotor umfasst, der in der Lage ist, RES-I-Endonuclease in einer Pflanzenzelle zu transkribieren oder zu exprimieren, worin die Pflanzenzelle eine Wirtszelle oder Produktionszelle ist.
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine Pflanzenvirusnucleinsäure bereitgestellt, in welcher die native Hüllprotein-Kodiersequenz aus einer Virusnucleinsäure deletiert wurde, eine nicht-native Pflanzenvirus-Hüllprotein-Kodiersequenz und ein nicht-nativer Promotor, vorzugsweise der subgenomische Promotor der für nicht-natives Hüllprotein kodierenden Sequenz, der zur Expression im Pflanzenwirt, Verpackung der rekombinanten Pflanzenvirusnucleinsäure und Sicherstellung einer systemischen Infektion des Wirts durch die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure in der Lage ist, insertiert wurden. Alternativ dazu kann das Hüllproteingen durch Insertion der nicht-nativen Nucleinsäuresequenz innerhalb inaktiviert werden, sodass ein Fusionsprotein produziert wird. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure kann eine oder mehrere zusätzliche nicht-native subgenomische Promotoren umfassen. Jeder nicht-native subgenomische Promotor ist in der Lage, angrenzende Gene oder Nucleinsäuresequenzen im Pflanzenwirt zu transkribieren oder exprimieren, und ist nicht in der Lage, sich miteinander und mit nativen subgenomischen Promotoren zu rekombinieren. Nicht-native (fremde) Nucleinsäuresequenzen können angrenzend an den nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor oder die nativen und einen nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor insertiert werden, wenn mehr als eine Nucleinsäuresequenz enthalten ist. Die nicht-nativen Nucleinsäuresequenzen werden transkribiert oder im Pflanzenwirt unter Kontrolle des subgenomischen Promotors exprimiert, um die gewünschten Produkte zu produzieren.
  • In einer anderen Ausführungsform ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure wie in der ersten Ausführungsform bereitgestellt, mit der Ausnahme, dass die native Hüllprotein-Kodiersequenz angrenzend an einen der nicht-nativen subgenomischen Hüllproteinpromotoren platziert ist anstelle einer nicht-nativen Hüllprotein-Kodiersequenz.
  • In wieder einer anderen Ausführungsform ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereitgestellt, in welcher das native Hüllproteingen an seinen subgenomischen Promotor angrenzt und ein oder mehrere nicht-native subgenomische Promotoren in die Virusnucleinsäure insertiert worden sind. Die insertierten nicht-nativen subgenomischen Promotoren sind in der Lage, angrenzende Gene in einem Pflanzenwirt zu transkribieren oder zu exprimieren, und sind nicht in der Lage, sich miteinander und mit nativen subgenomischen Promotoren zu rekombinieren. Nicht-native Nucleinsäuresequenzen können angrenzend an die nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotoren insertiert werden, sodass die Sequenzen in der Wirtspflanze unter Kontrolle der subgenomischen Promotoren transkribiert oder exprimiert werden, um das gewünschte Produkt zu produzieren.
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure wie in der dritten Ausführungsform bereitgestellt, mit der Ausnahme, dass die native Hüllprotein-Kodiersequenz durch eine nicht-native Hüllprotein-Kodiersequenz ersetzt ist.
  • Die Virusvektoren sind durch Hüllproteine enkapsidiert, für welche die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure kodiert, um ein rekombinantes Pflanzenvirus herzustellen. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure oder das rekombinante Pflanzenvirus wird zur Infektion von geeigneten Wirtspflanzen verwendet. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure ist zur Replikation im Wirt, zur systemischen Verteilung in dem Wirt, zur Transkription oder Expression des/der fremden Gens/e im Wirt, um das gewünschte Produkt herzustellen, in der Lage.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäuren und rekombinante Viren ausgerichtet, die zur Aufrechterhaltung und Transkription oder Expression von nicht-nativen (fremden) Nucleinsäuresequenzen stabil sind und die in der Lage sind, solche fremden Sequenzen in der Wirtspflanze systemisch zu transkribieren oder exprimieren. Genauer umfassen rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung einen nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor, zumindest einen nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor, eine Pflanzenvirushüllprotein-Kodiersequenz und gegebenenfalls zumindest eine nicht-native Nucleinsäuresequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Infektion eines Pflanzenwirts durch ein rekombinantes Pflanzenvirus, das eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure enthält, oder durch die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereit, die eine oder mehrere nicht-native Nucleinsäuresequenzen enthält, die im infizierten Gewebe des Pflanzenwirts transkribiert oder exprimiert werden. Das Produkt der kodierenden Sequenzen kann aus der Pflanze gewonnen werden oder ein phänotypisches Merkmal in der Pflanze verursachen.
  • Der erste Schritt bei der Erreichung beliebiger Eigenschaften der Erfindung ist es, die Nucleotidsequenzen der Pflanzenvirusnucleotidsequenz durch bekannte herkömmliche Verfahren zu modifizieren, sodass eine oder mehrere nicht-native subgenomische Promotoren in die Pflanzenvirusnucleinsäure insertiert werden, ohne die biologische Funktion der Pflanzenvirusnucleinsäure zu zerstören. Die subgenomischen Promotoren sind in der Lage, angrenzende Nucleinsäuresequenzen in einem Pflanzenwirt zu transkribieren oder exprimieren, der durch rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure oder rekombinantes Pflanzenvirus infiziert ist. Die native Hüllprotein-Kodiersequenz kann in zwei Ausführungsformen deletiert sein, unter die Kontrolle eines nicht-nativen subgenomischen Promotors in einer zweiten Ausführungsform gestellt sein oder beibehalten in einer weiteren Ausführungsform sein. Wenn sie dele tiert oder aber inaktiviert ist, wird ein nicht-natives Hüllproteingen unter Kontrolle eines der nicht-nativen subgenomischen Promotoren oder optional unter der Kontrolle des nativen subgenomischen Hüllproteingenpromotors insertiert. Das nicht-native Hüllprotein ist in der Lage, die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure zu enkapsidieren, um ein rekombinantes Pflanzenvirus zu produzieren. Daher enthält die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure eine für Hüllprotein kodierende Sequenz, die eine native oder eine nicht-native Hüllprotein-Kodiersequenz sein kann, unter Kontrolle eines der nativen oder nicht-nativen subgenomischen Promotoren. Das Hüllprotein ist in die systemische Infektion des Pflanzenwirts involviert.
  • Einige der Viren, die diese Anforderung erfüllen und daher geeignete Viren sind, umfassen Viren aus der Tabakmosaikvirusgruppe, wie z.B. Tabakmosaikvirus (TMV); Augenbohnenmosaikvirus (CMV), Alfalfa-Mosaikvirus (AMV), Gurkengrünscheckungsmosaikvirus-Wassermelonenstamm (CGMMV-W) und Hafermosaikvirus (OMV), und Viren aus der Trespenmosaikvirusgruppe, wie z.B. Trespenmosaikvirus (BMV), Ackerbohnenscheckungsvirus und chlorotisches Augenbohnenscheckungsvirus. Weitere geeignete Viren umfassen Reis-Nekrose-Virus (RMV) und Geminiviren, wie z.B. Tomaten-Gold-Mosaikvirus (TGMV), Maniokmosaikvirus (CLV) und Maisstrichelvirus (MVS).
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure, die weiters eine oder mehrere nicht-native Nucleinsäuresequenzen umfasst, die in der Lage sind, im Pflanzenwirt transkribiert zu werden. Die nicht-native Nucleinsäuresequenz wird angrenzend an einen oder die nicht-nativen subgenomischen Viruspromotoren und/oder den nativen Hüllproteingenpromotor platziert, abhängig von der besonderen verwendeten Ausführungsform. Die nicht-native Nucleinsäure wird durch herkömmliche Verfahren insertiert, oder die nicht-native Nucleinsäuresequenz kann in oder angrenzend an die native Hüllprotein-Kodiersequenz insertiert werden, sodass ein Fusionsprotein produziert wird. Die nicht-native Nucleinsäuresequenz, die transkribiert wird, kann als RNA transkribiert werden, die in der Lage ist, die Expression eines phänotypischen Merkmals durch einen Anti-Sense-Mechanismus zu regulieren. Alternativ dazu kann die nicht-native Nucleinsäuresequenz in rekombinanter Pflanzenvirusnucleinsäure im Pflanzenwirt transkribiert und translatiert werden, um ein phänotypisches Merkmal herzustellen. Die nicht-native Nucleinsäuresequenz(en) kann/können auch für die Expression von mehr als einer phänotypischen Eigenschaft kodieren. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure, welche die nicht-native Nucleinsäuresequenz enthält, wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt, sodass sich nicht-native Nucleinsäuresequenz(en) in richtiger Ausrichtung zu einem subgenomischen Viruspromotor befinden, welcher auch immer verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Pflanzenzelle bereit, die einen Vektor oder ein Plasmid umfasst, der/das eine Nucleinsäuresequenz aus 3 (Seq.-ID Nr. 16) umfasst, worin die Pflanzenzelle eine Wirtszelle oder Produktionszelle ist.
  • Verfahren zur Herstellung von CEL-I- und RES-I-Enzym sind nicht auf Pflanzenvirusvektoren beschränkt. Diese Gene oder deren Varianten können in einen beliebigen Wirtsorganismus durch eine Reihe verschiedener fachbekannter Verfahren eingeführt werden.
  • Verfahren zur Transformation verschiedener Wirtszellen sind in Klein et al., „Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment", Bio/Technol., New York, N. Y., Nature Publishing Company, 10 (3), 286-291 (März 1992), offenbart. Verfahren zur Transformation einer großen Vielzahl von höheren Pflanzenspezies sind bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22, 421-477 (1988).
  • Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt unter Verwendung von Verfahren wie Elektroporation, PEG-vermittelter Transfektion, Teilchenbombardierung, Siliziumfaserverabreichung oder Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten oder Embryoide bildendem Kallus in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden. Siehe z.B. Tomes et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, 197-213, in: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Hrsg. O. L. Gamborg und G. C: Phillips, Springer-Verlag, Berlin, Heidel berg, New York (1995). Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglykolausfällung ist in Paszkowski et al., Embo J. 3, 2717-2722 (1984), beschrieben. Elektroporationsverfahren sind in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5824 (1985), beschrieben. Ballistische Transformationsverfahren sind in Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987), beschrieben.
  • Alternativ dazu können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden und in einen herkömmlichen Agrobacterium-tumefaciens-Wirtsvektor eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium-tumefaciens-Wirts steuern die Insertion des Konstrukts und angrenzender Marker in die Planzenzell-DNA, wenn die Zelle mit den Bakterien infiziert ist. Agrobacterium-tumefaciens-vermittelte Transformationsverfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al., Science 233, 496-498 (1984), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 4803 (1983). Zum Beispiel ist Agrobacteriumtransformation von Mais in US-Patent Nr. 5.981.840 beschrieben. Agrobacteriumtransformation von Einkeimblättlern ist in US-Patent Nr. 5.591.616 beschrieben. Agrobacteriumtransformation von Sojabohnen ist in US-Patent Nr. 5.563.055 beschrieben.
  • Andere Transformationsverfahren umfassen (1) agrobacterium-rhizogenes-vermittelte Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und Fuller, in: Genetic Engineering, Band 6, PWJ Rigby, Hrsg., London, Academic Press (1987), und C. P. Lichtenstein und J. Draper, in: DNA Cloning, Band II, D. M. Glover, Hrsg., Oxford IRI Press (1985)), WO 88/02405 , veröffentlicht am 7. April 1988, beschreibt die Verwendung von A.-rhizogenes-Stamm A4 und seinem Ri-Plasmid gemeinsam mit A.-tumefaciens-Vektoren pARC8 oder pARC16, (2) liposomenvermittelte DNA-Aufnahme (siehe z.B. Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25, 1353 (1984)), (3) die Verwirbelungsverfahren (siehe z.B. Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1228 (1990)).
  • DNA kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen eingeführt werden, wie z.B. von Zhou et al., Methods in Enzymology 101, 433 (1983), D. Hess, intern. Rev. Cytol. 107, 367 (1987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter 6, 165 (1988), beschrieben.
  • Expression von Nucleinsäuren, die für Polypeptid kodieren, kann durch Injektion der DNA in reproduktive Organe einer Pflanze wie von Pena et al., Nature 325, 274 (1987), beschrieben erhalten werden. DNA kann auch direkt in Zellen unreifer Embryos injiziert werden, und die Rehydratisierung von ausgetrockneten Embryos kann wie von Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987), und Benbrook et al., in Proceedings Bio. Expo. (1986), Butterworth, Stoneham, Mass. 27-54 (1986), beschrieben durchgeführt werden.
  • Transformierte Pflanzenzellen, die von beliebigen der oben angeführten Transformationsverfahren abstammen, können kultiviert werden, um eine gesamte Pflanze zu regenerieren, die den transformierten Genotyp besitzt. Solche Regenerationsverfahren basieren auf der Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebskulturwachstumsmedium, typischerweise auf einem Biozid und/oder Herbicidmarker, der gemeinsam mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung eingeführt worden ist. Zur Transformation und Regeneration von Mais siehe Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2, 603-618 (1990).
  • CEL I und RES I und deren Varianten können auch durch andere Wirts- oder Wirt/Vektor-Systeme hergestellt werden. Eine Polynucleotidsequenz kann in ein rekombinantes Plasmid, Virus oder ein anderes fachbekanntes Vehikel eingeführt werden, das durch Insertion oder Inkorporation der genetischen Sequenzen manipuliert worden ist. Solche Expressionsvektoren enthalten einen Promotor, eine Sequenz, die eine wirksame Transkription von insertierter Gensequenz des Wirts erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor. Vektoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem den T7-basierten Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)), den pMSXND-Expressionsvektor zur Expression in Säugetierzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263, 3521 (1988)) und von Baculovirus abstammende Vektoren zur Expression in Insektenzellen. Das DNA-Segment kann im Vektor gegenwärtig sein, der operabel mit regulierenden Elementen verbunden ist, z.B. einen Promotor (z.B. T7, Metallothionein-I oder Polyhedrinpromotoren).
  • Polynucleotidsequenzen können entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten exprimiert werden. Wirte können Mikroben-, Hefe-, Insekten und nichtmenschliche Säugetierorganismen umfassen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen, die eukaryotische oder virale Sequenzen aufweisen, in Prokaryoten sind fachbekannt.
  • Biologisch funktionelle virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zur Expression und Replikation in einem Wirt in der Lage sind, sind fachbekannt. Solche Vektoren werden zur Inkorporation von DNA-Sequenzen der Erfindung verwendet.
  • Fachbekannte Verfahren können zur Herstellung von Expressionsvektoren verwendet werden, die für CEL I oder RES I kodierende Sequenzen und geeignete Transkriptions/Translationskontrollsignale enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, synthetische Verfahren und In-vivo-Rekombination/genetische Verfahren [siehe zum Beispiel die in Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, N. Y. (1989), beschriebenen Verfahren].
  • Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen kann zur Expression einer für CEL I oder RES I kodierenden Sequenz verwendet werden. Diese umfassen unter anderem Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert wurden, die eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, Hefe, die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren transformiert wurde, die eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden, die eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, oder Tierzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert wurden (z.B. Retroviren, Adenovirus, Vakziniavirus), die eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, oder transformierte Tierzellsysteme, die für stabile Expression hergestellt wurden.
  • Abhängig vom verwendeten Wirt/Vektorsystem kann eine beliebige Zahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und in duzierbarer Promotoren, Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminatoren etc., im Expressionsvektor verwendet werden [siehe z.B. Bitter et al., Methods in Enzymology 153, 516-544 (1987)]. Zum Beispiel können induzierbare Promotoren, wie z.B. pL von Bakteriophagen lambda, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor), bei Klonierung in Bakteriensystemen verwendet werden. Bei Klonierung in Säugetierzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallothioneinpromotor) oder von Säugetierviren (z.B. der langen terminalen Retroviruswiederholung; dem späten Adenoviruspromotor, dem Vakziniavirus-7,5-K-Promotor) abstammen, verwendet werden. Promotoren, die durch DNA-Rekombinations- oder synthetische Verfahren produziert wurden, können auch zur Bereitstellung zur Transkription der insertierten RES-I- oder CEL-I-Kodiersequenz verwendet werden.
  • In Bakteriensystemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhaft abhängig von der Verwendung ausgewählt werden, die für das exprimierte Protein beabsichtigt ist. Zum Beispiel können, wenn große Mengen von RES I oder CEL produziert werden sollen, Vektoren, welche die Expression von hohen Ausmaßen von Fusionsproteinprodukten steuern, die einfach gereinigt werden, wünschenswert sein. Jene, die hergestellt werden, um eine Spaltstelle zu enthalten, um zur Gewinnung beizutragen, sind bevorzugt. Solche Vektoren umfassen unter anderem E.-coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2, 1791 (1983)), in welchem eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz in den Vektor im Leseraster mit der für LacZ kodierenden Region ligiert wird, sodass ein Hybrid-LacZ-Protein produziert wird, pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509 (1989)).
  • In Hefe kann eine Vielzahl von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten. Für einen Bericht siehe Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Hrsg. Ausubel et al., Green Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Kapitel 13 (1988); Grant et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, in: Methods in Enzymology, Hrsg. Wu & Grossman 31987, Acad. Press, N.Y., Band 153, 516-544 (1987); Glover, DNA Cloning, Band II, IRL Press, Washington, D.C., Kapitel 3 (1986), und Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in En zymology, Hrsg. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Band 152, 673-684 (1987), und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Hrsg. Strathem et al., Cold Spring Harbor Press, Band I und 11 (1982). Ein konstitutiver Hefepromotor, wie z.B. ADH oder LEU2, oder ein induzierbarer Promotor, wie z.B. GAL, kann verwendet werden (Cloning in Yeast, Kapitel 3, R. Rothstein, in: DNA Cloning, Band 11, A Practical Approach, Hrsg. D. M. Glover, IRL Press, Washington, D.C. (1986)). Alternativ dazu können Vektoren verwendet werden, die Integration von fremden DNA-Sequenzen in das Hefechromosom fördern.
  • Eukaryotische Systeme und vorzugsweise Säugetierexpressionssysteme ermöglichen das Auftreten richtiger Posttranslationsmodifikationen von exprimierten Säugetierproteinen. Eukaryotische Zellen, welche die Zellmaschinerie für richtige Verarbeitung des primären Transkripts, Glykosylierung, Phosphorylierung und vorteilhafte Sekretion des Genprodukts besitzen, können als Wirtszellen für die Expression von RES I oder CEL I verwendet werden. Säugetierzelllinien können bevorzugt sein. Solche Wirtszelllinien können unter anderem CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 und WI38 umfassen.
  • Säugetierzellsysteme, die rekombinante Viren oder Viruselemente verwenden, um Expression zu steuern, können hergestellt werden. Zum Beispiel kann, wenn Adenovirusexpressionsvektoren verwendet werden, eine für CEL I oder RES I kodierende Sequenz an einen Adenovirustranskriptions/translationskontrollkomplex ligiert werden, z.B. den späten Promotor und dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch In-vitro- oder In-vivo-Rekombination in das Adenovirusgenom insertiert werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virusgenoms (z.B. Region E1 oder E3) resultiert in einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, das Protein in infizierten Wirten zu exprimieren [siehe z.B. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659 (1984)]. Alternativ dazu kann der Vaziniavirus-7,5-K-Promotor verwendet werden [z.B. siehe Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79; 7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol. 49, 857-864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982)]. Vektoren, die auf Rinderpapillomvirus basieren, haben die Fähigkeit, sich als extrachromosomales Element zu replizieren (Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1, 486 (1981)). Kurz nach Eintreten dieser DNA in Mauszellen repliziert das Plasmid etwa 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Transkription der insertierten cDNA erfordert keine Integration des Plasmids in das Wirtschromosom, wodurch ein hohes Ausmaß an Expression ermöglicht wird. Diese Vektoren können für stabile Expression verwendet werden, indem ein selektierbarer Marker in das Plasmid aufgenommen wird, wie z.B. das Neo-Gen. Alternativ dazu kann das Retrovirusgenom zur Verwendung als Vektor modifiziert werden, der in der Lage ist, die Expression eines CEL-I- oder RES-I-Gens in Wirtszellen einzuführen und zu steuern (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6349-6353 (1984)). Hochgradige Expression kann auch unter Verwendung von induzierbaren Promotoren erreicht werden, einschließlich von unter anderem Metallothionein-IIA-Promotor und Hitzeschockpromotoren.
  • Wirtszellen können mit einer CEL-I- oder RES-I-cDNA transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z.B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen etc.) und einen selektierbaren Marker kontrolliert werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Widerstand gegen die Selektion und ermöglicht Zellen, das Plasmid stabil in deren Chromosome zu integrieren und zu wachsen, um Foki zu bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien expandiert werden können. Zum Beispiel können nach Einführung der fremden DNA gentechnisch erzeugte Zellen 1-2 Tage lang in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden und dann auf ein selektives Medium gebracht werden. Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich unter anderem Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-[Wigler et al., Cell 11, 223 (1977)], Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-[Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026 (1962)] und Adeninphosphoribosyltransferase-[Lowy et al., Cell 22, 817 (1980)] Gene können in tk–, hgprt–- bzw. aprt–-Zellen verwendet werden. Es kann auch die Antimetabolitresistenz als Basis für die Selektion von dhfr verwendet werden, das Methotrexatresistenz verleiht [Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl: Acad. Sci. USA 78, 1527 (1981)]; gtp, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)]; neo, das Resistenz gegen Aminoglycosid G- 418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1 (1981)); und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin-Gene verleiht [Santerre et al., Gene 30, 147 (1984)]. Kürzlich sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden, nämlich trpB, das Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, das Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden [Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047 (1988)]; und ODC (Ornithindecarboxylase), die Resistenz gegen Ornithindecarboxylaseinhibitior, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO, verleiht [L. McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laborstory, Hrsg. (1987)].
  • Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch herkömmliche sowie durch fachbekannte Verfahren durchgeführt werden. Wo der Wirt prokaryotisch ist, wie z.B. E. coli, können kompetente Zellen, die zur DNA-Aufnahme in der Lage sind, aus Zellen hergestellt werden, die nach exponentieller Wachstumsphase geerntet werden, und in der Folge durch das CaCl2-Verfahren unter Verwendung von fachbekannten Verfahren behandelt werden. Alternativ dazu kann MgCl2 oder RbCl verwendet werden. Transformation kann auch wenn gewünscht nach Bildung eines Protoplasten der Wirtszelle durchgeführt werden.
  • Tier- und niedrige eukaryotische (z.B. Hefe-)Wirtszellen sind kompetent für Transformation oder werden dafür durch verschiedene Mittel kompetent gemacht. Es gibt mehrere bekannte Verfahren zur Einführung von DNA in Tierzellen. Diese umfassen Kalziumphosphatcopräzipitate, herkömmliche mechanische Verfahren, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Gentransfer mit Hilfe der Partikelkanone, Insertion eines Plasmids, das in Liposomen eingekapselt ist, oder es können Virusvektoren verwendet werden. Eukaryotische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die für ein CEL I oder mit einem RES-I der Erfindung kodieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, das für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, wie das Herpes-simplex-Thymidinkinasegen, co-transformiert werden. Ein anderes Verfahren ist die Verwendung eines eukaryotischen Virusvektors, wie z.B. Simian-Virus-40 (SV40), Sindbis-Virus oder Rinderpapillomvirus, um eukaryotsiche Zellen vorübergehend zu infizieren oder zu transformieren und das Protein zu exprimieren [siehe zum Beispiel Eukaryo tic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laborstory, Gluzmnan, Hrsg. (1982)]. Die transfizierten Zellen werden durch fachbekannte Mittel kultiviert. R. J. Kuchler, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung von Sequenzvarianten von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid bereit, worin der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt von CEL-I- oder RES-I-Enzym, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität steigt, worin zumindest eine oder mehrere Varianten hergestellt werden.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die Heteroduplexpolynucleotide zurkulär, linear oder ein Replikon sind.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die gewünschten Varianten verschiedene Komplementaritätsausmaße aufweisen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die Strangspaltungsaktivität, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität nacheinander oder gleichzeitig hinzugefügt werden.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Hinzufügung von Ligaseaktivität bereit, bereitgestellt durch Mittel, wie z.B. T4-DNA-Ligase, E.-coli-DNA-Ligase, oder Taq-DNA-Ligase.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Strangspaltungsaktivität durch ein Enzym bereitgestellt, wie z.B. RES I, T4-Endonuclease-VII oder T7-Endonuclease-I.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist Polymeraseaktivität durch Pol-beta bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist Proof-Reading-Aktivität durch T4-DNA-Polymerase oder T7-DNA-Polymerase bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die wirksame Menge an Strangspaltungsaktivität und Proof-Reading-Aktivität und Ligaseaktivität durch RES-I-Enzym, T4-DNA-Polymerase und E.-coli-DNA-Ligase bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die wirksame Menge der Strangspaltungsaktivität und Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität durch RES-I-Enzym, T7-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase bereitgestellt.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Erhöhung der Diversität in einer Population von Sequenzen bereit, welche die Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligaseaktivität und Strangspaltungsaktivität, die durch Res-I-Enzym bereitgestellt werden, und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität ansteigt, umfasst, worin die Diversität in der Population erhöht wird.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids bereit, das für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität zwischen den Strängen des Heteroduplexpolynucleotids steigt, worin Diversität in der Population erhöht wird, und Screening oder Selektion einer Population von Varianten für die gewünschte funktionelle Eigenschaft.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids bereit, das für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligaseaktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität zwischen Strängen des Heteroduplexpolynucleotids ansteigt, worin die Diversität in der Population erhöht wird; Überführung von DNA in RNA und Screening oder Selektion einer Population von Ribonucleinsäurevarianten auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft.
  • Wieder eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids bereit, das eine gewünschte funktionelle Eigenschaft aufweist, umfassend: Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität zwischen Strängen des Heteroduplexpolynucleotids steigt, Überführung des Heteroduplexpolynucleotids in RNA und der RNA in ein Polypeptid und Screening oder Selektion einer Population von Polypeptidvarianten auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft.
  • Wieder eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids bereit, das für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, wo der Heteroduplex optional etwa 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 62 %, 58 %, oder 47 % identisch ist und etwa 100 Basenpaare, 1.000 Basenpaare, 10.000 Basenpaare oder 100.000 Basenpaare oder größer ist, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität zwischen Strängen des Heteroduplexpolynucleotids steigt, Screening oder Selektion einer Population von Varianten mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft, Denaturieren der Population von Varianten, um einzelsträngige Polynucleotide zu erhalten, Annealing der einzelsträngigen Polynucleotide, um zumindest ein zweites Heteroduplexpolynucleotid zu bilden, Kombination des zweiten Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym, und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz von Komplementarität zwischen Strängen des Heteroduplexpolynucleotids steigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Polynucleotidsequenz oder einer Population von verbesserten Polynucleotidsequenzen, typischerweise in Form von amplifizierten und/oder klonierten Polynucleotiden, wodurch die verbesserte(n) Polynucleotidsequenz(en) zumindest eine gewünschte phänotypische Eigenschaft aufweisen (z.B. für ein Polypeptid kodieren, Transkription von verbundenen Polynucleotiden fördern, ein Protein binden, die Funktion eines Virusvektors verbessern und dergleichen), die ausgewählt werden können und auf die gescreent werden kann. Solche gewünschten Polynucleotide können auf eine Reihe von Arten wie z.B. Expression eines geeigneten Pflanzen-, Tier-, Pilz-, Hefe- oder Bakterienexpressionsvektors, Integration zur Bildung einer transgenen Pflanze, nicht-menschlichen Tiers oder Mikroorganismus, Expression eines Ribozyms und dergleichen verwendet werden.
  • GRAMMR stellt Auflösung von fehlgepaarten Basenpaaren auf Heteroduplex-DNA-Strängen in einer In-vitro-Reaktion bereit. Diese Reaktion beginnt mit Spaltung eines Strangs oder des anderen an oder nahe einer Fehlpaarung; gefolgt vom Herausschneiden von fehlgepaarten Basen aus dem gespaltenen Strang und Polymerisierung, um die resultierende Lücke mit Nucleotiden zu füllen, die als Matrize für die Sequenz des anderen Strangs dienen. Der resultierende Nick kann durch Ligation versiegelt werden, um das Gerüst wieder zusammenzufügen. Die Summe der separaten unabhängigen Fehlpaarungsauflösungsereignisse, die im gesamten Heteroduplexmolekül auftreten, resultiert in der Neuordnung von Sequenzinformation in diesem gesamten Molekül. Die Sequenzinformation wird sich in einer Vielzahl von Kombinationen neu anordnen, um eine komplexe Bibliothek von Sequenzvarianten zu erzeugen.
  • In einer Ausführungsform von GRAMMR wird eine Bibliothek von Mutanten durch ein beliebiges fachbekanntes Verfahren, wie z.B. mutagene PCR, chemische Mutagenese etc., gefolgt von Screening oder Selektion von Mutanten mit einer gewünschten Eigenschaft erzeugt. Die mutierten DNAs werden gemischt, auf Einzelstränge denaturiert und anellieren gelassen. Teilweise komplementäre Stränge, die hybridisieren, weisen nicht-basengepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen auf. Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al., Nuc. Acids Res., Band 26, Nr. 20, 4597-4602 (1998); Yang et al., Biochemistry 39, 3533-3541 (2000)] oder einer ähnlichen fehlpaarungsgerichteten Aktivität, wie z.B. RES I, verursacht Nicken eines oder mehrerer Polynucleotidstränge an oder nahe der Fehlpaarungen. Außerdem kann CEL I oder RES I an oder nahe einer Insertion/Deletion nicken. Die Gegenwart einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität enthält (z.B. T4-DNA-Pol), ermöglicht Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymeraseaktivität füllt die Lücke unter Verwendung eines anderen Strangs als Matrize. Eine Polymerase, der 5'-zu-3'-Exonuclease-Aktivität und Strangersetzungsaktivität fehlt, füllt die Lücke und hört auf zu polymerisieren, wenn sie das 5'-Ende von DNA erreicht, die an der ursprünglichen CEL-I-Spaltstelle zu finden ist, wodurch nur kurze Bereiche der Sequenz resynthetisiert werden. DNA-Ligase (z.B. T4-DNA-Ligase oder E.-coli-DNA-Ligase) kann dann den Nick durch Wiederherstellung des Phosphatgerüsts versiegeln. Dieses Verfahren kann gleichzeitig an mehreren Stellen und an beiden Strängen eines bestimmten Heteroduplex-DNA-Moleküls auftreten. Das Ergebnis ist eine Randomisierung von Sequenzunterschieden unter Inputsträngen, um eine Population von Sequenzvarianten zu ergeben, die vielfältiger ist als die Population der Startsequenzen. Diese entstehenden Polynucleotide können direkt in einen geeigneten Vektor kloniert werden oder durch PCR vor Klonierung amplifiziert werden. Alternativ dazu kann die Reakti on auf Heteroduplexregionen innerhalb des Kontextes eines doppelsträngigen runden Plasmidmoleküls oder eines anderen geeigneten Replikons durchgeführt werden, das direkt in den geeigneten Wirt nach der GRAMMR-Reaktion eingeführt werden kann. In einer anderen Alternative können die entstehenden Polynucleotide in RNA-Polynucleotide transkribiert werden und direkt verwendet werden, zum Beispiel durch Inokulation eines Pflanzenvirusvektors auf eine Pflanze, wie z.B. im Fall eines Virusvektortranskriptionsplasmids. Die resultierenden Klone werden einer Selektion oder einem Screen auf Verbesserungen einer gewünschten Eigenschaft unterworfen. Das gesamte Verfahren kann dann ein oder mehrere Male mit den ausgewählten Klonen in einem Versuch wiederholt werden, um zusätzliche Verbesserungen zu erreichen.
  • Wenn die entstehenden Polynucleotide direkt kloniert werden, besteht die Möglichkeit, dass unvollständig aufgelöste Moleküle, die bestehen bleiben, bei Replikation in dem Klonierungswirt zu zwei verschiedenen Plasmiden in derselben Zelle führen können. Diese Plasmide können möglicherweise zu gemischten Plasmidkolonien führen. Wenn es gewünscht ist, eine solche Möglichkeit zu vermeiden, können die entstehenden Polynucleotidmoleküle im Wirt gezüchtet werden, um Replikation/Auflösung zu ermöglichen, die Polynucleotide isoliert werden und in die neuen Wirtszellen zurücktransformiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform wird, wenn Sequenzinput von mehr als zwei Eltern pro Molekül wünschenswert ist, das obige Verfahren in einer zyklischen Art durchgeführt, bevor Klonierung von entstehenden Polynucleotiden durchgeführt wird. Nach der GRAMMR-Reaktion werden die doppelsträngigen Polynucleotide denaturiert, anellieren gelassen und das Fehlpaarungsauflösungsverfahren wiederholt. Nach einer gewünschten Zahl solcher Zyklen können entstehende Polynucleotide direkt kloniert werden, in einen geeigneten Vektor eingeführt werden, oder sie können durch PCR vor Klonierung amplifiziert werden. Die resultierenden Klone werden Selektion oder einem Screen auf die Verbesserungen einer gewünschten Eigenschaft unterworfen.
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine „molekulare Rückkreuzung" durchgeführt, um den Hintergrund schädlicher Mutationen aus den gewünschten Mutationen zu entfernen. Ein Pool gewünschter mutierter DNAs kann an Wildtyp-DNA hybdridisiert werden, um dieses Verfahren durchzuführen. Klone können für Verbesserung ausgewählt, gepoolt und zum Wildtyp rückgekreuzt werden, bis es keine weiteren signifikanten Veränderungen gibt.
  • Die Wirksamkeit des Verfahrens wird durch verschiedene Verfahren zum Anreichern der Ausgangspopulation um Heteroduplexmoleküle verbessert, wodurch die Anzahl von ungeänderten entstehenden Elternmolekülen reduziert wird. Die fehlgepaarten Hybride können unter Verwendung von Aptameren, Farbstoffen oder anderen Mitteln, die sich an fehlgepaarte DNA binden, affinitätsgereinigt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung von Mut-S-Proteinaffinitätsmatrix (Wagner et al., Nucleic Acids Res. 23 (19), 3944-3948 (1995); Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5057-5061 (1986)) oder fehlpaarungsbindenden, aber nicht-spaltenden Mutanten von Phagen-T4-Endonuclease-VII [Golz und Kemper, Nucleic Acids Research 27, e7 (1999)].
  • In einer Ausführungsform wird das Verfahren modifiziert, sodass die Inputpolynucleotide aus einem Einzelstrang jeder Sequenzvariante bestehen. Zum Beispiel werden einzelsträngige DNAs von entgegengesetzter Strangbeschaffenheit aus verschiedenen Elternsequenzen durch asymmetrische PCR erzeugt, um teilweise komplementäre einzelsträngige Moleküle zu erzeugen. Annealing der Stränge miteinander zur Herstellung von Heteroduplex wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Alternativ dazu können einzelsträngige DNAs durch bevorzugten Verdau eines Strangs jeder doppelsträngigen Eltern-DNA mit Lambda-Exonuclease erzeugt werden, gefolgt von Annealing der übrigen Stränge aneinander. In dieser Ausführungsform weisen die Annealing-Stränge keinen 100 % komplementären Strang auf, mit dem sie reanellieren können. Daher gibt es einen niedrigeren Hintergrund von nicht-modifizierten Polynucleotiden, d.h. „Elternpolynucleotide" unter den entstehenden Polynucleotiden, die zu einer höheren Wirksamkeit von neuanordnenden Sequenzvariationen führen. Diese erhöhte Wirksamkeit ist besonders in Situationen wertvoll, wo ein Screen statt einer Selektion verwendet wird, um auf die gewünschten Polynucleotide zu testen.
  • Ein anderes Verfahren zur Heteroduplexbildung ist es, doppelsträngige Eltern-DNAs zu mischen, sie zu denaturieren, um die Stränge zu trennen, und einzelsträngige DNAs aneinander anellieren zu lassen, um eine Population von Heteroduplexen und Eltern-Homoduplexen zu erzeugen. Die Heteroduplexe können dann selektiv mit einem Heteroduplex-Fangverfahren, wie z.B. dem oben beschriebenen, unter Verwendung von MutS oder einer nicht-spaltenden T4-Endonuclease-VII-Mutante angereichert werden. Alternativ dazu können die Eltern-Homoduplexmoleküle in der Population durch Restriktionsenzyme gespalten werden, die sich mit Stellen der Fehlpaarung überlagern, sodass sie im Heteroduplex nicht gespalten werden, aber in den Eltern-Homoduplexmolekülen gespalten werden. Ungespaltene Heteroduplex-DNA kann dann durch Größenfraktionierung in einem Agarose-Gel isoliert werden, wie es durchgeführt wurde, um Volllängenplasmid auf Volllängenplasmid-Heteroduplex-DNA-Molekülen wie in Beispiel 9 beschrieben herzustellen. Nick-Versiegelung in jenen heteroduplexierten Plasmidmolekülen voller Länge wurde dann durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugt.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die doppelsträngigen Eltern-, oder Input-, Polynucleotide durch die Hinzufügung von „Klemmen"-Sequenzen modifiziert. Ein Inputpolynucleotid oder Pool von Polynucleotiden wird durch PCR mit der Hinzufügung einer einzigartigen Sequenz im 5'-Primer amplifiziert. Das andere Inputpolynucleotid oder Pool wird durch PCR mit der Hinzufügung einer einzigartigen Sequenz im 3'-Primer amplifiziert. Klemmensequenzen können hergestellt werden, um eine einzigartige Restriktionsenzymstelle für das 5'-Ende des Gens von Interesse und eine andere für das 3'-Ende zu enthalten, sodass beim Schritt der Klonierung der Produkte der GRAMMR-Reaktion nur Produkte mit der 5'-Klemme des ersten Polynucleotids (oder Pools) und dem 3'-Ende des zweiten Polynucleotids (oder Pools) geeignete Enden für die Klonierung aufweist. Alternativ dazu können die Produkte der GRAMMR-Reaktion unter Verwendung der einzigartigen Sequenzen der 5'- und 3'-Klemmen amplifiziert werden, um ein ähnliches Ergebnis zu erhalten. Daher gibt es einen niedrigeren Hintergrund der nicht-modifizierten Polynucleotide, d.h. „Elternpolynucleotide", unter den entstehenden Polynucleotidklonen, die zu einer höheren Wirksamkeit der Neuordnung von Sequenzvariationen führen. Diese erhöhte Wirksamkeit ist besonders in Situationen wertvoll, wo ein Screen eher als Selektion verwendet wird, um auf gewünschte Polynucleotide zu testen. Gegebenenfalls können Oligonucleotidprimer zur GRAMMR-Reaktion hinzugefügt werden, die zu Klemmenprimersequenzen komplementär sind, sodass jeder Elternteil als oberer Strang dienen kann, wodurch beiden reziproken Heteroduplexen ermöglicht wird, an der Fehlpaarungsauflösungsreaktion teilzunehmen.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von zyklischen heteroduplexierten Polynucleotiden wird durchgeführt, wo doppelsträngige Eltern-DNAs terminale Klemmensequenzen wie oben beschrieben aufweisen, wo die einzelsträngigen Klemmensequenzen, die sich von einem Ende des Heteroduplexes erstrecken, komplementär zu einzelsträngigen Klemmensequenzen sind, die sich vom anderen Ende des Heteroduplexes erstrecken. Diese komplementären, einzelsträngigen Klemmen werden anellieren gelassen, wodurch das heteroduplexierte DNA-Molekül zirkularisiert wird. Elternhomoduplexe, die aus der Reanellierung identischer Sequenzen resultieren, haben nur eine Klemmensequenz und daher keine komplementären einzelsträngigen Sequenzen an ihren Termini, mit welchen Zirkularisierung auftreten kann. Zusätzlich dazu kann eine DNA-Polymerase und eine DNA-Ligase verwendet werden, um beliebige Lücken in den zirkulären Molekülen zu füllen bzw. die Nicks im Rückgrat zu versiegeln, um in der Bildung einer Population von kovalent geschlossenen zirkulären Heteroduplexmolekülen zu resultieren. Da die kovalent geschlossenen zirkulären Heteroduplexmoleküle nicht in deren Komponentenstränge dissoziieren, wenn sie weiteren Denaturierungsbedingungen unterworfen werden, kann das Verfahren der Denaturierung, Zirkularisierung und Ligation wiederholt werden, um mehr der linearen doppelsträngigen Elternduplexe in geschlossene zirkuläre Heteroduplexe zu überführen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine Region einer einzelsträngigen zirkulären Phagemid-DNA an eine verwandte aber nicht-identische lineare DNA hybridisiert werden, die dann mit einer Polymerase, wie z.B. T7-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase plus T4-Gen-32-Protein, verlängert werden, dann an das resultierende Nick ligiert werden kann, um ein zirkuläres, doppelsträngiges Molekül mit heteroduplexierten Regionen an den Stellen der Unterschiede zwischen den DNAs zu gewinnen. GRAMMR kann dann auf diesem Molekül durchgeführt werden, um eine Bibliothek von sequenz-neuangeordneten Molekülen zu gewinnen.
  • Alternativ dazu werden zwei einzelsträngige zirkuläre Phagemid-DNAs von entgegengesetzter Strangpolarität in Bezug auf das Plasmidrückgrat und Elterngensequenzen, die das Target der Neuordnung sind, aneinander anelliert. Eine Region von übermäßiger Fehlpaarung tritt auf, wo sich die Ursprungssequenzen des Phagen f1 befinden. Nach GRAMMR-Behandlung kann diese Region der übermäßigen Fehlpaarung wieder zu einer der Elterntypsequenzen zurückkehren, wodurch ein funktioneller f1-Ursprung wiederhergestellt wird. Diese doppelsträngigen Moleküle enthalten auch Fehlpaarungsregionen an den Stellen der Unterschiede zwischen den Strängen, die für die Elterngene von Interesse kodieren. GRAMMR kann dann auf diesem Molekül durchgeführt werden, um eine Bibliothek von sequenz-neuangeordnetem Molekül zu erhalten.
  • Wie in den vorangegangenen Absätzen besprochen kann die Ausgangs-DNA oder Input-DNA aus einer beliebigen Zahl von Formen bestehen. Zum Beispiel kann Input-DNA voller Länge einzelsträngig und von entgegengesetztem Sense sein, wie in Beispiel 2 gezeigt wird. Alternativ dazu kann die Input-DNA auch ein Fragment des Strangs voller Länge sein. Die Input-DNAs können doppelsträngig sein, entweder einer oder beide, oder modifiziert, wie z.B. durch Methylierung, Phosphorthiolatbindungen, Peptid-Nucleinsäure, Inkorporation von Uracil in die DNA, Substution von RNA in einem oder beiden Strängen oder dergleichen. Einer der Stränge eines Duplexes kann entlang beider Stränge kontinuierlich, nicht-kontinuierlich aber zusammenhängend, nicht-kontinuierlich mit Überlappungen oder nicht-kontinuierlich mit Lücken sein.
  • GRAMMR kann auch auf DNA-Fragmentierung und auf Neuordnung basierende DNA-Neukombinationsschemen angewendet werden. Zum Beispiel in Verfahren, wo Genfragmente durch Zyklen von Denaturierung, Anellierung und Extension im Verlauf der Genneuordnung geführt werden, kann GRAMMR als Zwischenschritt verwendet werden.
  • In einer solchen Ausführungsform wird die DNA aus einem Gen oder Pool von mutierten Genen durch enzymatische, mechanische oder chemische Mittel fragmentiert und gegebenenfalls ein Größenbereich dieser Fragmente durch ein Mittel isoliert, wie z.B. Trennung auf einem Agarose-Gel. Das Ausgangspolynucleotid, wie z.B. Wildtyp oder eine gewünschte Variante oder ein Pool davon, wird zu den Fragmenten hinzugegeben und das Gemisch denaturiert und dann anellieren gelassen. Die anellierten Polynucleotide werden mit einer Polymerase behandelt, um die einzelsträngigen Lücken unter Verwendung des intakten Strangs als Matrize zu füllen. Die resultierenden teilweise komplementären doppelten Stränge haben keine nicht-basen-gepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen. Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al., Nucl. Acids Res., Band 26 Nr. 20, 4597-4602 (1998), Yang et al., Biochemistry 39, 3533-3541 (2000)] oder einem Mittel mit ähnlicher Aktivität, wie z.B. RES I, verursacht Nicking eines oder der anderen Polynucleotidstränge an oder nahe der Fehlpaarungen. Hinzufügung einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität enthält, wie z.B. T4-DNA-Polynerase, ermöglicht Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymeraseaktivität füllt die Lücke unter Verwendung des anderen Strangs als Matrize. Eine DNA-Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, kann dann den Nick durch Wiederherstellung des Phosphatrückgrats versiegeln. Das Ergebnis ist eine Randomisierung von Sequenzvariation unter Input-Strängen, um entstehende Stränge mit potenziell verbesserten Eigenschaften zu ergeben. Diese entstehenden Polynucleotide können direkt in einen geeigneten Vektor kloniert werden, oder sie können vor Klonierung mittels PCR amplifiziert werden. Die resultierenden Klone werden einer Selektion oder einem Screen auf Verbesserungen einer gewünschten Eigenschaft unterworfen.
  • In einer solchen Ausführungsform wird die DNA aus einem Pool von mutierten Genen durch enzymatische, mechanische oder chemische Mittel fragmentiert, oder Fragmente werden durch eingeschränkte Verlängerung von zufälligen Oligonucleotiden, anelliert an Elternmatrizen, erzeugt ( US Patent Nr. 5.965.408 ), und gegebenenfalls wird ein Größenbereich der Fragmente durch ein Mittel, wie z.B. Trennung auf einem Agarose-Gel, isoliert. Das Gemisch wird denaturiert und dann anellieren gelassen. Die anellierten Polynucleotide werden gegebenenfalls mit einer Polymerase behandelt, um die einzelsträngigen Lücken zu füllen. Die resultierenden, teilweise komplementären doppelsträngigen Fragmente weisen nicht-basengepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen auf. Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al. (1998); Yang et al. (2000)] oder einem Mittel mit ähnlicher Aktivität, wie z.B. RES I, verursacht Nicking eines oder mehrerer Polynucleotidstränge 3' zu jeder Fehlpaarung. Die Aktivität einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität aufweist, wie z.B. T4-DNA-Polymerase, ermöglicht Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymerase-Aktivität füllt die Lücke unter Verwendung des anderen Strangs als Matrize. Gegebenenfalls kann dann eine DNA-Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, den Nick durch Wiederherstellung des Phosphatrückgrats versiegeln. Das Ergebnis ist eine Randomisierung der Sequenzvariation unter Input-Strängen, um entstehende Stränge mit potenziell verbesserten Eigenschaften zu ergeben. Nachfolgende Runden von Denaturierung, Annealing und GRAMMR ermöglichen Genneuordnungen. PCR kann zur Amplifikation des gewünschten Abschnitts des neuangeordneten Gens verwendet werden. Diese entstehenden PCR-Polynucleotide können in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Die resultierenden Klone werden einer Selektion oder einem Screen auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft unterworfen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das Starten mit einem kontinuierlichen Gerüststrang bereit, an welchen Fragmente eines anderen Gens oder Gene anellieren. Die Klappen und Lücken werden getrimmt und wie in Coco et al., Nature Biotech. 19 (01) 354, US-Patent Nr. 6.319.713 beschrieben aufgefüllt, und GRAMMR wird durchgeführt. In diesem Verfahren lässt GRAMMR weitere Sequenzanordnung entstehen, indem Transfer von Sequenzinformation zwischen dem Matrizenstrang und dem Strang entstehen, der aus Lappen- und Lückentrim mung und Ligation resultiert. Dieses Verfahren stellt die Vorteile der Einführung von spezifischen Sequenzbereichen in einen kontinuierlichen Strang bereit, gefolgt von GRAMMR von Resten, die sich mit dem Gerüst fehlpaaren. Durch gleichzeitiges Annealing vieler Fragmente mit derselben Sequenz oder Gen können viele einzelne Stellen gleichzeitig angesteuert werden, wodurch eine Neuordnung mehrerer Sequenzen oder Gene auf einmal ermöglicht wird. In der vorliegenden Ausführungsform wird das Gerüst nicht notwendigerweise abgebaut, der Duplex kann eher direkt kloniert werden oder durch PCR vor Klonierung amplifiziert werden. Übermäßige Fehlpaarungsauflösung führt zu einer perfekt duplexierten DNA. Teilweise Fehlpaarungsauflösung führt im Wesentlichen zu zwei verschiedenen neuangeordneten Produkten pro Duplex.
  • Wie aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich, kann GRAMMR auch auf eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, welche das Annealing von verwandten DNAs als Schritt in deren Verfahren umfassen. Zum Beispiel erfordern viele ortsgerichtete Mutageneseprotokolle das Annealing von für Mutanten kodierenden DNA-Molekülen an eine zirkuläre DNA in einer einzelsträngigen Form, entweder Phagemid oder denaturiertes Plasmid. Diese DNAs werden mit einer Polymerase verlängert, gefolgt von Behandlung mit Ligase, um den Nick zu versiegeln, mit weiterer Manipulation, um die Elternsequenz zu entfernen, wobei die gewünschte Mutation oder Mutationen, die in den genetischen Elternhintergrund inkorporiert waren, zurückgelassen werden. Obwohl diese Protokolle im Allgemeinen verwendet werden, um spezifische Mutationen in eine bestimmte DNA-Sequenz zu inkorporieren, ist es möglich, dass eine GRAMMR-Reaktion auf die heteroduplexierten Moleküle angewendet werden, die in einem solchen Verfahren erzeugt werden, um Sequenzvariationen zwischen den zwei Strängen neuanzuordnen, wodurch eine vielfältige Reihe von Nachkommen mit neuangeordneter genetischer Variation entsteht.
  • Eine andere Ausführungsform stellt aufeinander folgende Runden von Neuordnung auf nur einer besonderen Region der DNA von Interesse bereit. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente an eine zirkuläre einzelsträngige Phagemid-DNA anelliert, und GRAMMR wird durchgeführt. Die Fragmente können behandelt werden, um sie da vor zu bewahren, physikalisch in das entstehende Material inkorporiert zu werden. Zum Beispiel können sie am 3'-Ende mit Di-Desoxy-Resten terminiert werden, welche diese nicht-verlängerbar machen. Mehrere Runden von Neuordnung können durchgeführt werden, aber es werden nur modifizierte Moleküle aus dem ursprünglichen einzelsträngigen DNA-Klon gewonnen. Die Folge wird sein, dass die DNA-Fragmente, die in dieser Neuordnung verwendet werden, nur Sequenzinformation zum Endprodukt beitragen und nicht physikalisch in das gewinnbare Endprodukt integriert werden.
  • GRAMMR kann für Protein-, Peptid- oder Aptamer-Veranschaulichungsverfahren verwendet werden, um eine Rekombination zwischen Bibliothekselementen zu erhalten, die ausgewählt worden sind. Da für GRAMMR keine Fragmentation der Input-DNAs erforderlich ist, kann es möglich sein, Sequenzinformation zwischen sehr kleinen Sequenzbereichen neu anzuordnen. Zum Beispiel können DNAs, die für kleine Peptide kodieren, oder RNA-Aptamere, die aufgrund einer besonderen Eigenschaft ausgewählt worden sind, wie z.B. Targetbindung, neu angeordnet werden. Damit Annealing zwischen den ausgewählten DNA-Molekülen auftreten kann, sollte ein gewisses Ausmaß an Sequenzhomologie zwischen den Molekülen aufweisen, wie z.B. an den 5'- und 3'-Regionen der kodierenden Sequenz, in Regionen des randomisierten Sequenzsegments, die aufgrund von ähnlichen Bindungsaktivitäten Ähnlichkeit aufweisen, oder durch das Biasing von Codon-Wobble-Basen-Identität an eine bestimmte Gruppe von Standards.
  • Manipulation der Reaktionstemperatur, bei welcher GRAMMR durchgeführt wird, kann nützlich sein. Zum Beispiel tragen niedrigere Temperaturen zur Stabilisation von Heteroduplexen bei, die ermöglichen, dass GRAMMR auf stärker fehlgepaarten Substraten durchgeführt wird. Ähnlich können Zusatzstoffe, die Basenpaarung zwischen Strängen beeinflussen, wie z.B. Salze, Formamid etc., verwendet werden, um die Stabilität des Heteroduplexes in der GRAMMR-Reaktion zu ändern, wodurch das Ergebnis der Reaktion beeinflusst wird.
  • Eine andere Ausführungsform stellt Zonenmutagenese durch GRAMMR bereit, d.h. willkürliche oder halb-willkürliche Mutationen an und in der unmittelbaren Nachbarschaft von fehlgepaarten Resten unter Verwendung von Nucleotidanaloga, die multiples Basenpaarungspotenzial aufweisen. Dies stellt die Konzentration von im Wesentlichen Zufallsmutagenese an einem bestimmten Punkt von Interesse bereit und fügt einen anderen Vorteil zur vorliegenden Erfindung hinzu. Gruppen von Genen, die ähnlich sind, aber voneinander geringfügig unterschiedliche Funktionen aufweisen, z.B. viele Enzyme, zeigen moderate Sequenzunterschiede voneinander in Regionen, die für ihre eigenen besonderen Aktivitäten operativ sind. Diese Aktivitäten können Substratpräferenz, Bindungspartner, regulierende Stellen oder dergleichen umfassen. Gensequenzen, die diese Funktionen regeln, sollen innerhalb der Population verwandter Gene heterogen sein. Da es bekannt ist, dass die Spezifität einer solchen Funktion mit diesen Aminosäuren und deren Nachbarn assoziiert ist, kann GRAMMR-Mutagenese zusätzlich zur Neuordnung von Sequenzinformation zwischen Genen auch zur Steuerung von Zufallsmutagenese an diese Regionen verwendet werden, um ihre Funktion entstehen zu lassen, während andere Sequenzen nicht gestört werden, wie z.B. strukturelles Gerüst, invariante Reste und andere solche wichtigen Stellen, die möglicherweise gegenüber Randomisierung weniger tolerant sind.
  • Verschiedene Enzyme mit unterschiedlichen Funktionen unterscheiden sich nicht nur in den operativen Regionen, wie z.B. aktiven Stellen und regulierenden Stellen. Es ist wahrscheinlich, dass sie andere Unterschiede voneinander aufweisen, die durch genetischen Drift entstehen. Weitere Randomisierung an den Stellen solcher Veränderungen kann daher für das Ergebnis eines Mutagenese-Versuches als neutral, minimal wichtig oder schädlich eingestuft werden. Um die Zufallsmutagenese weg von den inkonsequenten Stellen und in die Richtung von Stellen zu lenken, die ein besseres Ergebnis für Zufallsmutagenese darstellen, wie z.B. die aktive Stelle eines Enzyms, können die Codonverwendungs-Einflüsse der Gene manipuliert werden, um das Gesamtausmaß von Nucleotidkomplementarität in diesen Regionen zu verringern oder zu erhöhen. Wenn Regionen größerer Komplementarität weniger empfindlich auf GRAMMR sind als Regionen geringerer Komplementarität, wird der Grad von GRAMMR-gerichteter willkürlicher Zonenmutagenese an einer bestimmten Stelle moduliert.
  • In einem beliebigen DNA-Neukombinationsversuch ist es wünschenswert, den Anteil von nicht-neukombinierten oder Eltern-DNAs, die innerhalb der Population von neukombinierten Nachkommen erhalten werden, zu minimieren. Mehrere Ansätze können verwendet werden, um dies zu erreichen. In einem Plasmid-auf-Plasmid-DNA-Neukombinationsformat, wo die Gene, die neu kombiniert werden sollen, auf separaten, aber sonst identischen Plasmiden gegenwärtig sind, wird jedes Plasmid an einer oder einer anderen unterschiedlichen einzigartigen gegenwärtigen Restriktionsstelle linearisiert. Nach Entfernung der Restriktionsendonucleasen werden die linearisierten DNAs gemischt, voneinander geschmolzen und anellieren gelassen, sodass sich Populationen von Heteroduplex-DNA bilden, die entweder genickte, geschlossen zirkuläre Heteroduplex-Moleküle oder doppelsträngige und lineare Homoduplexe sind. Es ist die Population von zirkulären doppelsträngigen Heteroduplex-DNA-Molekülen, die das gewünschte Substrat für die GRAMMR-Reaktion darstellen. Man kann entweder diese gewünschte Population durch Gelfraktionierung anreichern oder eines oder eine Vielzahl von Verfahren verwenden, die keine physikalische Trennung dieser Population erfordern, aber stattdessen die Gewinnung von nicht-neukombinierten Elternmolekülen beeinträchtigen. Mehrere dieser Verfahren sind nachstehend aufgelistet.
  • Zuerst wird nach der GRAMMR-Reaktion der gemischten Population von linearem Eltern-Homoduplex und zellulärem doppelsträngigem Heteroduplex im Allgemeinen Transformation von E. coli durchgeführt. Da zirkuläre DNA in der Transformation von E. coli weit wirksamer als ihr linearisiertes Gegenstück ist, können die Elternhomoduplexe in diesem Schritt gut unterschieden werden, indem ihre Zirkularisierung in transformationskompetente Moleküle vermieden wird. Die Verwendung von E.-coli-DNA-Ligase als Ligase-Komponente der GRAMMR-Reaktion dient der Vermeidung von Rezirkularisierung von Eltern-Homoduplex, da sie wirksamer Nicks versiegelt als kurze kohäsive Termini bindet, die aus Restriktionsendonucleasespaltung resultieren. Weiters ligiert dieses Enzym Blunt-Enden sehr ineffizient. Als Folge der Verwen dung dieser Strategie werden die Nachkommen, die aus der Transformation von E. coli mit der GRAMMR-Reaktion resultieren, aus nicht-neukombinierten Elterngenen abgereichert und mit Molekülen angereichert, welche in die GRAMMR-Reaktion als Heteroduplex-Substrate eintraten.
  • Ein anderes Verfahren, um Elterngenkontamination aus der Population von entstehenden GRAMMR-Molekülen auszuschließen, ist es, die Plasmidlinearisierungsstellen innerhalb eines selektierbaren Markers zu positionieren. Die Stellen sollen sich in ausreichender Distanz voneinander befinden, um zu ermöglichen, dass Annealing zwischen versetzten Enden eines Heteroduplexes stattfindet, und sollen entweder Überhänge aufweisen, die eingefügt oder abgetrimmt werden können, oder eine Deletion von Sequenz bei Spaltung verursachen. Wie oben werden die Plasmide, welche die Gene enthalten, die neu kombiniert werden sollen, an einer oder anderen Stellen linearisiert. Nach Entfernung der Restriktionsendonucleasen werden die linearisierten DNAs gemischt, geschmolzen und anellieren gelassen. Die resultierende Probe entsteht aus einem Gemisch von zirkulären Heteroduplexen und linearen Homoduplexen. Diese Probe kann dann mit einer Proof-Reading-Polymerase, wie z.B. T4-DNA-Polymerase, in der Gegenwart von dNTPs behandelt werden. Die zirkulären Homoduplexe sollten nicht betroffen sein, während die linearen Eltern-Homoduplexe an deren Termini abgestumpft sind, wobei Basen zur Sequenz des selektierbaren Markers wirksam hinzugegeben oder deletiert werden, wenn das Molekül an einem beliebigen Punkt in der GRAMMR-Reaktion oder nach Transformation in E. coli rezirkularisiert wird. Wenn die Hinzufügung oder Deletion dieser Sequenzen zu einer Unterbrechung der Funktion des selektierbaren Markers führt, dann werden die resultierenden Moleküle unter geeigneter Selektion nicht gewonnen.
  • Ein anderes Verfahren, das zur Prävention von nicht neu kombinierter Elternkontamination der neu kombinierten Bibliothek verwendet werden kann, ist, die linearisierten DNAs vor Schmelzen und Annealing zu dephosphorylieren. Lineare Homoduplex-Moleküle werden dazu gebracht, unfähig zu sein, sich in zirkuläre Moleküle zu ligieren, während zirkuläre Heteroduplexe einfach einen einzigen Nick in jedem Strang enthalten, aber weiter zirkulär bleiben und daher für wirksame Transformation in E. coli kompetent sind.
  • Ein anderes Verfahren, das zur Vermeidung von nicht neu kombinierter Elternkontamination der neu kombinierten Bibliothek verwendet werden kann, ist, mit Enzymen zu verdauen, deren Erkennungsstellen mit Fehlpaarungen in heteroduplexierten Molekülen überlappt werden. Verdau der Elternhomoduplexe an diesen Stellen machen die resultierenden Moleküle linear, sodass sie beliebigen oben beschriebenen Behandlungen unterworfen werden, um Elternkontamination zu vermeiden. Die resultierenden Moleküle können auch kleiner gemacht werden, was eine Trennung der intakten zirkulären Heteroduplexmoleküle ermöglicht.
  • Wenn zusätzlich zum Ausschließen von nicht neu kombinierten Elternmolekülen aus einem Neukombinationsversuch die Vermeidung von Neukombination zwischen beliebigen zwei oder mehreren Enden einer Population von zwei oder mehreren Elterngenen gewünscht ist, können dieselben Prinzipien wie beschrieben angewendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung tritt die willkürliche Neuordnung in einer In-vitro-DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion auf. Dieses Verfahren erfordert keine Schritte von „Genneuordnung", die als Grundlage für die frühere Mutationsneuordnung („Neukombinations-") Verfahren dienen. Stattdessen basiert es auf der Fähigkeit eines rekonstituierten oder künstlichen DNA-Fehlpaarungsauflösungssystems, um Sequenzvariationen aus einem oder mehreren Strängen von DNA in einen anderen Strang durch Hybridisierung und Fehlpaarungsauflösung in vitro zu übertragen.
  • Im Allgemeinen sind Standardverfahren von DNA-Rekombinationstechnologie in verschiedenen Publikationen beschrieben, z.B. [Ausubel (1987), Ausubel (1999), Sambrook et al. (1989)], wovon jedes hierin in seiner Gesamtheit durch Verweis aufgenommen ist. Polynucleotid-modifizierende Enzyme wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Wenn gewünscht können PCR-Amplimere zur Amplifikation einer vorgegebenen DNA-Sequenz nach Ermessen des Fachmanns ausgewählt werden.
  • Es versteht sich, dass jede der in der vorliegenden Erfindung gelehrten Aktivitäten, die in die GRAMMR-Reaktion involviert sind, mit einem funktionell äquivalenten Mittel mit ähnlicher Aktivität ausgetauscht werden kann und dass solche Veränderungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Zum Beispiel konnte Taq-DNA-Ligase wie in Beispiel 6 angegeben T4-DNA-Ligase ersetzen. Andere Ligasen können ebenfalls ersetzt werden, wie z.B. E.-coli-DNA-Ligase. Ähnlich wie in Beispiel 12 dargestellt kann T7-DNA-Polymerase für T4-DNA-Polymerase substituiert werden. Andere Enzyme mit geeigneter Proof-Reading-Aktivität können anstelle beliebiger dieser Enzyme für die Proof-Reading-Aktivität wirken, die für die GRAMMR-Reaktion erforderlich ist. Auf ähnliche Weise kann eine beliebige Polymerase mit funktionell äquivalenter Aktivität zu jenen, von denen gezeigt wurde, dass sie für GRAMMR funktionieren, für Substitution verwendet werden.
  • Strangspaltung kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden. Zusätzlich zu CEL I kann eine Reihe von funktionell äquivalenten und potenziell ähnlichen Aktivitäten, die in Extrakten aus einer Vielzahl von Pflanzenspezies zu finden sind [Oleykowski, Nucleic Acids Res. 26, 4597-602 (1998)], verwendet werden. Andere fehlpaarungsgerichtete Endonucleasen, wie z.B. T4-Endonuclease-VII, T7-Endonuclease-I und SP-Nuclease [Oleykowski, Biochemistry 38, 2200-5 (1999)], können verwendet werden. Eine andere besonders nützliche fehlpaarungsgerichtete Endonuclease ist RES I.
  • CEL I und RES I können modifiziert werden, um Enzymvarianten mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Homologe Nucleinsäuresequenzen aus anderen Quellen können durch Beobachtung von Pflanzen festgestellt werden. Alternativ dazu können CEL I oder RES I mutiert werden, und entgegengesetzte Stränge mit weniger als 100 % Identität können zusammengebracht werden, um ein Heteroduplex-Molekül zu bilden. Das hierin offenbarte vorliegende Verfahren oder ein anderes Verfahren können verwendet werden, um neue CEL-I- und RES-I-Enzymvarianten herzustellen.
  • CEL I IST EINE FEHLPAARUNGSENDONUCLEASE
  • CEL I ist eine Fehlpaarungsendonuclease, die aus Sellerie isoliert wird. Die Verwendung von CEL I in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion von Mutationen in Polynucleotidsequenzen, auf die gezielt wird, insbesondere jenen, die mit Krebs assoziiert sind, ist in US-Patent Nr. 5.869.245 offenbart. Verfahren zur Isolation und Herstellung von CEL I sind ebenfalls in diesem Patent offenbart. Jedoch gibt es keine Offenbarung in diesem Patent, die eine Verbindung mit der Verwendung von CEL I in DNA-Sequenzneuordnung herstellt.
  • Nucleinsäuremoleküle, die für CEL I kodieren, sind in PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 01/62974 A1 offenbart. Wie in US-Patent Nr. 5.869.245 ist die Verwendung von CEL I in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion von Mutationen in Polynucleotidsequenzen offenbart, auf die gezielt wird und die mit Krebs assoziiert sind. Ähnlich gibt es keine Offenbarung, die eine Verbindung zur Verwendung von CEL I in DNA-Sequenzneuordnung herstellt.
  • RES I IST EINE FEHLPAARUNGSENDONUCLEASE
  • Die Verwendung von RES-I-Endonuclaease wird in diagnostischen Verfahren zur Detektion von Mutationen in Polynucleotidsequenzen, auf die gezielt wird, in Erwägung gezogen, insbesondere jenen, die mit Krebs assoziiert sind. Beispiele für manche dieser Arten von diagnostischen Verfahren sind in US-Patent Nr. 5.869.245 und Del Tito et al. offenbart. Die Verwendung von RES I wird auch in Verfahren zur Detektion von Mutationen in großen genomischen Regionen, Surenko et al., und für Mutationsscreeningverfahren, wie z.B. TILLING, wie in McCallum et al. offenbart, in Erwägung gezogen.
  • Die Reaktivität von Endonuclease-VII von Phage T4 mit DNA-Schleifen von acht, vier oder einem Nucleotid oder beliebigen von 8 möglichen Basenfehlpaarungen in vitro ist in „Endonuclease VII of Phage T4 Triggers Mismatch Correction in Vitro", Solaro et al., J. Mol Biol 230 (93) 868, offenbart. Die Veröffentlichung berichtet von einem Mechanismus, wo Endonuclease VIII doppelsträngige Unterbrechungen durch die Herstellung von Nicks und Gegennicks innerhalb von sechs Nucleotiden 3' zur Fehlpaarung einführt. Die Veröffentlichung offenbart, dass eine Zeitverzögerung zwischen dem Auftreten des ersten Nicks und des Gegennicks ausreichend war, um die 3'-5'-Exonucleaseaktivität von gp43 zu ermöglichen, um die Fehlpaarung und ihre Polymerase-Aktivität zu entfernern, um die Lücke vor dem Auftreten des Gegennicks zu füllen. Nucleotide werden aus dem ersten Nick gelöscht, der sich 3' zur Fehlpaarung an einem Strang befindet und 5' von der Fehlpaarung am ersten stabilen Basenpaar stoppt. Die Polymeraseaktivität schreitet in 5'-zu-3'-Richtung in Richtung des anfänglichen Nicks voran, der durch DNA-Ligase versiegelt wird. Als Ergebnis erstrecken sich sehr kurze Reparaturspuren von 3 bis 4 Nucleotiden über die Stelle der früheren Fehlpaarung. Die Veröffentlichung endet mit einer Diskussion über die verschiedenen Aktivitäten, die Endonuclease VII innerhalb von Phage T4 aufweisen kann. Jedoch offenbart die Veröffentlichung keinen praktischen Nutzen von Endonuclease VII außerhalb von Phage T4, und es gibt keine Offenbarung hinsichtlich der Anwendbarkeit in DNA-Neuordnung.
  • Verfahren zur Schaffung von Bibliotheken von chimären DNA-Sequenzen in vivo in Escherichia coli sind in Nucleic Acids Research, Band 27, Nr. 18, e18 (1999), A. A. Volkov, Z. Shao und F. H. Arnold, J. P. Abostado et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(18), 5792-5796 (1984); B. P. Cami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(2), 503-507 (1984), S. D. Chang et al., Gene 29(3), 255-261 (1984), offenbart. Die Verfahren verwenden Heteroduplexe, die in vitro gebildet werden, um E. coli zu transformieren, wo die Reparatur von Regionen von Nicht-Identität in Heteroduplex eine Bibliotek von neuen, rekombinierten Sequenzen schafft, die aus Elementen aus jedem Elternteil bestehen. Obwohl die Publikationen die Verwendung dieses Verfahrens als geeignete Hinzufügung zu bestehenden DNA-Rekombinationsverfahren offenbaren, sind die offenbarten Verfahren auf die In-vivo-Umgebung von E. coli beschränkt. A. A. Volkov et al., Methods in Enzymology 328, 456-463, Academic Press, Inc. San Diego (2000), behaupten, dass es mehr als einen Mechanismus gibt, der für Fehlpaarungsreparatur in E. coli verantwortlich ist, und spekulieren, dass der Reparatur mechanismus des ,langen Bereichs', der das MutS/L/H-Enzymsystem verwendet, vermutlich für die Heteroduplexreparatur verantwortlich war.
  • Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele sind bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.
  • BEISPIEL 1
  • Klonierung, Expression und Reinigung von CEL-I-Endonuclease
  • Dieses Beispiel lehrt die Herstellung von Nucleinsäuremolekülen, die zur Expression von CEL-I-Endonuclease aus Pflanzen verwendet wurden, hierin identifiziert als p1177MP4-CEL-I-Avr (Seq.-ID Nr. 1) und p1177MP4-CEL-I-6HIS (Seq.-ID Nr. 2). Insbesondere bezieht sich dieses Beispiel auf Offenbarungen, die in US-Patent Nr. 5.316.931 , 5.589.367 , 5.866.785 und 5.889.190 , hierin durch Verweis aufgenommen, gelehrt wurden.
  • Sellerie-RNA-Extraktion:
  • Sellerie wurde auf einem lokalen Markt gekauft. Kleine Mengen von Selleriegewebe (0.5 bis 0,75 Gramm) wurden geschnitten, in flüssigem Stickstoff gefroren und mit Mörser und Stößel in Gegenwart von zerkleinertem Glas gemahlen. Nach Hinzufügung von 400 Mikroliter Trizol und weiterem Mahlen wurden 700 Mikroliter des Extrakts entfernt und 5 Minuten lang auf Eis belassen. Zweihundert Mikroliter Chloroform wurden dann hinzugefügt und die Proben zentrifugiert, bei Raumtemperatur drei Minuten lang stehen gelassen und bei 15.000 g 10 Minuten lang erneut zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde in ein neues Röhrchen entfernt und ein gleiches Volumen von Isopropanol hinzugefügt. Die Röhrchen wurden umgedreht, um sich zu mischen, und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen gelassen, gefolgt von 10-minütiger Zentrifugation bei 15.000 g bei 4 °C. Das Pellet wurde zweimal in 400 Mikroliter 70 % Ethanol, einmal in 100 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 40 Mikroliter destilliertem Wasser resuspendiert. Ein Mikroliter von RNasin wurde hinzugefügt, und 3,5 Mikroliter wurden auf einem 1 % Agarose-Gel laufen gelassen, um die Qualität von RNA-prep zu überprüfen (Gel-Bild). Der Rest wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 °C aufbewahrt.
  • Cel-I-Genklonierung und Expression durch einen Virusvektor:
  • Die gesamte RNA von Sellerie wurde einer Umkehrtranskription unterworfen, gefolgt von PCR, um die cDNA, die für die Cel-I-Gensequenz kodiert, zu amplifizieren. In separaten Reaktionen wurden elf Mikroliter des gesamten Sellerie-RNA-prep mit einem Mikroliter (50 Picomol) von entweder Cel-I-Avr-R, Cel-I-6H-R oder mit zwei Mikroliter von Oligo-dT-Primer gemischt. CeI-I-Avr-R wurde verwendet, um cDNA zu primen und die native Cel-I-Sequenz am 3'-Ende des Gens zu amplifizieren, während Cel-I-6H-R verwendet wurde, um eine Sequenz hinzuzufügen, die für ein Linkerpeptid und eine 6-His-Markierung am 3'-Terminus des Cel-I-Gens kodiert. Die Proben wurden eine Minute lang auf 70 °C aufgeheizt und vor der Hinzufügung von 4 Mikroliter 5 X Superscript II Puffer, zwei Mikroliter 0,1 M DTT, 1 Mikroliter 10 mM jedes dNTPs und 1 Mikroliter Superscript II (Gibco/BRL) zu jeder Reaktion auf Eis rasch abgekühlt. Die Reaktionen wurden bei 42 °C eine Stunde lang inkubiert.
  • PCR-Amplifikation der Cel-I-cDNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Verfahrens von W. M. Barnes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(6), 2216-20 (15. März 1994)) mit einem Taq-Pfu-Gemisch oder mit Pfu alleine durchgeführt. Die RT-Reaktion, die mit Cel-I-Avr-R geprimt wurde, wurde als Matrize für eine PCR unter Verwendung der Primer Cel-I-Pac-F (als Vorwärtsprimer) gepaart mit Cel-I-Avr-R (als Rückwärtsprimer) verwendet. In anderen PCRs wurde die RT-Reaktion, die mit Oligo-dT geprimt wurde, als Matrize für beide der obigen Primerpaare verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden in 100 Mikroliter mit 30 Annealing-Zyklen bei 50 °C und zwei Minuten Extension bei 72 °C durchgeführt. Aliquoten der resultierenden Reaktionen wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Reaktionen, in welchen Pfu als einzige Polymerase verwendet wurde, zeigten kein Produkt. Alle Reaktionen, die mit den Taq/Pfu-Gemischen durchgeführt wurden, erbrachten ein Produkt der erwarteten Größe. Jedoch ergaben jene, die von cDNA amplifiziert wurden, die mit Cel-I-spezifischen Primerpaaren geprimt wurden, mehr Produkt als Reaktionen, die aus cDNA amplifiziert wurden, die mit Oligo-dT geprimt wurde. DNAs aus den PCR-Reaktionen, welche die meisten Produkte erhalten, wurden unter Verwendung eines Zymoclean-DNA-Zentrifugationssäulensets gereinigt und mit Pacl und AvrII verdaut, gel-isoliert und in Pac-I und Avr-II-verdautes Plasmid pRT130, einen tobamovirusbasierten GENEWARE®-Vektor, ligiert. 2 Mikroliter jeder Ligation wurden in DH5α-kompetentes E. coli transformiert und über Nacht auf LB-amp-Agarplatten kultiviert. Kolonien wurden geerntet und über Nacht in flüssiger Kultur gezüchtet, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung eines Qiagen-Plasmid-prep-Sets isoliert. 12 Klone jedes Konstrukts wurden durch Verdau mit Pacl und AvrII gescreent, und 11 von 12 jedes Sets waren für das Insert der korrekten Größe positiv. Zehn der Klone für jedes Konstrukt wurden in vitro transkribiert, und RNA wurde auf N.-benthamiana-Pflanzen inokuliert. Zusätzlich dazu wurden die CEL-I-Geninserts in beiden Reihen von zehn Klonen Sequenzanalyse unterworfen. Mehrere Klone, die Inserts enthielten, die für die native Form von CEL I kodierten, zeigten Sequenzidentität mit der in WO 01/62974 A1 veröffentlichten Cel-I-Sequenz. Ein Klon, der ein Insert enthielt, das für CEL I kodiert, fusioniert an eine 6-Histidin-Sequenz, war mit der veröffentlichten Cel-I-Sequenz identisch. Ein Klon von jedem (pRT130-CEL-I-Avr-B3 bzw. PRT130-CEL-I-6His-A9) wurde für weitere Arbeit ausgewählt. Die für CEL I kodierenden Sequenzen in diesen Klonen wurden in der Folge auf einen anderen GENEWARE®-Vektor transferiert. Die Sequenzen dieser Klone, p1177MP4-CEL-I-Avr-B3 und p1177MP-4-CEL-I-6His-A9, werden als Seq-ID Nr. 1 bzw. Seq-ID Nr. 2 bereitgestellt.
  • Test von Aktivitäten von kloniertem CEL I:
  • Zur Bestimmung, ob die GENEWARE®-Konstrukte, die Cel-I-Sequenzen enthielten, aktives CEL-I-Enzym produzierten, wurden Proben von pRT30-CEL-I-Avr und pRT130-CEL-I-6his und mit GFP-GENEWARE-kontrollinfizierte Plasmide geerntet und in einem kleinen Mörser und Stößel in Tris-HCl bei pH 8,0 homogenisiert. Extrakte wurden gereinigt und auf Nicking-Aktivität von supergeknäuelter DNA getestet. Jeder Nicking-Test supergeknäuelter DNA wurde in einer Reaktion durchgeführt, die 0,5 Mikrogramm eines supergeknäuelten Plasmid-prep eines pUC19-Derivats in 1 X NEB-Ligasepuffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern durchgeführt. Die Mengen von Pflanzenextrakt, die zu Reaktionen hinzugegeben wurden, waren 0,1 Mikroliter, 0,01 Mikroliter oder 0,001 Mikroliter, wurden 30 Minuten lang bei 42 °C inkubiert und auf einem 1 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde in dem GFP-GENEWARE-kontrollinfizierten Pflanzenextrakt detektiert, während Extrakte aus Pflanzen, die mit den CEL-I-GENEWARE-Konstrukten infiziert wurden, wertvolle Ausmaße an Aktivität gegen das Plasmid-DNA-Substrat zeigten.
  • Zusätzliche Aktivitätstests wurden auf Extrakten von Pflanzen durchgeführt, die mit pRT130-CEL-I-Avr-B3 und pRT130-CEL-I-6His-A9 inokuliert wurden. In diesen Tests wurde intrazelluläres Fluid aus infizierten Blättern gewaschen und separat vom Material, das mit den übrigen gewaschenen Blattgeweben erhalten wurde, getestet. Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Inkubation bei 37 °C eine Stunde lang durchgeführt wurde. Proben wurden auf einem 1 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen und fotografiert.
  • Reinigung von 6-His-markiertem CEL I aus infizierten N.-benthamiana-Pflanzen:
  • N.-benthamiana-Pflanzen wurden mit RNA-Transkripten aus pRT130-CEL-I-6His-A9 20-21 Tage nach Aussaat inokuliert. Gewebe wurden aus 96 infizierten Pflanzen 10 Tage nach Inokulation geerntet und intrazellulären Fluidwaschungen unterworfen. Kurz gesagt wurde infiziertes Blatt- und Stammmaterial 30 Sekunden lang zweimal mit gekühltem Infiltrationspuffer vakuuminfiltriert (50 mM Phosphat, pH 4, in Gegenwart von 7 mM β-ME). Infiltrierte Gewebe wurden geblottet, um überschüssigen Puffer zu adsorbieren, und sekretierte Proteine wurden durch Zentrifugation bei 2500 × g 20 min lang unter Verwendung eines Korbrotors (Beckman) gewonnen. PMSF wurde zu dem extrahierten intrazellulären Fluid (IF), das rekombinantes CEL I enthielt, bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben und bei 25 °C 15 min lang unter Rühren inkubiert. Nach Hinzufügung von Imidazol (pH 6,0) und NaCl zum Extrakt auf die Endkonzentration von 5 mM bzw. 0,5 M wurde IF auf pH 5,2 angepasst und durch 1,2-μ-Sartorius-GF-Membran (Whatman) filtriert, um das meiste der Rubisco- und grünen Pigmente zu entfernen. Sofort nach Reinigung wurde der pH unter Verwendung von konzentrierter NaOH-Lösung auf 7,0 angepasst und auf Eis 20 min lang inkubiert, um nicht-proteinhältigem Material zu ermöglichen, zu präzipitieren. IF wurde unter Verwendung von 0,8-μ- oder 0,6510,45-μ-Sartorius-GF (Whatman) weiter gereinigt. Rekombinantes CEL I wurde aus dem gereinigten IF durch Metallchelatierungs-Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni2+-Fast-Flow-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, New Jersey), das mit Bindungspuffer (50 mM Phosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0), der 5 mM Imidazol enthielt, äquilibiert worden war, mit einer linearen Geschwindigkeit von 300 cm/h gereinigt. Ungebundenes Protein wurde mit 20 mM Imidazol/Bindungspuffer gewaschen, und CEL I wurde aus Ni2+-Sepharose mit einem linearen Gradienten von 20 bis 400 M Imidazol im Bindungspuffer eluiert. Fraktionen, die immer noch Imidazol enthielten, wurden wie oben beschrieben auf die Nicking-Aktivität von supergeknäuelter DNA getestet, aber es wurde festgestellt, dass diese vernachlässigbare Aktivität aufweisen. Dieselben Fraktionen wurden dann gegen 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, in Gegenwart von ZnCl2 unter Verwendung von 10-kD-Molekulargewicht-Cutoff-Dialyseschlauch (Pierce) dialysiert und wieder getestet. Die Nicking-Aktivität supergeknäuelter DNA wurde nach dieser Dialyse wiederhergestellt.
  • IF und gereinigtes CEL-I-Protein wurden unter Verwendung von vorgegossenem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE-)Tris-Glycin-Gels (Invitrogen, Carlsbad, CA) im Puffersystem von Laemmli mit einem XceII-II-Mini-Cell-Gerät (Invitrogen, Carlsbad, CA) analysiert. Die Proteinbanden wurden durch Coomassie-Brilliantblau und durch Silberfärbung sichtbar gemacht. SDS-PAGE-Gels wurden gescannt und unter Verwendung von Bio-Rad-Gelbildgeber analysiert.
  • Massenspektrometrie von gereinigtem CEL I:
  • Die durchschnittliche Molekularmasse von gereinigtem CEL I wurde durch matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmt. Eine Aliquote von CEL I wurde 1:10 mit 50 % Aetonitril/Wasser verdünnt und mit Sinapinsäurematrix (1:1 (Vol./Vol.)) unter Verwendung eines PE-Biosystem-DE- Pro-Massenspektrometers gemischt. Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 25 kV und im positiv-linearen Ionenmodus durchgeführt.
  • Massenspektrometrie von Peptiden, die aus gereinigtem CEL I isoliert werden:
  • CEL I wurde auf SDS-PAGE auf einem 14 % Gel getrennt und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Eine einzelne homogene Bande war sichtbar. Diese Bande wurde herausgeschnitten und vollständig entfärbt. Protein wurde in Gegenwart von 10 mM DTT in 50 % Acetonitril 30 min lang bei 37 °C reduziert, und reduzierte Sulfhydro-Gruppen wurden in Gegenwart von 28 mM Iodacetamid in 50 % Acetonitril 30 min lang bei 24 °C in Abwesenheit von Licht blockiert. Gelstücke wurden mit 50 % Acetonitril gewaschen, und nach Teildehydrierung wurde die herausgeschnittene CEl-I-Bande in einer Lösung von Trypsin hoher Reinheit (Promega) aufgeweicht. Der proteolytische Verdau wurde bei 37 °C 16 h lang fortgesetzt. Die resultierenden Peptide wurden aus Gelstücken mit einem 50 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) eluiert und in einem SpeedVac konzentriert. Die Peptide wurden durch MALDI-TOF analysiert. Gemischte tryptische Verdaue wurden in einer Matrix von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure kristallisiert und unter Verwendung eines PerSeptive-Biosystem-DE-STR-MALDI-TOF-Massenspektrometers, das mit verzögerter Extraktion ausgerüstet ist, betrieben in einem reflektorpositiven Ionenmodus und bei Beschleunigungsspannung von 20 kV, analysiert. Erwartete theoretische Massen wurden durch MS-Verdau (Protein Prospector) oder GPMAW-Programm (Lighthouse Data, Odense, Dänemark) berechnet. Für Tandem-Massenspektrometrie (Nanoelektrosprayionisierung (ESI)) wurden Peptidproben mit 5 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure verdünnt und LC-MS/MS unterworfen und auf einem orthogonalen Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometerinstrument (Micromass, Inc., Manchester, UK) analysiert. Die Daten wurden durch Mslynx verarbeitet, und die Datenbank wurde durch Sonar durchsucht.
  • Viral exprimiertes rekombinantes CEL I wurde in das IF sekretiert. Gereinigtes IF-extrahiertes Material wurde dazu verwendet, die His-Markierungs-CEL-I-Aktivität zu reinigen. CEL I wurde unter Verwendung Einschritt-Ni2+-Affinitätschromatographietrennung gereinigt. Eine höchst geeignete homogene einzelne Proteinbande wurde, wie durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE und Massenspektrometrie bestimmt, gereinigt. Die Größe der reifen Proteine und die prozentuelle Glykosylierung stimmen damit überein, was für das CEL-I-Protein berichtet worden ist, das aus Sellerie isoliert wurde [Yan et al. (2000)]. Das gereinigte CEL I hat eine durchschnittliche Molekularmasse von 40 kD, wie durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestimmt, zeigt 23,5 Masse-% Glykosylierung. CEL I weist vier potenzielle Glykosylierungsstellen an Aminosäurepositionen 58, 116, 134 und 208 auf. Eine monoisotope Masse von 2152,6086 (2152,0068 theoretisch) Da, die der Masse des Peptids 107-125 (K) DMCVAGAIQNFTSQLGHFR (H) (Seq.-ID Nr. 35) entspricht, die durch MALDI-TOF gewonnen wurde, zeigt, dass Asparagin 116 nicht glykosyliert ist. Gemeinsam zeigen diese Gelanalyse- und Massenspektrometriedaten, dass eine signfikante Fraktion des CEL-I-Proteins gewinnbar war und dass das Protein in der N.-benthamiana-Pflanze korrekt verarbeitet wurde.
  • Für nachfolgende Versuche wurde das 6-His-markierte CEL-I-Enzym unter Verwendung von p1177MP4-CEL-I-6His-A9 produziert. Dieser Klon wurde transkribiert und auf N.-benthamiana-Pflanzen inokuliert, die 8 Tage nach Infektion geerntet wurden. Das Pflanzenmaterial wurde mit 2 Volumina Extraktionspuffer (500 mM NaCl, 100 mM NaPi, 25 mM Tris, pH 8,0, 7 mM Beta-mercaptoethanol, 2 mM PMSF) kombiniert und vakuuminfiltriert. Nach der Pufferinfiltration wurde das Gewebe in einem Entsafter aufgeweicht, der resultierende grüne Saft auf 4 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol angepasst und bei 4 °C eine Stunde lang stehen gelassen. Der grüne Saft wurde entweder durch 20-minütige Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (3500 × g) gereinigt oder mit Perlit (2 % (Gew./Vol.)) kombiniert und durch einen 1,2-μm-Filter filtriert. Das markierte CEL I kann selektiv aus dem gereinigten grünen Saft durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt werden. Der grüne Saft wurde entweder mit Nickel-NTA-Harz kombiniert, und Chargen-Bindung von CEL I wurde durchgeführt, oder Reinigung wurde in Säulenformat durchgeführt, wo der grüne Saft durch ein Bett von Nickel-NTA-Harz fließen konnte. Zur Bindung wurde der gereinigte grüne Saft auf 10 % (Gew./Vol.) Glycerin und 10 mM Imidazol angepasst. Nach der Bin dung wird das Harz umfassend mit Waschpuffer (330 mM NaCl, 100 mM NaPi, pH 8,0, 10 mM Imidazol) gewaschen und das gebundene CEL-I-Enzym aus dem Nickel-NTA-Harz in 2 Harzbettvolumina von 1 X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eluiert, die 400 mM Imidazol enthielt. Die CEL-I-Formulierung wurde in der Folge gegen 1 X PBS dialysiert, um das Imidazol zu entfernen, auf Aktivität getestet und bei 4 °C oder bei -20 °C mit oder ohne Glycerin bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • BEISPIEL 2
  • Spaltung von fehlgepaartem DNA-Substrat durch CEL-I
  • Dieses Beispiel lehrt die Herstellung von CEL-I-Enzym und seine Verwendung in der Spaltung von fehlgepaartem DNA-Substrat.
  • CEL-I-Enzym wurde aus Selleriestangen unter Verwendung von Homogenisierung, Ammoniumsulfat und Concanavalin-A-Sepharose-Protokoll, das von Yang et al. beschrieben (Biochemistry 39, 3533-3541 (2000)), hierin durch Verweis aufgenommen, wurde, hergestellt. Eine 1,5-kg-Probe von gekühlten Selleriestangen wurde mit einem Entsafter homogenisiert. Ein Liter des Safts wurde gewonnen, auf 100 mM Tris-HCl, pH 7,7, mit 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) angepasst und durch zwei Schichten Miracloth filtriert. Festes (NH4)2SO4 wurde langsam bis zu 25 % Sättigung hinzugegeben, während auf Eis gerührt wurde. Nach 30 Minuten wurde die Suspension bei 27.000 g 1,5 Stunden lang bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen und mit festem (NH4)2SO4 auf 80 % Sättigung angepasst, während auf Eis gerührt wurde, gefolgt durch Zentrifugation bei 27.000 g 2 Stunden lang. Die Pellets wurden in Puffer B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,7, 0,5 M KCl, 100 μM PMSF) resuspendiert und gegen denselben Puffer dialysiert.
  • Conconavalin-A-(ConA-)Sepharoseaffinitätschromatographie wurde durch ein erstes Inkubieren der dialysierten Probe mit 2 ml von ConA-Harz über Nacht unter sanftem Rühren durchgeführt. Das ConA-Harz wurde dann in eine Säule mit 0,5 cm Durchmesser gepackt und mit mehreren Säulenvolumina von Puffer B gewaschen.
  • Elution wurde unter Verwendung von 0,3 M Alpha-Methylmannosid in Puffer B durchgeführt. Fraktionen wurden in 1-ml-Aliquoten gewonnen. Fraktionen wurden auf Fehlpaarungsspaltungsaktivität auf einem radiomarkierten Fehlpaarungssubstrat getestet, indem 0,1 Mikroliter jeder Fraktion mit der fehlgepaarten Sonde in Puffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2) 30 Minuten lang bei 45 °C wie von Oleykowski et al., Nucleic Acids Research 26, 4597-4602 (1998), beschrieben, hierin durch Verweis aufgenommen, inkubiert wurden. Reaktionsprodukte wurden durch Trennung auf 10 % TBE-PAGE-Gels, die 7% Harnstoff enthielten (Invitrogen), sichtbar gemacht, gefolgt von Autoradiographie. Aliquoten der CEL-I-Fraktionen, die über Fehlpaarungsspaltungsaktivität verfügten, wurden gefroren bei -20 °C aufbewahrt. Eine Reihe von Fünffach-Verdünnungen von CEL-I-Fraktion Nr. 5 wurde dann auf Fehlpaarungsspaltung von radiomarkiertem Fehlpaarungssubstrat analysiert. Reaktionen wurden entweder in Puffer D, T4-DNA-Ligasepuffer von New England BioLabs (NEB) (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM ATP, 25 Mikrogramm/ml BSA) oder T4-DNA-Ligasepuffer von Gibco/BRL (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 5 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol-8000) durchgeführt. Reaktionsprodukte wurden wie oben angegeben sichtbar gemacht. Von Spaltungsaktivität in Puffer D und in NEB-T4-DNA-Ligasepuffer wurde festgestellt, dass diese im Wesentlichen äquivalent sind, während Spaltung in dem PGE-enthaltendem Gibco/BRL-Ligasepuffer im Vergleich zu den anderen Puffern um das Fünf- bis Zehnfache verstärkt war.
  • Zusätzliche Analyse von CEL-I-Aktivität wurde unter Verwendung von definierten Heteroduplex-DNAs aus zwei verschiedenen Genen von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Subtrat durchgeführt. Dieses GFP-Heteroduplex-Substrat wurde durch Annealing einzelsträngiger DNAs, die dem Zyklus-3-GFP (Seq.-ID Nr. 30) entsprechen, auf dem Sense-Strang und Wildtyp-GFP (Seq.-ID Nr. 29) auf dem Antisense-Strang hergestellt. Die einzelsträngigen DNAs waren durch asymmetrische PCR synthetisiert und durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert worden. Nach Annealing durch Erhitzen auf 90 °C und Abkühlen auf Raumtemperatur in Gegenwart von 1 X NEB-Restriktionsenzympuffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit) wurde die Heteroduplex-DNA durch Agarose-Gelelektrophorese iso liert, gefolgt vom Herausschneiden der Heteroduplex-Bande und Extraktion unter Verwendung von Qiaquick-DNA-Zentrifugationssäulen. Eine Gesamtheit von achtundzwanzig Fehlpaarungen, ein oder zwei Nucleotide lang, treten auf der gesamten Länge des Heteroduplex-Moleküls auf. Die Verteilung der Fehlpaarungen reicht von kleinen Clustern von mehreren Fehlpaarungen, die durch eine oder zwei Nucleotide getrennt sind, bis zu Fehlpaarungen, die durch mehr als dreißig Basenpaare getrennt sind, auf jeder Seite.
  • Eine Reihe von Dreifach-Verdünnungen von CEL I in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer wurden hergestellt, und 1-Mikroliter-Aliquoten von jeder wurden in zwei separaten Reihen von 10-Mikroliter-Reaktionen inkubiert, wobei jede als Substrat entweder 0,5 Mikrogramm einer supergeknäuelten Plasmidformulierung oder einhundert Nanogramm des Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex enthielt. Alle Reaktionen fanden in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer statt. Reaktionen wurden bei 45 °C 30 Minuten lang inkubiert und auf 1,5 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen.
  • Behandlung von supergeknäuelter Plasmid-Formulierung mit zunehmenden Mengen von CEL I führte zur Umkehr von supergeknäuelter DNA zu genickten, zirkulären, dann linearen Molekülen und dann zu kleineren Fragmenten von DNA willkürlicher Größe. Behandlung von fehlgepaartem GFP-Substrat mit der CEL-I-Formulierung führte zu Verdau von Heteroduplex voller Länge in Leiter-DNA-Banden, die wahrscheinlich Spaltung auf entgegengesetzten DNA-Strängen in der Nachbarschaft von Clustern von Fehlpaarungen repräsentieren. Weiterer Verdau führte zur Umsetzung des fehlgepaarten GFP-Substrats zu kleineren DNAs, die einen Grenzverdau von Heteroduplex-DNA durch die CEL-I-Formulierung zeigten.
  • BEISPIEL 3
  • Verwendung von kloniertem CEL I in der GRAMMR-Reaktion
  • Dieses Beispiel zeigt, dass CEL I aus einer klonierten Quelle anstelle von nativem CEL-I-Enzym, das aus Sellerie gereinigt wurde, in genetischer Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung ohne jegliche merkliche Veränderung in Ergebnissen verwendet werden kann.
  • Die cDNA von Cel I wurde aus Sellerie-RNA kloniert. Das Gen wurde in einen TMV-Virusvektor insertiert und exprimiert. Transkripte des Konstrukts wurden dazu verwendet, Nicotiana-benthamiana-Pflanzen zu infizieren. Infiziertes Gewebe wurde geerntet und das CEL-I-Enzym gereinigt. Die Ergebnisse der GRAMMR-Reaktion, die unter Verwendung des gereinigten Enzyms erhalten wurden, wurden mit jenen verglichen, die CEL I verwendeten, das aus Sellerie gereinigt wurde, und es wurde festgestellt, dass sie ähnlich sind.
  • Reaktionen wurden unter Verwendung von einundzwanzig Nanogramm des zirkulären doppelsträngigen heteroduplexierten GFP-Plasmidsubstrats durchgeführt, wie in BEISPIEL 3 beschrieben, in zehn Mikroliter, enthaltend 1 X NEB-Ligasepuffer, 0,5 mM pro dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), 1 Einheit von T4-DNA-Polymerase, und entweder 1,0 Mikroliter von CEL-I, aus Sellerie gereinigt (Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben), oder 0,3 Mikroliter von CEL I, aus einer klonierten Quelle gereinigt. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in kompetentes DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse, gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen untersucht. Die RFLP-Ergebnsise zeigten, dass Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, sowohl in von Sellerie abstammendem CEL I als auch in Reaktionen, die kloniertes CEL I enthielten, aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese Ergebnisse. Deshalb zeigten die Daten, dass CEL I aus einer klonierten Quelle anstelle von CEL I aus Sellerie für GRAMMR verwendet werden kann. Zusätzlich dazu zeigten die Daten, dass es die CEL-I-Aktivität ist, die Teil der GRAMMR-Reaktion ist, anstelle einer zufälligen Wirkung, die aus den Reinigungsschritten resultiert, die in der Extraktion von CEL I aus Sellerie verwendet worden sind.
  • BEISPIEL 4
  • Klonierung, Expression und Verwendung von RES-I-Endonuclease
  • Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus Selaginella lepidophylla, die Identifikation einer Nucleinsäuresequenz aus der Bibliothek, die für eine Endonuclease kodiert, und die Expression der neuen Endonuclease, hierin „RES 1" genannt. RNA wurde aus Geweben der Auferstehungspflanze, Selaginella lepidophylla, unter Verwendung des Trizol-Verfahrens extrahiert, und oligo-dT-geprimete cDNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Resultierende cDNAs wurden in einen GENEWARE®-basierten Klonierungsvektor ligiert, und die Ligationsprodukte wurden in kompetente E.-coli-Zellen transformiert. Bakterielle Kolonien, die GENEWARE®-cDNA-Klone enthielten, wurden willkürlich geerntet und als flüssige Kulturen vor DNA-Prepping und Bestimmung der klonierten cDNA-Sequenzen gezüchtet. Die Sequenzdaten für die klonierten Selaginella-cDNAs wurden in eine Datenbank geladen, die dann mittels BLAST-Analyse auf Sequenzen untersucht wurde, die Ähnlichkeit mit der DNA-Sequenz von Cel-I-Gen aufweisen. BLAST-Analyse wurde auch auf anderen DNA-Sequenzdatenbanken durchgeführt, die Sequenzen von cDNAS enthielten, die von einer anderen Spezies erhalten wurden.
  • BLAST-Ergebnisse, die ein gewisses Ausmaß an Homologie zur Sellerie-CEL-I-Sequenz zeigten, wurden in Bibliotheken aus mehreren Spezies identifiziert, und die entsprechenden GENEWARE®-cDNA-Klone wurden in eine einzige Reihe von GENEWARE®-cDNA-Klonen neu angeordnet. Diese Reihe von cDNA-Klonen wurde dann in vitro transkribiert, um infektiöse GENEWARE®-Transkripte zu erreichen, die dann auf Blättern auf Nicotiana-benthamiana-Pflanzen zur Expressionsanalyse von cDNA-Sequenzen, für die innerhalb des GENEWARE®-Virusgenoms kodiert wurde, inokuliert wurden. Sieben Tage nach Inokulation wurden Blattproben aus den infizierten Pflanzen entnommen und in zwei Volumina Wasser homogenisiert. Die Extrakte wurden dann auf Nicking- und Spaltungsaktivität superspiralisierter DNA getestet.
  • Jeder Nickingtest superspiralisierter DNA wurde in einer Reaktion durchgeführt, die 0,5 Mikrogramm eines superspiralisierten Plasmid-Prep eines pUC19-Derivats in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern enthielt. Die Mengen des Pflanzenextrakts, das zu den Reaktionen hinzugegeben wurde, waren 1 Mikroliter, 0,33 Mikroliter oder 0,011 Mikroliter, inkubiert bei 37 °C 30 Minuten lang und auf einem 1 % TAE-Agarose-Gel in Gegenwart von Gelstar-Fluoreszenz-DNA-Färbungsreagens laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde in nicht-infizierten Pflanzenextrakten detektiert, während nur Extrakte aus Pflanzen, die mit GENEWARE®-Konstrukten infiziert waren, die cDNAs für ein einziges Gen aus Selaginella lepidophylla enthielten, wertvolle Ausmaße an Aktivität gegen das Plasmid-DNA-Substrat zeigten.
  • Die vollständigen Gensequenzen dieser Klone wurden bestimmt, und es wurden PCR-Primer entworfen, um das offene Lesegerüst minus beliebiger nicht-kodierender 5'- und 3'-Sequenzen zu amplifizieren und um einen Sechs-Histidin-Schwanz zum C-Terminus des kodierten Proteins hinzuzufügen. Die Primer wurden dann zur Amplifikation des ORFs aus einem der aktiven Selaginella-Klone voller Länge verwendet. Das resultierende PCR-Produkt wurde dann in den GENEWARE®-Vektor pDN4 zwischen den Pacl- und AvrII-Stellen zur Expression in planta kloniert. Der resultierende Klon, pLSB2225, der das ResI-ORF (Seq.-ID Nr. 16) enthielt und für das Res-I-Protein (Seq.-ID Nr. 34) kodierte, wurde sequenziert, um nachzuweisen, dass das Gen korrekt insertiert worden war, und dann in vitro transkribiert, gefolgt von Inokulation der infektiösen Transkripte auf N.-benthamiana-Pflanzen. Sieben Tage nach Inokulation wurden infizierte Pflanzenextrakte wie oben beschrieben hergestellt und auf Nicking- und Verdauaktivität superspiralisierter DNA getestet, um die Aktivität des klonierten Enzyms nachzuweisen.
  • Jeder Nicking-Test superspiralisierter DNA wurde in einer Reaktion durchgeführt, die 0,5 Mikrogramm eines superspiralisierten Plasmid-Preps eines pUC19-Derivats in 1 X NEB-E.-coli-DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 50 mM KCl in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern enthält. Die Mengen des Pflanzenextrakts, das zu den Re aktionen hizugegeben wurden, waren 0,2 Mikroliter, 0,04 Mikroliter, 0,008 Mikroliter oder 0,0016 Mikroliter, inkubiert bei 37 °C 30 Minuten lang und auf einem 0,8 % TAE-Agarose-Gel in Gegenwart von Gelstar-Fluoreszenz-DNA-Färbungsreagens laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde in nicht-infizierten Pflanzenextrakten detektiert, während Extrakte aus Pflanzen, die mit GENEWARE®-Selaginella-Konstrukt pLSB2225 infiziert waren, wertvolle Ausmaße an Aktivität gegen das Plasmid-DNA-Substrat zeigten.
  • Nachdem in diesem Test positive Ergebnisse erhalten worden waren, wurden die Extrakte von pLSB2225-infizierten Pflanzen in einer GRAMMR-Reaktion verwendet, um die Fähigkeit dieses Enzyms zu testen, als Komponente der Fehlpaarungsauflösungsreaktion anstelle des GENEWARE®-produzierten CEL-I-Enzyms zu wirken.
  • BEISPIEL 5
  • Verwendung von RES I in der GRAMMR-Reaktion
  • Dieses Beispiel zeigt, dass RES I anstelle eines nativen CEL-I-Enzyms, das aus Sellerie gereinigt wurde, in genetischer Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung ohne jegliche merkliche Veränderung der Ergebnisse verwendet werden kann.
  • GRAMMR wurde zwischen dem Wildtyp-Aequorea-victoria-GFP-Gen (Prasher et al., Gene 111 (92) 229) in einem pBS-Derivat (Strategene, La Jolla, CA) durchgeführt, für welches pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und eine Variante mit Mutationen kodierte, um Fluoreszenzintensität in E. coli zu verstärken und die Emissionswellenlänge auf Blaulicht-Emission zu ändern [Crameri et al., Nat. Biotechnol. 16 (96) 315; Heim et al., PNAS 91 (94) 12501; Yang et al., J. Biol. Chem. 273 (98) 8212). Dieses Variantengen (Seq.-ID Nr. 33), für welches das Plasmid pBSC3BFP kodiert, wie in 5 dargestellt (Seq.-ID Nr. 32), kodiert für ein Fluoreszenzprotein, das helles blaues Licht emittiert, wenn es durch Langwellen-UV-Licht angeregt wird.
  • Die GRAMMR-Reaktionen wurden auf GFP/c3BFP-Heteroduplexen in einem zirkulären, doppelsträngigen Plasmid-DNA-Kontext durchgeführt. Die zirkulären Gesamtplasmid-Heteroduplex-DNA-Substrate wurden durch zuerst Linearisieren von pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und pBSC3BFP (5, Seq.-ID Nr. 32) durch Verdau mit Kpn I und NgoM IV und dann durch Reinigen der verdauten DNA unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen hergestellt. Als Nächstes wurden 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten Plasmide gemischt und in einem Volumen von 20 Mikrolitern auf 1 X SSPE gebracht (180 nM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA bei pH 7,4). Das Gemisch wurde dann bei 95 Grad Celsius 4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht, wo es 10 Minuten lang vor Inkubation bei 37 Grad Celsius blieb. Nach 30 Minuten wurde die anellierte DNA-Probe zurück auf Eis transferiert, wo sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen blieb.
  • Zwei unabhängige Reihen von Neukombinationsreaktionen wurden durchgeführt, um CEL I mit RES I in deren Fähigkeiten zu vergleichen, Sequenz-Neukombination durch GRAMMR zu erleichtern. Jede GRAMMR-Reaktion enthielt eine Einheit von T4-DNA-Polymerase, 2 Einheiten von E.-coli-DNA-Ligase und 5 Nanomol jedes dNTP in 1 X NEB-E.coli-DNA-Ligasepuffer, ergänzt mit KCl auf 50 mM. Zwei separate Enzymverdünnungsreihen wurden durchgeführt. Zu jeder von zwei Reihen von Röhrchen, die Aliquoten des obigen Cocktails enthielten, wurden 1-Mikroliter-Aliquoten von GENEWARE®-exprimierten CEL-I- oder RES-I-Extraktionen in Verdünnung von 1/3, 1/9, 1/27, 1/81 oder 1/243 hinzugefügt. Eine endonucleasefreie Kontrollreaktion wurde ebenfalls vorbereitet. Zu jeder der Reaktionen wurden 1-Mikroliter-Aliquoten, die 20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplexsubstrats enthielten, hinzugefügt und die Reaktionen eine Stunde lang bei Raumtemperatur und 30 Minuten lang auf Eis vor Transformation in kompetentes E. coli inkubiert.
  • Grünfluoreszierendes Protein (GFP) und blaufluoreszierendes Protein (BFP) konnten in den resultierenden Kolonien durch Bestrahlung mit langwelligem UV sichtbar gemacht werden. Das Eltern-Wildtyp-GFP weist schwache Grünfluoreszenz auf, und das Eltern-c3-BFP ergab starke Blaufluoreszenz. In den Genen, die für diese fluoreszierenden Proteine kodieren, befinden sich die Sequezen, die diese Emissions farbe bestimmen, und jene, die Fluoreszenzintensität regeln, an unterschiedlichen Positionen. Es wird erwartet, dass DNA-Neukombination zum „Aufheben der Verbindung" der Sequenzen, welche die Emissionsfarbe bestimmen, von jenen, die Fluoreszenzintensität regeln, führt. Als Folge ist zu erwarten, dass die resultierenden Nachkommen Neuordnung der funktionellen Eigenschaften der Emissionsfarbe und Intensität zeigen. Deshalb konnte ein Maß für das Ausmaß der DNA-Neukombination, die in jeder Reaktion stattgefunden hatte, durch Untersuchung der Farbe und Intensität der Fluoreszenz aus den bakteriellen Kolonien auf den entsprechenden Platten beurteilt werden. In der Null-Nuclease-Kontrolle wurden nur schwach grüne und hellblaue Kolonien beobachtet. Jedoch wurden auf Platten mit Zellen, die mit DNAs aus den Reaktionen transformiert wurden, die entweder CEL I oder RES I enthielten, einige stark grüne sowie einige schwach blaue Kolonien beobachtet, was zeigte, dass eine Neukombination von DNA-Sequenzen stattgefunden hatte. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass dies tatsächlich der Fall war und dass durchschnittlich die Gewinnung von neukombinierten Klonen größer als 85 % für beide CEL I und RES I war und dass die Anzahl und Verteilung der Informationstransferereignisse für beide Enzyme ähnlich war. Jedoch erschien es, dass die Aktivität von RES I in diesem Versuch mehrfach höher war als jene von CEL I, wie durch die geringe Transformationswirksamkeit von Reaktionen, die mit höheren Konzentrationen der RES-I-Formulierung behandelt wurden, angegeben wurde.
  • BEISPIEL 6
  • Konservierung von Volllängen-GFP-Gen mit Fehlpaarungsauflösungscocktails
  • Dieses Beispiel zeigt verschiedene Fehlpaarungsauflösungscocktails, die das Volllängen-GFP-Gen konservieren.
  • Fehlgepaarte GFP-Substrate wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CEL I in Gegenwart von Cocktails von Enzymen behandelt, die gemeinsam ein synthetisches Fehlpaarungsauflösungssystem ausmachen. Die verwendeten Enzyme waren CEL I, T4-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase. CEL-I-Aktivität soll den Heteroduplex 3' zu fehlgepaarten Basen nicken. T4-DNA-Polymerase enthält 3'-5'-Proof-Reading-Aktivität zur Exzision der fehlgepaarten Base aus dem genickten Heteroduplex. T4-DNA-Polymerase und Taq-DNA-Polymerase enthalten DNA-Polymerasen, die in der Lage sind, die Lücke zu füllen. T4-DNA-Ligase versiegelt den Nick im reparierten Molekül. Taq-DNA-Polymerase weist auch 5'-Klappenase-Aktivität auf.
  • Es wurden Matrixversuche durchgeführt, um die Reaktionsbedingungen zu identifizieren, die zur Auflösung von Fehlpaarungen im GFP-Heteroduplexsubstrat dienen. In einem Versuch wurde Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex in einem Matrixformat mit Reihenverdünnungen von CEL-I-Fraktion Nummer fünf (oben beschrieben) in acht verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Jede Reaktion enthielt 100 Nanogramm von Heteroduplexsubstrat und 0,2 Mikroliter von T4-DNA-Ligase (Gibco BRL) in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer und dNTPs bei jeweils 250μM, in einem Reaktionsvolumen von 10 Mikroliter. Insgesamt enthielt die Matrix 96 einzelne Reaktionen. Eine volle Reihe von Reaktionen wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, während eine andere volle Reihe bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert wurde.
  • Nach Inkubation wurde PCR zur Amplifikation des GFP-Gens aus jeder Reaktion verwendet. Aliquoten aus jeder PCR wurden dann mit HindiII und HpaI verdaut und auf 3 % Agarose-Gelen mit Ethidiumbromid einer Elektrophorese unterworfen. Nur Zyklus-3-GFP weist eine HindiII-Stelle auf, und nur Wildtyp kodiert für eine HpaI-Stelle.
  • Wenn DNA-Fehlpaarungsauflösung an einer der fehlgepaarten HindiII- oder HpaI-Stellen auftrat, war zu erwarten, dass ein Anteil des PCR-Produkts beide Stellen enthielt, was eine neue Bande ergab. Die Bande wurde in allen Proben beobachtet, einschließlich den negativen Kontrollproben, die weder CEL I noch T4-DNA-Polymerase aufwiesen noch Taq-DNA-Polymerase. Die Ergebnisse ließen vermuten, dass ein Grundmaß an Hintergrundneukombination an einem bestimmten Punkt im Versuch, anders als in der GRAMMR-Reaktion, auftreten hätte können; möglicherweise im PCR-Schritt. Von PCR-vermittelter Neukombination ist bekannt, dass sie in gewisser Häufigkeit zwischen verwandten Sequenzen während Amplifikation auftritt; Paabo et al., J. Biol. Chem. 265 (90), 4718-4721.
  • In einem anderen Versuch werden 200 Nanogramm von Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex mit CEL I und T4-DNA-Polymerase in verschiedenen Konzentrationen gemeinsam mit 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase in Gegenwart oder Abwesenheit von T4-DNA-Ligase behandelt (0,2 Einheiten, Gibco BRL). Jede Reaktion enthielt 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer mit 0,05 mM jedes dNTP in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern. Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, und 10 Mikroliter wurden auf einem 2 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen. Ergebnisse zeigten, dass in Gegenwart von DNA-Ligase, aber in Abwesenheit von T4-DNA-Polymerase zunehmende Mengen von CEL I größeren Abbau der heteroduplexierten DNA verursachten, aber dass dieser Wirkung durch die Erhöhung der Menge von T4-DNA-Polymerase in der Reaktion entgegengewirkt werden kann. Diese Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Komponenten der vollständigen Reaktion zusammenwirken könnten, um die Integrität des Volllängengens durch DNA-Fehlpaarungsauflösung zu konservieren.
  • Es wurde ein anderer Matrixversuch durchgeführt, um diese Ergebnisse zu erweitern und zusätzliche Bedingungen für DNA-Fehlpaarungsauflösung für dieses synthetische System zu identifizieren. 60 Nanogramm von Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex wurden mit CEL I und T4-DNA-Polymerase in verschiedenen Konzentrationen in Gegenwart von 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase und 0,2 Einheiten von T4-DNA-Ligase in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer, der 0,5 mM jedes dNTP enthielt, in einem Rekationsvolumen von 10 Mikrolitern behandelt. Jede Reihe von Reaktionen wurde 1 Stunde lang bei 20 °C, 30 °C, 37 °C oder 45 °C inkubiert. Alle Reaktionen wurden dann auf 1,5 % TBE-Agarose-Gelen in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen. Die Ergebnisse zeigten, dass der GFP-Heteroduplex durch die CEL-I-Formulierung alleine in diskrete Fragmente gespalten wurde. Der Erfolg von DNA-Fehlpaarungsauflösung wurde anfänglich durch den Grad kalibiert, in welchem die offensichtliche Volllängenintegrität der GFP-Sequenz durch andere Komponenten des Fehlpaarungsauflösungssystems in Gegenwart von CEL I aufrechterhalten wur de. Bedingungen von Enzymkonzentration und Temperatur wurden identifiziert, die einen hohen Anteil der DNA als Volllängenmoleküle in diesem Test konservierten. Nämlich ein Mikroliter der CEL-I-Fraktion-5-Formulierung (in Beispiel 2 beschrieben) mit einem Mikroliter (1 Einheit) von T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der anderen Reaktionskomponenten, die im Versuch konstant gehalten wurden. Es wurde festgestellt, dass, als die Reaktionstemperatur zunahm, die Abbauaktivität von CEL I dementsprechend zunahm. Weiters wurde festgestellt, dass die anderen Komponenten der Reparaturreaktion wirkten, um die Integrität der Volllängen-DNA bei 20 °C, 30 °C, und 37 °C zu konservieren, aber bei der Konservierung der Volllängen-DNA bei 45 °C deutlich weniger wirksam waren. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgerten die Erfinder, dass unter diesen Versuchsbedingungen Inkubation bei 45 °C für das GRAMMR-Verfahren nicht optimal war und dass Inkubation bei 20 °C, 30 °C und 37 °C zulässig war.
  • BEISPIEL 7
  • Wiederherstellung von Restriktionsstellen an GFP-Heteroduplex-DNA nach DNA-Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR)
  • Dieser Versuch zeigt die Funktionsfähigkeit von genetischer Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR), indem die Wiederherstellung von Restriktionstellen gezeigt wird.
  • Die Volllängen-Produkte eines zwanzigfachen Scale-Ups der GRAMMR-Reaktion, bei 37 °C eine Stunde lang durchgeführt, welche die optimalen Bedingungen vewendet (die 1x Reaktion enthielt sechzig Nanogramm von Heteroduplex-DNA, einen Mikroliter von CEL-I-Fraktion fünf (in BEISPIEL 2 beschrieben), eine Einheit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 0,2 Einheiten von T4-DNA-Ligase in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer, der 0,5 mM jedes dNTP in einem Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern enthielt) wurden gel-isoliert und Restriktionsanalyse durch Endonucleasen unterworfen, deren Erkennungsstellen sich mit Fehlpaarungen im GFP-Heteroduplex überlagern, wodurch diese Stellen in der DNA gegenüber Restriktionsenzymspaltung resistent gemacht werden. Die verwendeten Enzyme waren BamHI, HindIII, HpaI und XhoI. Negative Kontrollen bestanden aus unbehandeltem GFP-Heteroduplex. Positive Kontrollen bestanden einzeln aus Zyklus-3- oder Wildtyp-GFP-Sequenzen. Alle Kontrollen wurden mit denselben Enzymen verdaut wie das Produkt der DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion. Alle Proben wurden auf einem 2 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen.
  • Nach Behandlung mit dem Fehlpaarungsauflösungscocktail erhielt ein DNA-Abschnitt Empfindlichkeit auf BamHI- und XhoI-Restriktionsendonucleasen, was zeigte, dass DNA-Fehlpaarungsauflösung aufgetreten war. Die HapI-geschnittenen Proben konnten nicht interpretiert werden, da ein geringes Ausmaß an Spaltung in der negativen Kontrolle auftrat. Die HindII-, BamHI- und XhoI-Stellen zeigten verschiedene Grade an Spaltung in den GRAMMR-behandelten Proben. Die Wiederherstellung der XhoI-Stelle war umfassender als jene der BamHI-Stelle, die hingegen umfassender war als die Wiederherstellung an der HindIII-Stelle.
  • Das Ausmaß, in welchem Spaltung auftritt, zeigt das Ausmaß an, in welchem Fehlpaarungen in der DNA an jener Stelle aufgelöst worden waren. Unterschiede in der Fehlpaarungsauflösungswirksamkeit können mit dem Wesen oder der Dichte von Fehlpaarungen in Zusammenhang stehen, die an diesen Stellen gegenwärtig sind. Zum Beispiel erstreckt sich die XhoI-Stelle über einen Drei-Fehlpaarungscluster, während die BamHI-Stelle sich über zwei Fehlpaarungen erstreckt und die HindIII-Stelle sich über eine einzige Fehlpaarung erstreckt.
  • BEISPIEL 8
  • GRAMMR-behandelte GFP-Gene
  • Dieses Beispel zeigt, dass GRAMMR Sequenzvariation zwischen zwei Gensequenzen in einem Heteroduplex neu anordnet und dass es keine signifikanten Unterschiede in GRAMMR-Produkten gibt, die direkt kloniert wurden oder vor Klonierung PCR-amplifiziert wurden.
  • Die GRAMMR-behandelten DNA-Moleküle aus BEISPIEL 7 wurden in der Folge entweder direkt durch Ligation in pCR-Blunt-II-TOPO (Invitrogen) kloniert oder durch PCR amplifiziert und in pCR-Blunt-II-TOPO gemäß den Anweisungen des Herstellers ligiert, gefolgt von Transformation in E. coli. Nach dem Ernten individueller Kolonien und Züchtung in flüssiger Kultur wurde DNA hergestellt, und die Sequenzen des GFP-Inserts wurden bestimmt. Als negative Kontrollen wurde das unbehandelte GFP-Heteroduplexsubstrat entweder direkt kloniert oder vor Klonierung in das Plasmid PCR-amplifiziert.
  • In GRAMMR resultiert Neuordnung von Sequenzinformation aus einem Verfahren des Informationstransfers von einem Strang auf den anderen. Diese Stellen des Informationstransfers sind analog zu Crossover-Ereignissen, die in rekombinationsbasierten DNA-Neukombinationsverfahren auftreten. Um die Ergebnisse dieser Neuordnungsversuche zueinander in Beziehung zu setzen, sind die entstehenden GRAMMR-Sequenzen hinsichtlich Crossover beschrieben. Sequenzen von zwanzig Volllängen-GFP-Klonen, die von GRAMMR-behandelten GFP-Genen stammten, wurden analysiert. Vier dieser Klone stammten von DNA, die direkt in pZeroBlunt (Invitrogen) nach GRAMMR-Reaktion kloniert wurden (keine PCR-Amplifikation). Die anderen sechzehn Sequenzen wurden nach PCR-Amplifikation kloniert. Analyse dieser Volllängen-GFP-Sequenzen zeigte, dass alle zwanzig Sequenzen Sequenzneuordnung mit zwischen ein und zehn Crossover pro Gen durchmacht haben. Eine Gesamtheit von 99 Crossover wurde in dieser Reihe von Genen festgestellt, was einen Durchschnitt von etwa 5 Crossover pro Gen ergab. Mit dem Abstand zwischen der ersten und den letzten Fehlpaarungen von etwa 590 Nucleotiden wurde eine gesamte Häufigkeit von etwa einem Crossover pro 120 Basenpaare berechnet. Innerhalb dieser Reihe von zwanzig Klonen war eine Gesamtheit von sieben Punktmutationen innerhalb der Sequenzen aufgetreten, die sich zwischen den PCR-Primersequenzen befanden, was eine Mutationshäufigkeit von etwa 0,05 % ergab.
  • Fünfunddreißig Klone, die nicht GRAMMR-Reaktion unterzogen wurden, wurden sequenziert. Von diesen Kontrollen stammten vierzehn von direkter Klonierung, und einundzwanzig wurden nach PCR-Amplifikation unter Verwendung von GFP-Hetero duplex als Matrize erhalten. Von diesen fünfunddreißig nicht-GRAMMR-behandelten Kontrollkolonien waren acht Rekombinanten, die von einem bis drei Crossover reichten, wobei die meisten einzelne Crossoverereignisse waren. Eine Gesamtheit von fünfundzwanzig Punktmutationen waren innerhalb der Sequenzen, die sich zwischen den PCR-Primern befanden, aufgetreten, was eine Mutationshäufigkeit von etwa 0,1 % ergab.
  • Zwischen den GRAMMR-behandelten Produkten, die entweder direkt kloniert oder PCR-amplifiziert wurden, wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Bemerkenswerterweise war jedoch, in den nicht-GRAMMR-behandelten Kontrollen, die Häufigkeit von Rekombinanten in den PCR-amplifizierten DNAs höher als in den direkt klonierten DNAs. Diese höhere Häufigkeit stimmt mit Ergebnissen überein, die von anderen erhalten wurden, bei welchen festgestellt wurde, dass ein bestimmtes Ausmaß an Rekombination durch „Jumping-PCR" verursacht wurde (Paabo et al., DNA damage promotes jumping between templates during enzymatic amplification; J. Biol. Chem. 265 (90), 4718-4721).
  • BEISPIEL 9
  • Heteroduplex-Substratherstellung für genetische Plasmid-auf-Plasmid-Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung (POP-GRAMMR) von GFP-Plasmiden
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Heteroduplex-Substrat für genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung in Form von intakten zirkulären Plasmiden erfolgen kann. Zyklus-3-GFP und Wildtyp-GFP-Heteroduplexmoleküle wurden im Plasmid-auf-Plasmid-(POP-)Format hergestellt. In diesem Format wurden die GFP-Sequenzen innerhalb des Kontextes eines zirkulären doppelsträngigen Plasmidvektorrückgrats neu geordnet. Dies ermöglichte die Gewinnung von neu geordnetem Produkt durch direkte Transformation von E. coli unter Verwendung einer Aliquoten der GRAMMR-Reaktion. In der Folge war weder PCR-Amplifikation noch andere zusätzliche Manipulation der GRAMMR-behandelten DNA notwendig, um neugeordnete Klone zu erhalten.
  • Es wurde fehlgepaartes DNA-Substrat für POP-GRAMMR-Reaktionen erzeugt, das Wildtyp-GFP (Seq-ID Nr. 29) und Zyklus-3-GFP (Seq.-ID Nr. 30) enthielt, was zu zwei pBluescript-basierten Plasmiden führte, pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) bzw. pBSC3GFP (Seq.-ID Nr. 17). Die GFPs wurden zwischen den Kpnl- und EcoRI-Stellen des pBluescript-Polylinkers insertiert, sodass die einzigen Sequenzunterschiede zwischen den zwei Plasmiden an Stellen auftraten, wo die Wildtyp- und Zyklus-3-GFPs sich voneinander unterschieden. Beide Plasmide wurden durch Verdau des Plasmidrückgrats mit SapI linearisiert, unter Verwendung einer DNA-Zentrifugationssäule gereinigt, gemischt und zu einem 1 X PCR-Puffer geändert (Barnes, PNAS 91, 2216-2220 (1994)), in siedendem Wasserbad drei Minuten lang erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die denaturierten DNA-Stränge zu anellieren. Denaturierung und Annealing dieser DNAs führte zu einem Gemisch aus Duplexen, der Neubildung von Elternduplexen und der Bildung von Heteroduplexen aus dem Annealing von Strängen von jedem der zwei Input-Plasmide. Eltern-Duplexe wurden für GRAMMR als unerwünscht angesehen und wurden durch Verdau mit Restriktionsenzymen entfernt, die in dem einen oder anderen Elternduplex entfernt wurden, aber nicht in den heteroduplexierten Molekülen. PmII und XhoI wurden für diese Operation ausgewählt, da PmII nur in der Wildtyp-GFP-Sequenz schneidet und XhoI nur Zyklus-3-GFP schneidet. Nach Behandlung mit diesen Enzymen wurden die Produkte auf einem Agarose-Gel aufgelöst. Die ungeschnittenen Volllängen-Heteroduplex-Moleküle wurden aus den PmII- und XhoI-geschnittenen Elternhomoduplexen in einem Agarose-Gel aufgelöst und durch Exzision der Bande und Reinigung mit einer DNA-Zentrifugationssäule gereinigt.
  • Die resultierende Population von heteroduplexierten Molekülen wurde mit DNA-Ligase behandelt, um die linerare DNA in zirkuläre, doppelsträngige DNA-Heteroduplexe zu überführen. Nach Nachweis durch Agarose-Gel-Shift-Analyse wurde das zirkuläre doppelsträngige heteroduplexierte GFP-Plasmid als Substrat für GRAMMR-Reaktionen verwendet. Beispiele für die resultierenden Klone sind als Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8 enthalten.
  • BEISPIEL 10
  • Exemplarische Reaktionsparameter für genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
  • Vergleich der CEL-I- und T4-DNA-Polymerasekonzentrationen
  • Die GRAMMR-Reaktion umfasst die Wechselwirkung von zahlreichen enzymatischen Aktivitäten. Mehrere Parameter, die mit GRAMMR-Reaktion assoziiert waren, wurden untersucht, wie z. B. CEL-I-Konzentration, T4-DNA-Polymerasekonzentration, Reaktionstemperatur, Substitution von T4-DNA-Polymerase mit T7-DNA-Polymerase, die Gegenwart von Taq-DNA-Polymerase und die Quelle von CEL-I-Enzym. Eine Matrix aus drei verschiedenen CEL-I-Konzentrationen gegen zwei Konzentrationen von T4-DNA-Polymerase wurde geschaffen, um die Grenzen der In-vitro-DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion zu untersuchen.
  • Einundzwanzig Nanogramm (21 ng) des zirkulären doppelsträngigen heteroduplexierten Plasmids, das wie in BEISPIEL 9 beschrieben hergestellt wurde, wurde als Substrat in einer Reihe von 10-Mikroliter-Reaktionen verwendet, die 1 X NEB-Ligasepuffer, 0,5 mM jedes dNTP, 1,0 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), entweder 1,0 oder 0,2 Einheiten T4-DNA-Polymerase und entweder 0,3, 0,1 oder 0,03 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung (Fraktion 5, in BEISPIEL 2 beschrieben) enthielten. Sechs Reaktionen, die alle sechs Kombinationen der zwei T4-DNA-Polymerasekonzentrationen mit den drei CEL-I-Konzentrationen darstellten, wurden hergestellt, in äquivalente Gruppen von fünf Mikrolitern geteilt und bei entweder 20 Grad Celsius oder 37 Grad Celsius inkubiert. Eine Kontrollreaktion, die kein CEL I und 0,2 Einheiten von T4-DNA-Polymerase enthielt, wurde mit den anderen Reaktionskomponenten hergestellt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in kompetente DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse (RFLP), gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen untersucht. RFLP-Analyse basierte auf Unterschieden in mehreren Restriktionsenzymerkennungsstellen zwischen den Wildtyp- und Zyklus-3-GFP-Genen. Die RFLP-Ergebnisse zeigten, dass durch die CEL-1/T4-DNA-Polymerase/Temperaturmatrix Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, aufgetreten war und dass keine solche Neuordnung in den Null-CEL-I-Kontrollklonen aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass Neuordnung in allen CEL-I-enthaltenden Proben aufgetreten war. Sequenzierung bestätigte auch, dass die Null-CEL-I-Kontrollen nicht neu geordnet waren, mit Ausnahme eines einzigen Klons der 16 Kontrollklone, der eine Einzelbasenänderung von einer Gensequenz zur anderen aufwies, die vermutlich entweder aus der Reparatur in E. coli oder aus willkürlicher Mutation resultierte. Die Sequenzen mehrerer exemplarischer entstehender GRAMMR-GFP-Klone sind dargestellt, wobei alle aus der Reaktion entstanden sind, die 0,3 Mikroliter der CEL-I-Formulierung und 1,0 Einheiten von T4-DNA-Polymerase enthielten, die bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde. Die Eltern-Wildtyp- und Zyklus-3-GFP-Gene sind hauptsächlich für Referenzzwecke dargestellt.
  • BEISPIEL 11
  • Taq-DNA-Poymerase ist für genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung nicht erforderlich
  • Dieser Versuch zeigt, dass Taq-DNA-Polymerase nicht dramatisch, wenn überhaupt, zur Funktionsweise von GRAMMR beiträgt oder diese beeinflusst. Von Taq-DNA-Polymerase wird berichtet, dass sie eine 5'-Klappen-ase-Aktivität aufweist, und ist in die Lehren der vorherigen Beispiele als Schutz gegen die mögliche Bildung und das Bestehen von unerwünschten 5'-Klappen in der heteroduplexierten DNA, die der GRMAMR-Reaktion unterzogen wurden, aufgenommen worden.
  • GRAMMR-Reaktionen wurden geschaffen, wie in Beispiel 10, mit einundzwanzig Nanogramm des zirkulären doppelsträngigen heteroduplexierten GFP-Plasmidsubstrats in 10-Mikroliter-Reaktionen, die 1 X NEB-Ligasepuffer, jeweils 0,5 mM dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase, 1,0 Einheiten T4-DNA-Polymerase, 1,0 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung (Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben) und entweder 2,5 Einheiten, 0,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase oder keine Taq-DNA-Polymerase enthielten. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in kompetente DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse, gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen, analysiert. Die RFLP-Ergebnisse zeigten, dass Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Taq-DNA-Polymerase in der GRAMMR-Reaktion aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese Ergebnisse. Deshalb zeigen die Daten, dass Taq-DNA-Polymerase für GRAMMR nicht notwendig war.
  • BEISPIEL 12
  • Alternierende Proof-Reading-DNA-Polymerasen zur genetischen Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
  • Dieser Versuch zeigt, dass genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung nicht auf die Verwendung von T4-DNA-Polymerase beschränkt ist und dass alternierende DNA-Polymerasen dadurch ersetzt werden können.
  • Es wurden Reaktionen geschaffen, wie in Beispiel 10, mit einundzwanzig Nanogramm des zirkulären, doppelsträngigen heteroduplexierten GFP-Plasmidsubstrats in 10-Mikroliter-Reaktionen, die 1 X NEB-Ligasepuffer, 0,5 mM jedes dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), 10 Einheiten oder 2 Einheiten T7-DNA-Polymerase, 1,0 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung (Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben) und 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase enthielt. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in kompetente DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse, gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen, untersucht. Die RFLP-Ergebnisse zeigten, dass Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, in beiden T7-DNA-Polymeraseenthaltenden Reaktionen aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese Ergebnisse. Deshalb zeigen die Daten, dass T7-DNA-Polymerase T4-DNA-Polymerase für GRAMMR ersetzen kann. Zusätzlich dazu zeigt es, dass indiviudelle Kom ponenten und Funktionalitäten in GRAMMR weitgehend ersetzt werden können, während ähnliche Ergebnisse erhalten werden.
  • BEISPIEL 13
  • Molekulares Züchten von Tobamovirus-30K-Genen in einem Virusvektor
  • In den vorangegangenen Beispielen ist gelehrt worden, dass genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung zur Neuordung von Sequenzen nützlich ist, die höchst homolog sind, zum Beispiel wtGFP und Zyklus-3-GFP sind 96 % identisch. Das vorliegende Beispiel lehrt, dass GRAMMR zur Neuordnung von abweichenderen Nucleinsäuresequenzen verwendet werden kann, wie z.B. Gene, die für Tobamovirusbewegungsproteingen kodieren.
  • Heteroduplexe von zwei Tobamovirus-Bewegungsprotein (MP-)Genen, die etwa 75 % identisch sind, wurden erzeugt. Das Heteroduplex-Substrat wurde durch Annealing von teilweise komplementären einzelsträngigen DNAs von entgegengesetzter Strangbeschaffenheit durch asymmetrische PCR synthetisiert, wobei ein Strang für das Bewegungsproteingen aus dem Tabakmosaikvirus-U1-Typ-Stamm (TMV-U1) (Seq.-ID Nr. 9) und der andere Strang für das Bewegungsproteingen aus Tomatenmosaikvirus (ToMV) (Seq.-ID Nr. 10) kodiert. Die Sequenzen der zwei teilweise komplementären Bewegungsproteingene wurden durch 33 Nucleotide von absoluter Komplementarität flankiert, um Annealing der DNAs an deren Termini zu fördern und PCR-Amplifikation und Klonierung zu erleichtern. Die Annealing-Reaktion fand durch Mischung von 2,5 Mikrogramm jeder einzelsträngigen DNA in einer 150-Mikroliter-Reaktion, die 333 mM NaCl, 33 mM MgCl2, 3,3 mM Dithiothreit, 166 mM Tris-HCl, pH 7, enthielt, und Inkubation bei 95 °C eine Minute lang, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur statt. GRAMMR wurde durch Inkubation von 5 Mikroliter des Heteroduplex-Substrats in einer 20-Mikroliter-Reaktion, die 1 X NEB-Ligasepuffer, 0,5 mM jdes dNTP, 0,4 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), 2,0 Einheiten von T4-DNA-Polymerase und CEL I enthielt, durchgeführt. Das CEL I stammte aus einer klonierten Formulierung, und die Menge, die verwendet wurde, variierte von 2 Mikroliter von Prep, gefolgt von fünf seriellen 3fach-Verdünnungen. Es wurde eine siebente Formulierung ohne CEL I hergestellt, die als Kontrolle diente.
  • Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde DNA aus den Reaktionen unter Verwendung von Strataprep-Zentrifugations-DNA-Reinigungssäulen (Stratagene, LaJolla, CA) gereinigt und als Matrizen für PCR-Reaktionen unter Verwendung von Primern verwendet, die zum Annealing an die flankierenden Primer-Bindungsstellen der zwei Sequenzen entworfen wurden. PCR-Produkte aus jeder Reaktion wurden unter Verwendung von Strataprep-Säulen gereinigt, mit AvrII und PacI verdaut und in den Bewegungsprotein-Slot von ähnlich geschnittenem pGENEWARE®-MP-Avr-Pac ligiert. Dieses Plasmid enthielt einen infektiösen Tobamovirus-GFP-Klon voller Länge, der mit AvrII- und Pac-I-Stellen modifiziert worden war, die das Bewegungsproteingen flankieren, um sein Ersetzen durch andere Bewegungsproteingene zu ermöglichen. Nach Transformation von DH5-alpha-E.-coli und Ausplattierung wurden Kolonien geerntet, Kulturen gezüchtet und DNA extrahiert. Die Bewegungsproteininserts wurden DNA-Sequenzanalyse aus beiden Richtungen unterworfen, und die Sequenzdaten bestätigten, dass in der Mehrheit der Inserts, die von GRAMMR-behandeltem Material abstammen, neugeordnete Sequenzen befanden, die sowohl aus TMV-U1- als auch ToMV-Bewegungsproteingensequenzen stammten. Die DNA-Sequenzen aus mehreren exemplarischen entstehenden GRAMMR-MP-Klonen sind als Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14 und Seq.-ID Nr. 15 dargestellt.
  • BEISPIEL 14
  • Molekulare Züchtung von höchst divergierenden Tobamovirus-30K-Genen in Virusvektoren unter Verwendung von genetischer Plasmid-auf-Plasmid-Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung (POP-GRAMMR)
  • Beispiel 4 lehrte die Neuordnung von Bewegungsprotein-(MP-)Genen aus mehreren divergierenden Stämmen von Tobamovirus (etwa 75 % identisch; in den pGE-NEWARE-MP-Avr-Pac-Vektor kloniert) unter Verwendung von GRAMMR. Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Plasmid-auf-Plasmid-GRAMMR (POP-GRAMMR) zur Neuordnung von noch höher divergierenden Spezies.
  • Es wurden Ausgangs-Eltern-MP-Gene aus den Tobamoviren TMV-Cg (6, Seq-ID Nr. 18), TMV-Ob (7, Seq.-ID Nr. 19), TVM-U2 (8, Seq.-ID Nr. 20), TMV-U1 (Seq.-ID Nr. 9) und Tomatenmosaikvirus (ToMV) (Seq.-ID Nr. 10) verwendet. Das Plasmid von pGENEWARE-ToMV-MP wurde durch Verdau mit Sma-I linearisiert. Die Plasmide von pGENEWARE, die MP-Gene entweder aus TMV-Cg, TMV-Ob, TMV-U2 oder TMV-U1 enthielten, wurden mit Stu I verdaut. Die verdauten pGENEWARE-MP-Konstrukte wurden unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen gereinigt. Die folgenden Heteroduplexpaare wurden erzeugt: pGENEWARE-Cg-MP und pGE-NEWARE-ToMV-MP, pGENEWARE-TMV-Ob-MP und pGENEWARE-ToMV-MP, pGENEWARE-TMV-U2-MP und pGENEWARE-ToMV-MP, pGENEWARE-ToMV-MP-U1-MP und pGENEWARE-ToMV-MP. Die Heteroduplexe dieser MP-Gensequenzen sind etwa 47 %, 58 %, 62 %, bzw. 75 % identisch. Heteroduplex-DNA wurde durch Mischung von 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten Plasmide in 1 X SSPE (180 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, bei pH 7,4) in einem Volumen von 20 Mikroliter erzeugt. Das Gemisch wurde bei 95 Grad Celsius 4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht, wo es 10 Minuten vor Inkubation bei 37 Grad Grad Celsius blieb. Nach 30 Minuten wurde die anellierte DNA-Probe dann zurück auf Eis transferiert, wo sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen beibehalten wurde.
  • Jede 10-Mikroliter-GRAMMR-Reaktion enthielt 1 Einheit von T4-DNA-Polymerase, 2 Einheiten E.-coli-DNA-Ligase und 0,5 mM von jedem dNTP in 1 X NEB-E.-coli-DNA-Ligasepuffer, ergänzt mit KCl auf 50 mM. Eine 1-Mikroliter-Aliquote von CEL I (verdünnt 1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243 oder 1/729) wurde als Nächstes hinzugefügt. Eine endonucleasefreie Kontrollreaktion wurde ebenfalls hergestellt. Zu jeder der Reaktionen wurde eine 1-Mikroliter-Aliquote hinzugefügt, die 20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplex-Substrats enthielt, und die Reaktionen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur und 30 Minuten lang auf Eis vor Transformation in kompetentes E. coli inkubiert.
  • DNA-Sequenzanalyse wurde aus beiden Richtungen durchgeführt, und die Sequenzdaten zeigten, dass eine signfikante Zahl an Klonen, die von GRAMMR-behandeltem Material abstammten, neugeordnete Sequenzen waren, die Information aus beiden Elternbewegungsproteingensequenzen enthielten. Die DNA-Sequenzen aus mehreren exemplarischen entstehenden pGENEWARE-MP-Klonen aus der GRAMMR-Reaktion sind wie folgt, TMV-CG/ToMV-Klone, 9, Seq.-ID Nr. 21 und 10, Seq.-ID Nr. 22, TMV-Ob/ToMV-Klone, 11, Seq.-ID Nr. 23 und 12, Seq.-ID Nr. 24; TMV-U2/ToMV-Klone, 13, Seq.-ID Nr. 25 und 14, Seq.-ID Nr. 26, und TMV-U1/ToMV-Klone, 15, Seq.-ID Nr. 27 und 16, Seq.-ID Nr. 28.
  • BEISPIEL 15
  • GRAMMR auf linearisiertem DNA-Substrat unter Verwendung von Endonucleasen, die innerhalb eines selektierbaren Markers spalten
  • Dieses Beispiel zeigt eine GRAMMR-Reaktion, wo DNA-Substratmoleküle mit Restriktionsendonucleasen linearisiert werden, die innerhalb eines selektierbaren Markergens spalten.
  • GRAMMR wird zwischen dem Wildtyp-Aequorea-victoria-GFP-Gen [Prasher et al., Gene 111 (92) 229] in einem PBS-Derivat (Stratagene, La Jolla, CA), für welches pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) kodiert, und einer Variante mit Mutationen durchgeführt, um Fluoreszenzintensität in E. coli zu verstärken und um die Emissionswellenlänge auf Blaulichtemission zu ändern [Crameri et al., Nat. Biotechnol. 14 (96) 315; Heim et al., PNAS 91 (94) 12501; Yang et al., J. Biol. Chem. 273 (98) 8212]. Dieses Variantengen, für welches das Plasmid pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32) kodiert, kodiert für ein fluoreszierendes Protein, das starkes blaues Licht emittiert, wenn es durch langwelliges UV-Licht angeregt wird.
  • Die GRAMMR-Reaktionen werden auf GFP/c3BFP-Heteroduplexen in einem zirkulären doppelsträngigen Plasmid-DNA-Kontext durchgeführt. Die zirkulären Gesamtplasmid-Heteroduplex-DNA-Substrate werden durch erstes Linearisieren von pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32) durch Verdau mit Ahd I bzw. Bcg I, dann durch Reinigung der verdauten DNA unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen hergestellt. Als Nächstes wurden 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten Plasmide gemischt und auf 1 X SSPE (180 nM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA bei pH 7,4) in ein Volumen von 20 Mikrolitern gebracht. Das Gemisch wird dann bei 95 Grad Celsius 4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht, wo es 10 Minuten lang vor Inkubation bei 37 Grad Celsius blieb. Nach 30 Minuten wird die anellierte DNA-Probe zurück auf Eis transferiert, wo sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen gehalten wurde.
  • Zwei unabhängige Reihen von Neuordnungsreaktionen wurden durchgeführt, um CEL I mit RES I in deren Fähigkeiten zu vergleichen, um Sequenzneuordnung durch GRAMMR zu erleichtern. Jede Reaktion wird zuerst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 Einheit von T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 5 Nanomol jedes dNTP in 1 X NEB-E.-coli-Ligasepuffer, ergänzt mit KCl auf 50 mM, behandelt. In der Folge wurden 2 Einheiten von E.-coli-DNA-Ligase hinzugefügt. Zwei separate Enzymverdünnungsreihen werden dann durchgeführt. Zu jeder von zwei Reihen von Röhrchen, die Aliquoten des obigen Cocktails enthielten, wurden 1-Mikroliter-Aliquoten von GENEWARE®-exprimierten CEL-I- oder RES-I-Extrakten in Verdünnungen von 1/3, 1/9, 1/27, 1/81 oder 1/243 hinzugefügt. Eine endonucleasefreie Kontrollreaktion wird ebenfalls vorbereitet. Zu jeder der Reaktionen werden 1-Mikroliter-Aliquoten hinzugefügt, die 20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplex-Substrats enthalten, und die Reaktionen werden bei Raumtemperatur eine Stunde lang und auf Eis 30 Minuten lang vor Transformation in kompetente E. coli inkubiert.
  • Grünfluoreszierendes Protein (GFP) und blaufluoreszierendes Protein (BFP) wird in den resultierenden Kolonien durch Bestrahlung mit langwelligem UV sichtbar gemacht. Das Eltern-Wildtyp-GFP ergibt schwache Grünfluoreszenz, und das Eltern-c3BFP ergibt starke Blaufluoreszenz. In den Genen, die für diese Fluoreszenzproteine kodieren, befinden sich die Sequenzen, welche die Emissionsfarbe bestimmen, und jene, die Fluoreszenzintensität regeln, an voneinander unterschiedlichen Positionen.
  • Es wird angenommen, dass DNA-Neuordnung zur „Aufheben der Verbindung" der Sequenzen, welche die Emissionsfarbe bestimmen, von jenen, die Fluoreszenzintensität regeln, führt. Als Folge wird von den resultierenden Nachkommen erwartet, dass sie Neuordnung der funktionellen Eigenschaften von Emissionsfarbe und Intensität zeigen. Deshalb kann ein Maß für das Ausmaß der DNA-Neuordnung, das in jeder Reaktion stattgefunden hatte, durch Untersuchung der Farbe und Intensität von Fluoreszenz aus den Baterienkolonien auf den entsprechenden Platten beurteilt werden.
  • BEISPIEL 16
  • Detektion von DNA-Mutationen unter Verwendung von RES-I- und Multiplex-Analyse
  • Die Empfindlichkeit von RES I für Fehlpaarungsdetektion wird durch seine Fähigkeit veranschaulicht, Mutationen in gepoolten DNA-Proben zu detektieren. DNA wird aus peripheren Blutlymphozyten von Individuen erhalten, die genetischem Sreening unterzogen werden. Proben werden entweder nur aus Brustkrebs, nur Ovarialkrebs, Brust/Ovarialkrebssyndromfamilien oder aus Nicht-Brust/Ovarialkrebskontrollproben erhalten. Unmarkierte Primer, die für Exon-2 von BRCA1 spezifisch sind, werden verwendet, um diese Region des Gens zu PCR-amplifizieren. Die Wildtyp-PCR-Produkte von Exon-2 werden mit γ-32P-ATP markiert. Kurz gesagt, 10 Picomol von PCR-Produkt werden durch das Wizard-Verfahren (Promega) gereinigt. Exon-2-Wildtypprodukte werden dann unter Verwendung von T4-Kinase und 15 Picomol von γ-32P-ATP bei 6.000 Ci/mmol in 30 μl 1 X Kinasepuffer (70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreit) bei 37 °C 1 Stunde lang phosphoryliert. Die Reaktionen werden dann mit 1 μl 0,5 M EDTA gestoppt. Das Reaktionsvolumen wird mit 1 X STE-Puffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA) auf 50 μl gebracht und durch eine Pharmacia-Sonden-Quant-Säule verarbeitet. Markierte DNA (1 pmol/μl in 100 μl) wird dann für Hybridisierung mit individuellen markierten PCR-amplifizierten Versuchsproben verwendet. Für jede individuelle Probe werden 100 fmol des unmarkierten PCR-amplifizierten Produkts mit 200 fmol des 32P-markierten Wildtyp-PCR-Produkts in RES-I-Reaktionspuffer (25 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) inkubiert. Nach Denaturierung und Renaturierung werden heteroduplexierte, radiomarkierte PCR-Produkte gegenüber RES 130 Minuten lang bei 37 °C in 1 X RES-Reaktionspuffer ausgesetzt und über die Hinzufügung von 10 μl eines Stopp-Gemisches gestoppt (75 % Formamid, 47 mM EDTA, 1,5 % SDS, Xylol-Cyanol und Bromphenolblau). Die Heteroduplexe werden dann mit dem Enzym individuell behandelt oder in einem Probenröhrchen gepoolt und behandelt. Die Produkte der Reaktion werden auf ein 15 % Polyacrylamidgel geladen, das 7 M Harnstoff enthält.
  • Um die Fähigkeit von RES I, Mutationen in gepoolten DNA-Proben zu detektieren, weiter zu veranschaulichen, werden 1, 2, 3, 5, 10 oder 30 heteroduplexierte, radiomarkierte PCR-Produkte (wieder aus Exon 2 des BRCA1-Gens amplifiziert) gegenüber RES I in einem einzigen Reaktionsröhrchen ausgesetzt und die Produkte auf einem 6 % Poylacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, laufen gelassen. Proben werden amplifiziert und wie oben beschrieben radiomarkiert. Jeder Pool enthält nur eine Probe, die eine Mutation aufweist (AG-Deletion). Die anderen Proben in jedem Pool sind vom Wildtyp. Kontrollproben werden nicht RES I ausgesetzt. In den gepoolten Proben, wo eine Mutation gegenwärtig ist, spaltet RES I die PCR-Produkte einheitlich, was die Empfindlichkeit des Enzyms in Gegenwart von überschüssiger nichtmutierter Wildtyp-DNA veranschaulicht. Als Kontrolle werden die heteroduplexierten PCR-Produkte, die keine Mutationen enthielten, analysiert, und es erscheint keine geschnittene Bande, die einer Mutation entspricht.
  • BEISPIEL 17
  • Detektion von Mutationen und Polymorphismen durch RES I in Proben, die aus Familien erhalten wurden, die hohes Risiko aufwiesen
  • PCR-Primer-Sets, die für die Exons in dem BRCA1-Gen spezifisch sind, werden synthetisiert. Die Gensequenz von BRCA1 ist bekannt. Die Exongrenzen und entsprechenden Basennummern sind in Tabelle II angeführt. Primer zur Amplifikation gewünschter Sequenzen können einfach von Fachleuten nach dem in Current Proto cols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg. John Wiley and Sons, Inc. (1995), beschriebenen Verfahren entworfen werden. Diese Primer werden so geplant, dass in jeder PCR-Reaktion ein Primer am 5'-Terminus mit einer Fluoreszenzmarkierung, 6-FAM, markiert wird, während der andere Primer ähnlich mit einer Markierung einer anderen Farbe, TET, markiert wird. Ein PCR-Produkt ist daher mit zwei Farben markiert, sodass DNA-Nicking-Ereignisse in jedem Strang unabhängig beobachtet werden können und die Messungen bekräftigt werden. TABELLE II
    EXONGRENZEN UND ENTSPRECHENDE BASENNUMMERN IN BRCA1
    EXON BASENNUMMERN
    1 1-100
    2 101-199
    3 200-253
    5 254-331
    6 332-420
    7 421-560
    8 561-665
    9 666-712
    10 713-788
    11 789-4215
    11B 789-1591
    11C 1454-2459
    11A 2248-3290
    11D 3177-4215
    12 4216-4302
    13 4303-4476
    14 4477-4603
    15 4604-4794
    16 4795-5105
    17 5106-5193
    18 5194-5273
    19 5274-5310
    20 5311-5396
    21 5397-5451
    22 5452-5526
    23 5527-5586
    24 5587-5711
  • Periphere Blutproben von Personen aus Familien mit hohem Risiko werden entnommen und die DNA isoliert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von E-Iongase (BRL) amplifiziert und unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt. Die DNA wird auf 94 °C erhitzt und langsam in 1 X RES-I-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2) abgekühlt, um Heteroduplexe zu bilden. Die Heteroduplexe werden in 20 μl 1 X RES-I-Puffer mit 0,2 μl von RES-I und 0,5 Einheiten von AmpliTaq bei 45 °C 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionen werden mit 1 mM Phenanthrolin gestoppt und weitere 10 Minuten bei 45 °C inkubiert. Die Probe wurde durch eine Centricep-Säule (Princeton Separations) verarbeitet und getrocknet. Ein Mikroliter von ABI-Ladungspuffer (25 mM EDTA, pH 8,0, 50 mg/ml Blaudextran), 4 μl entionisiertes Formamid und 0,5 μl interner Spurstandard TAMRA werden zu dem getrockneten DNA-Pellet hinzugefügt. Die Probe wird 2 Minuten lang auf 90 °C erhitzt und dann vor Ladung auf Eis abgeschreckt. Die Probe wird dann auf ein 4,25 % denaturierendes, 34 cm großes, gut abzulesendes Acrylamidgel geladen und auf einem ABI-373-Sequenzierer unter Verwendung von GENESCAN-672-Software analysiert. Der 6-FAM-markierte Primer in dieser Versuchsprobe befindet sich an Nucleotid 3177 der BRCA1-cDNA (Region 11 D), der TET-markierte Primer ist 73 Nucleotide in dem Intron zwischen Exon 11 und Exon 12. Jeder Spike repräsentiert die Gegenwart einer DNA-Bande, die durch Spaltung des Heteroduplexes durch RES I produziert wurde, wo eine Muitation oder ein Polymorphismzus vorhanden ist. Ein Spike repräsentiert die Größe des RES-I-produzierten Fragments von der 3'-Seite der Fehlpaarungsstelle zur 5'-6-FAM-Markierung des oberen Strangs. Der andere Spike repräsentiert das entsprechende Fragment im unteren Strang von der 3'-Seite der Fehlpaarung zur 5'-TET-Markierung. Die Summe der zwei Fragmente ist eine Base länger als die Länge des PCR-Produkts. Das 6-FAM-Panel zeigt einen Spike an Base Nr. 645 aus der 6-FAM-Markierung, und das TET-Panel zeigt einen Spike an Base Nr. 483 aus der TET-Markierung, die beide der Stelle der 5-Basen-Deletion an Nucleotid 3819 der BRCA1-DNA entsprechen.
  • Analyse von Exon 11 in einem anderen Individuum wird unter Verwendung eines 6-FAM-markierten Primers an Nucleotid 1454 von BRCA1-cDNA durchgeführt. Der TET-markierte Primer befindet sich an Nucleotid 2459 (Region 11C). Die PCR-amplifizierten Produkte werden amplifiziert und wie oben beschrieben hergestellt. In diesem Individuum zeigt das 6-Fam-Panel einen Spike an Base Nr. 700 und das TET-Panel einen Spike an Nr. 305, wobei jeder Spike der Stelle der RES-I-Inzision im jeweiligen DNA-Strang einer Nichtsinnmuation von A > T an Nucleotid 2154 von BRCA1-cDNA entspricht. Das 6-FAM-Panel zeigt auch einen Spike an Base Nr. 747, und das TET-Panel zeigt einen Spike an Nr. 258, welcher der Stelle eines Polymorphismus C > T an Nucleotid 2201 von BRCA1-cDNA entspricht. Die Nichtsinnmutation und der Polymorphismus können durch Sequenzierung der Probe unter Verwendung des ABI-377-Sequenzierers nachgewiesen werden.
  • Bestimmte Individuen weisen Mutationen in einer anderen Region von Exon 11, Region 11A, auf der schematischen Darstellung in n auf. Ein 6-FAM-markierter Primer an Nucleotid 2248 von BRCA1-cDNA und ein TET-markierter Primer an Nucleotid 3290 werden verwendet, um diese Region von Exon 11 zu amplifizieren. Nach Amplifikation werden die Proben wie oben beschrieben verarbeitet.
  • Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection (ATCC)
  • Es sind drei Hinterlegugen bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, durchgeführt worden. Es ist eine Hinterlegung eines Plasmid-DNA-Konstrukts durchgeführt worden, das ein Derivat von Tabakmosaikvirus und cDNA des CEL-I-Fehlpaarungsendonucleasegens aus Sellerie, markiert mit 6HIS, enthält. Das Konstrukt wird intern P1177MP4-CEL-I-6HIS genannt und hat die ATCC-Nummer PTA-3927 zugewiesen bekommen. Eine Hinterlegung eines Plasmid-DNA-Konstrukts, das ein Derivat von Tabakmosaikvirus und cDNA des CEL-I-Fehlpaarungsendonucleasegens aus Sellerie enthielt, ist durchgeführt worden. Das Konstrukt wird intern P1177MP4-CEL-I-Avr genannt und hat die ATCC-Nummer PTA-3926 zugewiesen bekommen. Eine Hinterlegung eines Plasmid-DNA-Konstrukts, das ein Derivat von Tabakmosaikvirus und ein cDNA-Insert enthält, das für ein 34kDa-Protein aus Selaginella lepidophylla kodiert, ist durchgeführt worden. Das cDNA-Insert wird als RES-I-6HIS bezeichnet. RES I ist ein Fehlpaarungsendonuc leasegen. Das Konstrukt wird intern pLSB-2225 genannt und hat die ATCC-Nummer PTA-4562 zugewiesen bekommen.
  • Diese Hinterlegungen wurden gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die Hinterlegung von Mikroorganismen und den darunter gültigen Bestimmungen und für einen Zeitraum von zumindest dreißig (30) Jahren und zumindest fünf (05) Jahren, nachdem die Hinterlegungsstelle die letzte Anfrage für das Ausstatten einer Probe der Hinterlegung erhalten hat, oder für den wirksamen Zeitraum eines Patents, das aus dieser Anmeldung oder einer nachfolgenden Anmeldung, die beliebige dieser Hinterlegungen zitiert, hervorgehend erteilt worden ist, abhängig davon, welcher Zeitraum länger ist, durchgeführt. Jede Hinterlegung wird ersetzt, sollte sie in diesem Zeitraum nicht-lebensfähig werden.
  • Es gilt anzumerken, dass die Bezeichnungen des Anmelders für jeden dieser Klone in der Hinterlegung auf die zuvor genannte Hinterlegung bei der American Type Culture Collection gekürzt wurden, d.h. p1177MP4-CEL-I-Avr-B3 wird p1177MP4-CEL-I-Avr genannt, und p1177MP4-CEL-I-6His-A9 wird p1177MP4-CEL-I-6His genannt. Der Klon p1177MP4-CEL-I-Avr (Seq.-ID Nr. 1) enthielt das offene CEL-I-Lesegerüst, das sich von Nucleotid 5765 bis 6655 erstreckte (Seq.-ID Nr. 3), und der Klon p1177MP4-CEL-I-6His-A9 (Seq.-ID Nr. 2) enthielt das offene CEL-I-6His-Lesegerüst, das sich von Nucleotid 5765-6679 (Seq.-ID Nr. 4) erstreckte.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001
  • Figure 01280001
  • Figure 01290001
  • Figure 01300001
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Figure 01330001
  • Figure 01340001
  • Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Figure 01370001
  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01400001
  • Figure 01410001
  • Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
  • Figure 01450001
  • Figure 01460001
  • Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001
  • Figure 01520001
  • Figure 01530001
  • Figure 01540001
  • Figure 01550001
  • Figure 01560001
  • Figure 01570001
  • Figure 01580001
  • Figure 01590001
  • Figure 01600001
  • Figure 01610001
  • Figure 01620001
  • Figure 01630001
  • Figure 01640001
  • Figure 01650001
  • Figure 01660001
  • Figure 01670001
  • Figure 01680001
  • Figure 01690001
  • Figure 01700001
  • Figure 01710001
  • Figure 01720001
  • Figure 01730001
  • Figure 01740001
  • Figure 01750001
  • Figure 01760001
  • Figure 01770001
  • Figure 01780001

Claims (12)

  1. In-vitro-Verfahren zur Gewinnung einer Peptidsequenz mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft, umfassend: a) Herstellung von zumindest einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz, worin die Heteroduplexpolynucleotidsequenz zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist; b) Mischung von Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einer wirksamen Menge einer Fehlpaarungsendonuclease RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 oder einer Kombination von Fehlpaarungsendonucleasen, die eine Fehlpaarungsendonuclease RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 umfassen, eines Proof-Reading-Enzyms, dNTPs und eines Ligaseenzyms; c) Bereitstellung von ausreichend Zeit für nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare, sodass diese in komplementäre Basenpaare überführt werden, worin eine Population von Polynucleotidsequenzvarianten resultiert; d) Expression von Polynucleotidsequenzvarianten; und e) Screening von Varianten auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft und Selektion dieser aufgrund dieser Eigenschaft.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fehlpaarungsendonuclease eine Sequenzvariante einer Fehlpaarungsendonuclease RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 ist, wobei die Sequenzvariante Endonucleaseaktivität aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Heteroduplexpolynucleotidsequenz für Endonucleaseaktivität kodiert.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, worin die Expression von Polynucleotidvarianten die Transfektion eines Wirtsorganismus mit einem rekombinanten Plasmid oder einem rekombinanten Virusvektor umfasst, der für eine der Polynucleotidvarianten kodiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, worin die Expression von Polynucleotidvarianten die Transformation eines Wirtsorganismus mit einer der Polynucleotidvarianten umfasst.
  6. Verfahren zur Herstellung einer Fehlpaarungsendonuclease RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 oder einer Sequenzvariante davon, umfassend: a) Transfektion einer Wirtspflanze, eines nicht-menschlichen Wirtstiers oder Wirtshefe oder Wirtspilz oder Wirtsbakterium mit einem rekombinanten Virusvektor, der für eine Polynucleotidsequenz für das RES I oder eine Sequenzvariante davon kodiert; b) Züchtung der Wirtspflanze oder eines Wirtstiers oder Wirtshefe oder Wirtspilz oder Wirtsbakterium, worin die Polynucleotidsequenz für das RES I oder eine Sequenzvariante davon exprimiert wird; und c) Extraktion des RES I oder einer Sequenzvariante davon aus dem Wirt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das RES I eine Sequenzvariante davon ist.
  8. Verfahren zur Bestimmung einer Mutation in einer Targetsequenz eines einzelsträngigen Polynucleotids unter Verweis auf eine nicht-mutierte Sequenz eines Polynucleotids, die mit dem Polynucleotid hybridisierbar ist, das die Targetsequenz umfasst, worin die Polynucleotide amplifiziert, mit einem detektierbaren Marker markiert und aneinander hybridisiert werden, der Aktivität einer Endonuclease unterworfen werden und auf die Gegenwart der Mutation analysiert werden, wobei die Verbesserung die Verwendung eines Fehlpaarungsendonucleaseenzyms RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 oder einer Sequenzvariante davon mit Ursprung von Selaginella lepidophylla umfasst, wobei die Aktivität des Enzyms Folgendes umfasst: a) Detektion von Fehlpaarungen, ob diese bekannt oder unbekannt sind, zwischen den hybridisierten Polynucleotiden; b) katalytische Bildung eines im Wesentlichen einzelsträngigen Nicks an einer Targetsequenz, die eine Fehlpaarung enthält; und c) Erkennung einer Mutation in einer Targetpolynucleotidsequenz, wobei die Erkennung von flankierenden Polynucleotidsequenzen im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, weiters umfassend d) Erkennung von Polynucleotidschleifen und -insertionen zwischen den hybridisierten Polynucleotiden.
  10. In-vitro-Verfahren zur Gewinnung einer Polynucleotidsequenz, die für eine gewünschte funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: a) Herstellung von zumindest einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz, worin die Heteroduplexpolynucleotidsequenz zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare aufweist; b) Mischung von Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einer wirksamen Menge einer Fehlpaarungsendonuclease RES I mit der Sequenz der Seq.-ID Nr. 34 oder einer Sequenzvariante davon oder einer Kombination von Fehlpaarungsendonucleasen, die das RES I oder eine Variante davon umfassen, eines Proof-Reading-Enzyms, dNTPs und eines Ligaseenzyms; c) Bereitstellung von ausreichend Zeit für nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare, sodass diese in komplementäre Basenpaare überführt werden, worin eine Population von Polynucleotidsequenzvarianten resultiert; und d) Screening der Varianten auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft und Selektion dieser aufgrund dieser Eigenschaft.
  11. Nucleinsäuremolekül, umfassend die Nucleinsäuresequenz von Seq.-ID Nr. 16.
  12. Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 34.
DE60314902T 2002-02-01 2003-01-31 Fehlpaarungsendonukleasen und verwendungsverfahren Expired - Lifetime DE60314902T2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US211079 1998-12-14
US35372202P 2002-02-01 2002-02-01
US353722P 2002-02-01
US10/098,155 US20030157495A1 (en) 2002-02-01 2002-03-14 Nucleic acid molecules encoding CEL I endonuclease and methods of use thereof
US98155 2002-03-14
US10/211,079 US7078211B2 (en) 2002-02-01 2002-08-01 Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof
PCT/US2003/002958 WO2003066809A2 (en) 2002-02-01 2003-01-31 Mismatch endonucleases and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60314902D1 DE60314902D1 (de) 2007-08-23
DE60314902T2 true DE60314902T2 (de) 2008-04-10

Family

ID=27739010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60314902T Expired - Lifetime DE60314902T2 (de) 2002-02-01 2003-01-31 Fehlpaarungsendonukleasen und verwendungsverfahren

Country Status (8)

Country Link
US (4) US7078211B2 (de)
EP (1) EP1565557B1 (de)
JP (1) JP4395632B2 (de)
AT (1) ATE366807T1 (de)
AU (1) AU2003207776B2 (de)
CA (1) CA2473187C (de)
DE (1) DE60314902T2 (de)
WO (1) WO2003066809A2 (de)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110111413A1 (en) * 2001-02-02 2011-05-12 Padgett Hal S Method of optimizing codon usage through dna shuffling
US7838219B2 (en) * 2001-02-02 2010-11-23 Novici Biotech Llc Method of increasing complementarity in a heteroduplex
DE60234159D1 (de) * 2001-02-02 2009-12-10 Large Scale Biology Corp Methode zur erhöhung der komplementarität in einem heteroduplex-polynucleotid
US7078211B2 (en) * 2002-02-01 2006-07-18 Large Scale Biology Corporation Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof
EP1574570A1 (de) * 2004-03-12 2005-09-14 Universität Regensburg Verfahren zur Verringerung der Anzahl von fehlgepaarten Nukleotiden in doppelsträngigen Polynukleotiden
ES2292270B1 (es) * 2004-04-14 2009-02-16 Oryzon Genomics, S.A. Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas.
US20060029612A1 (en) * 2004-04-15 2006-02-09 Large Scale Biology Corporation Prevention and treatment of recurrent respiratory papillomatosis
US7729761B2 (en) * 2004-07-14 2010-06-01 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for controlled gene or protein delivery
DE602005025878D1 (de) * 2004-07-30 2011-02-24 Genoplante Valor Verfahren zur herstellung von hochempfindlichen endonukleasen, neuartige zubereitungen von nukleasen und ihre verwendung
CN101278052A (zh) * 2005-07-18 2008-10-01 普罗塔里克斯有限公司 生物活性大分子的粘膜或肠给药
EP1934335A4 (de) * 2005-09-08 2010-05-05 Large Scale Biology Corp Modifizierte tabak-mosaikvirus-teilchen als gerüste zur anzeige von protein-antigenen für impfstoff-anwendungen
WO2007101028A2 (en) * 2006-02-24 2007-09-07 Transgenomic, Inc. Method to produce enzymatically active recombinant endonucleases
US7888475B2 (en) * 2008-09-15 2011-02-15 Padgett Hal S Interferon alpha and interferon kappa fusion protein
WO2011102802A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Agency For Science, Technology And Research Method for reducing mismatches in double-stranded dna molecules
CN103945931B (zh) 2011-09-26 2017-03-22 基因技术股份公司 高效的小体积核酸合成
CN104220602B (zh) * 2012-02-01 2018-10-30 合成基因组股份有限公司 用于合成错误最小化核酸分子的材料和方法
US20130274129A1 (en) 2012-04-04 2013-10-17 Geneart Ag Tal-effector assembly platform, customized services, kits and assays
US10563240B2 (en) 2013-03-14 2020-02-18 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
US20150119260A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-30 National Taiwan University Circulating cancer biomarker and its use
EP3169781B1 (de) 2014-07-15 2020-04-08 Life Technologies Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur nukleinsäureassemblierung
LT3557262T (lt) 2014-12-09 2022-11-10 Life Technologies Corporation Didelio efektyvumo nukleorūgščių sintezė mažame tūryje
EP3320103A1 (de) 2015-07-07 2018-05-16 Thermo Fisher Scientific Geneart GmbH Enzymatische synthese von nukleinsäuresequenzen
EP3359669B1 (de) 2015-10-06 2020-05-13 Pierce Biotechnology, Inc. Vorrichtungen und verfahren zur herstellung von proteinen
JP2019502399A (ja) * 2016-01-22 2019-01-31 ビオーム バイオサイエンシズ プライベート リミティド アクネ菌を検出し治療する方法及びそのキット
US20210147830A1 (en) 2018-06-29 2021-05-20 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh High throughput assembly of nucleic acid molecules
GB201905303D0 (en) 2019-04-15 2019-05-29 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Multiplex assembly of nucleic acid molecules
US20240025939A1 (en) 2020-03-06 2024-01-25 Life Technologies Corporation High sequence fidelity nucleic acid synthesis and assembly
US11667968B2 (en) 2021-05-27 2023-06-06 New England Biolabs, Inc. Fragmentation of DNA

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US17477A (en) * 1857-06-09 allerton
US48268A (en) * 1865-06-20 Improved process for preparing coffee
US45175A (en) * 1864-11-22 Improved grinding-plate
AU4434585A (en) 1985-03-30 1986-10-23 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4994368A (en) 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
US5556750A (en) 1989-05-12 1996-09-17 Duke University Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems
US5556747A (en) 1990-07-09 1996-09-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for site-directed mutagenesis
US5795747A (en) 1991-04-16 1998-08-18 Evotec Biosystems Gmbh Process for manufacturing new biopolymers
DE4112440C1 (de) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
WO1993020233A1 (en) 1992-03-27 1993-10-14 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
DE69633723T2 (de) 1995-06-07 2006-02-02 Trevigen, Inc. Methode zur detektion von punktmutanten mittels nukleinsäurereperaturenzym und in vitro mutagenese
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
ATE236270T1 (de) 1995-12-15 2003-04-15 Univ Duke Verfahren zum nachweis und zur entfernung von mutantsequenzen, die während enzymatischer amplifikation entstehen
WO1997037011A1 (en) 1996-04-01 1997-10-09 Setratech S.A.R.L. Meiotic recombination in vivo of partially homologous dna sequences
US5869245A (en) 1996-06-05 1999-02-09 Fox Chase Cancer Center Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands
AU721493B2 (en) 1996-06-05 2000-07-06 Fox Chase Cancer Center Mismatch endonucleases and uses thereof in identifying mutations in targeted polynucleotide strands
FR2772048B1 (fr) 1997-12-04 2001-12-21 Biomethodes Procede de clonage par digestion multiple, vecteurs pour sa mise en oeuvre et ses applications
WO1999029902A1 (en) 1997-12-08 1999-06-17 California Institute Of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
US6846655B1 (en) 1998-06-29 2005-01-25 Phylos, Inc. Methods for generating highly diverse libraries
FR2789696A1 (fr) 1999-02-12 2000-08-18 Biomethodes Procede de mutagenese d'un fragment d'acide nucleique par clonage et polymerisation-ligation
FR2793807B1 (fr) 1999-05-20 2003-05-16 Biomethodes Methode d'insertion d'un fragment d'acide nucleique dans un vecteur, ses applications et les kits pour sa mise en oeuvre
DE19953854C2 (de) 1999-11-09 2002-01-17 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften
US6391557B1 (en) 2000-02-22 2002-05-21 Fox Chase Cancer Center Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof
EP1257671B1 (de) 2000-02-22 2015-01-14 Fox Chase Cancer Center Fehlpaarungsendonuklease kodierendes nukleinsäuremolekül und verfahren zu dessen verwendung
EP1283877A2 (de) 2000-05-23 2003-02-19 California Institute Of Technology Gen-rekombination und hybridprotein entwicklung
FR2813314B1 (fr) 2000-08-25 2004-05-07 Biomethodes Procede de mutagenese dirigee massive
US20040091886A1 (en) 2000-09-21 2004-05-13 Moore Jeffrey C. Method for generating recombinant polynucleotides
US6783941B2 (en) 2000-12-06 2004-08-31 Novozymes A/S Method for producing a polynucleotide library in vitro by mismatch repair of heteroduplexes
DE60234159D1 (de) 2001-02-02 2009-12-10 Large Scale Biology Corp Methode zur erhöhung der komplementarität in einem heteroduplex-polynucleotid
US7078211B2 (en) * 2002-02-01 2006-07-18 Large Scale Biology Corporation Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof
DE10248258A1 (de) 2002-10-16 2004-05-06 Biopsytec Analytik Gmbh Mutierte Nukleinsäure einer Cel I-Endonuklease und Verfahren zur Herstellung des rekombinanten vollständigen Cel I-Proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US20060194288A1 (en) 2006-08-31
WO2003066809A3 (en) 2005-06-30
CA2473187C (en) 2012-07-31
EP1565557A2 (de) 2005-08-24
ATE366807T1 (de) 2007-08-15
AU2003207776A1 (en) 2003-09-02
US7078211B2 (en) 2006-07-18
US7273739B2 (en) 2007-09-25
EP1565557A4 (de) 2005-11-30
US20080145913A1 (en) 2008-06-19
CA2473187A1 (en) 2003-08-14
EP1565557B1 (de) 2007-07-11
US20030148315A1 (en) 2003-08-07
JP4395632B2 (ja) 2010-01-13
US7056740B2 (en) 2006-06-06
DE60314902D1 (de) 2007-08-23
US20030157682A1 (en) 2003-08-21
AU2003207776B2 (en) 2008-12-11
WO2003066809A2 (en) 2003-08-14
JP2005529586A (ja) 2005-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60314902T2 (de) Fehlpaarungsendonukleasen und verwendungsverfahren
EP1151109B1 (de) Fucosyltransferase-gen
CN106164272B (zh) 修饰的植物
DE69333880T2 (de) Erhaltung von männlichen sterilen pflanzen
DE69731608T2 (de) Verbessertes barstar-gen
DE69636225T2 (de) Stimulierung der homologen rekombination in pflanzlichen organismen mittels rekombinations fördernder enzyme
JP4689940B2 (ja) ヘテロ二本鎖の相補性を増大させる方法
EP3041345A2 (de) Helminthosporium turcicum-resistente pflanze
DE60115863T2 (de) Beta 1, 2-xylosyltransferase gen aus arabidopsis
EP0797673A2 (de) Transgene pflanzen mit einer gesteigerten biomasseproduktion
DE60035892T2 (de) Gene und verfahren zur wachstumsmanipulation
EP1337646A2 (de) Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs
EP3393234B1 (de) Restorer-pflanze
DE3103714A1 (de) Dns-rekombinationsverfahren zur herstellung eines dem menschlichen interferon aehnlichen proteins
JP2007529991A (ja) ポリヌクレオチド配列改変体
US7582423B2 (en) Population of polynucleotide sequence variants
EP1275736B1 (de) Verfahren zur Identifizierung von Leserastermutationen
CN116375832A (zh) 蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用
EP1309694A2 (de) Verfahren zur verbesserten herstellung von cyanophycin und dessen folgeprodukte
DE102015017161A1 (de) Restorer-Pflanze

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition