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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Proteinen.
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Die Biosynthese von Isoprenoiden über den klassischen
Mevalonat-Weg ist seit längerem
bekannt. Es konnte in jüngerer
Zeit gezeigt werden, daß bei
einigen Bakterien, Parasiten und in den Plastiden der Pflanzen die
Isoprenoidsynthese über
einen alternativen Weg, den sog. DOXP-Weg (Synonyme: MEP-Weg, Nicht-Mevalonat-Weg,
Rohmer-Weg) erfolgt (1).
Die meisten Reaktionsschritte des DOXP-Wegs, die durch die Enzyme
DOXP-Synthase (Dxs), DOXP-Reductoisomerase (Dxr), YgbP, YchB, und
YgbB katalysiert werden, sind inzwischen gut erforscht. Darüber hinaus
ist bekannt, daß die
Enzyme GcpE und LytB an den späten
Reaktionsschritten des DOXP-Wegs beteiligt sind. GcpE ist nach derzeitigen Erkenntnissen
an der Umwandlung von 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphat
(MEcPP) in 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat
(HMBPP) beteiligt. LytB katalysiert die Umwandlung von HMBPP in
Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP) und Dimethylallyl-Pyrophosphat (DMAPP).
Die publizierten Hinweise (s.u.) auf die Funktion von GcpE und LytB sind
jedoch nur indirekt. Die enzymatische Aktivität dieser Enzyme konnte noch
nie in einem in vitro-System
mit genau bekannter Zusammensetzung demonstriert werden.
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Die Enzyme des DOXP-Wegs stellen
interessante Zielstrukturen für
die Entwicklung neuer antimikrobieller und herbizider Wirkstoffe
dar. Da der menschliche und tierische Organismus Isoprenoide nicht über den
DOXP-Weg, sondern über
den Mevalonat-Weg synthetisiert, ist von derartigen Wirkstoffen
nur eine sehr geringe Toxizität
zu erwarten. So konnte gezeigt werden, daß Fosmidomycin, ein Inhibitor
der DOXP-Reductoisomerase, hochwirksam gegen bakterielle und parasitäre Infektionen
ist. Klinische Daten über
die Effizienz von Fosmidomycin zur Behandlung von Malaria und Urogenitaltrakt-Infektionen
sind verfügbar.
Außerdem
ist Fosmidomycin als Herbizid wirksam. Dabei ist Fosmidomycin mit
einer LD50 > 11 g/kg
p.o. in der Ratte extrem ungiftig.
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Es ist davon auszugehen, daß Inhibitoren
für weitere
Enzyme des DOXP-Wegs vergleichbar vorteilhafte Eigenschaften für die pharmazeutische
und agrochemische Anwendung bieten. Besonders durch die gleichzeitige
Applikation von Inhibitoren für
verschiedene Enzyme des DOXP-Wegs können Wirkstoffkombinationen
mit synergistischer Wirkung erhalten werden. Derzeit sind nur Inhibitoren
für die DOXP-
Reductoisomerase beschrieben. Außerdem wurde Fluoropyruvat
als schwacher Inhibitor der DOXP-Synthase identifiziert. Für die übrigen Enzyme des
DOXP-Wegs existieren keine bekannten Inhibitoren. Deshalb besteht
ein Bedarf nach geeigneten Testsystemen zur Auffindung derartiger
Inhibitoren. Dafür
ist es in notwen dig, die Aktivität
der jeweiligen Enzyme in einer definierten Versuchsanordnung messen
zu können.
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Verschiedene Hinweise auf die Funktion
von GcpE und LytB sind publiziert. So haben bioinformatische Ansätze ergeben,
daß das
gcpE und lytB-Gen nur bei solchen Organismen vorkommt, die auch
die Gene für
die übrigen
Enzyme des DOXP-Wegs besitzen. Erste experimentelle Hinweise auf
die Funktion von LytB wurden mit Hilfe von Cyanobakterien der Gattung
Synechocystis mit einer Mutation im Promotorbereich des lytB-Gens
gewonnen. Die Zellen waren im Wachstum und der Pigmentproduktion
beeinträchtigt
(Cunningham et al., 2000, J. Bacteriol. 182: 5841–5848).
Durch Zusatz von 3-Methyl-3-buten-1-ol und Methyl-2-buten-1-ol, den Alkohol-Derivaten
der Isoprenoid-Vorläufermoleküle IPP und
DMAPP, konnte der wildtypische Phänotyp rekonstituiert werden.
Durch Überexpression
des lytB-Gens verschiedener
Organismen in E. coli-Bakterien, die durch gentechnische Veränderungen
zur Karotinoid-Synthese befähigt
waren, wurde eine verstärkte
Karotinoid-Produktion beobachtet.
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Außerdem wurden E.coli-Mutanten
konstruiert, bei denen das gcpE oder lytB-Gen deletiert wurde. Diese
Zellen waren nur lebensfähig,
wenn sie ein artifizielles Operon enthielten, das die Synthese von Isoprenoiden über den
Mevalonat-Weg ermöglichte (Altincicek
et al., 2001, FEBS Lett. 499:37–40;
Altincicek et al., 2001, J Bacteriol. 183:2411–6). Die Deletion des gcpE-Gens
führte
zu einer Akkumulation von MEcPP in den Bakterienzellen (Seemann
et al., 2002, Tetrahedron Lett. 44:775–8). Analog wurde bei gcpE-Deletionsmutanten
eine ca. 150-fache
Anreicherung von HMBPP beobachtet (Hintz et al., 2001, FEBS Lett.
509:317–322).
Daraus wurde geschlossen, dass MEcPP das Substrat von GcpE und HMBPP
das Substrat von LytB darstellt.
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Mit dem Ziel die Reaktionsprodukte
der beiden Enzyme zu identifizieren, wurden E. coli-Bakterien konstruiert,
die die Gene dxr, ygbP, ychB, ygbB und gcpE auf einem artifiziellen
Operon überexprimierten
(Hecht et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:1483–42). Außerdem exprimierten
diese Zellen das xylB-Gen über,
dessen Genprodukt für
die Phosphorylierung von 1-Desoxy-D-xylulose zu DOXP verantwortlich
ist. Wenn dem Kulturmedium dieser Zellen 13C-markierte
1-Desoxy-D-xylulose zugesetzt wurde, konnte die Produktion von HMBPP durch
NMR Spektroskopie nachgewiesen werden. Enthielt das Operon zusätzlich das
lytB-Gen, wurde die Produktion von IPP und DMAPP nachgewiesen (Rohdich
et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1158–1163).
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Die Produktion von HMBPP aus MEcPP konnte
in Extrakten aus E. coli-Zellen, die das gcpE-Gen auf einem Expressionsplasmid
enthielten, beobachtet werden (Seemann et al., 2002, Tetrahedron
Lett. 43, 1413–15).
Die Umsetzung von HMBPP in IPP und DMAPP konnte analog in Extrakten
aus E. coli-Zellen, die das lytB-Gen überexprimieren, gezeigt werden
(Adam et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Aug. 27, e-published
ahead of print). Außerdem
konnte eine verstärkte
Umsetzung von HMBPP in IPP und DMAPP in E. coli-Zellextrakten oder Extrakten aus isolierten
Chromoplasten des Roten Pfeffers gezeigt werden, wenn den Extrakten
rekombinantes LytB-Protein zugesetzt wurde. Bei diesen Versuchen
war die Umsetzung aber von unbekanntene Faktoren, die aus den Zellextrakten
stammten, abhängig.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Proteinen
des DOXP-Wegs bereitzustellen. Dieses Verfahren soll ferner dazu
genutzt werden, Substanzen mit antimikrobieller Wirkung oder herbizider Wirkung,
jedoch geringen Nebenwirkungen für Mensch
und Tier aufzufinden.
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Überraschenderweise
hat sich nun herausgestellt, daß sowohl
die Aktivität
des GcpE- als auch des LytB-Enzyms in einem definierten System gemessen
werden kann, wenn eine Verbindung mit elektronenübertragenden Eigenschaften
verwendet wird. Es wird also ein Verfahren zur gleichzeitigen oder
getrennten Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, ausgewählt aus
GcpE und LytB, bereitgestellt, in dem das jeweilige Enzym, eine
oder mehrere Verbindungen mit elektronenübertragenden Eigenschaften
und mindestens eine Substanz, ausgewählt aus 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphat
(MEcPP) und 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat
(HMBPP) miteinander in Kontakt gebracht werden und der Umsatz oder
die Konzentrationsänderung
oder die Änderung
des Oxidationszustands einer der beteiligten Verbindungen gemessen
wird und daraus die Aktivität
des Enzyms bestimmt wird. Als Verbindungen mit elektronenübertragenen
Eigenschaften eignen sich besonders Dithionit, Titan(III)citrat,
Methylviologen, Benzylviologen oder eine andere Verbindung ausgewählt aus
der Gruppe, die aus Antrachinon; Antrochinon-2,6-disulfonat; Antrochinon-2-sulfonat; 2-Hydroxy-1,4-anthrachinon;
1,4-Benzochinon; Tetrachlorobenzochinon; 2,5-Dibromo-3-methyl-6-isopropylbenzochinon; 5-n-Undecyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazol; 1,4-Naphtochinon;
1,4-Naphtochinon-2-sulfonat; 1,2-Naphtochinon; 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon; 5-Hydroxy-1,4-naphthochinon;
Indigo; 5,5'-Indigodisulfonat;
5,5',7-Indigotrisulfonat;
5,5',7,7'-Indigotetrasulfonat;
N,N,N',N',-Tetramethyl-p-phenylendiamin; 2,3,5,6-Tetramethyl-p-phenylendiamin;
Phenazin; Phenazinethosulfat; Phenazinmethosulfat; N-Methylphenazoniummethosulfat;
N-Methylphenazoniumsulfonatmethosulfat; N-Ethylphenazoniumethosulfat; N-Methyl-1-hydroxyphenazoniummethosulfat; Neutral-Rot;
Phenol-Rot; Chlorphenol-Rot; Cresol-Rot; Bromcresol-Purpur; Methylen-Blau;
Toluidin-Blau; Safranin;
2,6-Dichlorphenolindophenol; Durochinon; Pyocyanin; Ruthenium-Hexaminchlorid; Trimethylhydrochinon;
Menadion; 5-Deaza-7,8-dimethyl-10-methylisoalloxazin; Difenzoquat;
Deiquat; photoreduziertes Deazaflavin besteht. Auch eignen sich
weitere Verbindungen, durch die die Übertragung eines einzelnen
Elektrons möglich
ist, be sonders chinoide Verbindungen, die zur Ausbildung eines Hemichinons
befähigt
sind. Als Elektronenübertäger können auch
geeignete Proteine verwendet werden. Besonders eignen sich Cytochrome,
Flavodoxin, Flavodoxinreduktase, Ferredoxin, Ferredoxinreductase,
Thioredoxin, Thioredoxinreductase, YfgB und Glutathionreductase.
Auch ist die gleichzeitige Verwendung einer der oben erwähnten Verbindungen
und einem Protein mit elektronenübertragenden Eigenschaften
möglich.
Aufgrund des unterschiedlichen Absorptionsverhaltens des reduzierten
und oxidierten Elektronenübertägers kann
der enzymatische Umsatz durch photometrische Messung kontinuierlich
verfolgt werden. Grundsätzlich
können
auch mehrere der genannten Elektronenüberträger verwendet werden.
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Die GcpE, bzw. LytB-Aktivität kann bei
diesem Verfahren auch direkt durch Messung der Konzentrationsänderungen
des umgesetzten Substrats (MEcPP, bzw. HMBPP) oder der gebildeten
Produkte (HMBPP, bzw. IPP und DMAPP) bestimmt werden. Dazu eignen
sich verschiedene chromatographische und spektroskopische Methoden
wie HPLC, MS, LC-MS, GC, GC-MS, NMR oder DC. Besonders geeignet
sind NMR, HPLC und LC-MS. Prinzipiell kann die Aktivität auch über die
Umkehrreaktion bestimmt werden. Auch ist es möglich, gekoppelte Testsysteme
aufzubauen, bei denen ein oder mehrere weitere enzymatische oder
chemische Reaktionen vor- oder nachgeschaltet sind. Insbesondere
ist die gleichzeitige Aktivitätsbestimmung
von GcpE und LytB möglich.
Weiterhin kann der enzymatische Umsatz potentiometrisch oder photometrisch über die
Absorption des Eisen-Schwefel-Clusters des LytB-Proteins gemessen werden.
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Die Substrate MEcPP, bzw. HMBPP werden bevorzugt
in einer Konzentration von 0,001 bis 10 mM eingesetzt, der Elektronenüberträger in einer Konzentration
von 0,01 bis 10 mM. Die verwendeten Substrate können chemisch oder enzymatisch
synthetisiert oder aus Bakterien-, Pflanzen- oder Parasitenzellen,
bevorzugt nach Deletion des gcpE-, bzw. des lytB-Gens, isoliert
werden.
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Die Überführung des Elektronenüberträgers in
die reduzierte Form erfolgt z.B. durch Zusatz von geeigneten Reduktionsmitteln,
wie z.B. Na-Dithionit oder Titan(III)citrat. Diese Reduktionsmittel
können bereits
allein zu einem Substratumsatz führen.
Auch in diesem Fall kann Methylviologen, Benzylviologen oder eine
weitere Verbindung, die sich als Redox-Indikator eignet, verwendet
werden, um den Ablauf der Reaktion photometrisch zu verfolgen. Prinzipiell
kann die Reduktion des Elektronenüberträgers auch photochemisch, elektrochemisch
oder enzymatisch erfolgen.
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Die photometrische Messung des Umsatzes erfolgt
bevorzugt in einem Wellenlängenbereich
von 200 nm bis 800 nm, ganz bevorzugt bei 604 nm, 662 nm und 732
nm, wenn z.B. Methylviologen als Elektronenüberträger genutzt wird. Die Reaktion
kann in verschiedenen kompa tiblen Puffersystemen erfolgen. Beispielsweise
eignen sich als Puffer TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, MES, Phosphat.
Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen 4,0 und 9,5. Außerdem können Salze
wie NaCl, KCl, LiCl und MgCl2 zugesetzt
werden. Die Reaktion kann in Gegenwart verschiedener Kationen, vor
allem Co2+, Mn2+,
Fe2
+, Mg2+, Ni2+, Zn2+, die beispielsweise als Chloride zugesetzt
werden, erfolgen. Auch kann der Zusatz von Molybdän-, Wolfram-
und Vanadium-Verbindungen günstig
sein. Das System ist tolerant gegen hohe Varianzen in der Gesamtsalzkonzentration,
vorzugsweise werden aber Konzentrationen zwischen 5 und 1000 mM
verwendet. Es können
auch Sulfhydryl-reaktive Reduktionsmittel wie DTT, 2-Mercaptoethanol, Glutathion
und Cystein zugesetzt werden, vorzugsweise im Konzentrationsbereich
zwischen 0,5 und 20 mM. Weiter mögliche
Additiva sind NADH, NAD+, NADPH, NADP+, FAD, FADH2, FMN,
FMNH2 und Tris(2-carboxyethyl)phosphin,
bevorzugt in Konzentrationen von 0,01 bis 20 mM. Auch kann ein günstiger
Effekt durch den Zusatz von unspezifischen Proteinen wie BSA oder
Casein und Detergenzien wie Tween 20, Tween 80, CHAPS, NP-40 oder
Triton X-100, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0,01 und 2 %,
erreicht werden, besonders zur Überprüfung verschiedener
potentieller Inhibitoren.
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Das verwendete GcpE-, bzw. LytB-Protein kann
rekombinant hergestellt oder aus verschiedenen Organismen aufgereinigt
werden. Prinzipiell kann das Enzym aus jedem Organismus, der über den
DOXP-Weg verfügt,
stammen. Als besonders günstig
hat sich die Verwendung von Proteinen aus thermophilen Organismen,
vor allem Aquifex aeolicus, Thermus thermophilus, und Thermotoga
maritima, erwiesen. In diesem Fall kann die Reaktion bei erhöhten Temperaturen
zwischen 45 und 100 °C
erfolgen. Weiterhin eignen sich besonders die Enzyme aus pathogenen
Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Escherichia
coli und Haemophilus influenzae. Auch ist die Verwendung der Enzyme
aus Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana, Menta piperita,
und Solanum lycopersicum möglich.
Auch können
die Enzyme aus Parasiten des Stamms Apicomplexa, insbesondere dem
Malaria-Erreger Plasmodium falciparum und dem Erreger der Toxoplasmose
Toxoplasma gondii, stammen.
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Es hat sich als besonders günstig erwiesen, die
Enzyme vor oxidativer Schädigung
zu schützen. Dies
wird bevorzugt dadurch erreicht, daß die Aufreinigung der Enzyme
und die Durchführung
des Aktivitätstests
unter Sauerstoffausschluß erfolgt.
Dies kann durch Arbeiten unter Schutzgas wie Stickstoff oder Argon
erreicht werden. Es können
entweder die verschiedenen verwendeten Gefäße und Apparaturen mit Schutzgas
beschickt werden oder die Arbeiten in einem gasdichten mit Schutzgas
gefluteten Zelt oder einer entsprechenden Kammer (sog. glove box) durchgeführt werden.
Auch ist es möglich,
das Eisen-Schwefel-Cluster der Enzyme zu rekonstituieren. Dies ist
beispielsweise durch Inkubation mit Fe(NH4)2(S04)2, FeCl2 oder FeCl3
oder andere zwei- oder dreiwertige Eisenverbindungen und einem Dithionit
und/oder Sulfid und/oder einem oder mehrerer Hilfsproteine wie z.B.
dem Nifs-Protein möglich. Es
kann dabei auch das Isotop Fe-57 verwendet werden.
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Der erfindungsgemäße LytB-Aktivitätstest kann
zur Auffindung spezifischer Enzyminhibitoren genutzt werden. Dazu
werden die zu testenden Substanzen dem Reaktionsansatz zugesetzt
und ihr Einfluß auf
die Umsatzrate gemessen. Die Substanzen werden typischerweise in
verschiedenen Konzentrationen zwischen 1 nM und 0,2 mM getestet.
Soll eine größere Anzahl
von Substanzen ohne verfügbarer
Information über
ihre inhibitorischen Eigenschaften getestet werden, so werden sie
in den meisten Fällen zunächst bei
einer fixen Konzentration im Bereich von 0,005 bis 0,2 mM eingesetzt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur
Durchführung
eines sog. „high-throughput screenings" (HTS). Dadurch wird
die Untersuchung einer große
Anzahl von potentiellen Inhibitoren (1.000 bis 1.000.000 Verbindungen)
ermöglicht.
Für die
Durchführung
des HTS eigenen sich besonders Mikrotiterplatten, mit 96, 384 oder
1536 wells. Das bevorzugte Reaktionsvolumen beträgt in Abhängigkeit vom Plattenformat
0,5 bis 200 μl.
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Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystem
identifizierten Inhibitoren eigenen sich als antibakterielle und
antiparasitäre
Wirkstoffe für
die Behandlung von Mensch und Tier, sowie als Herbizide, bzw. als
Leitstrukturen für
die Entwicklung solcher Wirkstoffe.
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Die für das erfindungsgemäße Verfahren
benötigten
Komponenten können
als sog. „kit" als Experimentalausrüstung zur
Verfügung
gestellt und vermarktet werden. Ein solcher kit enthält beispielsweise
fertige angesetzte Lösungen
der zur Durchführung
des Verfahrens nötigen
Reagenzien oder Konzentrate zur Herstellung solcher Lösungen,
außerdem
spezielle Reaktionsgefäße, Geräte und Apparaturen
sowie eine Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Assays.
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Beispiel 1: Expressionsklonierung
des gcpE-Gens
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Es wurde ein Plasmid zur rekombinanten Darstellung
des GcpE-Proteins aus T. theromphilus in E. coli konstruiert. Da
die Expression der originalen DNA-Sequenz wegen des hohen G/C-Gehalts infeffizient
ist, wurde ein vollständig
synthetisches Gen im präferierten
Codon-Gebrauch von
E. coli hergestellt. Das synthetische Gen wurde über die Restriktionsschnittstellen
Nco I und Bgl II in den Expressionsvektor pQE-60 ligiert. Die carboxyterminale
Oligo-Histidin-Sequenz wurde durch Verdau des Plasmids mit Bbl II
und Hind III, Auffüllen
der überhängenden
Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und Religation
mit T4-Ligase beseitigt.
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Beispiel 2: Aufreinigung
des rekombinanten GcpE-Proteins
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4 Schüttelkolben mit je 400 ml TB
(Terrific Broth)-Medium supplementiert mit 0,2 mg/ml Ampicillin
und 0,05 mM FeCl3 wurden mit je 10 ml aus
einer Übernachtkultur
von E. coli TOP10F'-Zellen,
die mit dem oben beschriebenen Plasmid transformiert wurden waren,
inokuliert. Die Kulturen wurden unter lebhaftem Schütteln für 12 h bei
37°C inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und auf Trockeneis
eingefroren. Alle folgenden Schritte wurden unter Sauerstoffausschluß durchgeführt. Das
Pellet wurde mit 80 ml Puffer A (20 mM Tris HCl, pH 8,0) mit 0,1
mg/ml DNase I versetzt, und die Zellen durch Ultraschallbehandlung
disintegriert. Das Lysat wurde für
20 min bei 16.000 rpm zentrifugiert und der Überstand einer Hitzedenaturierung
bei 65°C
für 30
min unterworfen. Das präzipitierte
Material wurde durch Zentrifugation bei 25.000 rpm für 25 min
beseitigt und der Überstand über einen
Filter mit 0,2 um Porendurchmesser filtriert. Die Lösung wurde
auf eine 1,6 × 40
cm DEAE-Sepharose-Säule
(Fast Flow, Pharmacia), die mit Puffer A äquilibriert wurden war, geladen.
Die Säule
wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in Puffer
A eluiert. Die Hauptfraktion wurde durch Gelfiltration (Sephadex
G-25, PD10, Pharmacia) in Puffer A umgepuffert. Das Protein wurde
weiter durch Anionenaustausch-Chromatogrphie gereinigt (1 × 10 cm,
source 15 Q, Pharmacia; 0 bis 1 M NaCl in Puffer A). Die Hauptfraktion wurde
durch Ultrafiltration auf 1,3 ml konzentriert (Centricon, Millipore,
30 kDa cut-off). Ein letzter Reinigungsschritt erfolgte durch Gelfiltration über eine XK
16/60 Superdex 75-Säule,
die mit 100 mM NaCl in Puffer A äquilibriert
und eluiert wurde. Die Proteinlösung
wurde durch Ultrafiltration auf 25 mg/ml konzentriert und bei –80°C gelagert.
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Beispiel 3: Durchführung des
GcpE-Aktivitätstests
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Die Umsetzung von MEcPP durch das
GcpE-Protein wurde photometrisch gemessen. Alle Arbeiten wurden
in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Die Reaktion erfolgte
bei 55 °C.
In einer Quarzküvette
wurden 0,7 ml einer Lösung
von 2 mM Methylviologen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) vorgelegt. Das
Methylviologen wurde durch Zusatz Na-Dithionit in seine reduzierte
Form überführt, bis
eine OD von 2,0 erreicht wurde. Dem Ansatz wurden das GcpE-Protein
in unterschiedlichen Mengen zugesetzt und die Reaktion durch Zugabe
von 1 mM MEcPP gestartet. Die einsetzende Abnahme der Absorption des
reduzierten Methylviologens wurde bei einer Wellenlänge von
732 nm gemessen. In 2 ist
die GcpE-abhängige
zeitliche Abnahme der Absorption von reduziertem Methylviologen
bei 732 nM in Gegenwart von MEcPP gezeigt.. Mit Hilfe der so erhaltenen
Meßwerte
wurde die Aktivität
des GcpE-Proteins
auf ca. 1 μmol
min–1 mg–1 berechnet.
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Beispiel 4: Expressionsklonierung
des lytB-Gens
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Durch PCR wurde unter Verwendung
der Oligonukleotiden Aa-LytB-cHis-for (5'-CCATGGTTGACATAATAATCGCA-3') und Aa-LytB-cHis-rev (5'-AGATCTGGAGGAAACCAATTGCCC-3') das lytB-Gen aus
genomischer DNA von A. aeolicus amplifiziert. Nach Zwischenklonierung
des PCR-Produkts in den pCR-TOPO-T/A-Vektor wurde die Insertion mit NcoI
und BglII herausgelöst,
gereinigt und in den mit NcoI und BglII vorbehandelten pQE60-Vektor ligiert.
Das so erhaltene Konstrukt pQE60-Aa-LytB ermöglicht die Expression des LytB-Enzyms
aus A. aeolicus mit einer carboxyterminalen His6-Fusion.
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Beispiel 5: Aufreinigung
des rekombinanten LytB-Proteins
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E. coli- TOP10F'- oder XL1Blue- Zellen mit einem geeigneten
Hilfsplasmid zur Expression AT-reicher Sequenzen wurden mit dem
Expressionsplasmid pQE60-Aa-LytB transformiert und in Standard I-Medium
(Merck) mit 150 μg/ml
Ampicillin und mit 25 μg/ml
Chloramphenicol inkubiert. Die Induktion der Expression erfolgte
in der logarithmischen Wachstumsphase bei einer OD600nm von
0,8 mit 1 mM IPTG entweder bei 37°C
für 4 Stunden
oder bei 30°C über Nacht.
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500 ml der induzierten Zellkultur
wurden abzentrifugiert und in 50 ml entgastem Puffer A aufgenommen.
Alle folgenden Schritte wurden in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Die
Zellen wurden durch Ultra-Schall disintegriert (Ultraschall Sonoplus
HD70, Bandelin, Berlin, 70% Amplitude, 40% Puls-Pause-Verhältnis).
Nach 30 minütiger
Zentrifugation bei 14.000 g und 4°C
wurde die zytoplasmatische Fraktion für 30 min auf 65°C erhitzt
und erneut 30 min bei 14.000 g und 4°C zentrifugiert. Die lösliche Protein-Fraktion
wurde über
einen Filter (Renner) mit einem Porendurchmesser von 0,2 um filtriert.
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Das Filtrat wurde mit Hilfe einer
Peristaltikpumpe bei einer Flußrate
von 2 ml/min auf eine HR10/10-Säule
mit ca. 8 ml Bettvolumen, die mit der Metall-Affinitäts-Matrix
Talon Superflow (Clonetech) gefüllt
worden war, geladen. Die Säule
wurde dann in eine FPLC-Anlage transferiert und mit folgendem Stufengradient
bei einem Fluß von
2 ml/min entwickelt: Waschen mit 80% Puffer A und 20% Puffer B für 25 min,
Elution mit 100% Puffer B für
15 min. Die Elution wurde durch UV-Absorptionsmessung bei 280 nm
verfolgt, und die entsprechenden Fraktionen gesammelt.
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Die Fraktionen, die das LytB-Protein
enthielten, wurden schließlich über eine
PD10-Säule (Amersham-Pharmacia)
auf Puffer C umgepuffert. Bei Bedarf wurde die Proteinlösung durch
Ultrafiltration aufkonzentriert. Das Protein zeigte eine auffällig dunkelbraune
Färbung
mit einem Absorptionsmaximum um 410 nm, das durch das vorhandene
Eisen-Schwefel-Cluster zustande kommt.
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- Puffer A: 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl
- Puffer B: 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM Imidazol
- Puffer C: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)
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Beispiel 6: Durchführung des
Lyt-B Aktivitätstests
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Die Umsetzung von HMBPP durch das LytB-Protein
wurde photospektrometrisch analysiert. Alle Arbeiten wurden in einer
Sauerstoff-freien Atmosphäre
durchgeführt.
Danbei wurde in einer Quarzküvette
0,6 ml einer Lösung
von 0,1 mM Methylviologen in 20 mM Tris-HCl (pH 8) vorgelegt. Das Methylviologen
wurde durch Zusatz von 0,08 mM Na-Dithionit in seine reduzierte
Form überführt. Dem Ansatz
wurden 10 μg
LytB-Protein zugesetzt und die Reaktion durch Zugabe von 0,1 mM
oder 1 mM HMBPP gestartet. In einem Kontrollansatz wurde kein HMBPP
zugesetzt. Die einsetzende Abnahme der Absorption des reduzierten
Methylviologens wurde in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 800
nm verfolgt. Dazu wurde in Abständen
von 30 sec jeweils ein vollständiges
Absorptionsspektrum aufgenommen. In 3 ist
die LytB-abhängige
zeitliche Abnahme der UV-VIS-Absorption von reduziertem Methylviologen
bei unterschiedlichen HMBPP-Konzentrationen gezeigt. Der Extinktionskoeffizient
von Methylviologen liegt bei 604 nm bei 13,6×103 M–1cm–1, bei
662 nm bei 7,28×103 M–1cm–1 und
bei 732 nm bei 3,15×103 M–1cm–1.
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Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
den DOXP-Weg bzw. Nicht Mevalonat-Weg und dessen involvierte Intermediate
und Enzyme.
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2 zeigt
die GcpE-abhängige
zeitliche Abnahme der Absorption von reduziertem Methylviologen
bei 732 nm in Gegenwart von MEcPP.
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3 zeigt
die LytB abhängige
zeitliche Abnahme der UV-VIS Absorption von reduziertem Methylviologen
bei unterschiedlichen HMBPP Konzentrationen.