DE69636225T2

DE69636225T2 - Stimulierung der homologen rekombination in pflanzlichen organismen mittels rekombinations fördernder enzyme

Info

Publication number: DE69636225T2
Application number: DE69636225T
Authority: DE
Inventors: Bernd Reiss; Hans Kosak; Manfred Klemm; Jeff Schell
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: WO1997008331A1; EP0847445A1; DE69636225D1; US6583336B1; JP2000507804A; ATE329047T1; EP0847445B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Herstellung von transgenen pflanzlichen Organismen oder transgenen Pflanzenzellen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche transgene pflanzliche Organismen oder transgene pflanzliche Zellen, die Verwendung von Vektoren, die DNA umfassen, welche für ein rekombinationsförderndes Enzyme für die Wiedergutmachung von Schäden, die durch Umwelteinflüsse in Pflanzen oder Pflanzenzellen verursacht werden, codieren sowie neue Vektoren.
Das Verfahren der homologen Rekombination erfordert die Suche nach Homologie, die Erkennung von Sequenzähnlichkeit sowie den Strangaustausch zwischen zwei DNA-Molekülen. Bei Bakterien werden diese unterschiedlichen Schritte durch ein einziges Protein, nämlich das RecA-Protein (siehe Übersichtsartikel von Roca und Cox, 1990) vermittelt, dem eine zentrale Rolle beim Rekombinationsablauf von E. coli zukommt. Zur Initiierung der Rekombination und zur Weiterverarbeitung der von RecA erzeugten Zwischenprodukte sind jedoch zusätzliche Proteine erforderlich. Die Rekombination wird bei E. coli sowie vermutlich allen Organismen durch die Erzeugung von Einzelstrang-DNA (ssDNA) und DNA-Enden initiiert. Bei E. coli initiiert die gemeinsame Wirkung der Produkte des RecB-, RecC- und RecD-Gens einen wesentlichen Rekombinationsweg (siehe Übersichtsartikel von Dunderdale und West, 1994). Die ssDNA wird vom RecA-Protein erkannt, und Doppelstrang-DNR (dsDNA) wird aktiv gesucht. Der Austausch von komplementären Strängen führt zur Bildung von Rekombinationszwischenprodukten (Holliday-Strukturen). Die Zwischenprodukte können in unterschiedlichen Abläufen weiterverarbeitet werden; beim wichtigsten dieser Abläufe sind die Wirkungen des RuvA-, RuvB- und RuvC-Proteins beteiligt. Um die Rekombination erfolgreich zu vervollständigen, müssen alle Rekombinationsproteine zusammenwirken.
In vielen eukaryontischen Zellen wie Sproßhefe, Spalthefe, dem Menschen, Mäusen, Hühnern und Pflanzen (Terasawa et al., 1995; siehe auch Übersichtsartikel von Kowalcykowski und Eggleston, 1994) wurden Proteine mit einer auffallenden Ähnlichkeit zu RecA gefunden. Die am besten charakterisierten Proteine sind Dmc1 und Rad51 aus Saccharomyces cerevisiae. In beiden Fällen sind die entsprechenden Gene für die Rekombination unerläßlich und die Proteine weisen eine beträchtliche Sequenzhomologie mit RecA auf. Ein Vergleich der Primärsequenzen von Dmc1 und verschiedenen bakteriellen RecA-Proteinen legt nahe, daß diese Proteine vor der Trennung von Prokaryonten und Eukaryonten aus ein- und demselben Vorläufer hervorgegangen sind. Außerdem hat sich gezeigt, daß Rad51 eine große strukturelle Ähnlichkeit mit RecA aufweist. Rad51 bildet DNA/Protein-Filamente, deren Tertiärstruktur eine auffallende Ähnlichkeit zu denen, die von RecA gebildet werden (Ogawa et al., 1993) aufweisen. Während in früheren Untersuchungen nicht gezeigt werden konnte, daß Rad51 einen ATP-abhängigen, homologen Paarungsvorgang und Strangaustausch vermittelt (Shinohara, et al., 1992; Ogawa et al., 1993), wurden diese Auswirkungen in jüngeren Versuchen gezeigt (Sung, 1994). Rad51 interagiert mit anderen Proteinen, z. B. Rad52 und Dmc1, so daß es sich bei Rad51 um einen Teil eiens an der Rekombination beteiligten Komplexes handeln kann.
Die Komplexität dieser Proteine ist jedoch ein sehr deutlicher Hinweis darauf, daß sie nicht nur einfach ein dem RecA-Protein aus E. coli äquivalentes Homolog sind. Wiederum lassen sich unterschiedliche biologische Wirkungsweisen erwarten.
Es wurden verschiedene Berichte veröffentlicht, in denen der Wirkung des RecA-Proteins aus E. coli in tierischen Zellen, insbesondere in Säugetierzellen, das Hauptaugenmerk galt. So berichten Kido et al., 1992, über die Einschleusung eines funktionellen bakteriellen RecA-Proteins in Fusion mit dem Zellkernlokalisierungssignal des großen T-Antigens von SV40 in Säugetierzellen. Es wurden jedoch keine Funktionalitätsstudien an dem eingeschleusten Protein durchgeführt. WO 93/22443 befaßt sich mit der Zielsteuerung von exogenen Polynukleotidsequenzen, die auf RecA-Protein aus E. coli aufgetragen waren, an chromosomale DNA von Säugetierzellen. In dieser Schrift wird gezeigt, daß mit RecA-Protein beschichtete Oligonukleotide wirksam an die richtigen Positionen an Chromosomen zielgesteuert werden können, daß RecA die extrachromosomale Rekombination stimulieren kann und daß RecA/Kurz-DNA-Komplexe für die Zielsteuerung von Genen in Säugetierzellen verwendet werden können. Es gelang den Autoren jedoch nicht, die Stimulation der homologen Rekombination in lebenden Zellen oder einem ganzen Organismus zu zeigen. Spivak et al. (1991) berichten über die verbesserte Überlebensrate von HeLa-Zellen nach Behandlung mit RecA-Protein-haltigen Liposomen nach Bestrahlung. Das durch RecA stimulierte Überleben war jedoch nur gering. Cerruti et al berichten über die rekombinatorische Wirksamkeit von RecA-Protein aus E. coli in Plastiden, die jedoch keine Auswirkung auf die DNA-Reperatur oder das Überleben von Zellen hatte, vermutlich aufgrund der Tatsache, daß die Plastiden über ihr eigenes rekombinationsförderndes Enzym verfügen, das zu RecA aus E. coli homolog ist. Bis jetzt wurden keine erfolgreichen Versuche mit dem Ziel, RecA-Protein an Eukaryonten-Zellkerne zielzusteuern, durchgeführt, in denen man zu einer ausreichend hohen rekombinatorischen Wirksamkeit für die industrielle Anwendbarkeit von solchen Verfahren gelangte. Bezüglich Pflanzenzellen hat sich zum Beispiel die Einschleusung von RecA/DNA-Komplexen analog WO93/22443 in Pflanzenzellen durch PEG-vermittelte Transformation als äußerst schwierig erwiesen. Es scheint, daß diese Komplexe toxisch sind, und zum Zelltod von beinahe allen Protoplasten in der Population führen. Außerdem berichteten Kido et al., loc. cit., über den erfolglosen Versuch, ein RecA-Protein in die Zellkerne von Säugetierzellen einzuschleusen. Im Licht der Forschungen des Stands der Technik war es daher äußerst fraglich, ob ein rekombinationsförderndes Enzym wie RecA funktionsfähig in die Zellkerne von eukaryontischen Zellen eingeschleust werden konnte sowie weiterhin, ob solch ein eingeschleustes RecA-Protein tatsächlich in den Zellkern eindringen würde und die Rekombination aktiv in einem industriell anwendbaren Ausmaß fördern würde.
Die technische Aufgabe, auf der die vorliegende Erfindung beruht, bestand daher in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines transgenen Organismus oder einer transgenen Zelle, wobei bei diesem Verfahren ein rekombinationsförderndes Enzym verwendet wird. Die Lösung dieser technischen Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder transgenen Pflanzenzelle mit stimulierter homologer Rekombination, das folgendes umfaßt:

(a) Insertion einer DNA in das Genom einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, wobei diese DNA eine DNA umfaßt, die für ein rekombinationsförderndes Enzym aus der Gruppe E.coli-RecA-Proteine, modifizierte E.coli-RecA-Proteine mit ATPase-Aktivität sowie deren enzymatisch aktive Derivate oder Teile, und die zusätzlich für mindestens einen in dieser Pflanze oder dieser Pflanzenzelle exprimierbaren Selektionsmarker codiert; und
(b) Selektion von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die diese DNA gemäß (a) aufgenommen haben; und
(c) Kultivieren der gewünschten transgenen Pflanze oder der gewünschten transgenen Pflanzenzelle in einem geeigneten Kulturmedium.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es daher denkbar, daß das rekombinationsfördernde Enzym die gewünschten Eigenschaften vermittelt oder eine der gewünschten Eigenschaften darstellt. Im ersten Fall kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Beispiel zu Pflanzen mit einem hyperrekombinanten Phänotyp, die in der Pflanzenzüchtung nützlich sein könnten, zu Pflanzen, die eine erhöhte Toleranz gegenüber Umwelteinflüssen, zum Beispiel solchen, die durch UV oder Ozon verursacht werden, aufweisen, oder zu Pflanzen, die eine erhöhte Toleranz gegenüber DNA-Schädigung aufweisen, führen. Im zweiten Fall kann das rekombinationsfördernde Enzym zur Einschleusung durch Förderung der Rekombination einer interessierenden DNA-Sequenz in das Genom einer Pflanzenzelle oder eines pflanzlichen Organismus verwendet werden. Von diesen Transgenoten wird erwartet, daß sie die Frequenz der Zielsteuerung von Genen verbessern und diese Methodik zum Beispiel für die Pflanzenzüchtung anwendbar machen.
Weiterhin kann das rekombinationsfördernde Enzym in die Pflanzenzelle oder den pflanzlichen Organismus in Form einer Codierung durch eine entsprechende Nukleotidsequenz, die bei Expression dieses rekombinationsfördernde Enzym ergibt, eingeschleust werden. Das rekombinationsfördernde Enzym kann jedoch auch in die Pflanzenzelle oder den pflanzlichen Organismus als solches eingeschleust werden. In diesem Fall codiert die einzuschleusende DNA für ein Protein mit der zweiten bzw. einer weiteren gewünschten Eigenschaft. Die Nukleotidsequenz, die für die zweite bzw. weitere gewünschte Eigenschaften codiert, kann dann in das Genom der Pflanzenzelle oder des pflanzlichen Organismus durch die Wirksamkeit des rekombinationsfördernden Enzyms eingeschleust werden, welches natürlich in dieser Pflanzenzelle bzw. in diesem pflanzlichen Organismus biologisch aktiv sein muß. So kann es sich bei der zweiten oder weiteren Eigenschaft um ein zusätzliches Protein, das in der Pflanzenzelle bzw. in dem pflanzlichen Organismus zu exprimieren ist, oder um eine DNA-Sequenz, die bei Rekombination in das Genom des pflanzlichen Organismus bzw. der Pflanzenzelle zur Störung einer natürlich vorkommenden oder einer trans genen Genfunktion führt, handeln. Mit diesem Ansatz können auch modifizierte Proteine ohne Störung von endogenen nichtmodifizierten Kopien exprimiert und Variation zwischen den Transformanten umgangen werden. Es wird auch erwartet, daß Probleme aufgrund unstabiler Expression und Gene Silencing durch Verwendung der Zielsteuerung von Genen in Pflanzen umgangen werden können.
Zur Prüfung der Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde ein auf den von Lebel et al. (1993) veröffentlichten Daten und Systemen basierender, reproduzierbarer quantitativer Assay auf Mitomycin-C-Resistenz entwickelt. Es ist bekannt, daß sich Mitomycin C in vivo in die DNA einlagert, was zur Vernetzung der komplementären Stränge führt (Borowy-Borowski et al., 1990). Die Vernetzung führt zur Hemmung der DNA-Synthese bei Bakterien, ohne daß gleichzeitig die RNA- oder Proteinsynthese beeinflußt werden (Iyer und Szybalski, 1963). Bei Ustilago maydis und Saccharomyces cerevisiae wurde gezeigt, daß Mitomycin C die homologe Rekombination stimuliert, ohne dabei mutagen zu sein (Holliday, 1964). Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei unterschiedlichen höheren Eukaryontenzellen angestellt (Suzuki, 1965; Shaw und Cohen, 1964; Wang et al., 1988). Aus den Daten geht hervor, daß Mitomycin C wirksam die DNA-Replikation blockiert. Es wird vermutet, daß die entstandenen Tochterstrangblöcke in vielen Organismen durch homologe Rekombination (Schwesternchromatidaustauch) und Reparatur durch Herausschneiden repariert werden. Lebel et al. (1993) zeigten, daß Mitomycin C die intrachromosomale Rekombination in Pflanzenzellen stimuliert und so die rekombinatorische Reparatur von durch Mitomycin C verursachten Läsionen in Pflanzen nahelegt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß hohe Mitomycin-C-Konzentrationen unbehandelte Pflanzenzellen als Vertreter für Eukaryontenzellen wirksam abtöten, vermutlich dadurch, daß die Fähigkeit des endogenen Reparatur/Rekombinationssytems ausgeschöpft ist. Es wurde daher weiterhin gefunden, daß beim Wildtyp das Überleben der Protoplasten bei Mitomycin-C-Behandlung einer Dosis-Wirkungs-Kurve folgt, ähnlich, wie sie häufig bei Bakterien und Hefe beobachtet werden, nämlich, daß bei niedrigen Dosen eine Schulter und bei höheren Dosen ein halblogarithmischer Abfall auftritt (7).
Die Auswertung der Dosis-Wirkungs-Kurven (7) gemäß Friedberg (1985) legt nahe, daß die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte nt-RecA-Expression den Zellen die Fähigkeit, Schäden, die durch bis zu 50 μg/ml Mitomycin C verursacht werden, zu reparieren verleiht, während der endogene Reparaturmechanismus bei Wildtyp-Tabakprotoplasten nur Schäden, die von bis zu 15 μg/ml Mitomycin C verursacht werden, zu reparieren vermögen.
Pflanzenzellen, die nt-RecA exprimieren, wiesen daher eine beträchtlich höhere Resistenz gegenüber diesem Wirkstoff auf. Dies legt nahe, daß RecA in Pflanzenzellen funktionsfähig sein kann und dabei mit der endogenen pflanzlichen Rekombinationsmaschinerie interagiert oder diese ergänzt. Weiterhin stimulierte RecA direkt die intrachromosomale Rekombination in Pflanzen. Aufgrund dieser Daten kann erwartet werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren zu wesentlich höheren Rekombinationsfrequenzen als beliebige im Stand der Technik beschriebene Verfahren führt.
Die vorliegende Erfindung wurde in bezug auf Pflanzenzellen erläutert. Es wird erwartet, daß die vorliegende Erfindung zum ersten Mal eine Rekombinationseffizienz in den Zellkernen von Pflanzenzellen oder pflanzlichen Organismen ermöglicht, die zu einem industriell anwendbaren Verfahren zur Erzeugung von solchen transgenen Pflanzenzellen oder pflanzlichen Organismen führt.
In einem äußerst bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze oder Pflanzenzelle Nicotinia tabacum oder Arabidopsis thaliana bzw. davon abgeleitet.
In einer einem weiteren bevorzugten Verfahren sind die gewünschten Eigenschaften die Stimulierung der homologen Rekombination, Förderung der Zielsteuerung von Genen, Stimulierung von endogenen Mechanismen für die Reparatur von DNA-Schädigung, was zu einer Toleranz gegenüber verschiedenen chemischen und physikalischen Agentien (Ozon, UV) führt. Außerdem kann die weitere gewünschte Eigenschaft zum Beispiel ein zusätzliches exprimiertes Protein, das den Phänotyp des transgenen pflanzlichen Organismus bzw. der transgenen pflanzlichen Zelle auf eine gewünschte Art und Weise ändert, wie die Expression von zusätzlichen Oberflächenmarkern oder die Expression von unterschiedlichen/zusätzlichen Stoffwechselenzymen. Weiterhin kann diese Eigenschaft zur Störung einer natürlich vorkommenden Genfunktion in dem pflanzlichen Organismus oder der Pflanzenzelle führen.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren handelt es sich bei dem Selektionsmarker um Hyg, Km, PPT, Mtx oder Sul.
Der Fachmann ist mit diesen Selektionsmarkern gut vertraut, wobei Hyg für Hygromycinresistenz steht, Km für Kanamycinresistenz steht, PPT für Phosphonothricin (Basta) -resistenz steht, Mtx für Methotrexatresistenz steht und Sul für Sulfonamidresistenz steht. Der Fachmann kann jedoch diese bevorzugten Selektionsmarker durch beliebige andere Selektionsmarker, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, ersetzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem rekombinationsfördernden Enzym um das E. coli-RecA-Protein.
In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich bei dem Derivat des rekombinationsfördernden Enzyms um ein Fusionsprotein des E. coli-RecA-Proteins und einer Zellkernzielsteuerungssequenz.
Die gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform erzielten Versuchsdaten haben gezeigt, daß nt-RecA fähig war, die UV-Resistenz von recA E. coli zu erhöhen. Das chimäre Protein konnte an ssDNA binden und einen In-vitro-Strangaustausch ungefähr gleich wirksam wie RecA katalysieren. Interessanterweise wies nt-RecA im Gegensatz zu RecA eine hohe ATPase-Aktivität in Abwesenheit von ssDNA auf. Diese ssDNA-unabhängige Aktivität von nt-RecA wurde durch Zugabe von ssDNA gleich stark wie RecA selbst stimuliert. Es ist derzeit nicht bekannt, ob diese Aktivitäten auf zwei unterschiedlichen Proteinen (nt-RecA und ein RecA-artiges Abbauprodukt) im Ansatz beruhen oder ob es sich um eine intrinsische von nt-RecA handelt. Es kann auch nicht völlig ausgeschlossen werden, daß die ATPase-Aktivität von nt-RecA in Abwesenheit von ssDNA auf Spuren von kontaminierender ATPase oder DNA, die während des Nachweises durch Gelelektrophorese und Färben übersehen worden sind, beruht. Es ist jedoch wahrscheinlich, daß das nt-RecA-Fusionsprotein tatsächlich über unterschiedliche ATPase-Eigenschaften verfügt. Da der ATPase-Level von nt-RecA in Abwesenheit von ssDNA etwas höher als der von RecA in Gegenwart von ssDNA ist, könnte nt-RecA als modifiziertes RecA-Protein angesehen werden, das konstitutiv auf eine Art und Weise aktiviert wird, die an die Proteine RecA441 und RecA730 erinnert (Witkin et al., 1982). Die ATPase-Aktivität von RecA scheint zwei unterschiedliche Funktionen auszuüben, nämlich die Recyclierung des Enzyms und die Überwindung von nichthomologen DNA-Regionen (siehe Übersichtsartikel von Kowalczykowski und Eggleston, 1994; Roca und Cox, 1990).
In eine äußerst bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zellkernzielsteuerungssequenz um die Zellkernzielsteuerungssequenz T SV40.
Die SV40-Zellkernzielsteuerungssequenz ist in der Fachwelt gut bekannt und bedarf hier keiner weiteren Beschreibung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Insertion durch PEG-Transformation, Agrobakterium-Transformation, Elektroporation, Teilchenbeschuß, Liposomenfusion, in-planta-Transformation, Calciumphosphatfällung oder Virusinfektion vermittelt.
Das optimale verwendete Verfahren hängt vom taxonomischen Ursprung des pflanzlichen Organismus oder der Pflanzenzelle, der bzw. die zu transfizieren ist, ab. Der Fachmann weiß, welche Insertionsmethode sich für diesen Zweck am besten eignet.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen transgenen pflanzlichen Organismus oder eine transgene pflanzliche Zelle, der bzw. die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine DNA umfaßt, die für eine Zellkernzielsteuerungssequenz codiert, welche operativ mit einer DNA, die für ein rekombinationsförderndes Enzym aus der Gruppe E.coli-RecA-Proteine, modifizierte E.coli-RecA-Proteine mit ATPase-Aktivität und enzymatisch aktiven Teilen davon codiert, mindestens einem Selektionsmarker und mindestens einer weiteren DNA, die für eine gewünschte Eigenschaft codiert, verbunden ist, wobei das von dem Vektor codierte Fusionsprotein aus Zellkernzielsteuerungssequenz/rekombinationsförderndem Enzym eine ATPase-Aktivität aufweist.
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß gefunden, daß das Fusionsprotein aus aus Zellkernzielsteuerungssequenz und rekombinationsförderndem Enzym, wie es beispielhaft durch das Fusionsprotein, bei dem die Zellkernzielsteuerungssequenz von SV40 abstammt und es sich bei dem rekombinationsfördernden Enzym um das E. coli-RecA-Protein handelt, veranschaulicht wird, eine hohe ATPase-Aktivität vermittelt. Diese Aktivität scheint zwei unterschiedliche Funktionen auszuüben:
erstens scheint sie, das Enzym zu recyclieren und zweitens scheint sie, nichthomologe DNA-Regionen zu überwinden.
Der mindestens eine Selektionsmarker, der in dem Vektor, der die darin vorhandenen verschiedenen DNA-Sequenzen exprimieren kann, vorhanden ist, wurde bereits oben diskutiert. Das gleiche trifft auch für weitere DNAs zu, die für eine gewünschte Eigenschaft codieren und ebenfalls in dem erfindungsgemäßen Vektor vorhanden sein können.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Vektors handelt es sich bei der Zellkernzielsteuerungssequenz um die Zellkernzielsteuerungssequenz T SV40. Bei dem rekombinationsfördernden Enzym handelt es sich um das E. coli-RecA-Protein.
In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Vektor um pS/nt-RecA oder pEV/nt-RecA. Die Konstruktion dieser Vektoren ist in Beispiel 1 ausführlich beschrieben. Weitere Einzelheiten zu diesen Vektoren sind in 1 angegeben.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines Vektors, der eine DNA umfaßt, die einer damit zu transformierenden oder transfizierenden Pflanzenzelle eine oder mehrere gewünschte Eigenschaften verleiht, umfaßt; wobei diese DNA zusätzlich für mindestens einen in dieser Pflanzenzelle exprimierbaren Selektionsmarker codiert und weiterhin für ein rekombinationsförderndes Enzym aus der Gruppe E. coli-RecA-Proteine, modifizierte E. coli-RecA-Proteine mit ATPase-Aktivität und enzymatisch aktive Derivate oder Teile davon codiert, das die bzw. eine der gewünschten Eigenschaften für die Wiedergutmachung von Schäden, die durch Umwelteinflüsse in Pflanzen oder Pflanzenzellen verursacht werden, vermittelt. Bezüglich der Selektionsmarker sind rekombinationsfördernde Enzyme und Insertionsvorgänge, sowie bevorzugte Ausführungsformen davon oben beschrieben worden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden diese Schädigungen durch DNA-Schäden, vorzugsweise durch UV-Bestrahlung, Ozon, SO₂, Methylierungsmittel oder mutagenen Agentien, verursacht.
DIE ABBILDUNGEN ZEIGEN FOLGENDES:
1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG VON TRANSGENEN RECA-GENEN.
Die Codiersequenzen sind durch gefüllte Balken angegeben. Bei recA-Transgenen sind in den offenen Kästchen die Sequenzen angegeben, die zu der recA-Codierregion hinzugefügt wurden. Kleine Kästchen geben Sequenzen an, die nicht für Proteine codieren. Die Nukleotidsequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die hinzugefügt wurden, um zu pS/nt-recA und pEV/nt-recA zu gelangen, sind angegeben. Promoter sind als leere Pfeile angegeben, Polyadenylierungssignale als leere Kästchen. Abkürzungen: HindIII: Erkennungssequenz für die HindIII-Endonuklease; P35S: CaMV-35S-Promoter; PAA: Polyadenylierungssignal aus CaMV; ori: Replikationsursprung aus E. coli; Sul^r: Sulfonamidresistenzgen; Amp^r: Ampicillinresistenzgen; Br: rechte Bordersequenz der T-DNA; Bl: linke Bordersequenz der T-DNA; λP₁: Leftward-Promoter des Phagen Lamda.
2: VERGLEICH DER ATPASE-AKTIVITÄTEN VON RECA UND NT-RECA
Das RecA- und nt-RecA-Protein (100 pMol) wurde jeweils in Gegenwart oder Abwesenheit von ssDNA radioaktiv markiert. Der ATP-Verbrauch wurde bestimmt und die spezifischen Aktivitäten wurden berechnet.
3: VERGLEICH DER EINZELSTRANG-BINDUNGS-AKTIVITÄTEN VON RECA UND NT-RECA
Jeweils 0, 20, 50 und 100 pMol RecA- und nt-RecA wurden mit 400 pMol (Nukleotide) ssDNA in Gegenwart von γSATP inkubiert. Die Ansätze wurden elektrophoretisch auf 0,8%igen Agarosegels bei 4°C analysiert und die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Wo angegeben (+ entprot:) wurden die Proben vor der Elektrophorese entproteinisiert. Marker: Phage-Lamda-DNA, die mit PstI-Endonuklease verdaut worden war. Die Lage der Einzelstrang-Substrat-DNA in dem Gel ist angegeben (ssDNA).
4: VERGLEICH DER STRANGAUSTAUSCH-AKTIVI-TÄTEN VON RECA UND NT-RECA
Das RecA-Protein und das nt-RecA-Protein wurden wie von Menetski et al. (1990) beschrieben über den in der Abbildung angegeben Zeitraum mit Mischungen von linearer Doppelstrang-DNA und zirkulärer ssDNA in Gegenwart von einzelstrangbindendem Protein (SSB) und γSATP inkubiert. Der Ansatz wurde elektrophoretisch auf 0,8%igem Agarosegel bei Raumtemperatur analysiert und die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Kontrollreaktionen, die kein RecA-Protein oder nt-RecA-Protein (–(nt)RecA), kein γSATP (–ATP), kein Magnesium (–Mg), kein einzelstrangbindendes Protein (–SSB) bzw. weder einzelstrangbindendes Protein noch γSATP (–SSB –ATP) enthielten, wurden mitlaufen gelassen. Als Marker M1 diente Phage-Lamda-DNA, die mit PstI-Endonuklease verdaut worden war, während Marker M2 eine Mischung entspannter DNA (offener Ring "open circle", oc), linearisierter DNA (lin) überdrehter DNA (closed coiled circle", ccc) doppelsträngiger sowie zirkulärer einzelsträngiger (ss) DNA. Die Lage des offenen Rings, des Reaktionsprodukts der in dem Gel sichtbaren Strangaustauschreaktion, ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
5: TRANSGENE PFLANZEN, DIE RECA BZW. NT-RECA EXPRIMIEREN
Proteine, die durch Elektrophorese an SDS-haltigen, 12%igen Polyacrylamidgelen getrennt worden waren, wurden auf Nitrocellulose geblottet, und das RecA-Antigen wurde mit dem monoklonalen Anti-RecA-Antikörper ARM414 (Ikeda et al., 1990) nachgewiesen. Die Lage von aus E. coli aufgereinigtem RecA ist angegeben. Die Molekulargewichte wurden aufgrund einer Mischung von vorgefärbten Proteinen (BioRad), die in der Elektrophorese mitlaufen gelassen wurden, abgeleitet.
6: SUBZELLULÄRE LOKALISATION VON RECA UND NT-RECA IN TRANSGENEN TABAKPFLANZEN
Es wurden Protoplasten aus Blättern präpariert und die Proteine mit Formaldehyd fixiert. Die Zellkerne wurden durch DAPI-Färbung (DAPI-Tafeln) sichtbar gemacht. Dieselben Protoplasten wurden mit dem Anti-RecA-Antikörper ARM414 und zur Visualisierung des RecA-Antigens mit einem mit FITC markierten, zweiten Antikörper gefärbt (Anti-RecA-Tafeln). A: Protoplasten von nichttransgenen SR1-Pflanzen. B: Protoplasten von RecA-exprimierenden G64/2-Pflanzen. C: Protoplasten von nt-RecA-exprimierenden G63/19-Pflanzen.
7: RECA- UND NT-RECA-TRANSGENE PROTOPLASTEN SIND GEGEN DIE TOXISCHE WIRKUNG VON MITOMYCIN C STÄRKER RESISTENT
Protoplasten, die von SR1-, G64/2- und G63/19-Pflanzen erhalten worden waren, wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Mitomycin C zu Mikrokalli regeneriert. Die Überlebensfrequenzen werden durch die Anzahl in Gegenwart von Mitomycin C regenerierten Mikrokalli dividiert durch die Anzahl in Abwesenheit von Mitomycin C regenerierten Mikrokalli definiert. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unterschiedlichen Datengruppen. Die Irrtumsbalken zeigen die für jeden Datenpunkt berechnete Standardabweichung. Die Datenpunkte wurden in drei zusätzlichen unabhängigen Versuchen innerhalb von ±25% für 0, 10, 25 bzw. 50 μg/ml Mitomycin C reproduziert.
8: DIE EXPRESSION VON RECA UND NT-RECA FÜHRT ZUR STIMULIERUNG DER INTRACHROMO-SOMALEN REKOMBINATION
In drei unabhängigen Versuchen wurden mindestens 5 × 10⁶ Protoplasten, die aus jeder der drei Linien präpariert worden waren, in Gegenwart von Kanamycin regeneriert. Die Frequenz der intrachromosomalen Rekombination wurde aufgrund der Anzahl Kalli, die in Gegenwart von Kanamycin wuchsen, dividiert durch die bei jedem Versuch erzielte Regenerationsfrequenz, berechnet. Angegeben sind die Mittelwerte; die Fehler-Balken bedeuten die Standardabweichung.
BEISPIEL 1: EXPRESSION VON RECA UND DESSEN ZIEL-STEUERUNG AN DEN ZELLKERN BEI PFLANZEN:
Zellkernproteine halten sich ungeachtet ihrer Größe im Zellkern auf. Es wird angenommen, daß "Zellkernlokalisierungssignale", kurze Aminosäureabschnitte für die Zielsteuerung von Zellkernproteinen verantwortlich sind (siehe Übersichtsartikel von Dingwall und Laskey, 1986; Silver, 1991). Die Größe des E. coli-RecA-Monomers entspricht ungefähr der Ausschlußgrenze der Zellkernporen von Eukaryonten; cytoplasmische ssDNA/RecA-Filamente würden höchstwahrscheinlich ausgeschlossen werden. Es ist unwahrscheinlich, daß ein RecA-Protein Zellkernlokalisierungssignale enthält und daher vom Zellkern und dementsprechend seinem Ziel ausgeschlossen wird. Um diese Möglichkeit abzudecken, wurde RecA-Protein in Pflanzen als Beispiel für einen eukaryontischen Organismus exprimiert, und zwar nicht nur in seiner authentischen Form, sondern auch als Fusion mit einem Zellkernlokalisierungssignal.
Zuerst wurde das recA-Gen dahingehend modifiziert, daß die meisten bakteriellen Sequenzen von seinen nicht- translatierten Regionen stromaufwärts und stromabwärts entfernt wurden. In einem zweiten Schritt wurde die Codiersequenz in 5'-Richtung mit der Zellkernlokalisierungssequenz des großen T-Antigens von SV40 verbunden (Kalderon et al., 1984), was zu einem Fusionsprotein führte (nt-RecA). Um die Translation von nt-RecA zu optimieren, wurde eine vom Rubisco-SSU-Gen (Cashmore, 1983) abgeleitete Leitsequenz, die für ein Traslationsinitiationscodon codiert, in 5'-Richtung von der nt-RecA-Codiersequenz fusioniert. Sowohl die recA- als auch die nt-recA-Sequenz wurden unter die transkriptionelle Kontrolle des 35S-Promoters des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) gestellt und in 3'-Richtung mit einem eukaryontischen Polyadenylierungssignal versehen (1). Schließlich wurden die Gene in einen binären Vektor, der sich für die Agrobakterium-vermittelte Pflanzentransformation eignet, insertiert, wobei ein Sulfonamidresistenzgen (Sul^r) für die Selektion von transformierten Pflanzen verwendet wurde (1). In dem Plasmid pS/recA war die Orientierung des recA-Transgens in bezug auf das Sul^r-Gen derart, daß die beiden Gene in unterschiedliche Richtungen transkribiert wurden. In dem Plasmid pS/nt-recA werden jedoch das nt-recA-Gen und das Sul^r-Gen in die gleiche Richtung transkribiert.
Für die biochemische Charakterisierung wurde das nt-RecA-Fusionsprotein auch in E. coli exprimiert. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pEV/nt-recA konstruiert, in dem nt-recA mit einer künstlichen Ribosomenbindungsstelle fusioniert war (1).
Es folgt nun eine genaue Beschreibung des Versuchs:
Modifizierte recA-Gene wurden von dem Plasmid pDR1453 (Sancar und Rupp, 1979) abgeleitet. Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym SacII verdaut und mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I stumpfendig gemacht, und der amino-terminale Teil des recA-Gens wurde als SacII/EcoRI-Fragment in das Plasmid pUCl8, das mit EcoRI und SmaI geschnitten worden war, subkloniert, wodurch man zu dem Plasmid pRecA-1 gelangte. Dieses Plasmid wurde mit HinfI verdaut und stumpfendig gemacht, und der carboxy-terminale Teil des recA-Gens wurde als HinfI/EcoRI-Fragment in pUC19 (EcoRI/SmaI) subkloniert (pRecA-2). Der amino-terminale Teil wurde weiter modifiziert. Ein von pRecA-1 erhaltenes BstXI/EcoRI- und TagI/BstXI-Fragment, codierend für den amino-terminalen Teil von recA ohne das Initiationscodon sowie zwei komplementäre Oligonukleotide (5'GGG GAC TCC TCC TAA GAA GAA GCG TAA GGT TAT GGC GAT3' (SEQ ID Nr. 1) und 5' CGA TCG CCA TAA CCT TAC GCT TCT TCT TAG GAG GAG TCC CC3' (SEQ ID Nr. 2)), codierend für die fehlenden Codons, sowie die Zellkernlokalisierungssequenz von SV40 wurden in das Plasmid pUC18, das mit EcoRI und SmaI verdaut worden war, insertiert, wodurch man zu dem Plasmid pRecA-3 gelangte. Die DNA-Sequenz der entsprechenden Anschlüsse bestätigte die erwartete Struktur der Konstrukte.
Für die Expression von nt-RecA in Pflanzen wurden die Leitsequenz und die Codons, die für die ersten vier Aminosäuren des Rubisco-SSU-Gens codieren, mit dem recA-Gen fusioniert. Das Plasmid pSP64/TPNPTII (Wassmann et al., 1986) enthält den amino-terminalen Teil des SSU-Gens. Dieses Plasmid wurde mit EcoRV und SalI verdaut, und ein von pRecA-3 abgeleitetes SmaI/EcoRI-Fragment, das den carboxy-terminalen Abschnitt des recA-Gens sowie ein EcoRI/SalI-Fragment von pRecA-2 enthält, wurde hineininsertiert, wodurch man pRecA-4 erhielt. Das vollständige nt-recA-Gen wurde durch Verdauung mit HindIII und SalI aus pRecA-4 herausgeschnitten. Die HindIII-Enden wurden stumpf gemacht, und das Fragment wurde in das Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) insertiert, das dahingehend modifiziert worden war, daß es stromaufwärts der unikären EcoRI-Stelle eine zusätzliche HindIII-Stelle enthielt. Mit diesem Schritt wurden der CaMV-35S-Promoter bzw. das Polyadenylisierungssignal mit dem nt-recA-Gen fusioniert. Für die Expression von RecA in Pflanzen wurden das SmaI/EcoRI-Fragment von pRecA-3, das den amino-terminalen Abschnitt des recA-Gens enthielt, und das EcoRI/SalI-Fragment aus pRecA-2, das den carboxy-terminalen Abschnitt enthielt, in das modifizierte pDH51-Plasmid über die entsprechenden Restriktionsstellen insertiert. Um das Plasmid pEV/nt-recA für eine Expression in E. coli zu erhalten, wurden das BamHI/EcoRi-Fragment von pRecA-3, das den aminoterminalen Abschnitt des recA-Gens enthielt, und das EcoRI/SalI-Fragment von pRecA-2, das dessen carboxyterminalen Abschnitt enthielt, in das Plasmid pEVvfr1 (Crowl et al., 1985) insertiert.
Der binäre Vektor, der ein selektierbares Sul^r-Markergen enthält, wurde folgendermaßen konstruiert: Das Plasmid pJIT119 (Guerineau et al., 1990) wurde mit HindIII verdaut, die Enden wurden mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt, und das HindIII/SalI-Fragment, das das Sul^r-Gen trug, wurde in das Plasmid pDH51, das mit SmaI und SalI verdaut worden war, insertiert. Um pS001 zu erhalten, wurde das Sul^r-Gen, das mit dem CaMV-35S-Promoter und dem Polyadenylisierungssignal fusioniert war, über die NcoI- und SstI-Restriktionsstellen gegen das Methotrexat-Resistenzgen in pM001 ausgetauscht (Reiss et al., 1994). Das recA-Gen und das nt-recA-Gen wurde jeweils durch Verdauung mit HindIII herausgeschnitten und in die unikäre HindIII-Restriktionsstelle des Plasmids pS001 insertiert, wodurch man zu den Plasmiden pS/recA und pS/nt-recA gelangte.
BEISPIEL 2: CHARAKTERISIERUNG VON NT-RECA.
Um zu bestimmen, ob die Fusion des Zellkernlokalisierungssignals irgendeinen Einfluß auf die biochemischen Eigenschaften von RecA ausübte, wurden verschiedene Reaktionen geprüft:

(I) In E. coli vermittelt RecA direkt über die rekombinatorische Reparatur von Replikationenblöcken und indirekt dadurch, daß es die Induktion von SOS-Reaktionen, darunter die verstärkte Expression von RecA selbst (Roberts et al., 1978) vermittelt, UV-Resistenz. Um die Funktion des nt-RecA-Plasmids zu prüfen, wurde pEV/nt-recA, in dem das nt-recA-Gen vom Phagenpromoter λP₁ aus transkribiert wird, in den RecA--E. coli-Stamm DH5α eingeschleust.

Insbesondere wurde das Plasmid pEV/nt-recA in den E. coli-Stamm DH5α (supE44, ΔlacUl69(Φ801acZΔM15), hsdRl7, recA1, endAl, gyrA96, thi-1, relAl, Gibco/BRL), das für ein hitzeinduzierbares Lambda-Repressorgen codiert, beherbergt, transformiert. Die Kulturen wurden bei 28°C in LB-Medium mit einem Zusatz von Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (25 μg/ml) gezüchtet. Die Expression wurde durch einen Temperaturübergang auf 42°C induziert. Nach einem zusätzlichen zweistündigen Wachstums- und Expressionszeitraum wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet und mit 250 mM Tris/HCl pH 7,5, 25% (w/v) Saccharose, gewaschen. Hohe Expressionsniveaus durch thermische Inaktivierung des Repressors λcI857 erwiesen sich als letal. Bei 28°C jedoch waren die Zellen lebensfähig und UV-tolerant, was anzeigt, daß nt-RecA funktionsfähig war. Aufreinigung von nt-RecA wie für RecA von Cox et al. (1981) gemäß den Abwandlungen von Griffith und Shores (1985) beschrieben, ergab 20 mg nt-RecA aus 2 g Zellen. Das Protein wurde in 20 mM Tris/HCl pH7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT-Puffer mit 20% (v/v) Glycerin bei –20°C aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wurde gemäß Bradford (1976) bestimmt. Reinheit und Identität des nt-RecA-Proteins wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Färbung mit Coomassie-Blau sowie Western-Blotting unter Verwendung des Antikörpers ARM414, einem auf traditionelle Weise erzeugten Antikörper, verifiziert.
Das Präparat enthielt ein einzelnes Protein, das in der Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar war. Dieses Protein reagierte im Western-Blot mit dem anti-RecA-Antikörper. Unter Verwendung dieser Kriterien entsprach die Reinheit des nt-RecA-Präparats der Reinheit eines Präparats des RecA-Proteins, das gemäß dem gleichen Protokoll von mit Nalidixinsäure induzierten E. coli-Zellen, die das Plasmid pDR1453 trugen, aufgereinigt worden war.

(II) Die ATPase-, ssDNA-Bindungs- und Strangaustauschaktivitäten wurden mit hochaufgereinigtem nt-RecA-Protein, das durch Hitzeinduktion eines recAl-E. coli- Strangs, der pEV/nt-recA trug, produziert worden war, analysiert. Es wurde gezeigt, daß die aufgereinigten nt-RecA-Präparate kleine Mengen (weniger als 5%) eines Proteins mit dem Molekulargewicht von authentischem RecA enthielten, was vermutlich auf eine Prozessierung durch eine unspezifische Protease oder darauf, daß die Translation bei einem internen Initiationscodon in nt-recA begann, zurückzuführen war.

Die ATPase-Aktivitäten von nt-RecA und authentischem RecA, die beide nach der gleichen Vorgehensweise (Griffith und Shores, 1985) aus E. coli-Kulturen aufgereinigt worden waren, wurden parallel in Gegenwart bzw. Abwesenheit von ssDNA im Assay getestet (Shibata et al., 1981). Im wesentlichen wurde die ATPase-Aktivität wie von Shibata et al. (1981) beschrieben bestimmt, nur daß statt [³H] ATP [¹⁴C] ATP (Amersham, spezifische Aktivität 5 × 10¹² Ci/Mol) verwendet wurde. Es wurde gefunden, daß die ATPase-Basalaktivität von authentischem RecA niedrig war, jedoch durch Zugabe von ssDNA wie erwartet 20fach stimuliert war (siehe Roca und Cox, 1990). Im Gegensatz dazu wurde gefunden, daß die ATPase-Basalaktivität von nt-RecA wesentlich höher war und durch Zugabe von ssDNA proportional weniger stark stimuliert wurde (2).

(III) Die Bindung von aufgereinigtem nt-RecA an ssDNA wurde mit Gelretardations-Assays getestet. Eine fixe Menge ssDNA wurde mit ansteigenden Mengen aufgereinigtem RecA- und nt-RecA-Protein in Gegenwart von γSATP zur Verhinderung der Dissoziation der Komplexe inkubiert. Insbesondere wurde die Bindung von nt-RecA und RecA an ssDNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl 25 mM Tris/Acetat, 4 mMMgCl₂, 1 mM DTT, 20 μM Nukleotid-ssDNA von einem Derivat des Phagen M13mp18, siehe Beschreibung von Wada et al. (1994), sowie 2 m μ γSATP bestimmt. Unterschiedliche Proteinmengen (0, 20, 50, bzw. 100 pMol) wurden 30 Minuten bei 37°C mit dieser Mischung inkubiert. Zur Entproteinisierung wurde mit SDS und EDTA auf Endkonzentrationen von 1% (w/v) bzw. 10 mM versetzt (Riddles und Lehmann, 1985). Es wurden keine Unterschiede bezüglich der Bindungskinetik beobachtet (3).
(IV) Das RecA- und das nt-RecA-Protein förderten den Strangaustausch zwischen linearer dsDNA und zirkulärer ssDNA (Menetski et al., 1990) mit der gleichen Kinetik (4). Die Strangaustauschreaktion wurde genau wie bei Menetski et al. (1990) beschrieben durchgeführt. Als Substrate wurden geschlossene zirkuläre ssDNA und mit BglI linearisierte dsDNA, die von einem Derivat des Phagen M13mp18 (Wada et al., 1994) präpariert worden waren, verwendet.

Diese Tests ergaben daher, daß nt-RecA die von einem RecA-Protein erwarteten Aktivitäten zeigte.
BEISPIEL 3: CHARAKTERISIERUNG VON RECA- UND NT-RECA-TRANSGENEN PFLANZEN
Für die Infektion von Tabak-Blattscheibchen wurden Agrobakterien, die binäre Vektoren mit dem recA- und dem nt-recA-Transgen trugen, verwendet: die Plasmide pS/recA und pS/nt-recA wurden auf dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101/pMP90RK (Koncz and Schell, 1986) mittels Elektroporation übertragen, und die erhaltenen Stämme (für recA transgene Pflanzen wurden mit G64 bezeichnet, und die für nt-recA transgenen Pflanzen mit G63) wurden für die Inokulation von Blattscheibchen, die nach veröffentlichten Verfahren (Koncz and Schell, 1986) aus sterilen SR1-Tabakpflanzen hergestellt worden waren, verwendet. Die transformierten Schosse wurde auf Sulfadiazin (100 mg/l) selektiert. Die Pflanzen wurden regeneriert und auf Bewurzelung auf Sulfadiazin (100 mg/l) geprüft. Die transgenen Pflanzen wurden im Gewächshaus bis zur Reife herangezogen und die Samen wurden geerntet. Die Vererbung der Transgene wurde durch Keimung der Samen in Gegenwart von Sulfadiazin auf dem gleichen Medium geprüft. Die SRlhph2-Pflanzen wurden aus Keimlingen, die unter sterilen Bedingungen auf Hygromycin (15 mg/l) selektiert worden waren, herangezogen. Die SRlhph2-Pflanzen wurden im Gewächshaus mit G63- und G64-Pflanzen gekreuzt. Schwesternpflanzen, die das recA- und das hph2-Transgen enthielten, wurden dadurch selektiert, daß man die Keimlinge in Gegenwart von sowohl Sulfadiazin (100 mg/l) und Hygromycin (15 mg/l) unter sterilen Bedingungen heranzog. Die Pflanzen wurden ohne weitere Selektion bis zur Reife herangezogen. Einzelne transgene Pflanzen wurden der Reihe nach numeriert. Sprosse, die sich auf sulfonamidhaltigen Selektivmedien bewurzelten, wurden als resistent erachtet und für die weitere Analyse selektiert.
Das Vorhandensein der recA-Transgene wurde durch Southern-Blots bestätigt. Für die Southern-Hybridisierungen wurde aus Blättern präparierte Gesamt-DNA (Murray und Thompson, 1980) mit EcoRI restringiert, und die Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt und auf eine Nylon-Membran geblottet (Zetaprobe, Biorad). Die Membran wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit radioaktiv markierten Sonden, die nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (1984) hergestellt worden waren, hybridisiert. Fragmente, die für recA-Sequenzen codieren, wurden mit Hilfe eines Fragments von pRecA-4, das das gesamte Gen abdeckt, nachgewiesen. Die Kopienzahl der Inserte wurde mit Hilfe von Sonden, die spezifisch für Border-Fragmente, welche sich vom Sμl^r und vom recA-Gen ableiteten, spezifisch waren, bestimmt. Es wurde gefunden, daß 11 von 12 sulfonamidresistenten G64-Pflanzen ein intaktes recA-Transgen trugen. Pflanzen mit Einzelkopie-Inserts wurden selektiert, und es wurde gezeigt, daß sie den Sulfonamidresistenzmarker an ihre Nachkommenschaft als einzelnes, mendelndes Merkmal vererbten. Im Gegensatz dazu wurde gefunden, daß nur drei von 36 G63-Pflanzen ein intaktes nt-recA-Gen trugen. Bei einer davon, nämlich G63/19, war die rechte Border der T-DNA deletiert. Die Deletion führte zu einer Fusion der 35S-Promotersequenzen, die die nt-recA-Expression kontrollieren, mit pflanzlichen Genomsequenzen. Andere transgene Pflanzenlinien trugen entweder keine recA-Sequenzen oder umgeordnete nt-recA-Gene. Es wurde gezeigt, daß die intakten nt-recA-Transgene in den drei unabhängigen transgenen Pflanzen als einzelne Kopie vorlagen und als einzelnes mendelndes Merkmal vererbt wurden.
Die Expression des recA- und des nt-recA-Gens wurde unter Verwendung von Western-Blots von Proteinextrakten von Blättern, wobei als Sonde ein RecA-spezifischer monoklonaler Maus-Antikörper (ARM414, Ikeda et al., 1990) verwendet wurde, verfolgt. Zuerst wurden die Proteine aus Blättern von in Sterilkultur herangezogenen Pflanzen extrahiert. Die Blätter wurden mit Laemmli-Probenpuffer (Laemmli, 1970) (ohne Bromphenolblau) unter Zusatz von Meersand, unter Verwendung eines Glasstäbchens in einem Eppendorf-Röhrchen zermahlen.
Nach 15minütiger Hitzedenaturierung der Proben bei 95°C wurde der Extrakt durch Zentrifugieren geklärt, und der Überstand wurde für die weitere Analyse verwendet. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt (Bradford, 1976), und 50 μg wurden für eine Elektrophorese an Polyacrylamid-SDS-Gelen nach der Methode von Laemmli (1970) verwendet. Die Proteine wurden wie beschrieben (Towbin, 1979) auf Nitrocellulose-Membranen (Schleicher and Schuell, Porengröße 0,45 μm) übertragen. Das RecA-Protein wurde mit Hilfe des monoklonalen anti-RecA-Antikörpers ARM414 (Ikeda et al., 1990) in einer 1:200-Verdünnung in TBST-Puffer nachgewiesen, und zwar nach Blockierung der unspezifischen Proteinbindung durch 5% Trockenmagermilch. Zur Entwicklung des Blots wurde ein zweiter Antikörper (Ziege-anti-Maus, Promega), der an alkalische Phosphatase gekoppelt war, und NBT/BCIP (Promega)-Färbung oder ein zweiter Anti-Maus-Anti-körper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, und Chemilumineszenz (ECL, Amersham) verwendet. So wurde gezeigt, daß alle Pflanzen mit einem intakten recA- oder nt-recA-Gen RecA-Protein exprimierten. Die Expression in G64-Pflanzen (recA) war bei den meisten Transgenoten ähnlich und machte ungefähr 0,1% des Gesamt-Pflanzenproteins aus, wie dies aufgrund eines Vergleichs der Färbungsintensitäten mit denjenigen einer Verdünnungsserie von gereinigtem RecA-Protein geschlossen werden konnte. Das Expressionsniveau von nt-RecA lag im Bereich von 0,01% (G63/17) bis 0,1% (G63/19) des Gesamtproteins. Sowohl das RecA- als auch das nt-RecA-Protein schien in den Pflanzenzellen stabil zu sein, und beide wiesen das erwartete Molekulargewicht auf (5). Bei nt-recA-transgenen Pflanzen wurden mit dem Antikörper kleine Mengen von zusätzlichen Proteinen nachgewiesen. Da diese Proteine ein niedrigeres Molekulargewicht aufwiesen, handelte es sich dabei vermutlich um Abbauprodukte des tatsächlichen nt-RecA-Proteins.
Die Lokalisierung des RecA- und des nt-RecA-Proteins der Zelle wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Es wurden Pflanzen mit vergleichbaren Expressionsniveaus (G64/2 und G63/19) ausgewählt und Protoplasten oder Wurzelquetschpräparate hergestellt. Die Protoplasten wurden nach der Methode von Negrutiu (1987) für die immunhistochemische Lokalisierung des RecA- und nt-RecA-Proteins präpariert. Die Proteine wurden bei Raumtemperatur mit 5% Formaldehyd fixiert (105 Protoplasten in 2 ml K3, 0,4 M Saccharose). Der Formaldehyd wurde durch Waschen in W5 entfernt, und das Chlorophyll wurde mit Methanol extrahiert. Unspezifische Bindungen wurden durch einstündige Inkubation der Protoplastenpräparate in 5% BSA in TBST blockiert. Die Protoplasten wurden durch Zentrifugation gewonnen und in TBST mit anti-RecA-Antikörper ARM414 (1:50) inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit TBST-Puffer, der 5% BSA enthielt, wurden die Protoplasten mit FITC-markiertem Anti-Maus-Antikörper (Promega, 1:1000) inkubiert. Nichtgebundene Antikörper wurden durch Waschen mit TBST, 5% BSA entfernt. Die Zellkerne wurden mit DAPI (2 μg/ml) in dem gleichen Puffer gefärbt. Das Präparat wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (Zeiss Axiophot) untersucht.
Nach einstündigem Fixieren von Blättern und Wurzeln in Methanol:Essigsäure (3:1) bei Raumtemperatur waren das RecA- und das nt-RecA-Protein in dem gesamten Gewebe von Jungpflanzen lokalisiert. Das Gewebe wurde mit K3-Medium equilibriert und über Nacht mit 0,9% Cellulase in dem gleichen Medium inkubiert. Nach fünfminütigem Inkubieren in Essigsäure wurde das Gewebe auf eine Objektträger übertragen und zerquetscht. Die Färbung mit anti-RecA-Antikörper erfolgte wie oben für die Protoplasten beschrieben.
In G63/19-Pflanzen, trat FITC-Fluoreszenz fast ausschließlich im Zellkern auf (6). Eine gewisse Färbung war auch in den Chloroplasten zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren in den G64/2-Zellen die Zellkerne nicht besonders gefärbt. Es schien jedoch, daß eine schwache Bevorzugung für eine Assoziation mit dem Zellkern und Konzentration in der Zone um den Zellkern auftrat (6). In nichttransgenen SR1-Tabakpflanzen wurde nur eine Hintergrundfärbung beobachtet. Hieraus kann geschlossen werden, daß die SV40-Zellkernlokalisierungssequenz in nt-RecA zu einer wirksamen Akkumulierung dieses Proteins im Zellkern der Pflanzenzelle führt.
BEISPIEL 4: DIE EXPRESSION VON RECA UND NT-RECA FÜHRT ZU EINER VERSTÄRKTEN RESISTENZ GEGEN MITOMYCIN C
Um die Auswirkung von Mitomycin C auf das Pflanzenwachstum zu untersuchen, wurde ein quantitativer, reproduzierbarer Assay verwendet. Es wurde das von Lebel et al. (1993) beschriebene System, mit dem das Schicksal von einzelnen Pflanzenzellen verfolgt werden kann, so weiterentwickelt, daß man zu einer höheren Empfindlichkeit gegenüber Mitomycin C und einer monotonen Überlebens-Dosis-Reaktionskurve gelangte.
Bei diesem System wurden Protoplasten aus steril gezüchteten SR1-Tabakpflanzen sowie parallel dazu Präparaten, die mit unterschiedlichen Mitomycin-C-Konzentrationen behandelt worden waren, hergestellt. Anschließend wurden die Protoplasten in einer Beadartigen Kultur in Gegenwart von Mitomycin C kultiviert. Bei den unbehandelten Protoplasten fand eine aktive Zellteilungstätigkeit statt, und es wurden innerhalb von vier bis acht Wochen Mikrokalli gebildet. Es werden nun die genauen Versuchsangaben beschrieben:
Von Blättern von axenisch gezogenen Pflanzen wurden nach der von Negrutiu (1987) beschriebenen Methode mit gewissen Modifikationen Protoplasten hergestellt. Abgeschnittene Blätter (3 g) wurden 16 Stunden im Dunklen in 145-mm-Petrischalen bei 22°C in 50 ml K3, 0,4 M Saccharose, 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kinetin, 0,6% Cellulase Onozuka R10 (Serva) und 0,3% Macerozym R10 (Serva) verdaut. Die Protoplasten wurden durch Filtration durch Stahlsiebe (Maschenweite 250 μm bzw. 100 μm) gereinigt und einmal mit W5-Medium gewaschen. Die Protoplasten wurden in 1 ml MaMg-Puffer (0,5 M Mannit, 15 mM MgCl₂, 0,1% MES, pH 5,7) suspendiert, unter dem Lichtmikroskop gezählt und mit K3, 0,4 M Saccharose auf eine Endkonzentration von 10⁶ Zellen/ml verdünnt. Ein aliquoter Teil der Protoplastenlösung (1 ml) wurde mit 9 ml K3-Medium mit 0,4 M Saccharose verdünnt, und es wurde mit Mitomycin C von einer Vorratslösung auf die in 7 angegebenen Endkonzentrationen versetzt. Nach zweitägiger Inkubation im Dunklen bei 22°C wurden die Protoplasten mit der Bead-Technik von Shillito et al. (1983) mit gewissen Modifikationen kultiviert. Die Protoplasten wurden durch Verdünnung mit einem gleichen Volumenmedium, das 0,8% niedrigschmelzende Agarose (FMC) als Geliermittel enthielt, eingebettet und auf einem festen Trägersystem (Filterpapierscheiben) in 20 ml Flüssigmedium gezüchtet. Die Kulturen wurden ungefähr vier Wochen lang gezüchtet, wobei wöchentlich das Medium gewechselt wurde. Das Überleben wurde bonitiert, sobald die Mikrokalli eine Größe von 2 bis 4 mm erreicht hatten. Aus repräsentativen Proben wurden Pflanzen herangezogen. Diese Pflanzen wiesen keine offensichtlichen Wachstumsabnormitäten auf.
In einem typischen Kontrollversuch wuchsen 10% bis 20% der ausplatierten Protoplasten zu Mikrokalli heran. Bei ansteigenden Mitomycin-C-Konzentrationen war die Bildung von Mikrokalli fortschreitend gehemmt (7). Bei Konzentrationen von 40 μg/ml und darüber wurde kein Wachstum (weniger als 10^–3% Kontrollwerte) beobachtet. Die Überlebenskurve wies bei niedrigen Dosierungen eine Schulter, was das Vorhandensein von Reparaturmechanismen, die zu Resistenz gegen Mitomycin C führten, sowie im Anschluß daran eine halblogarithmische Region bei hohen Mitomycin-C-Dosierungen, die Schäden, welche nicht mehr durch die endogenen Reparaturmechanismen repariert werden konnten, verursachten, auf.
Die Protoplasten von einer Pflanze, die für das recA-Transgen homozygot waren (G64/2), waren etwas, jedoch signifikant, resistenter gegenüber der toxischen Wirkung von Mitomycin C als die Kontrollzellen. Bei Konzentrationen von 40 μg/ml Mitomycin C überlebten mehr als 0,1% der Zellen und wuchsen zu Mikrokalli heran (7). Bei Mitomycin-C-Konzentrationen von 50 μg/ml und darüber wuchsen jedoch keine recA-transgenen Zellen (weniger als 10^–3% der Kontrollwerte). Im Gegensatz dazu waren über 0,1% nt-recA-transgene Protoplasten (Homozygote G63/19) zu Wachstum und Regeneration bei Konzentrationen von bis zu 50 μg/ml Mitomycin C, der höchsten geprüften Konzentration, befähigt (7).
BEISPIEL 5: DIE INTRACHROMOSOMALE REKOMBINATION EINES CHROMOSOMALEN MARKERS WIRD DURCH RECA UND NT-RECA STIMULIERT.
Pflanzen enthalten üblicherweise repetitive DNA-Sequenzen in großen Mengen. Eine Rekombination innerhalb dieser Sequenzen spielte offenbar bei der Genomevolution eine Rolle (siehe Übersichtsartikel von Flavell, 1982). Zur Untersuchung des intrachromosomalen Rekombinationswegs bei Pflanzen wurde von Peterhans et al. (1990) ein transgenes System entwickelt. Ein Paar Deletionsderivate des selektierbaren Markergens Neomycinphosphortransferase(nptII, Beck et al., 1982) wurde stabil in das Tabakgenom integriert. Durch die Deletionen wurden Abschnitte des 5'- oder des 3'-Endes des Gens entfernt, wodurch dieses nichtfunktionell gemacht wurde. Die Abschnitte in der Linie SR1hph2 (Peterhans et al., 1990) waren als direkte Sequenzwiederholungen mit einem homologen 352 Bp großen überlappenden Abschnitt orientiert, der durch ein funktionelles Hygromycin-Phosphortransferasegen (Van den Elzen et al., 1985) unterbrochen war. Bei dieser Linie war das Grundmodul in drei eng gekoppelten Kopien in dem Genom vorhanden. Intrachromosomale Rekombinationsereignisse, die zur Wiederherstellung eines funktionsfähigen nptII-Gens führen, können leicht durch Selektion von kanamycinresistenten Zellen in Gewebekultur nachgewiesen werden.
Zur Untersuchung des Einflusses der Expression von RecA und nt-RecA auf die intrachromosomale Rekombination wurde die Linie SR1hph2, die die defizienten nptII-Gene enthielt, mit den homozygoten Linien G64/2 bzw. G63/19 gekreuzt. Nachkommenschaftspflanzen, die das recA- bzw. nt-recA-Gen sowie die defizienten nptII-Gene enthielten, wurden dadurch selektiert, daß man Samen auf Hygromycin und Sulfonamid keimen ließ. Pflanzen mit Resistenz gegenüber beiden Antibiotika wurden unter sterilen Kulturbedingungen ohne weitere Selektion herangezogen, und Blattmesophyllprotoplasten wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Zur Bestimmung der Anzahl der intrachromosomalen Rekombinationsereignisse wurden die Kulturen 6 bis 8 Wochen lang in Gegenwart von 100 μg/ml Kanamycin nach dem Einbetten gezüchtet. Zur Bestimmung der Regenerationshäufigkeit wurden die Protoplasten unter identischen Bedingungen ohne Kanamycin herangezogen. Aus repräsentativen Proben von Mikrokalli wurden Pflanzen regeneriert, um die Resistenz gegen Kanamycin zu überprüfen. Die Protoplasten wurden ausplattiert und kultiviert, bis Mikrokalli sichtbar waren. Für jeden Ansatz Protoplasten wurde die Anzahl Protoplasten, die in Abwesenheit einer Selektion Mikrokalli bildeten, (Regenerationshäufigkeit) bestimmt; sie betrug für alle Protoplastenpräparate ungefähr 20% bis 30%. Es wurde die Anzahl Protoplasten, die in Gegenwart von Kanamycin regenerierten, bestimmt. Aus der Anzahl Mikrokalli, die auf Kanamycin wuchsen, im Vergleich zu der Gesamtzahl Kalli, die auf nichtselektiven Medien erschienen, wurde die Häufigkeit der intrachromosomalen Rekombination berechnet. Für die Regeneration zu Pflanzen wurden 20 kanamycinresistente Mikrokalli zufällig gewählt. Alle regenerierten Pflanzen bildeten auf kanamycinhaltigem Medium Wurzeln, was bestätigte, daß Kalli, die in Gegenwart von Kanamycin wuchsen, tatsächlich gegen dieses Antibiotikum resistent waren.
In der Kontrollinie SR1hph2 ergab sich eine intrachromosomale Rekombinationshäufigkeit von 1,04 × 10^–5. Im Gegensatz dazu ergaben sich bei G64/2 × SR1hph2 und G63/19 × SR1hph2 Frequenzen von 5,37 x 10^–5 bzw. 10,3 × 10^–5 (8). Diese Werte zeigen, daß das RecA-Protein, insbesondere dann, wenn es an den Zellkern zielgesteuert ist, mit dem Pflanzenchromosom und der Rekombinationsmachinerie des Wirts wechselwirken kann und das Ausmaß der intrachromosomalen somatischen Rekombination deutlich erhöhen kann.
BEISPIEL 6: FÖRDERUNG DER GENZIELSTEUERUNGSFREQUENZ BEI PFLANZEN DURCH EKTOPISCHE NT-RECA-EXPRESSION.
Es wurde ein chimärer Zielsteuerungs-Locus erzeugt, der aus dem samenspezifischen hochmolekularen Glutenin (HMW)-Promoter (Colot et al., 1987) und zusätzlichen Sequenzen, die aus pBR322 und einem selektierbaren Marker, der Methotrexatresistenz in Pflanzen vermittelt, besteht, erzeugt. Um zu diesem Konstrukt zu gelangen, wurde der HMW-Promoter als EcoRI/BamHI-Fragment in den binären Vektor pMN001 (Reiss et al., 1994) kloniert. Das entstandene Plasmid wurde mittels Elektroporation auf Agrobacterium übertragen (GV3101pMP90RK, Koncz und Schell, 1986), und mit den erhaltenen Stämmen wurden transgene SR1-Tabakpflanzen mit Hilfe der Blattscheibcheninfektion gemäß veröffentlichten Methoden (Marton et al., 1982; De Block et al., 1984; Marton, 1984; Horsch et al., 1985) erzeugt. Diese Pflanzen wurden mittels Southern-Blotting charakterisiert, und eine Linie, die den chimären Zielsteue rungs-Locus als Einzelkopie enthielt, wurde B18/4 genannt. Diese Linie exprimierte NPT II in Samen, mit einem empfindlichen Enzymassay (Reiss et al., 1984) wurde jedoch keine Aktivität in Blättern nachgewiesen. Wurde Callus auf Blattscheibchen von diesen Pflanzen induziert, so entwickelte sich grünes lebendiges Material gut auf Methotrexat, auf Kanamycin jedoch wurde kein Callus gebildet. Diese Pflanzen wurden mit G63/19-SR1-Pflanzen, die das nt-RecA-Protein exprimierten, gekreuzt (Reiss et al., 1996).
Es wurde ein Reparaturkonstrukt hergestellt, das bei homologer Rekombination mit dem B18/4-Target zu konstitutiver Expression von NPT II führen sollte. Dieses Konstrukt war mit dem für die Erzeugung von B18/4 verwendeten Konstrukt identisch, enthielt jedoch einen Promoter, der in allen Geweben exprimiert wird, nämlich den CaMV-35S-Promoter, als Insert in die BamHI-Stelle zwischen dem HMW-Promoter und dem npt II-Gen, und das npt II-Gen war die nichtfunktionelle Variante D42, die eine Carboxy-terminale Deletion enthielt, von der gezeigt worden war, daß sie in E. coli nicht zu aktivem Protein führte (Beck et al., 1982). Dieses Plasmid wurde wie oben beschrieben in Agrobacterium (GV3101pMP90RK) eingeschleust, wodurch man den Stamm G125 erhielt.
Zur Untersuchung der Gen-Zielsteuerung wurden Schwesternpflanzen, die aus einer Kreuzung zwischen G63/19-Pflanzen und B18/4 erhalten worden waren, auf Methotrexat und Sulfonamid selektiert, um auf das Vorhandensein von beiden Transgen-Sätzen zu selektieren. Es wurden Blattscheibchen hergestellt und mit dem Agrobacterium-Stamm G125, der das Reparatur konstrukt enthielt, transformiert. Bei Kontrolltransformationen wurden mit G125 auf insgesamt 58 SR1-Blattscheibchen nach Selektion auf Methotrexat 500 Kalli erhalten. Dies zeigte, daß G125 voll funktionsfähig war. Insgesamt wurden 189 Blattscheibchen von B18/4xG63/19 mit G125 infiziert, und nach Selektion auf Kanamycin wurden 21 Kanamycinresistenz-Kalli erhalten.
Um zu bestimmen. Ob die resistenten Kalli aus eventuell aufgetretenen Gen-Zielsteuerungsereignissen stammten, wurde aus 9 davon die gesamte genomische DNA präpariert. Die DNA wurde mittels PCR unter Verwendung eines Primer-Paars, das für ein intaktes npt II-Gen unter der Kontrolle des 35S-Promoters spezifisch war, amplifiziert (Primer 1 mit Homologie zu der -90-Region des 35S-Promoters: 5'GTG GAT TGA TGT GAT ATC TCC3' (SEQ ID NO: 3); Primer 2 mit Homologie zu in D42 deletierten npt II-Sequenzen: 5'CCG CTC AGA AGA ACT CGT CA3' (SEQ ID NO: 4)). In sechs Kalli wurde ein Fragment der für die Amplifikation des restorierten nptII-Gens mit diesem Primer-Paar vorhergesagten Größe erhalten. Mit DNA von der Elternlinie B18/4 und den restlichen drei Kalli wurde kein Amplifikationsprodukt erhalten. Aus diesen Ergebnissen geht das Vorhandensein eines intakten npt II-Gens unter der Kontrolle des 35S-Promoters in sechs der neun untersuchten Kalli hervor. Das npt II-Gen in den drei kanamycinresistenten, jedoch in der PCR negativen Kalli wurde höchstwahrscheinlich durch somaklonale Variation und nicht durch die Zielsteuerung von Genen aktiviert.
Die Restorationsfrequenz eines im Blattgewebe exprimierten intakten npt II-Gens durch Transformation mit G125 kann daher folgendermaßen berechnet werden:
Die Transformationsfrequenz in dem Kontrollversuch betrug 500 Transformanten pro 58 Blattscheibchen, oder 8,6/Blattscheibchen. Es war daher zu erwarten, daß in insgesamt 189 transformierten B18/4xG63/19-Blattscheibchen ungefähr 189 × 8,6 = 1625 Transformanten ohne Selektion auf Kanamycin erzeugt wurden. Es wurde eine Anzahl von 21 kanamycinresistenten Kalli nachgewiesen. Diese Kalli erschienen daher mit einer Frequenz von 21/1625, was ungefähr 1,3% entspricht. In einer repräsentativen Probe von neun, enthielten sechs ein restoriertes npt II-Gen. Die Zielsteuerungsfrequenz in diesem Versuch betrug daher 0,87%.
Es sind bereits zuvor transgene Zielsteuerungs-Loci ähnlich dem hier beschriebenen System verwendet worden. Die Zielsteuerungsfrequenzen, die bei diesen Zielsteuerungs-Loci unter Verwendung der Agrobacteriumvermittelten Transformation beobachtet wurden, lagen in der Größenordnung von 10^–4 (Offringa et al., 1990). Obwohl diese Versuche nicht direkt vergleichbar sein mögen, weist der in unseren Versuchen beobachtete Frequenzanstieg auf eine stimulierende Rolle der RecA-Expression hin.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder transgenen Pflanzenzelle mit stimulierter homologer Rekombination, das folgendes umfaßt: (d) Insertion einer DNA in das Genom einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, wobei diese DNA eine DNA umfaßt, die für ein rekombinationsförderndes Enzym aus der Gruppe E.coli-RecA-Proteine, modifizierte E.coli-RecA-Proteine mit ATPase-Aktivität sowie deren enzymatisch aktive Derivate oder Teile, und die zusätzlich für mindestens einen in dieser Pflanze oder dieser Pflanzenzelle exprimierbaren Selektionsmarke codiert; und (e) Selektion von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die diese DNA gemäß (a) aufgenommen haben; und (f) Kultivieren der gewünschten transgenen Pflanze oder der gewünschten transgenen Pflanzenzelle in einem geeigneten Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze oder Pflanzenzelle Nicotiana tabacum oder Arabidopsis thaliana ist bzw. davon abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das rekombinationsfördernde Enzym die Stimulierung der homologen Rekombination, Förderung der Zielsteuerung von Genen, und Stimulierung von endogenen Mechanismen für die Reparatur von DNA-Schädigung verursacht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem Selektionsmarker um Hyg^R, Km^R, PPT^R, Mtx^R oder Sul^R handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Derivat des rekombinationsfördernden Enzyms um ein Fusionsprotein des E.coli-RecA-Proteins und einer Zellkernzielsteuerungssequenz handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Zellkernzielsteuerungssequenz um die Zellkernzielsteuerungssequenz T SV40 handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Insertion durch PEG-Transformation, Agrobakterium-Transformation, Elektroporation, Teilchenbeschuß, Liposomenfusion, in-planta-Transformation, Calciumphosphatfällung oder Virusinfektion vermittelt wird.
Transgene Pflanze oder transgene Pflanzenzelle, die in ihrem Genom eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.
Vektor, der eine DNA umfaßt, die für eine Zellkernzielsteuerungssequenz codiert, welche operativ mit einer DNA, die für ein rekombinationsförderndes Enzym aus der Gruppe E.coli-RecA-Proteine, modifizierte E.coli-RecA-Proteine mit ATPase-Aktivität und enzymatisch aktiven Teilen davon codiert, mindestens einem Selektionsmarker und mindestens einer weiteren DNA, die für eine gewünschte Eigenschaft codiert, verbunden ist, wobei die gewünschte Eigenschaft aus der Reihe Expression eines zusätzlichen Proteins, das den Phänotyp des transgenen pflanzlichen Organismus bzw. der transgenen pflanzlichen Zelle auf eine gewünschte Art und Weise ändert, sowie Störung einer natürlich stattfindenden Genfunktion in dem pflanzlichen Organismus oder der pflanzlichen Zelle ausgewählt ist, wobei das von dem Vektor codierte Fusionsprotein aus Zellkernzielsteuerungssequenz/rekombinationsförderndem Enzym eine ATPase-Aktivität aufweist.
Vektor nach Anspruch 9, wobei es sich bei der Zellkernzielsteuerungssequenz um die Zellkernzielsteuerungssequenz T SV40 handelt.