WO2004035810A2 - Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivität von proteinen - Google Patents

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WO2004035810A2
WO2004035810A2 PCT/EP2003/010900 EP0310900W WO2004035810A2 WO 2004035810 A2 WO2004035810 A2 WO 2004035810A2 EP 0310900 W EP0310900 W EP 0310900W WO 2004035810 A2 WO2004035810 A2 WO 2004035810A2
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Martin Hintz
Hassan Jomaa
Ann-Kristin Kollas
Silke Sanderbrand
Jochen Wiesner
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the enzymatic activity of proteins.
  • DOXP route (synonyms: MEP route, non-Mevalonate route, Rohmer route) takes place (Fig. 1).
  • DOXP synthase Dxs
  • DOXP reductoisomerase Dxr
  • YgbP YchB
  • YgbB YgbB
  • GcpE and LytB are involved in the late reaction steps of the DOXP pathway.
  • GcpE is involved in the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) into 4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphate (HMBPP ) involved.
  • LytB catalyzes the conversion of HMBPP into isopentenyl pyrophosphate (IPP) and dimethylallyl pyrophos (DMAPP).
  • IPP isopentenyl pyrophosphate
  • DMAPP dimethylallyl pyrophos
  • the enzymes of the DOXP route represent interesting target structures for the development of new antimicrobial and herbicidal active ingredients. Since the human and animal organism synthesizes isoprenoids not via the DOXP route but via the mevalonate route, such active ingredients have only a very low toxicity expected. It has been shown that fosmidomycin, an inhibitor of DOXP reductoisomerase, is highly effective against bacterial and parasitic infections. Clinical data on the efficacy of fosmidomycin for the treatment of malaria and genitourinary tract infections are available. Fosmidomycin is also effective as a herbicide. Fosmidomycin with an LD50> 11 g / kg p.o. extremely non-toxic in the rat.
  • inhibitors for further enzymes of the DOXP route offer comparably advantageous properties for pharmaceutical and agrochemical use. Active ingredient combinations with a synergistic effect can be obtained, in particular, by the simultaneous application of inhibitors for different enzymes of the DOXP route.
  • the wild-type phenotype was reconstituted by adding 3-methyl-3-buten-l-ol and methyl-2-buten-1-ol, the alcohol derivatives of the isoprenoid precursors IPP and DMAPP.
  • IPP isoprenoid precursors
  • E. coli mutants were constructed in which the gcpE or lytB gene was deleted. These cells were only viable if they contained an artificial operon that enabled the synthesis of isoprenoids by the mevalonate route (Altincicek et al., 2001, FEBS Lett. 499: 37-40; Altincicek et al, 2001, J Bacterioi. 183: 2411-6). The deletion of the gcpE gene led to an accumulation of MEcPP in the bacterial cells (Seemann et al., 2002, Tetrahedron Lett. 44: 775-8).
  • E. coli bacteria were constructed which overexpressed the genes dxr, ygbP, ychB, ygbB and gcpE on an artificial operon (Hecht et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 98: 1483-42).
  • these cells overexpressed the xylB gene, the gene product of which is responsible for the phosphorylation of 1-deoxy-D-xylulose to DOXP.
  • the production of HMBPP could be detected by NMR spectroscopy. If the operon additionally contained the lytB gene, the production of IPP and DMAPP was verified (Rohdich et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1158-1163).
  • HMBPP from MEcPP could be observed in extracts from E. coli cells which contained the gcpE gene on an expression plasmid (Seemann et al., 2002, Tetrahedron Lett. 43, 1413-15).
  • Implementation of HMBPP in IPP and DMAPP could be shown analogously in extracts from E. coli cells that overexpress the lytB gene (Adam et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sei. USA Aug. 27, e-published ahead of print).
  • an increased conversion of HMBPP into IPP and DMAPP in E. coli cells or extracts from isolated chromoplasts of the red pepper could be shown when recombinant LytB protein was added to the extracts. In these experiments, however, the implementation was dependent on unknown factors that came from the cell extracts.
  • the present invention is therefore to provide a method for determining the activity of proteins of the DOXP pathway. This method is also intended to be used to find substances with an antimicrobial or herbicidal action, but with few side effects for humans and animals.
  • both the activity of the GcpE and of the LytB enzyme can be measured in a defined system if a compound with electron-transfer properties is used.
  • a method for the simultaneous or separate determination of the enzymatic activity of an enzyme selected from GcpE and LytB is thus provided, in which the respective enzyme, one or more compounds with electron-transfer properties and at least one substance selected from 2-C-methyl- D-ery thritol-2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) and 4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyI-pyrophosphate (HMBPP) are brought into contact with one another and the conversion or the change in concentration or the change in the oxidation state one of the compounds involved is measured and the activity of the enzyme is determined therefrom.
  • MEcPP 2-C-methyl- D-ery thritol-2,4-cyclodiphosphate
  • HMBPP 4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyI-pyrophosphate
  • Particularly suitable compounds with electron-transferring properties are dithionite, titanium (III) citrate, methyl viologen, benzyl viologen or another compound selected from the group consisting of antrachinone; Antrochinon-2,6-disulfonate; Antroquinone 2-sulfonate; 2-hydroxy-l, 4-anthraquinone; 1,4-benzoquinone; Tetrachlorobenzochinon; 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropylbenzoquinone; 5-n-undecyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazol; 1,4-naphthoquinone; l, 4-naphthoquinone-2-sulfonate; 1,2-naphthoquinone; 2-hydroxy-l, 4-naphthoquinone; 5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone; Indigo; 5,5'-Indigodisulfon
  • connections that make it possible to transfer a single electron are also suitable. especially quinoid compounds that are capable of forming a hemichinone.
  • Suitable proteins can also be used as electron carriers. Cytochromes, flavodoxin, flavodoxin reductase, ferredoxin, ferredoxin reductase, thio-redoxin, thioredoxin reductase, YfgB and glutathione reductase are particularly suitable. It is also possible to use one of the compounds mentioned above and a protein with electron-transfer properties at the same time. Due to the different absorption behavior of the reduced and oxidized electron carrier, the enzymatic conversion can be continuously monitored by photometric measurement. In principle, several of the electron carriers mentioned can also be used.
  • the GcpE or LytB activity can also be determined directly by measuring the changes in concentration of the converted substrate (MEcPP or HMBPP) or of the products formed (HMBPP, or IPP and DMAPP).
  • Various chromatographic and spectroscopic methods such as HPLC, MS, LC-MS, GC, GC-MS, NMR or DC are suitable for this. NMR, HPLC and LC-MS are particularly suitable.
  • the activity can also be determined via the reverse reaction. It is also possible to set up coupled test systems in which one or more further enzymatic or chemical reactions are connected upstream or downstream. In particular, the simultaneous determination of the activity of GcpE and LytB is possible. Furthermore, the enzymatic conversion can be measured potentiometrically or photometrically via the absorption of the iron-sulfur cluster of the LytB protein.
  • the substrates MEcPP or HMBPP are preferably used in a concentration of 0.001 to 10 mM, the electron transmitter in a concentration of 0.01 to 10 mM.
  • the substrates used can be synthesized chemically or enzymatically or isolated from bacterial, plant or parasite cells, preferably after deleting the gcpE or the lytB gene.
  • the transfer of the electron carrier into the reduced form takes place e.g. by adding suitable reducing agents, e.g. Na dithionite or titanium (III) citrate. These reducing agents alone can lead to substrate conversion. In this case too, methyl viologen, benzyl viologen or another compound which is suitable as a redox indicator can be used to follow the course of the reaction photometrically. In principle, the electron transfer can also be reduced photochemically, electrochemically or enzymatically.
  • suitable reducing agents e.g. Na dithionite or titanium (III) citrate.
  • the photometric measurement of the conversion is preferably carried out in a wavelength range from 200 nm to 800 nm, very preferably at 604 nm, 662 nm and 732 nm if, for example, methyl viologen is used as an electron transmitter.
  • the reaction can take various tible buffer systems. For example, TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, MES, phosphate are suitable as buffers.
  • the preferred pH range is between 4.0 and 9.5. Salts such as NaCl, KC1, LiCl and MgCl can also be added.
  • the reaction can take place in the presence of various cations, especially Co, Mn, Fe 2 , Mg, Ni, Zn, which are added, for example, as chlorides.
  • molybdenum, tungsten and vanadium compounds can also be favorable.
  • the system is tolerant of high variances in the total salt concentration, but concentrations between 5 and 1000 mM are preferably used.
  • Sulfhydryl-reactive reducing agents such as DTT, 2-mercaptoethanol, glutathione and cysteine can also be added, preferably in the concentration range between 0.5 and 20 mM.
  • Other possible additives are NADH, NAD + ,
  • NADPH NADPH
  • NADP + NADPH
  • FAD FAD
  • FADH 2 NADPH
  • FMN FMNH 2
  • Tris (2-carboxyethyl) phosphine preferably in concentrations of 0.01 to 20 mM.
  • a favorable effect can also be achieved, in particular by adding non-specific proteins such as BSA or casein and detergents such as Tween 20, Tween 80, CHAPS, NP-40 or Triton X-100, preferably in concentrations between 0.01 and 2% for testing various potential inhibitors.
  • the GcpE or LytB protein used can be produced recombinantly or purified from various organisms.
  • the enzyme can come from any organism that has the DOXP pathway.
  • the use of proteins from thermophilic organisms, especially Aquifex aeolicus, Thermus thermophilus, and Thermotoga maritima has proven to be particularly favorable.
  • the reaction can take place at elevated temperatures between 45 and 100 ° C.
  • the enzymes from pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Escherichia coli and Haemophilus influenzae are also particularly suitable.
  • the enzymes can also come from parasites of the Apicomplexa strain, in particular the malaria pathogen Plasmodium falciparum and the pathogen of the toxoplasmosis Toxoplasma gondii.
  • the LytB activity test according to the invention can be used to find specific enzyme inhibitors.
  • the substances to be tested are added to the reaction mixture and their influence on the conversion rate is measured.
  • the substances are typically tested in various concentrations between 1 nM and 0.2 mM. If a larger number of substances are to be tested without available information about their inhibitory properties, in most cases they are initially used at a fixed concentration in the range from 0.005 to 0.2 mM.
  • the method according to the invention is suitable for carrying out a so-called “high-throughput screening” (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • Microtiter plates are particularly suitable for carrying out the HTS, with 96, 384 or 1536 wells.
  • the preferred reaction volume is 0.5 to 200 ⁇ l depending on the plate format.
  • the inhibitors identified with the aid of the test system according to the invention are suitable as antibacterial and antiparasitic active substances for the treatment of humans and animals, and as herbicides or as lead structures for the development of such active substances.
  • kits as experimental equipment.
  • Such a kit contains, for example, ready-made solutions of the reagents or concentrates required for carrying out the process, as well as special reaction vessels.
  • Devices and apparatus as well as instructions for use for performing the assay.
  • Example 1 Expression cloning of the gcpE gene
  • a plasmid for the recombinant presentation of the GcpE protein from T. theromphilus in E. coli was constructed. Since the expression of the original DNA sequence is inefficient because of the high G / C content, a completely synthetic gene was produced in the preferred codon use of E. coli.
  • the synthetic gene was ligated into the expression vector pQE-60 via the restriction sites Nco I and Bgl II.
  • the carboxy-terminal oligo-histidine sequence was eliminated by digesting the plasmid with Bbl II and Hind III, filling in the overhanging ends with the Klenow fragment of DNA polymerase I and religation with T4 ligase.
  • Example 2 Purification of the recombinant GcpE protein 4 shaking flasks, each with 400 ml TB (Terrific Broth) medium supplemented with 0.2 mg / ml ampicillin and 0.05 mM FeCl 3 , were each with 10 ml from an overnight culture of E. coli TOP 10F 'cells, which with the Plasmid described above were transformed, inoculated. The cultures were incubated at 37 ° C with vigorous shaking for 12 h. The cells were harvested by centrifugation and frozen on dry ice. All of the following
  • Steps were carried out in the absence of oxygen.
  • the pellet was mixed with 80 ml of buffer A (20 mM Tris HC1, pH 8.0) with 0.1 mg / ml DNase I, and the cells were disintegrated by ultrasound treatment.
  • the lysate was centrifuged for 20 min at 16,000 rpm and the supernatant was subjected to heat denaturation at 65 ° C. for 30 min.
  • the precipitated material was removed by centrifugation at 25,000 rpm for 25 min and the supernatant was filtered through a filter with a 0.2 ⁇ m pore diameter.
  • the solution was loaded onto a 1.6 x 40 cm DEAE-Sepharose column (Fast Flow, Pharmacia) which had been equilibrated with buffer A.
  • the column was eluted with a linear gradient from 0 to 1 M NaCl in buffer A.
  • the main fraction was buffered in buffer A by gel filtration (Sephadex G-25, PD10, Pharmacia).
  • the protein was further purified by anion exchange chromatography (1 x 10 cm, source 15 Q, Pharmacia; 0 to 1 M NaCl in buffer A).
  • the main fraction was concentrated to 1.3 ml by ultrafiltration (Centricon, Millipore, 30 kDa cut-off).
  • a final purification step was carried out by gel filtration over an XK 16/60 Superdex 75 column, which was equilibrated and eluted with 100 mM NaCl in buffer A.
  • the protein solution was concentrated to 25 mg / ml by ultrafiltration and stored at -80 ° C.
  • the conversion of MEcPP by the GcpE protein was measured photometrically. All work was carried out in an oxygen-free atmosphere. The reaction took place at 55 ° C. 0.7 ml of a solution of 2 mM methyl viologen in 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) was placed in a quartz cuvette. The methyl viologen was converted into its reduced form by adding Na dithionite until an OD of 2.0 was reached. The batch was added with the GcpE protein in different amounts and the reaction was started by adding 1 mM MEcPP. The onset of a decrease in the absorption of the reduced methylviol was measured at a wavelength of 732 nm.
  • Example 4 Expression cloning of the lytB gene
  • the lytB gene from A. genomic DNA was analyzed by PCR using the oligonucleotides Aa-LytB-cHis-for (5'-CCATGGTTGACATAATAATCGCA-3 ') and Aa-LytB-cHis-rev (5'-AGATCTGGAGGAAACCAATTGCCC-3'). aeolic amplified. After the PCR product had been cloned into the pCR-TOPO-T / A vector, the insert was extracted with Ncol and BglII, purified and ligated into the pQE60 vector pretreated with Ncol and BglII. The pQE60-Aa-LytB construct obtained in this way enables the expression of the LytB enzyme from A. aeolicus with a carboxy-terminal His 6 fusion.
  • E. coli TOP10F 'or XLlBlue cells with a suitable auxiliary plasmid for the expression of AT-rich sequences were transformed with the expression plasmid pQE60-Aa-LytB and in standard I medium (Merck) with 150 ⁇ g / ml ampicillin and with 25 ⁇ g / ml incubated with chloramphenicol.
  • the induction of the expression was in the logarithmic growth phase at an OD 6 oo nm of 0.8 with 1 mM IPTG either at 37 ° C for 4 hours or at 30 ° C overnight.
  • 500 ml of the induced cell culture were centrifuged off and taken up in 50 ml of degassed buffer A. All of the following steps were carried out in an oxygen-free atmosphere.
  • the cells were disintegrated by ultrasound (ultrasound Sonoplus HD70, BANDELIN, Berlin, 70% amplitude, 40% pulse-pause ratio). After centrifugation at 14,000 g and 4 ° C. for 30 minutes, the cytoplasmic fraction was heated to 65 ° C. for 30 minutes and centrifuged again at 14,000 g and 4 ° C. for 30 minutes.
  • the soluble protein fraction was filtered through a filter (Reimer) with a pore diameter of 0.2 ⁇ m.
  • the filtrate was loaded using a peristaltic pump at a flow rate of 2 ml / min onto an HR10 / 10 column with a bed volume of approximately 8 ml, which had been filled with the metal affinity matrix Talon Superflow (Clonetech).
  • the column was then transferred to an FPLC system and developed with the following step gradient at a flow of 2 ml / min: washing with 80% buffer A and 20% buffer B for 25 min, elution with 100% buffer B for 15 min. The elution was monitored by UV absorption measurement at 280 nm and the corresponding fractions were collected.
  • the fractions containing the LytB protein were finally buffered to buffer C via a PDIO column (Amersham-Pharmacia). If necessary, the protein solution was concentrated by ultrafiltration. The protein showed a striking dark brown color with an absorption maximum around 410 nm, which is due to the existing iron-sulfur cluster.
  • Buffer A 30mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl
  • Buffer B 30mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl, 100mM imidazole Buffer C: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • HMBPP The conversion of HMBPP by the LytB protein was analyzed by photospectrometry. All work was carried out in an oxygen-free atmosphere. In addition, 0.6 ml of a solution of 0.1 mM methyl viologen in 20 mM Tris-HCl (pH 8) was placed in a quartz cuvette. The methyl viologen was converted into its reduced form by adding 0.08 mM Na dithionite. 10 ⁇ g LytB protein were added to the mixture and the reaction was started by adding 0.1 mM or 1 mM HMBPP. In a control batch, no HMBPP was added. The onset of a decrease in the absorption of the reduced methyl viologist was monitored in a wavelength range from 300 to 800 nm.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des GcpE und des LytB-Proteins. Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung eines Elektronen-Überträgers wie z.B. Dithionit, Methylviologen, Benzylviologen oder eines geeigneten Proteins, wodurch die photometrische Messung des Substratumsatzes ermöglicht wird. Das Verfahren eignet sich zur Identifizierung von Inhibitoren für die enzymatische Aktivität des GcpE und LytB-Proteins, die sich als antibakteriellen, antiparasitären und herbiziden Wirkstoffe oder als

Description

Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivi- tat von Proteinen.
Die Biosynthese von Isoprenoiden über den klassischen Mevalonat-Weg ist seit längerem bekannt. Es konnte in jüngerer Zeit gezeigt werden, daß bei einigen Bakterien, Parasiten und in den Piastiden der Pflanzen die Isoprenoidsynthese über einen alternativen Weg, den sog. DOXP- Weg (Synonyme: MEP-Weg, Nicht-Mevalonat-Weg, Rohmer-Weg) erfolgt (Fig. 1 ). Die meisten Reaktionsschritte des DOXP-Wegs, die durch die Enzyme DOXP-Synthase (Dxs), DOXP-Reductoisomerase (Dxr), YgbP, YchB, und YgbB katalysiert werden, sind inzwischen gut erforscht. Darüber hinaus ist bekannt, daß die Enzyme GcpE und LytB an den späten Reaktionsschritten des DOXP-Wegs beteiligt sind. GcpE ist nach derzeitigen Erkennt- nissen an der Umwandlung von 2-C-Methyl-D-erythri tol-2,4-cyclo-diphosphat (MEcPP) in 4- Hydroxy-3 -methyl -but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP) beteiligt. LytB katalysiert die Umwandlung von HMBPP in Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP) und Dimethylallyl-Pyropho s hat (DMAPP). Die publizierten Hinweise (s.u.) auf die Funktion von GcpE und LytB sind jedoch nur indirekt. Die enzymatische Aktivität dieser Enzyme konnte noch nie in einem in vitro- System mit genau bekannter Zusammensetzung demonstriert werden.
Die Enzyme des DOXP-Wegs stellen interessante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer antimikrobieller und herbizider Wirkstoffe dar. Da der menschliche und tierische Organismus Isoprenoide nicht über den DOXP-Weg, sondern über den Mevalonat-Weg synthetisiert, ist von derartigen Wirkstoffen nur eine sehr geringe Toxizität zu erwarten. So konnte gezeigt werden, daß Fosmidomycin, ein Inhibitor der DOXP-Reductoisomerase, hochwirksam gegen bakterielle und parasitäre Infektionen ist. Klinische Daten über die Effizienz von Fosmidomycin zur Behandlung von Malaria und Urogenitaltrakt-Infektionen sind verfügbar. Außerdem ist Fosmidomycin als Herbizid wirksam. Dabei ist Fosmidomycin mit einer LD50 > 11 g/kg p.o. in der Ratte extrem ungiftig.
Es ist davon auszugehen, daß Inhibitoren für weitere Enzyme des DOXP-Wegs vergleichbar vorteilhafte Eigenschaften für die pharmazeutische und agrochemische Anwendung bieten. Besonders durch die gleichzeitige Applikation von Inhibitoren für verschiedene Enzyme des DOXP-Wegs können Wirkstoffkombinationen mit synergistischer Wirkung erhalten werden. Derzeit sind nur Inhibitoren für die DOXP- Reductoisomerase beschrieben. Außerdem wurde Fluoropyruvat als schwacher Inhibitor der DOXP-Synthase identifiziert. Für die übrigen Enzyme des DOXP-Wegs existieren keine bekannten Inhibitoren. Deshalb besteht ein Bedarf nach geeigneten Testsystemen zur Auffindung derartiger Inhibitoren. Dafür ist es in notwen- dig, die Aktivität der jeweiligen Enzyme in einer definierten Versuchsanordnung messen zu können.
Verschiedene Hinweise auf die Funktion von GcpE und LytB sind publiziert. So haben bioin- formatische Ansätze ergeben, daß das gcpE und lytB-Gen nur bei solchen Organismen vorkommt, die auch die Gene für die übrigen Enzyme des DOXP-Wegs besitzen. Erste experimentelle Hinweise auf die Funktion von LytB wurden mit Hilfe von Cyanobakterien der Gattung Synechocystis mit einer Mutation im Promotorbereich des lytB-Gens gewonnen. Die Zellen waren im Wachstum und der Pigmentproduktion beeinträchtigt (Cunningham et al., 2000, J. Bacterioi. 182:5841-5848). Durch Zusatz von 3-Methyl-3-buten-l-ol und Methyl-2- buten-1-ol, den Alkohol-Derivaten der Isoprenoid- Vorläufermoleküle IPP und DMAPP, konnte der wildtypische Phänotyp rekonstituiert werden. Durch Überexpression des lytB- Gens verschiedener Organismen in E. coli-Bakterien, die durch gentechnische Veränderungen zur Karotinoid-Synthese befähigt waren, wurde eine verstärkte Karotinoid-Produktion beob- achtet.
Außerdem wurden E.coli -Mutanten konstruiert, bei denen das gcpE oder lytB-Gen deletiert wurde. Diese Zellen waren nur lebensfähig, wenn sie ein artifϊzielles Operon enthielten, das die Synthese von Isoprenoiden über den Mevalonat-Weg ermöglichte (Altincicek et al., 2001, FEBS Lett. 499:37-40; Altincicek et al, 2001, J Bacterioi. 183:2411-6). Die Deletion des gcpE-Gens führte zu einer Akkumulation von MEcPP in den Bakterienzellen (Seemann et al., 2002, Tetrahedron Lett. 44:775-8). Analog wurde bei gcpE-Deletionsmutanten eine ca. 150- fache Anreicherung von HMBPP beobachtet (Hintz et al, 2001, FEBS Lett. 509:317-322). Daraus wurde geschlossen, dass MEcPP das Substrat von GcpE und HMBPP das Substrat von LytB darstellt.
Mit dem Ziel die Reaktionsprodukte der beiden Enzyme zu identifizieren, wurden E. coli- Bakterien konstruiert, die die Gene dxr, ygbP, ychB, ygbB und gcpE auf einem artifϊziellen Operon überexprimierten (Hecht et al, 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98:1483-42). Au- ßerdem exprimierten diese Zellen das xylB-Gen über, dessen Genprodukt für die Phosphory- lierung von 1 -Desoxy-D-xylulose zu DOXP verantwortlich ist. Wenn dem Kulturmedium dieser Zellen 13C-markierte 1 -Desoxy-D-xylulose zugesetzt wurde, konnte die Produktion von HMBPP durch NMR Spektroskopie nachgewiesen werden. Enthielt das Operon zusätzlich das lytB-Gen, wurde die Produktion von IPP und DMAPP nachgewiesen (Rohdich et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99:1158-1163).
Die Produktion von HMBPP aus MEcPP konnte in Extrakten aus E. coli-Zellen, die das gcpE-Gen auf einem Expressionsplasmid enthielten, beobachtet werden (Seemann et al., 2002, Tetrahedron Lett. 43, 1413-15). Die Umsetzung von HMBPP in IPP und DMAPP konnte analog in Extrakten aus E. coli-Zellen, die das lytB-Gen überexprimieren, gezeigt werden (Adam et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sei. USA Aug. 27, e-published ahead of print). Außerdem konnte eine verstärkte Umsetzung von HMBPP in IPP und DMAPP in E. coli- Zelle trakten oder Extrakten aus isolierten Chromoplasten des Roten Pfeffers gezeigt werden, wenn den Extrakten rekombinantes LytB-Protein zugesetzt wurde. Bei diesen Versuchen war die Umsetzung aber von unbekanntene Faktoren, die aus den Zellextrakten stammten, abhängig-
Aufgabe der. vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Proteinen des DOXP-Wegs bereitzustellen. Dieses Verfahren soll ferner dazu genutzt werden, Substanzen mit antimikrobieller Wirkung oder herbizider Wirkung, jedoch geringen Nebenwirkungen für Mensch und Tier aufzufinden.
Überraschenderweise hat sich nun herausgestellt, daß sowohl die Aktivität des GcpE- als auch des LytB-Enzyms in einem definierten System gemessen werden kann, wenn eine Verbindung mit elektronenübertragenden Eigenschaften verwendet wird. Es wird also ein Verfahren zur gleichzeitigen oder getrennten Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, ausgewählt aus GcpE und LytB, bereitgestellt, in dem das jeweilige Enzym, eine oder mehrere Verbindungen mit elektronenübertragenden Eigenschaften und mindestens eine Substanz, ausgewählt aus 2-C-methyl-D-ery thritol-2,4-cyclo-diphosphat (MEcPP) und 4-Hydroxy-3- methyl-but-2-enyI-pyrophosphat (HMBPP) miteinander in Kontakt gebracht werden und der Umsatz oder die Konzentrationsänderung oder die Änderung des Oxidationszustands einer der beteiligten Verbindungen gemessen wird und daraus die Aktivität des Enzyms bestimmt wird. Als Verbindungen mit elektronenübertragenen Eigenschaften eignen sich besonders Dithionit, Titan(III)citrat, Methylviologen, Benzylviologen oder eine andere Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, die aus Antrachinon; Antrochinon-2,6-disulfonat; Antrochinon-2- sulfonat; 2-Hydroxy-l,4-anthrachinon; 1,4-Benzochinon; Tetrachlorobenzochinon; 2,5- Dibromo-3-methyl-6-isopropylbenzochinon; 5-n-Undecyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazol; 1,4-Naphtochinon; l,4-Naphtochinon-2-sulfonat; 1 ,2-Naphtochinon; 2-Hydroxy-l,4- naphthochinon; 5-Hydroxy-l,4-naphthochinon; Indigo; 5,5'-Indigodisulfonat; 5,5 ',7-
Indigotrisulfonat; 5,5',7,7'-Indigotetrasulfonat; N,N,N',N',-Tetramethyl-p-phenylendiamin; 2,3,5,6-Tetramethyl-p-phenylendiamin; Phenazin; Phenazinethosulfat; Phenazinmethosulfat; N-Methylphenazoniummethosulfat; N-Methylphenazoniumsulfonatmethosulfat; N- Ethylphenazoniumethosulfat; N-Methyl- 1 -hydroxyphenazoniummethosulfat; Neutral-Rot; Phenol-Rot; Chlorphenol-Rot; Cresol-Rot; Bromcresol-Purpur; Methylen-Blau; Toluidin- Blau; Safranin; 2,6-Dichlorphenolindophenol; Durochinon; Pyocyanin; Ruthenium- Hexaminchlorid; Trimethylhydrochinon; Menadion; 5-Deaza-7,8-dimethyl-10-methyl- isoalloxazin; Difenzoquat; Deiquat; photoreduziertes Deazaflavin besteht. Auch eignen sich weitere Verbindungen, durch die die Übertragung eines einzelnen Elektrons möglich ist, be- sonders chinoide Verbindungen, die zur Ausbildung eines Hemichinons befähigt sind. Als Elektronenübertäger können auch geeignete Proteine verwendet werden. Besonders eignen sich Cytochrome, Flavodoxin, Flavodoxinreduktase, Ferredoxin, Ferredoxinreductase, Thio- redoxin, Thioredoxinreductase, YfgB und Glutathionreductase. Auch ist die gleichzeitige Verwendung einer der oben erwähnten Verbindungen und einem Protein mit elektronenübertragenden Eigenschaften möglich. Aufgrund des unterschiedlichen Absorptionsverhaltens des reduzierten und oxidierten Elektronenübertägers kann der enzymatische Umsatz durch photometrische Messung kontinuierlich verfolgt werden. Grundsätzlich können auch mehrere der genannten Elektronenüberträger verwendet werden.
Die GcpE, bzw. LytB -Aktivität kann bei diesem Verfahren auch direkt durch Messung der Konzentrationsänderungen des umgesetzten Substrats (MEcPP, bzw. HMBPP) oder der gebildeten Produkte (HMBPP, bzw. IPP und DMAPP) bestimmt werden. Dazu eignen sich verschiedene chromatographische und spektroskopische Methoden wie HPLC, MS, LC-MS, GC, GC-MS, NMR oder DC. Besonders geeignet sind NMR, HPLC und LC-MS. Prinzipiell kann die Aktivität auch über die Umkehrreaktion bestimmt werden. Auch ist es möglich, gekoppelte Testsysteme aufzubauen, bei denen ein oder mehrere weitere enzymatische oder chemische Reaktionen vor- oder nachgeschaltet sind. Insbesondere ist die gleichzeitige Aktivitätsbestimmung von GcpE und LytB möglich. Weiterhin kann der enzymatische Umsatz poten- tiometrisch oder photometrisch über die Absorption des Eisen-Schwefel-Clusters des LytB- Proteins gemessen werden.
Die Substrate MEcPP, bzw. HMBPP werden bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 10 mM eingesetzt, der Elektronenüberträger in einer Konzentration von 0,01 bis 10 mM. Die verwendeten Substrate können chemisch oder enzymatisch synthetisiert oder aus Bakterien-, Pflanzen- oder Parasitenzellen, bevorzugt nach Deletion des gcpE-, bzw. des lytB-Gens, isoliert werden.
Die Überführung des Elektronenüberträgers in die reduzierte Form erfolgt z.B. durch Zusatz von geeigneten Reduktionsmitteln, wie z.B. Na-Dithionit oder Titan(III)citrat. Diese Reduktionsmittel können bereits allein zu einem Substratumsatz führen. Auch in diesem Fall kann Methylviologen, Benzylviologen oder eine weitere Verbindung, die sich als Redox-Indikator eignet, verwendet werden, um den Ablauf der Reaktion photometrisch zu verfolgen. Prinzipiell kann die Reduktion des Elektronenüberträgers auch photochemisch, elektrochemisch oder enzymatisch erfolgen.
Die photometrische Messung des Umsatzes erfolgt bevorzugt in einem Wellenlängenbereich von 200 nm bis 800 nm, ganz bevorzugt bei 604 nm, 662 nm und 732 nm, wenn z.B. Methylviologen als Elektronenüberträger genutzt wird. Die Reaktion kann in verschiedenen kompa- tiblen Puffersystemen erfolgen. Beispielsweise eignen sich als Puffer TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, MES, Phosphat. Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen 4,0 und 9,5. Außerdem können Salze wie NaCl, KC1, LiCl und MgCl zugesetzt werden. Die Reaktion kann in Ge- genwart verschiedener Kationen, vor allem Co , Mn , Fe2 , Mg , Ni , Zn , die beispiels- weise als Chloride zugesetzt werden, erfolgen. Auch kann der Zusatz von Molybdän-, Wolfram- und Vanadium-Verbindungen günstig sein. Das System ist tolerant gegen hohe Varianzen in der Gesamtsalzkonzentration, vorzugsweise werden aber Konzentrationen zwischen 5 und 1000 mM verwendet. Es können auch Sulfhydryl -reaktive Reduktionsmittel wie DTT, 2-Mercaptoe thanol, Glutathion und Cystein zugesetzt werden, vorzugsweise im Konzentrati- onsbereich zwischen 0,5 und 20 mM. Weiter mögliche Additiva sind NADH, NAD+,
NADPH, NADP+, FAD, FADH2, FMN, FMNH2 und Tris(2-carboxyethyl)phosphin, bevorzugt in Konzentrationen von 0,01 bis 20 mM. Auch kann ein günstiger Effekt durch den Zusatz von unspezifischen Proteinen wie BSA oder Casein und Detergenzien wie Tween 20, Tween 80, CHAPS, NP-40 oder Triton X-100, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0,01 und 2 %, erreicht werden, besonders zur Übe rüfung verschiedener potentieller Inhibitoren.
Das verwendete GcpE-, bzw. LytB-Protein kann rekombinant hergestellt oder aus verschiedenen Organismen aufgereinigt werden. Prinzipiell kann das Enzym aus jedem Organismus, der über den DOXP-Weg verfügt, stammen. Als besonders günstig hat sich die Verwendung von Proteinen aus thermophilen Organismen, vor allem Aquifex aeolicus, Thermus thermophilus, und Thermotoga maritima, erwiesen. In diesem Fall kann die Reaktion bei erhöhten Temperaturen zwischen 45 und 100 °C erfolgen. Weiterhin eignen sich besonders die Enzyme aus pathogenen Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Escherichia coli und Haemophilus influenzae. Auch ist die Verwendung der Enzyme aus Pflanzen, insbeson- dere Arabidopsis thaliana, Menta piperita, und Solanum lycopersicum möglich. Auch können die Enzyme aus Parasiten des Stamms Apicomplexa, insbesondere dem Malaria-Erreger Plasmodium falciparum und dem Erreger der Toxoplasmose Toxoplasma gondii, stammen.
Es hat sich als besonders günstig erwiesen, die Enzyme vor oxidativer Schädigung zu schüt- zen. Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, daß die Aufreinigung der Enzyme und die Durchführung des Aktivitätstests unter Sauerstoffausschluß erfolgt. Dies kann durch Arbeiten unter Schutzgas wie Stickstoff oder Argon erreicht werden. Es können entweder die verschiedenen verwendeten Gefäße und Apparaturen mit Schutzgas beschickt werden oder die Arbeiten in einem gasdichten mit Schutzgas gefluteten Zelt oder einer entsprechenden Kammer (sog. glove box) durchgeführt werden. Auch ist es möglich, das Eisen-Schwefel-Cluster der Enzyme zu rekonstituieren. Dies ist beispielsweise durch Inkubation mit Fe(NH4)2(SO4)2, FeC12 oder FeC13 oder andere zwei- oder dreiwertige Eisenverbindungen und einem Dithionit und/oder Sulfid und/oder einem oder mehrerer Hilfsproteine wie z.B. dem Nifs-Protein möglich. Es kann dabei auch das Isotop Fe-57 verwendet werden. Der erfindungsgemäße LytB -Aktivitätstest kann zur Auffindung spezifischer Enzyminhibitoren genutzt werden. Dazu werden die zu testenden Substanzen dem Reaktionsansatz zugesetzt und ihr Einfluß auf die Umsatzrate gemessen. Die Substanzen werden typischerweise in ver- schiedenen Konzentrationen zwischen 1 nM und 0,2 mM getestet. Soll eine größere Anzahl von Substanzen ohne verfügbarer Information über ihre inhibitorischen Eigenschaften getestet werden, so werden sie in den meisten Fällen zunächst bei einer fixen Konzentration im Bereich von 0,005 bis 0,2 mM eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Durchführung eines sog. „high-throughput screenings" (HTS). Dadurch wird die Untersuchung einer große Anzahl von potentiellen Inhibitoren (1.000 bis 1.000.000 Verbindungen) ermöglicht. Für die Durchführung des HTS eigenen sich besonders Mikrotiterplatten, mit 96, 384 oder 1536 wells. Das bevorzugte Reaktionsvolumen beträgt in Abhängigkeit vom Plattenformat 0,5 bis 200 μl.
Die mit Hilfe des erfϊ ndungsgemäßen Testsystem identifizierten Inhibitoren eigenen sich als antibakterielle und antiparasitäre Wirkstoffe für die Behandlung von Mensch und Tier, sowie als Herbizide, bzw. als Leitstrukturen für die Entwicklung solcher Wirkstoffe.
Die für das erfindungs gemäße Verfahren benötigten Komponenten können als sog. „kit" als Experimentalausrüstung zur Verfügung gestellt und vermarktet werden. Ein solcher kit enthält beispielsweise fertige angesetzte Lösungen der zur Durchführung des Verfahrens nötigen Reagenzien oder Konzentrate zur Herstellung solcher Lösungen, außerdem spezielle Reaktionsgefäße, Geräte und Apparaturen sowie eine Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Assays.
Beispiel 1 : Expressionsklonierung des gcpE-Gens
Es wurde ein Plasmid zur rekombinanten Darstellung des GcpE-Proteins aus T. theromphilus in E. coli konstruiert. Da die Expression der originalen DNA-Sequenz wegen des hohen G/C- Gehalts infeffizient ist, wurde ein vollständig synthetisches Gen im präferierten Codon- Gebrauch von E. coli hergestellt. Das synthetische Gen wurde über die Restriktionsschnittstellen Nco I und Bgl II in den Expressionsvektor pQE-60 ligiert. Die carboxyterminale Oli- go-Histidin-Sequenz wurde durch Verdau des Plasmids mit Bbl II und Hind III, Auffüllen der überhängenden Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und Religation mit T4-Ligase beseitigt.
Beispiel 2: Aufreinigung des rekombinanten GcpE-Proteins 4 Schüttelkolben mit je 400 ml TB (Terrific Broth)-Medium supplementiert mit 0,2 mg/ml Ampicillin und 0,05 mM FeCl3 wurden mit je 10 ml aus einer Übernachtkultur von E. coli TOP 10F' -Zellen, die mit dem oben beschriebenen Plasmid transformiert wurden waren, inokuliert. Die Kulturen wurden unter lebhaftem Schütteln für 12 h bei 37°C inkubiert. Die Zel- len wurden durch Zentrifugation geerntet und auf Trockeneis eingefroren. Alle folgenden
Schritte wurden unter Sauerstoffausschluß durchgeführt. Das Pellet wurde mit 80 ml Puffer A (20 mM Tris HC1, pH 8,0) mit 0,1 mg/ml DNase I versetzt, und die Zellen durch Ultraschallbehandlung disintegriert. Das Lysat wurde für 20 min bei 16.000 rpm zentrifugiert und der Überstand einer Hitzedenaturierung bei 65°C für 30 min unterworfen. Das präzipitierte Mate- rial wurde durch Zentrifugation bei 25.000 rpm für 25 min beseitigt und der Überstand über einen Filter mit 0,2 um Porendurchmesser filtriert. Die Lösung wurde auf eine 1,6 x 40 cm DEAE-Sepharose-Säule (Fast Flow, Pharmacia), die mit Puffer A äquilibriert wurden war, geladen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in Puffer A eluiert. Die Hauptfraktion wurde durch Gelfiltration (Sephadex G-25, PD10, Pharmacia) in Puffer A umgepuffert. Das Protein wurde weiter durch Anionenaustausch-Chromatogrphie gereinigt (1 x 10 cm, source 15 Q, Pharmacia; 0 bis 1 M NaCl in Puffer A). Die Hauptfraktion wurde durch Ultrafiltration auf 1,3 ml konzentriert (Centricon, Millipore, 30 kDa cut-off). Ein letzter Reinigungsschritt erfolgte durch Gelfiltration über eine XK 16/60 Superdex 75-Säule, die mit 100 mM NaCl in Puffer A äquilibriert und eluiert wurde. Die Proteinlösung wurde durch Ultrafiltration auf 25 mg/ml konzentriert und bei -80°C gelagert.
Beispiel 3 : Durchführung des GcpE- Aktivitätstests
Die Umsetzung von MEcPP durch das GcpE-Protein wurde photometrisch gemessen. Alle Arbeiten wurden in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Die Reaktion erfolgte bei 55 °C. In einer Quarzküvette wurden 0,7 ml einer Lösung von 2 mM Methylviologen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) vorgelegt. Das Methylviologen wurde durch Zusatz Na-Dithionit in seine reduzierte Form überführt, bis eine OD von 2,0 erreicht wurde. Dem Ansatz wurden das GcpE-Protein in unterschiedlichen Mengen zugesetzt und die Reaktion durch Zugabe von 1 mM MEcPP gestartet. Die einsetzende Abnahme der Absorption des reduzierten Methylvio- logens wurde bei einer Wellenlänge von 732 nm gemessen. In Fig. 2 ist die GcpE-abhängige zeitliche Abnahme der Absorption von reduziertem Methylviologen bei 732 nM in Gegenwart von MEcPP gezeigt.. Mit Hilfe der so erhaltenen Meßwerte wurde die Aktivität des GcpE- Proteins auf ca. 1 μmol min"1 mg"1 berechnet.
Beispiel 4: Expressionsklonierung des lytB-Gens Durch PCR wurde unter Verwendung der Oligonukleotiden Aa-LytB-cHis-for (5'- CCATGGTTGACATAATAATCGCA-3') und Aa-LytB-cHis-rev (5'- AGATCTGGAGGAAACCAATTGCCC-3') das lytB-Gen aus genomischer DNA von A. aeolicus amplifiziert. Nach Zwischenklonierung des PCR-Produkts in den pCR-TOPO-T/A- Vektor wurde die Insertion mit Ncol und Bglll herausgelöst, gereinigt und in den mit Ncol und Bglll vorbehandelten pQE60-Vektor ligiert. Das so erhaltene Konstmkt pQE60-Aa-LytB ermöglicht die Expression des LytB-Enzyms aus A. aeolicus mit einer carboxyterminalen His6-Fusion.
Beispiel 5: Aufreinigung des rekombinanten LytB-Proteins
E. coli- TOP10F'- oder XLlBlue- Zellen mit einem geeigneten Hilfsplasmid zur Expression AT-reicher Sequenzen wurden mit dem Expressionsplasmid pQE60-Aa-LytB transformiert und in Standard I-Medium (Merck) mit 150 μg/ml Ampicillin und mit 25 μg/ml Chloramphe- nicol inkubiert. Die Induktion der Expression erfolgte in der logarithmischen Wachstumsphase bei einer OD6oonm von 0,8 mit 1 mM IPTG entweder bei 37°C für 4 Stunden oder bei 30°C über Nacht.
500 ml der induzierten Zellkultur wurden abzentrifugiert und in 50 ml entgastem Puffer A aufgenommen. Alle folgenden Schritte wurden in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchge- führt. Die Zellen wurden durch Ultra-Schall disintegriert (Ultraschall Sonoplus HD70, Ban- delin, Berlin, 70% Amplitude, 40% Puls-Pause- Verhältnis). Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 14.000 g und 4°C wurde die zytoplasmatische Fraktion für 30 min auf 65°C erhitzt und erneut 30 min bei 14.000 g und 4°C zentrifugiert. Die lösliche Protein-Fraktion wurde über einen Filter (Reimer) mit einem Porendurchmesser von 0,2 μm filtriert. Das Filtrat wurde mit Hilfe einer Peristaltikpumpe bei einer Flußrate von 2 ml/min auf eine HR10/10-Säule mit ca. 8 ml Bettvolumen, die mit der Metall- Affinitäts-Matrix Talon Super- flow (Clonetech) gefüllt worden war, geladen. Die Säule wurde dann in eine FPLC-Anlage transferiert und mit folgendem Stufengradient bei einem Fluß von 2 ml/min entwickelt: Waschen mit 80% Puffer A und 20% Puffer B für 25 min, Elution mit 100% Puffer B für 15 min. Die Elution wurde durch UV- Absorptionsmessung bei 280 nm verfolgt, und die entsprechenden Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen, die das LytB-Protein enthielten, wurden schließlich über eine PDIO-Säule (Amersham-Pharmacia) auf Puffer C umgepuffert. Bei Bedarf wurde die Proteinlösung durch Ultrafiltration aufkonzentriert. Das Protein zeigte eine auffällig dunkelbraune Färbung mit einem Absorptionsmaximum um 410 nm, das durch das vorhandene Eisen-Schwefel-Cluster zustande kommt.
Puffer A: 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl
Puffer B: 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM Imidazol Puffer C: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)
Beispiel 6: Durchführung des Lyt-B Aktivitätstests
Die Umsetzung von HMBPP durch das LytB-Protein wurde photospektrometrisch analysiert. Alle Arbeiten wurden in einer Sauerstoff-freien Atmosphäre durchgeführt. Danbei wurde in einer Quarzküvette 0,6 ml einer Lösung von 0,1 mM Methylviologen in 20 mM Tris-HCl (pH 8) vorgelegt. Das Methylviologen wurde durch Zusatz von 0,08 mM Na-Dithionit in seine reduzierte Form überfuhrt. Dem Ansatz wurden 10 μg LytB-Protein zugesetzt und die Reakti- on durch Zugabe von 0,1 mM oder 1 mM HMBPP gestartet. In einem Kontrollansatz wurde kein HMBPP zugesetzt. Die einsetzende Abnahme der Absorption des reduzierten Methyl- viologens wurde in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 800 nm verfolgt. Dazu wurde in Abständen von 30 sec jeweils ein vollständiges Absorptionsspektrum aufgenommen. In Fig. 3 ist die LytB-abhängige zeitliche Abnahme der UV-VIS-Absorption von reduziertem Methyl- viologen bei unterschiedlichen HMBPP-Konzentrationen gezeigt. Der Extinktionskoeffizient von Methylviologen liegt bei 604 nm bei 13,6χl03 M^cm"1, bei 662 nm bei 7,28χl03 M^cm" bei 732 nm bei 3,15χl03 M' 1.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur gleichzeitigen oder getrennten Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, ausgewählt aus GcpE und LytB, dadurch gekennzeichnet, dass das jeweilige Enzym, eine oder mehrere Verbindung mit elektronenübertragenden Eigenschaften und mindestens eine Substanz, ausgewählt aus 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphat (MEcPP) und 4-Hydroxy-3 -methyl -but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), verwendet werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung mit elektronenübertragenden Eigenschaften verwendet wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Antrachinon; Antrochinon-2,6-disulfonat; Antrochinon-2-sulfonat; 2-Hydroxy-l,4- anthrachinon; 1 ,4-Benzochinon; Tetrachlorobenzochinon; 2,5-Dibromo-3-methyl-6- isopropylbenzochinon; 5-n-Undecyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazol; 1,4-
Naphtochinon; 1 ,4-Naphtochinon-2-Sulfonat; 1,2-Naphtochinon; 2-Hydroxy-l,4- naphthochinon; 5-Hydroxy-l,4-naphthochinon; Indigo; 5,5'-Indigodisulfonat; 5,5',7- Indigotrisulfonat; 5,5',7,7'-Indigotetrasulfonat; N,N,N',N',-Tetramethyl-p- phenylendiamin; 2,3,5,6-Tetramethyl-p-phenylendiamin; Phenazin; Phenazinethosulfat; Phenazinmethosulfat; N-Methylphenazoniummethosulfat; N-
Methylphenazoniumsulfonatmethosulfat; N-Ethylphenazoniumethosulfat; N-Methyl- 1 - hydroxyphenazoniummethosulfat; Neutral-Rot; Phenol-Rot; Chlorphenol-Rot; Cresol- Rot; Bromcresol-Purpur; Methylen-Blau; Toluidin-Blau; Safranin; 2,6-Dichlor-phenol- indophenol; Durochinon; Pyocyanin; Ruthenium-Hexaminchlorid; Trimethylhydrochinon; Menadion; 5-Deaza-7,8-dimethyl-10-methyl-isoalloxazin; Difenzoquat; Deiquat; photoreduziertes Deazaflavin; Dithionit; Titan(III)citrat; Methylviologen; Benzylviologen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Dithionit, Titan(III)c_trat, Methylviologen oder Benzylviologen verwendet wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Protein mit elektronenübertragenden Eigenschaften verwendet wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Cytochrom, Flavodoxin, Flavodoxinreduktase, Ferredoxin, Ferredoxinreductase, Thiredoxin, Thiredoxinreductase,
YfgB oder Glutathionreductase verwendet wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität von GcpE, oder LytB über eine photometrische Messung bestimmt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsänderung einer der Verbindungen gemäß der Ansprüche 2 bis 5 gemessen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationsänderung von reduziertem Benzylviologen oder Methylviologen gemessen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationsänderung von Dithionit oder Titan(III)citrat gemessen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorptionsänderung des Eisen-Schwefel-Clusters, das als Co-Faktor des GcpE oder des LytB-Enzyms fungiert, gemessen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorpitonsänderung eines Proteins mit elektronenübertragenden Eigenschaften gemessen wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationsänderung von 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphat (MEcPP), 4-Hydroxy-3-methyl-but-2- enyl-pyrophosphat (HMBPP), Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP) oder Dimethylallyl-
Pyrophosphat (DMAPP) gemessen wird.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Messung NMR- Spektroskopie, HPLC oder LC-MS verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das GcpE- oder LytB-Protein aus Bakterien, Parasiten oder Pflanzen stammt.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das GcpE- oder LytB- Protein aus einem thermophilen Organismus stammt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das GcpE- oder LytB- Protein aus Aquifex aeolicus, Thermotoga maritima oder Thermus thermophilus stammt.
17. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das GcpE- oder LytB- Protein aus Plasmodium falciparum stammt.
18. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das GcpE- oder LytB- Protein aus Arabidopsis thaliana, Menta piperita, oder Solanum lycopersicum stammt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das GcpE- oder LytB- Protein aus Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Escherichia coli oder Hae- mophilus influenzae stammt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das GcpE- oder LytB- Protein durch rekombinante Expression gewonnen wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Eisen-Schwefel-Cluster des GcpE- oder LytB-Proteins in vitro rekonstituiert wird.
22. Verfahren gemäß Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei Temperaturen zwischen 45 und 100°C erfolgt.
23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter anaeroben oder mikroaeroben Bedingungen erfolgt.
24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche zur Identifizierung von Inhibitoren der enzymatischen Aktivität des GcpE- oder LytB-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß po- tentiell die Aktivität des GcpE- oder des LytB-Proteins beeinträchtigende Substanzen dem reaktionsansatz zugesetzt werden und ihr Einfluß auf die Aktivität des Proteins bestimmt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24 zur Identifizierung von Substanzen mit antibakteriellen, an- tiparasitären und herbiziden Eigenschaften.
26. Verfahren gemäß Anspruch 24 und 25 zur Durchführung eines high-throughput scree- nings (HTS).
27. Experimentalausrüstung (kit) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26.
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