EP1337646A2 - Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs - Google Patents

Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs

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Publication number
EP1337646A2
EP1337646A2 EP01923731A EP01923731A EP1337646A2 EP 1337646 A2 EP1337646 A2 EP 1337646A2 EP 01923731 A EP01923731 A EP 01923731A EP 01923731 A EP01923731 A EP 01923731A EP 1337646 A2 EP1337646 A2 EP 1337646A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
dna
polypeptide
sequences
dna sequences
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01923731A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hassan Jomaa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioagency AG
Original Assignee
Bioagency AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioagency AG filed Critical Bioagency AG
Publication of EP1337646A2 publication Critical patent/EP1337646A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to DNA sequences which change the isoprenoid biosynthesis when integrated into the genome of viruses, eukaryotes and prokaryotes, and to genetic engineering processes for producing these transgenic viruses, eukaryotes and prokaryotes. It also relates to methods for identifying substances with herbicidal, antimicrobial, antiparasitic, antiviral, fungicidal, bactericidal activity in plants and antimicrobial, antiparasitic, antifungal, antibacterial and antiviral activity in humans and animals.
  • DNA sequences are therefore provided which code for enzymes which are involved in the DOXP pathway. Both genes (lytB and yfgB) and enzymes (LytB and YfgB) are involved in isoprenoid biosynthesis and are essential for the survival of the respective organisms (Examples 1 and 2).
  • the invention relates to the following DNA sequences:
  • DNA sequences which code for a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or for an analog or derivative of the polypeptide according to SEQ ID NO: 5, in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted by other amino acids, without significantly reducing the enzymatic effect of the polypeptide, and
  • DNA sequences which code for a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or for an analog or derivative of the polypeptide according to SEQ ID NO: 14, in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted by other amino acids, without significantly reducing the enzymatic effect of the polypeptide.
  • the DNA sequences all come from Plasmodium falciparum, strain 3D7.
  • DNA sequences mentioned in the sequence listing those are also suitable which have a different DNA sequence as a result of the degeneration of the genetic code, but for the same polypeptide or for an analog or derivative of the polypeptide in which one or more amino acids have been deleted, added or have been substituted by other amino acids without significantly reducing the enzymatic action of the polypeptide.
  • sequences according to the invention are suitable for the overexpression of genes in viruses, eukaryotes and prokaryotes which are responsible for the isoprenoid biosynthesis of the 1-deoxy-D-xylulose pathway.
  • the eukaryotes or eukaryotic cells include animal cells, plant cells, algae, yeasts, fungi and the prokaryotes or prokaryotic cells are archaebacteria and eubacteria.
  • viruses, eukaryotes and prokaryotes When a DNA sequence is integrated into a genome on which one of the above-mentioned DNA sequences is located, the expression of the above-described genes in viruses, eukaryotes and prokaryotes is made possible.
  • the viruses, eukaryotes and prokaryotes transformed according to the invention are grown in a manner known per se and the isoprenoid formed in the process is isolated and, if appropriate, purified. Not all isoprenoids need to be isolated because in some cases the isoprenoids are released directly into the air.
  • the invention further relates to a method for producing transgenic viruses, eukaryotes and prokaryotes with isoprenoid expression, which contains the following steps.
  • a vector e.g. plasmid, viral DNA
  • the intact whole plants can be regenerated from the transformed plant cells.
  • sequences coding for the proteins with the nucleotide sequences Seq ID NO: 1 and Seq ID NO: 9 can be provided with a promoter which ensures transcription in certain organs or cells and which is in the sense orientation (3 ' end of the promoter to 5 - end of the coding sequence) is coupled to the sequence which codes for the protein to be formed.
  • a termination signal determining the termination of the mRNA synthesis is appended to the 3 "end of the coding sequence.
  • the promoter can be used and the coding sequence is set to a sequence coding for a so-called signal sequence or a transit peptide.
  • the sequence must be in the same reading frame as the coding sequence of the protein.
  • n may be required. If, for example, the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, then at least one right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA must be inserted as the flanking region of the genes to be introduced become.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficient in EP 120516; Hoekama, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters BV Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit.Rev.Plant Sei. 4,1-46 and An et al. (1985) EMBO J.
  • agrobacteria e.g. Agrobacterium tu- mefaciens
  • the fusion of protoplasts the microinjection of DNA
  • electroporation as well as ballistic methods and virus infection.
  • Whole plants can then be regenerated from the transformed plant material in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for selection.
  • a suitable medium which can contain antibiotics or biocides for selection.
  • the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the transformed cells grow within the plants in the usual way (McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • the invention furthermore relates to expression vectors which contain one or more of the DNA sequences according to the invention.
  • expression vectors are obtained by providing the DNA sequences according to the invention with suitable functional regulation signals.
  • regulatory signals are DNA sequences which are responsible for expression, for example promoters, operators, enhancers, ribosomal binding sites and which are recognized by the host organism.
  • further regulation signals which control, for example, replication or recombination of the recombinant DNA in the host organism, can be part of the expression vector.
  • the host organisms transformed with the DNA sequences or expression vectors according to the invention also form part of the subject matter of the invention.
  • Host cells and organisms which do not have any intrinsic enzymes of the DOXP pathway are particularly suitable for the expression of the enzymes according to the invention. This applies to archaebacteria, animals, some fungi, Sclilei fungi and some eubacteria. The lack of these intrinsic enzyme activities makes the detection and purification of the recombinant enzymes much easier. This also makes it possible to reduce the activity and in particular the inhibition of the activity of the recombinant according to the invention with little effort Measure enzymes through various chemicals and pharmaceuticals in crude extracts from the host cells.
  • the enzymes according to the invention are advantageously expressed in eukaryotic cells when post-translational modifications and a native folding of the polypeptide chain are to be achieved.
  • introns are eliminated by splicing the DNA and the enzymes are produced in the polypeptide sequence characteristic of the parasites.
  • Sequences coding for introns can also be removed by recombinant DNA technology from the DNA sequences to be expressed or inserted experimentally.
  • the protein can be isolated from the host cell or the culture supernatant of the host cell by methods known to the person skilled in the art. In vitro reactivation of the enzymes may also be required.
  • the enzymes according to the invention or partial sequences of the enzymes can be expressed as a fusion protein with various peptide chains.
  • Oligo-histidine sequences and sequences derived from glutathione-S-transferase, thioredoxin or calmodulin-binding peptides are particularly suitable for this purpose. Fusions with thioredoxin-derived sequences are particularly suitable for prokaryotic expression, since this increases the solubility of the recombinant enzymes.
  • the enzymes according to the invention or partial sequences of the enzymes can be expressed as fusion proteins with peptide chains known to those skilled in the art that the recombinant enzymes are transported into the extracellular environment or into certain compartments of the host cells. This enables both the purification and the investigation of the biological activity of the enzymes to be facilitated.
  • the enzymes according to the invention can be obtained under standardized conditions by techniques known to the person skilled in the art by in vitro translation. Suitable systems are rabbit reticulocyte and wheat germ extracts and bacterial lysates. In vitro transcribed mRNA can also be translated into Xenopus oocytes.
  • Oligo- and polypeptides can be produced by chemical synthesis, the sequences of which are derived from the peptide sequence of the enzymes according to the invention. With a suitable choice of the sequences, such peptides have properties which are characteristic of the complete enzymes according to the invention. Such peptides can be produced in large quantities and are particularly suitable for studies on the kinetics of enzyme activity, the regulation of enzyme activity, the three-dimensional structure of the enzymes, the inhibition of enzyme activity by various chemicals and pharmaceuticals and the binding geometry and binding affinity of different ligands.
  • a DNA with the nucleotides from the sequences SEQ ID NO: 1 and 9 is preferably used for the recombinant production of the enzymes according to the invention.
  • DOXP route deoxy-D-xylulose-phosphate route
  • the invention therefore also includes a method for screening a compound.
  • a host organism which contains a recombinant expression vector, the vector having at least part of the oligonucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 9 or variants or homologs thereof, and also a compound which is suspected, that it has an antimicrobial, antiparasitic, antiviral and antimycotic effect in humans and animals or a bactericidal, antimicrobial, herbicidal or fungicidal activity in plants.
  • the host organism is then brought into contact with the compound and the effectiveness of the compound is determined.
  • Another object of this invention are methods for determining the enzymatic activity of the LytB and YfgB protein. This can be determined using the known techniques.
  • the change in concentration of the intermediates of the DOXP path, which act as substrates or products of the respective enzymes, is determined by photometric, fluorometric or chromatographic methods. Evidence of change in concentration can also be carried out by coupled enzyme assays, the detection being carried out via one or more additional enzymatic steps.
  • the additional enzymes can also be involved in the DOXP pathway or added experimentally to the system.
  • a gene that codes for a selection marker was to be introduced into the gcpe gene by genetic engineering methods and the gene was thereby inactivated.
  • a construct (pPflytBKO) was produced which contains an expression cassette which confers pyrimethamine resistance and is flanked by two fragments from the coding sequence of the P. falciparum lytB gene. This construct should be integrated into the gcpe gene by homologous recombination via the flanking sequences.
  • thermostable Pwo-DN A polymerase As a result of which the products have blunt ends and are suitable for "blunt end” ligations.
  • the sequence of the lytB gene was primed with 5'-ATG TCA GTT ACC ACA TTT TGT TCT TTA AAA AAA ACG G-3 'and 5'-GTG ATT TCA TTT TTC TCT TTC TTT TAT CAT C-3' and genomic DNA amplified from the P.
  • Tg DHFR-TS The dihydrofolate reductase gene from Toxoplasma gondii (Tg DHFR-TS) was used as the selection marker and had been modified in such a way that it conferred resistance to pyrimethamine.
  • the expression of TgDHFR-TS was carried out under the control of the 5 'and 3' untranslated elements of the P. falciparum calmodulin (Pf CAM) gene.
  • This expression cassette was obtained from the plasmid pTgD-TS.CAM5 / 3.KP, which had been constructed according to published protocols (Crabb, BS and Cowman, AF (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7289-7294 ).
  • the expression cassette was obtained by amplification with the primers 5'-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3 'and 5'-GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-3' with pTgD-TS.CAM5 / 3.KP as template.
  • the expression cassette was then inserted into the insert of pUCPfgcpe.
  • pUCPflytB was opened with Dsa I in the insert and the overhangs were filled with T4 and Klenow DNA polymerase.
  • the amplified expression cassette was phosphorylated and inserted via "blunt end" ligation, whereby pPflytBKO was obtained.
  • the infected erythrocytes (strain 3D7, mainly ring stages, approx. 15% parasitemia) were pelleted in a 10 cm culture dish and in 0.8 ml cytomix (120 mM KC1; 0.15 mM CaCl 2 ; 2 mM EGTA; 5 mM MgCl 2 ; 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 ; 25 mM HEPES, pH 7.6), which contained 150 ⁇ g plasmid DNA from pPflytBKO, resus- pendiert.
  • the electroporation was carried out in 4 mm cuvettes at 2.5 kV, 200 ohms and 25 ⁇ F.
  • the parasites were then plated out again on culture dishes and incubated. 48 h after the transfection, 400 nM pyrimethamine was added to the culture medium and after a further 48 h the pyrimethamine concentration was reduced to 100 nM. Resistant parasites could be detected microscopically after 22 days. After 6 weeks, the pyrimethamine concentration was increased to 2 ⁇ M for a further 3 weeks. The parasites were cloned by limiting dilution on 96 well cell culture plates and cultured for 11 days in the absence of pyrimethamine. Then 1 ⁇ M pyrimethamine was added again. Culture in the absence of pyrimethamine causes episomal plasmids to be lost, and subsequent reselection can only survive parasites that have integrated the plasmid chromosomally.
  • the genus Plasmodium is closely related to phylogenetically lower algae (Fichera, ME and Roos, DS (1997) Nature, 390, 407-409; Köhler, S, Delwiche, CF, Denny, PW, Tilyne, LG, Webster, P., Wilson, RJM, Palmer, JD and Roos, DS (1997) Nature, 275, 1485-1489). It can therefore be deduced that the lytB gene is obviously also essential for plants.
  • a gene that codes for a selection marker was to be introduced into the yfgB gene by genetic engineering methods and this should be inactivated thereby.
  • a construct (pPfyfgBKO) was produced which contains an expression cassette which confers pyrimethamine resistance and is flanked by two fragments from the coding sequence of the yfgB gene from P. falciparum. This construct should be integrated into the gcpe gene by homologous recombination via the flanking sequences.
  • thermostable Pwo DNA polymerase All of the PCR amplifications described were carried out using thermostable Pwo DNA polymerase, as a result of which the products have blunt ends and are suitable for "blunt end” ligations.
  • the yfgB sequence was primed with 5'-ATG GAA AAG TCA AAA AGG TAC ATA AGC CTG-3 'and 5'-AGC ATC GTC CAA ACG ATG AAA ATT TTC GTC-3' and genomic DNA from the P. falciparum strain 3D7 amplified as a template, phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and cloned into a pUC 19 vector linearized with Sma I (pUCPfyfgB).
  • TgDHFR-TS The dihydrofolate reductase gene from Toxoplasma gondii
  • Pf CAM P. falciparum calmodulin
  • This expression cassette was obtained from the plasmid pTgD-TS.CAM5 / 3.KP, which had been constructed according to published protocols (Crabb, BS and Cowman, AF (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7289-7294 ).
  • the expression cassette was amplified with the primers 5 '-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3' and 5 '-
  • the expression cassette was then inserted into the insert of pUCPfyfgB.
  • pUCPfgcpe was opened with Pac I in the insert and the overhangs were filled in with T4 and Klenow DNA polymerase.
  • the amplified expression cassette was phosphorylated and inserted via "blunt end" ligation, whereby pPfyfgBKO was obtained.
  • the infected erythrocytes (strain 3D7, mainly ring stages, approx. 15% parasitemia) were pelleted in a 10 cm culture dish and in 0.8 ml cytomix (120 mM KC1; 0.15 mM CaCl 2 ; 2 mM EGTA; 5 mM MgCl 2 ; 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 ; 25 mM HEPES, pH 7.6), which contained 150 ⁇ g plasmid DNA from pPfyfgBKO.
  • the electroporation was carried out in 4 mm cuvettes at 2.5 kV, 200 ohms and 25 ⁇ F.
  • the parasites were then plated out again on culture dishes and incubated. 48 h after the transfection, 400 nM pyrimethamine was added to the culture medium and after a further 48 h the pyrimethamine concentration was reduced to 100 nM. Resistant parasites could be detected microscopically after 18 days. After 6 weeks, the pyrimethamine concentration was increased to 2 ⁇ M for a further 3 weeks. The parasites were cloned by limiting dilution on 96 well cell culture plates and cultured for 11 days in the absence of pyrimethamine. Then 1 ⁇ M pyrimethamine was added again.
  • the pKO3 vector was used to produce a deletion mutant of E. coli (Lini, A.J .; Phillips, D .; Church, G.M .; J. Bacteriol. 179, 6228-6237).
  • the primers were used in a 1: 10 molar ratio (50 nM and 500 nM). Both PCR products were fused into one product in a second PCR amplification.
  • the product was cloned using the pCR-TA-TOPO cloning kit (Invitrogen) and cloned into the pKO3 vector via the restriction sites Bam HI and Sal I.
  • the following primers were used:
  • restriction interfaces are underlined. Overlapping sequences that define a 21 bp 'in frame' insertion are printed in bold.
  • the gene replacement experiments were carried out in a manner similar to that described (Linie, A.J .; Phillips, D .; Church, G.M .; J. Bacteriol. 179, 6228-6237).
  • the plasmid p ⁇ L03-L ⁇ yfgB was in the E. coli K-12 strain DSM No. 498 (ATCC 23716). After 1 h incubation at 30 ° C, bacteria with integrated plasmid were selected by a temperature shift to 43 ° C.
  • the following test for sucrose resistance and chloramphenicol sensitivity selected bacteria that had lost the vector sequences and then analyzed them for the desired genotype by PCR. Bacteria with a .y / g / 3 deletion were not found, which proves that the yfgB gene is essential for E. coli.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Plasmodium falciparum, nämlich die Gene lytB und yfgB, die bei Integration in das Genom von Viren, Eukaryonten und Prokaryonten die Isoprenoid-Biosynthese verändern sowie gentechnologische Verfahren zur Herstellung dieser transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten. Ausserdem betrifft sie Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit herbizider, antimikrobieller, antiparasitärer, antiviraler, fungizider, bakterizider Wirkung bei Pflanzen und antimikrobieller, antiparasitärer, antimykotischer, antibakterieller und antiviraler Wirkung bei Mensch und Tier.

Description

Gene des 1-Desoxy-D-xylulose-Biosynthesewegs
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die bei Integration in das Genom von Viren, Eukaryonten und Prokaryonten die Isoprenoid-Biosynthese verändern sowie gentechnologische Verfahren zur Herstellung dieser transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten. Außerdem betrifft sie Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit herbizider, antimikrobieller, antiparasitärer, antiviraler, fungizider, bakterizider Wirkung bei Pflanzen und antimikrobieller, antiparasitärer, antimykotischer, antibakterieller und antiviraler Wirkung bei Mensch und Tier.
Der Biosyntheseweg zur Bildung von Isoprenoiden über den klassischen Acetat/ Mevalonat- Weg und einen alternativen, Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg, den Desoxy-D- xylulose-Phosphat-Weg (DOXP- oder MEP-Weg), ist bereits bekannt (Rohmer, M., Knani, M., Simonin, P., Sutter, B., and Sahm, H. (1993): Biochem. J. 295: 517-524).
Es ist aber nicht bekannt, wie und über welche Wege in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten eine Änderung der Isoprenoidkonzentration über den Desoxy-D-xylulose-Phoshat-Weg erreicht werden kann.
Es werden daher DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die für Enzyme codieren, die am DOXP- Weg beteiligt sind. Beide Gene (lytB und yfgB) und Enzyme (LytB und YfgB) sind an der Isoprenoid-Biosynthese beteiligt und für das Überleben der jeweiligen Organismen essentiell (Beispiel 1 und 2).
Die Erfindung betrifft die folgenden DNA-Sequenzen:
DNA- Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:5, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu redu- zieren, und
DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 14 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 14, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
Die Erfindung ist ferner durch die Ansprüche 1 bis 4 definiert. Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche definiert. Die Gene und ihre Genprodukte (Polypeptide) sind im Sequenzprotokoll mit ihrer Primärstruktur aufgeführt und haben folgende Zuordnung: SEQ ID NO:l : lytB-Gen SEQ ID NO: 5: LytB-Protein SEQ ID NO:9: yfgB-Gen SEQ ID NO: 14: YfgB-Protein
Die DNA-Sequenzen stammen alle aus Plasmodium falciparum, Stamm 3D7.
Außer den im Sequenzprotokoll genannten DNA-Sequenzen sind auch solche geeignet, die infolge der Degeneration des genetischen Codes eine andere DNA-Sequenz besitzen, jedoch für das gleiche Polypeptid oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert wor- den sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren, codieren.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen eignen sich für die Überexpression von Genen in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten, die für die Isoprenoid-Biosynthese des 1-Desoxy-D-xylulose- Wegs verantwortlich sind.
Erfindungsgemäß gehören zu den Eukaryonten oder eukaryontischen Zellen tierische Zellen, Pflanzenzellen, Algen, Hefen, Pilze und zu den Prokaryonten oder prokaryontischen Zellen Archaebakterien und Eubakterien.
Bei Integration einer DNA-Sequenz in ein Genom, auf der eine der oben angegebenen DNA- Sequenzen lokalisiert ist, wird die Expression der oben beschriebenen Gene in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten ermöglicht. Die erfindungsgemäß transformierten Viren, Eukaryonten und Prokaryonten werden in an sich bekannter Weise gezüchtet und das währenddessen gebildete Isoprenoid isoliert und gegebenenfalls gereinigt. Nicht alle Isoprenoide müssen iso- liert werden, da die Isoprenoide in einigen Fällen direkt in die Raumluft abgegeben werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten mit Isoprenoid-Expression, das die folgenden Schritte enthält.
a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen i) Promotor, der in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt, ii) DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 5 oder 14 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 5 oder 14, iii) S'-nichttranslatierte Sequenz, die in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten zur Ad- dition von Poly-A Resten an das 3Λ-Ende der RNA führt, b) Transfer und Einbau der DNA-Sequenz in das Genom von Viren, prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen mit oder ohne Verwendung eines Vektors (z.B. Plasmid, virale DNA).
Aus den transformierten Pflanzenzellen können die intakten ganzen Pflanzen regeneriert werden.
Die für die Proteine kodierenden Sequenzen mit den Nukleotidabfolgen Seq ID NO:l und Seq ID NO: 9 können mit einem die Transkription in bestimmten Organen oder Zellen sicherstelle- neden Promotor versehen werden, der in sense-Orientierung (3 '-Ende des Promotors zum 5 - Ende der kodierenden Sequenz) an die Sequenz, die das zu bildende Protein kodiert, gekoppelt ist. An das 3"-Ende der kodierenden Seqeunz wird ein die Termination der mRNA-Synthese bestimmendes Terminationssignal angehängt. Um das zu exprimierende Protein in bestimmte subzelluläre Kompartimente, wie Chloroplasten, Amyloplasten, Mitochondrien, Vakuole, Cytosol oder Interzellularräume zu dirigieren, kann zwischen den Promotor und die kodierende Sequenz noch eine für eine sogenannte Signalsequenz oder ein Transitpeptid kodierende Sequenz gesetzt werden. Die Sequenz muß im gleichen Leserahmen wie die kodierende Sequenz des Proteins sein. Zur Vorbereitung der Einführung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl von Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikati- onssignal für E.coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC 184, EMBL 3 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden zum Beispiel für die Transformation der Pflanzen- zelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens eine rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flanlcenbereich den einzuführenden Genen eingefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekama, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit.Rev.Plant Sei. 4,1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4, 277-287 beschrie- ben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zellen erhalten. Sie erhält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hy- gromycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine Pflanze stehen viele Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit Hilfe von Agrobakterien, z.B. Agrobacterium tu- mefaciens , die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elekroporation, sowie ballistische Methoden und die Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann im geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die Pflanzen können nor- mal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen haben, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Expressionsvektoren, die eine oder mehrere der er- findungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten. Solche Expressionsvektoren erhält man, indem man die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit geeigneten funktionellen Regulationssignalen versieht. Solche Regulationssignale sind DNA-Sequenzen, die für die Expression verantwortlich sind, beispielsweise Promotoren, Operatoren, Enhancer, ribosomale Bindungsstellen, und die vom Wirtsorganismus erkannt werden.
Gegebenenfalls können noch weitere Regulationssignale, die beispielsweise Replikation oder Rekombination der rekombinanten DNA im Wirtsorganismus steuern, Bestandteil des Expressionsvektors sein.
Ebenso gehören die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Expressionsvektoren transformierten Wirtsorganismen zum Gegenstand der Erfindung.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich besonders solche Wirtszellen und Organismen, die keine intrinsischen Enzyme des DOXP- Wegs aufweisen. Dies trifft für Archaebacterien, Tiere, einige Pilze, Sclileimpilze und einige Eubakterien zu. Durch das Fehlen dieser intrinsischen Enzymaktivitäten wird die Detektion und Aufreinigung der rekombinanten Enzyme wesentlich erleichtert. Auch wird es erst dadurch möglich, mit geringem Aufwand die Aktivität und insbesondere die Hemmung der Aktivität der erfindungsgemäßen rekombinanten Enzyme durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka in Rohextrakten aus den Wirtszellen zu messen.
Die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme erfolgt vorteilhafterweise dann in eukaryonti- sehen Zellen, wenn posttranslatorische Modifikationen und eine native Faltung der Polypeptid- kette erreicht werden soll. Außerdem wird in Abhängigkeit vom Expressionssystem bei der Expression genomischer DNA-Sequenzen erreicht, daß Introns durch Spleißen der DNA beseitigt und die Enzyme in der für die Parasiten charakteristischen Polypeptidsequenz produziert werden. Für Introns codierende Sequenzen können auch durch rekombinante DNA- Technologie aus den zu exprimierenden DNA-Sequenzen beseitigt oder experimentell eingefügt werden.
Die Isolierung des Proteins kann aus der Wirtszelle oder dem Kulturüberstand der Wirtszelle nach dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Es kann auch eine in vitro Reaktivierung der Enzyme erforderlich sein.
Zur Erleichterung der Aufreinigung können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilsequenzen der Enzyme als Fusionsprotein mit verschiedenen Peptidketten exprimiert werden. Dazu eigenen sich besonders Oligo-Histidin-Sequenzen und Sequenzen, die von der Glutathion-S- Transferase, Thioredoxin oder Calmodulin-bindenden Peptiden abgeleitet sind. Fusionen mit Thioredoxin-abgeleiteten Sequenzen eignen sich besonders für prokaryontische Expression, da dadurch die Löslichkeit der rekombinanten Enzyme erhöht wird.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilsequenzen der Enzyme als Fusi- onsprotein mit solchen, dem Fachmann bekannten, Peptidketten exprimiert werden, daß die rekombinanten Enzyme in das extrazelluläre Millieu oder in bestimmte Kompartimente der Wirtszellen transportiert werden. Dadurch kann sowohl die Aufreinigung, als auch die Untersuchung der biologischen Aktivität der Enzyme erleichtert werden.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Enzyme kann es sich als zweckmäßig erweisen, einzelne Codone zu verändern. Dabei ist der gezielte Austausch von Basen in der kodierenden Region auch sinnvoll, wenn die genutzten Codone in den Parasiten abweichend sind von der Codonnutzung im heterologen Expressionssystem, um eine optimale Synthese des Proteins zu gewährleisten. Zudem sind oft Deletionen von nicht-translatierten 5 ' bzw. 3 '-Abschnitten sinn- voll, beispielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive ATTTA im 3 '-Bereich der /DNA vorliegen. Dann sollten diese bei der bevorzugen Expression in Eukaryonten deletiert werden. Veränderungen dieser Art sind Deletionen, Additionen oder Austausch von Basen und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme unter standardisierten Bedingungen durch dem Fachmann bekannte Techniken durch in vitro-Translation gewonnen werden. Dafür geeignete Systeme sind Kaninchen-Reticulozyten- und Weizenkeimextrakte und Bakterienlysate. Auch kann in vitro transskribierte mRNA in Xenopus-Oocyten translatiert werden.
Durch chemische Synthese können Oligo- und Polypeptide hergestellt werden, deren Sequenzen aus der Peptidsequenz der erfindungsgemäßen Enzyme abgeleitet sind. Bei geeigneter Wahl der Sequenzen besitzen derartige Peptide Eigenschaften, die für die vollständigen erfin- dungsgemäßen Enzyme charakteristisch sind. Derartige Peptide können in großen Mengen hergestellt werden und eignen sich besonders für Studien über die Kinetik der Enzymaktivität, die Regulation der Enzymaktivität, die dreidimensionale Struktur der Enzyme, die Hemmung der Enzymaktivität durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka und die Bindungsgeometrie und Bindungsaffinität verschiedener Liganden.
Vorzugsweise wird zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen Enzyme eine DNA mit den Nukleotiden aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und 9 verwendet.
Wie oben dargelegt gibt es in Pflanzen neben dem klassischen Acetat/ Mevalonat-Weg einen alternativen, Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg zur Bildung von Isoprenoiden, den Desoxy-D-xylulose-Phosphat-Weg (DOXP-Weg). Es hat sich herausgestellt, daß in vielen Parasiten, Bakterien, Viren und Pilzen dieser Desoxy-D-xylulose-Phosphat-Stoffwechselweg ebenfalls vorliegt.
Die Erfindung umfaßt daher außerdem ein Verfahren zum Screening einer Verbindung. Gemäß diesem Verfahren wird ein Wirtsorganismus, der einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Olignukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 9 oder Varianten oder Homologe dieser aufweist, und außerdem eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimikrobielle, antiparasitäre, antivirale und an- timykotische Wirkung bei Mensch und Tier oder eine bakterizide, antimikrobielle, herbizide oder fungizide Wirkung bei Pflanzen hat, bereitgestellt. Anschließend wird der Wirtsorganismus mit der Verbindung in Kontakt gebracht und die Wirksamkeit der Verbindung bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind Methoden zur Bestimmung der enzymatische Aktivität des LytB- und YfgB-Proteins. Diese kann nach den bekannten Techniken bestimmt werden. Hierbei wird die Konzentrationsänderung der Intermediate des DOXP-Wegs, die als Substrate oder Produkte der jeweiligen Enzyme fungieren, durch photometrische, fiuorimetri- sche oder chromatographische Verfahren bestimmt. Der Nachweis der Konzentrationsänderung kann auch durch gekoppelte Enzymassays erfolgen, wobei der Nachweis über ein oder mehrere zusätzliche enzymatische Schritte erfogt. Die zusätzlichen Enzyme können ebenfalls am DOXP- Weg beteiligt sein oder experimentell dem System zugefügt werden.
Beispiel 1
Um zu überprüfen, ob das lytB- Genprodukt für das Überleben der Blutstadien des Malariaerregers Plasmodium falciparum notwendig ist, wurde versucht, eine "gene disruption"- Mutante von P. falciparum herzustellen. Bei dieser Mutante sollte durch gentechnische Methoden ein Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, in das gcpe-Gen eingeführt und dieses dadurch inaktiviert werden. Dazu wurde ein Konstrukt (pPflytBKO) hergestellt, das eine Expressionskassette, die Pyrimethamin-Resistenz vermittelt, enthält und von zwei Fragment aus der codierenden Sequenz des lytB-Gens von P. falciparum flankiert wird. Dieses Konstrukt sollte durch homologe Rekombination über die flankierenden Sequenzen in das gcpe-Gen integriert werden.
Alle beschriebenen PCR-Amplifikationen wurden mit thermostabiler Pwo-DN A-Polymerase durchgeführt, wodurch die Produkte glatte Enden erhalten und für "blunt end"-Ligationen geeignet sind. Die Sequenz des lytB-Gens wurde mit den Primern 5'-ATG TCA GTT ACC ACA TTT TGT TCT TTA AAA AAA ACG G-3' und 5'-GTG ATT TCA TTT TTC TCT TTC TTT TAT CAT C-3' und genomischer DNA aus dem P. falciparum- Stamm 3D7 als Template ampli- fiziert, mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und in einen mit Sma I linearisierten pUC 19- Vektor kloniert (pUCPflytB). Als Selektionsmarker wurde das Dihydrofolatreduktase-Gen von Toxoplasma gondii (Tg DHFR-TS) verwendet, das so modifiziert worden war, daß es Resistenz gegen Pyrimethamin vermittelt. Die Expression von TgDHFR-TS erfolgte unter der Kontrolle der 5'- und 3'- nicht-translatierten Elemente des P. falciparum-Calmodulin (Pf CAM)- Gens. Diese Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pTgD-TS.CAM5/3.KP gewonnen, das nach publizierten Protokollen konstruiert worden war (Crabb, B. S. und Cowman, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7289-7294). Die Expressionskassette wurde durch Amplifikation mit den Primern 5'-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3' und 5'- GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-3' mit pTgD-TS.CAM5/3.KP als Tem- plate gewonnen. Anschließend wurde die Expressionskassette in das Insert von pUCPfgcpe eingefügt. Dazu wurde pUCPflytB mit Dsa I im Inserts geöffnet und die Überhänge mit T4- und Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt. Die amplifizierte Expressionskassette wurde phosphoryliert und über "blunt end"-Ligation eingefügt wodurch pPflytBKO erhalten wurde.
Zur Transfection durch Elektroporation wurden die infizierten Erythrozyten (Stamm 3D7, hauptsächlich Ringstadien, ca. 15 % Parasitämie) einer 10 cm-Kulturschale pelletiert und in 0,8 ml Cytomix (120 mM KC1; 0,15 mM CaCl2; 2 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM K2HPO4 / KH2PO4; 25 mM HEPES, pH 7,6), der 150 μg Plasmid-DNA von pPflytBKO enthielt, resus- pendiert. Die Elektroporation erfolgte in 4 mm-Küvetten bei 2,5 kV, 200 Ohm und 25 μF. Anschließend wurden die Parasiten wieder auf Kulturaschalen ausplattiert und inkubiert. 48 h nach der Transfection wurde dem Kulturmedium 400 nM Pyrimethamin zugefügt und nach weiteren 48 h die Pyrimethaminkonzentration auf 100 nM verringert. Nach 22 Tagen konnten resistente Parasiten mikroskopisch nachgewiesen werden. Nach 6 Wochen wurde die Pyrimethaminkonzentration für weitere 3 Wochen auf 2 μM erhöht. Die Parasiten wurden durch limittierende Verdünnung auf 96 Well-Zellkulturplatten kloniert und für 11 Tage in Abwesenheit von Pyrimethamin kultiviert. Dann wurden wieder 1 μM Pyrimethamin zugefügt. Durch die Kultur in Abwesenheit von Pyrimethamin gehen episomale Plasmide verloren, und bei der anschließenden erneuten Selektion können nur Parasiten überleben, die das Plasmid chromo- somal integriert haben.
In nur 5 Wells wuchsen Parasiten heran, da das Plasmid offenbar bei den meisten Parasiten episomal vorlag. Bei diesen Klone konnte die Expression des lytB-Gens durch RT-PCR noch nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde also durch nicht-homologe Rekombination in das Genom integriert und das lytB-Gen der Parasiten nicht inaktiviert. Offenbar sind also Parasiten mit inaktiviertem lytB-Gen nicht lebensfähig und das Gen damit essentiel. Nach neueren Erkenntnissen steht die Gattung Plasmodium phylogenetisch niederen Algen nahe (Fichera, M. E. und Roos, D. S. (1997) Nature, 390, 407-409; Köhler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Til- ney, L. G., Webster, P., Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. und Roos, D. S. (1997) Nature, 275, 1485-1489). Daher ist abzuleiten, daß das lytB-Gen offensichtlich auch für Pflanzen essentiell ist.
Beispiel 2
Um zu überprüfen, ob das yfgB- Genprodukt für das Überleben der Blutstadien des Malariaerregers Plasmodium falciparum notwendig ist, wurde versucht, eine "gene disruption"- Mutante von P. falciparum herzustellen. Bei dieser Mutante sollte durch gentechnische Methoden ein Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, in das yfgB-Gen eingeführt und dieses dadurch inaktiviert werden. Dazu wurde ein Konstrukt (pPfyfgBKO) hergestellt, das eine Expressionskassette, die Pyrimethamin-Resistenz vermittelt, enthält und von zwei-Fragment aus der codierenden Sequenz des yfgB-Gens von P. falciparum flankiert wird. Dieses Konstrukt sollte durch homologe Rekombination über die flankierenden Sequenzen in das gcpe-Gen integriert werden.
Alle beschriebenen PCR-Amplifikationen wurden mit thermostabiler Pwo-DNA-Polymerase durchgeführt, wodurch die Produkte glatte Enden erhalten und für "blunt end"-Ligationen geeignet sind. Die yfgB-Sequenz wurde mit den Primern 5'-ATG GAA AAG TCA AAA AGG TAC ATA AGC CTG-3' und 5'-AGC ATC GTC CAA ACG ATG AAA ATT TTC GTC-3' und genomischer DNA aus dem P. falciparum- Stamm 3D7 als Template amplifiziert, mit T4- Polynukleotidkinase phosphoryliert und in einen mit Sma I linearisierten pUC 19-Vektor klo- niert (pUCPfyfgB). Als Selektionsmarker wurde das Dihydrofolatreduktase-Gen von Toxoplasma gondii (Tg DHFR-TS) verwendet, das so modifiziert worden war, daß es Resistenz gegen Pyrimethamin vermittelt. Die Expression von TgDHFR-TS erfolgte unter der Kontrolle der 5'- und 3'- nicht-translatierten Elemente des P. falciparum-Calmodulin (Pf CAM)- Gens. Diese Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pTgD-TS.CAM5/3.KP gewonnen, das nach publizierten Protokollen konstruiert worden war (Crabb, B. S. und Cowman, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7289-7294). Die Expressionskassette wurde durch Amplifikation mit den Primern 5 '-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3 ' und 5 '-
GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-3' mit PTgD-TS.CAM5/3.KP als Template gewonnen. Anschließend wurde die Expressionskassette in das Insert von pUCPfyfgB eingefügt. Dazu wurde pUCPfgcpe mit Pac I im Insert geöffnet und die Überhänge mit T4- und Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt. Die amplifizierte Expressionskassette wurde phosphory- liert und über "blunt end"-Ligation eingefügt wodurch pPfyfgBKO erhalten wurde.
Zur Transfection durch Elektroporation wurden die infizierten Erythrozyten (Stamm 3D7, hauptsächlich Ringstadien, ca. 15 % Parasitämie) einer 10 cm-Kulturschale pelletiert und in 0,8 ml Cytomix (120 mM KC1; 0,15 mM CaCl2; 2 mM EGTA; 5 mM MgCl2; 10 mM K2HPO4 / KH2PO4; 25 mM HEPES, pH 7,6), der 150 μg Plasmid-DNA von pPfyfgBKO enthielt, resuspendiert. Die Elektroporation erfolgte in 4 mm-Küvetten bei 2,5 kV, 200 Ohm und 25 μF. Anschließend wurden die Parasiten wieder auf Kulturaschalen ausplattiert und inkubiert. 48 h nach der Transfection wurde dem Kulturmedium 400 nM Pyrimethamin zugefügt und nach weiteren 48 h die Pyrimethaminkonzentration auf 100 nM verringert. Nach 18 Tagen konnten resistente Parasiten mikroskopisch nachgewiesen werden. Nach 6 Wochen wurde die Pyrimethaminkonzentration für weitere 3 Wochen auf 2 μM erhöht. Die Parasiten wurden durch limittierende Verdünnung auf 96 Well- Zellkulturplatten kloniert und für 11 Tage in Abwesenheit von Pyrimethamin kultiviert. Dann wurden wieder 1 μM Pyrimethamin zugefügt. Durch die Kultur in Abwesenheit von Pyrimethamin gehen episomale Plasmide verloren, und bei der anschließenden erneuten Selektion können nur Parasiten überleben, die das Plasmid chromo- somal integriert haben. Die erneute Pyrimethaminzugabe wurde von keinem Parasitenklon überlebt. Diese Ergebnis deutet daraufhin, daß Parasiten mit inaktiviertem yfgB-Gen nicht lebensfähig sind und das Gen damit essentiel ist. Nach neueren Erkenntnissen steht die Gattung Plasmodium phylogenetisch niederen Algen nahe (Fichera, M. E. und Roos, D. S. (1997) Na- ture, 390, 407-409; Köhler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Tilney, L. G., Webster, P.,
Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. und Roos, D. S. (1997) Nature, 275, 1485-1489). Daher ist abzuleiten, daß das yfgB-Gen offensichtlich auch für Pflanzen essentiell ist. Beispiel 3: Das yfgB Gen ist essentiell für Escherichia coli
Konstruktion des Gen-Austausch-Plasmids pK03-ΔyfgB
Zur Herstellung einer Deletionsmutante von E. coli wurde der pKO3 Vektor benutzt (Lini , A. J.; Phillips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237). Zur Herstellung des Deletions- konstrukts wurden zwei Sequenzen stromabwärts und stromaufwärts des yfgB-Gens in zwei asymmetrischen PCR- Ansätzen amplifiziert. Die Primer wurden in 1 : 10- molarem Verhältnis (50 nM und 500 nM) eingesetzt. Beide PCR-Produkte wurden in einer zweiten PCR- Amplifikation zu einem Produkt fusioniert. Das Produkt wurde unter Verwendung des pCR- TA-TOPO Cloning Kits (Invitrogen) kloniert und über die Restriktionsschnittstellen Bam HI und Sal I in den pKO3-Vektor kloniert. Folgende Primer wurden verwendet:
yfgB-N-out, 5 '-AGGATCCtccatcatcaaaccgaac-3 ' yfgB-N-in, 5 '-TCCC ATCCACTAAACTTAAACATctattccggcctcgttat-3 ' yfgB-C-in, 5'-ATGTTTAAGTTTAGTGGATGGGaagcggtctgatagccatt-3' yfgB-C-out, 5 '-AGTCGACaagtggagcctgcttttc-3 '.
Die Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen. Überlappende Sequenzen, die eine 21 bp-'in frame'-Insertion definieren, sind fett gedruckt.
Konstruktion der Deletionsmutante v/tΔyfgB
Die 'gene replacement' -Versuche wurden ähnlich wie beschrieben durchgeführt (Linie, A. J.; Phillips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237). Das Plasmid p¥L03-L\yfgB wurde in den E. coli K-12 Stamm DSM No. 498 (ATCC 23716) transformiert. Nach 1 h Inkubation bei 30°C wurden Bakterien mit integriertem Plasmid durch einen Temperatur-Shift auf 43°C se- lektioniert. Durch folgende Testung auf Sucrose-Resistenz und Chloramphenicol-Sensitivität wurden Bakterien, die die Vektorsequenzen verloren hatten, selektioniert und anschließend durch PCR auf den gewünschten Genotyp analysiert. Bakterien mit einer .y/g/3-Deletion waren nicht auffindbar, was beweist, daß das yfgB-Gen essentiell für E. coli ist.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Ami- nosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß
SEQ ID NO:5, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz.
3. DNA- Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 14 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 14, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3 mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäurese- quenz.
5. DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem funktioneile Regulationssignale, insbesondere Promotoren, Operatoren, En- hancer, ribosomale Bindungsstellen, aufweist.
6. DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen i) Promotor, der in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt, ii) DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 5 oder 14 darge- stellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 5 oder 14, iii) 3'-nichttranslatierte Sequenz, die in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten zur Addition von Poly-A Resten an das 3 '-Ende der RNA führt,
7. Expressionsvektor, enthaltend eine oder mehrere DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
8. Protein, welches am l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg beteiligt ist und a) codiert wird von der in DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 9 oder b) codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder 9 oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der für das reife Protein codiert, hy- bridisieren oder c) codiert wird von DNA-Sequenzen, die ohne Degeneration des genetischen Codes mit den in b) definierten Sequenzen hybridisieren würden und für ein Polypeptid mit entsprechender Aminosäuresequenz codieren.
9. Protein nach Anspruch 8, welches die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 5 oder 14 aufweist.
10. Pflanzenzellen, enthaltend DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen, enthal- tend DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
12. Transgene Viren, Eukaryonten und Prokaryonten mit Isoprenoid-Expression, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthalten.
13. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmund der enzymatischen Aktivität des LytB- und YfgB-Proteins.
14. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Veränderung, insbesondere Erhöhung des Isoprenoidgehalts in Viren, eukaryontischen und proka- ryontischen Zellen.
15. Verwendung von DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf das LytB- und YfgB-Protein haben.
16. Verfahren zur Isolierung eines Proteins nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Kulturüberstände von Parasiten oder von aufgeschlossenen Parasiten über chromatographische und elektrophoretischen Techniken aufgereinigt werden.
17. Verfahren zur Isolierung eines Proteins nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es das Produkt einer viralen, prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist.
18. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des LytB- und YfgB-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationsänderung der Substrate, Co-Substrate und Produkte bestimmt wird.
19. Verfahren zur Herstellung von transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten mit Isoprenoid-Expression, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4 oder 5 in das Genom von Viren, eukaryontischen und prokaryontischen Zellen mit oder ohne Verwendung eines Plasmids transferiert und eingebaut wird.
20. Verfahren zum Screening einer Verbindung, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bereitstellen einer Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Oligonukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 9 oder Varianten oder Analoga dieser aufweist, und außer- dem eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimykotische, antibioti- sche, antiparasitäre oder antivirale Wirkung bei Mensch und Tier hat, b) In-Kontakt-Bringen des Mikroorganismus mit der Verbindung und c) Bestimmung der antimykotischen,antibiotischen, antiparasitären oder antiviralen Wirksamkeit der Verbindung..
21. Verfahren zum Screening einer Verbindung, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bereitstellen einer Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Oligonukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 9 oder Varianten oder Analoga dieser aufweist, und außer- dem eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimykotische, antibioti- sche, antiparasitäre oder antivirale Wirkung bei Mensch und Tier hat, b) In-Kontakt-Bringen des Mikroorganismus mit der Verbindung und c) Bestimmung der bakteriziden, fungiziden oder herbiziden Wirksamkeit der Verbindung.
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