NL9101620A - Werkwijze voor het aanbrengen van een deletie- of inversiemutatie in een plantegenoom; daarvoor bruikbaar recombinant dna; gemuteerde plant. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het aanbrengen van een deletie- of inversie-mutatie in een plantegenoom; daarvoor bruikbaar recombinant DNA; gemuteerde plant

Gebied van de uitvinding

De onderhavige uitvinding ligt op het gebied van de genetische manipulatie van planten en maakt daartoe gebruik van een uit twee elementen bestaand transpositiesysteem, alsmede een uit twee elementen bestaand recombinatiesysteem, beide werkzaam in de plant. Combinatie van deze beide systemen geeft de mogelijkheid om deletie- of inversiemutanten te verkrijgen die met geen van beide systemen alleen verkregen kunnen worden.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het aanbrengen van een deletie- of inversie-mutatie.in een plantegenoom, waarbij recombinatie in het plantegenoom wordt geïnduceerd nadat transpositie heeft plaatsgevonden, teneinde een deletie of inversie te induceren tussen de oorspronkelijke en de nieuwe positie van het transposon.

Achtergrond van de uitvinding Inleiding

De inductie van mutaties en met name deleties in het genoom van een organisme vormt een zeer belangrijk hulpmiddel bij de bestudering van de moleculaire organisatie van het genoom. Organismen met een mutant fenotype vormen vaak de basis voor de karakterisatie en isolatie van een gen of een set van genen. In met name prokaryoten wordt veelvuldig gebruik gemaakt van de inductie van deletiemutanten voor onderzoek naar de moleculaire structuur van het genoom, alsmede voor de karakterisatie en isolatie van genen waarnaar onderzoek wordt gedaan.

In prokaryoten is het proces van deletie-inductie relatief eenvoudig, omdat grote aantallen individuen kunnen worden getest en de frequentie waarmee homologe recombinatie optreedt relatief hoog is. In eukaryotische cellen is de frequentie waarmee homologe recombinatie optreedt echter veel lager en daarom is het minder eenvoudig om in deze cellen met hoge frequentie deletiemutanten te induceren.

Wel is het mogelijk om met behulp van chemische middelen, UV bestraling, stress behandeling etc. mutanten te verkrijgen in prokaryotische en eukaryotische cellen. Bij deze methodes ontstaan voornamelijk puntmutaties en deleties/inserties van enkele baseparen in het DNA van de behandelde cellen. Het mechanisme waarmee deze mutaties ontstaan, is vaak onduidelijk en de locatie van de opgetreden mutatie in het genoom is niet te achterhalen, tenzij geselecteerd wordt voor een van tevoren bepaalde mutatie.

Daarentegen is de locatie van een mutatie wel te bepalen wanneer gebruik gemaakt wordt van insertie-mutagenese. Het gemuteerde gen. kan dan namelijk geïsoleerd worden door gebruik te maken van de bekende sequentie van het gebruikte mutagen.

In prokaryoten wordt veel gebruik gemaakt van transposons als een insertie-mutagen. Een transposon is een bepaald stuk DNA dat in staat is van positie te veranderen in het genoom van de gastheer. Deze positieverandering kan plaats vinden via een zogenaamd conservatief mechanisme, waarbij het gen exciseert uit de oorspronkelijke positie en vervolgens reïntegreert in het genoom op een nieuwe locatie. In prokaryoten zijn echter ook transposons bekend die via een replicatieve methode transposeren. In dit geval blijft een volledige kopie van het transposon achter op de oorspronkelijke positie, terwijl er een nieuwe kopie van het transposon inserteert op een andere locatie in het genoom. De reïntegratie van een transposon in of nabij een bepaald gen kan dan leiden tot het optreden van een mutatie, doordat de expressie of de regulatie van het gen of van meerdere genen verstoord wordt.

Ook in eukaryotische cellen worden transposons gebruikt om door middel van insertie-mutagenese genen te isoleren, terwijl in plantecellen onder andere ook gebruik wordt gemaakt van het transfer-DNA (T-DNA) van Agrobacterium tumefaciens als een insertie-mutagen (Errampalli et al. 1991). In principe kan echter elk stuk DNA, dat kan inserteren in het genoom van een organisme, voor dit doel gebruikt worden.

In enkele gevallen is het in bacteriën ook mogelijk om naast insertiemutanten deleties te induceren na transpositie.

Dit is het gevolg van een replicatief mechanisme waarmee bepaalde transposons transposeren in bacteriën. Er blijft dan een kopie van het transposon achter op de originele plaats en er kan dan homologe recombinatie optreden tussen het transposon op de oude en nieuwe locatie (Sherratt 1989). In dierlijke cellen en plantecellen wordt ook gebruik gemaakt van transpositie om insertiemutanten te verkrijgen. Hier is het echter niet mogelijk om deleties te induceren na transpositie. Enerzijds niet omdat transpositie optreedt volgens een ander mechanisme dan replicatieve transpositie en er dus tijdens normale transpositie geen kopie van het transposon achterblijft op de oorspronkelijke locatie. Anderzijds niet omdat de frequentie van homologe recombinatie in dierlijke cellen en plantecellen, in vergelijking tot bacteriën, zo laag is dat zelfs wanneer meerdere kopieën van een transposon aanwezig zijn, deletiemutanten alleen gevonden kunnen worden onder zeer stringente selectiedruk.

Naast homologe recombinatie zijn er een aantal plaats-specifieke recombinatiesystemen bekend, die met hoge frequenties recombinatie induceren in de prokaryoot (Abremski et al. 1983) en in gist (Broach en Hicks 1980). Deze systemen worden gebruikt voor de inductie van deletie- en/of inversiemutanten in de desbetreffende gastheren. Het gebruik van een heteroloog plaats-specifiek recombinatiesysteem in de eukaryotische cel biedt de unieke mogelijkheid om met hogere frequentie recombinatie in deze cellen te verkrijgen, terwijl de homologe recombinatie-frequentie laag blijft. Dit gegeven maakt het dan ook mogelijk om met behulp van transpositie specifieke deleties te induceren in het eukaryotische genoom, zoals hieronder in detail beschreven wordt. Deze manier om deleties of inversies in het eukaryotische genoom te induceren, geeft de mogelijkheid om met een redelijke frequentie specifieke mutaties te induceren in het eukaryotische genoom en kan daardoor zeer goed bijdragen aan de karakterisatie en isolatie van genen uit het eukaryotische genoom.

Achtergrond Recombinatie

Om recombinatiesystemen in planten te kunnen gebruiken voor de isolatie van mutanten is het in de eerste plaats nodig om een goed gekarakteriseerd systeem te gebruiken. Endogene vormen van homologe en plaats-specifieke recombinatiesystemen in planten zijn tot op heden echter niet in detail onderzocht. Tevens geldt dat voor de recombinatiegebeurtenissen die optreden in de plant het mechanisme niet in detail bekend is. Vandaar dat deze endogene recombinatiesystemen vooralsnog niet reguleerbaar en daardoor niet bruikbaar zijn voor het gericht en controleerbaar induceren van deleties in het plantegenoom. Verder is de frequentie waarmee recombinatie optreedt in de plant zeer laag en dus ook om die reden zijn de endogene recombinatiesystemen niet of slecht bruikbaar voor de inductie van deleties in het plantegenoom. In dierlijke systemen is al veel onderzoek gedaan naar de optimalisatie van recombinatie, hoewel de frequenties zeer laag zijn en een stringente selectie een belangrijk onderdeel vormt in deze experimenten (voor overzicht zie Bollag et al. 1989). Toch zijn recentelijk veel pogingen gedaan om van .homologe recombinatie in planten gebruik te maken. Vooralsnog kan alleen onder stringente selectie met zeer lage frequentie recombinatie in planten worden aangetoond (Offringa et al. 1990;

Peterhans et al. 1990; Paszkowski et al. 1988; Baur et al. 1990; Putcha en Hohn 1991). De tot nu toe beschreven experimenten hebben zich voornamelijk toegespitst op homologe recombinatie van extrachromosomaal DNA met sequenties in het genoom, welke in een insertie van bepaalde sequenties in het genoom resulteert. Weinig onderzoek is echter verricht aan de vorming van deleties of inversies in het genoom.

Een andere mogelijkheid om recombinatie in planten te verkrijgen, is de introductie van een heteroloog recombinatie-systeem in de plant. Dit heeft als voordeel dat het nieuw binnen gebrachte recombinatiesysteem gereguleerd kan worden, in tegenstelling tot endogene recombinatiesystemen.

Recentelijk zijn een aantal plaats-specifieke recombinatiesystemen met succes geïntroduceerd in eukaryotische cellen. Deze relatief eenvoudige recombinatiesystemen blijken met zeer hoge efficiëntie te werken in zowel dierlijke als plantecellen (Dale en Ow 1990; Sauer en Henderson 1990; O'Gorman et al. 1991). Een voordeel van deze plaats-specifieke recombinatiesystemen is dat ze eenvoudig zijn en in detail zijn onderzocht op het mechanisme van recombinatie. Verder is een voordeel dat deze recombinatiesystemen in twee elementen kunnen worden gescheiden, namelijk de recombinatiesequenties en de eiwitten (recombinases) betrokken bij het recombinatieproces. Dit biedt de unieke mogelijkheid om eerst de recombinatiesequenties te inserteren in het genoom, waarna later op een gewenst tijdstip het recombinase kan worden geïntroduceerd, met als gevolg de recombinatie tussen de in het genoom aanwezige recombinatiesequenties. Een nadeel van recombinatiesystemen als deze is echter dat de recombinatiesequenties steeds weer opnieuw in het eukaryotische genoom geïntroduceerd moeten worden. Daardoor zijn deze recombinatiesystemen uiteindelijk alleen geschikt voor de deletie of . inversie van stukken nieuw geïntroduceerd DNA, dan wel voor de plaats-specifieke introductie van DNA in het eukaryotische genoom (Ode11 et al. 1990; Sauer en Henderson 1990; O'Gorman et al. 1991).

Introductie van een recombinatiesysteem in eukaryotische cellen zal onafhankelijk van de gebruikte transformatiemethode leiden tot de integratie van DNA op vrij willekeurige posities in het genoom. Wanneer de recombinatiesequenties onafhankelijk van elkaar integreren op willekeurige posities in het genoom is de kans klein dat twee recombinatiesequenties op een en hetzelfde chromosoom liggen, en daardoor zal er dus voornamelijk inter-chromosomale recombinatie worden geïnduceerd. Alleen wanneer beide recombinatiesequenties relatief dicht bij elkaar op één chromosoom gelegen zijn, is het mogelijk om inversie- en deletiemutanten te verkrijgen. Wel is het voor te stellen dat .een plaats-specifiek recombinatiesysteem gebruikt wordt voor bijvoorbeeld de deletie van bepaalde DNA segmenten die voor het transformatieproces van belang zijn, maar daarna geen essentiële functie meer vervullen voor het getransformeerde organisme. In zo'n geval kunnen de recombinatiesequenties tegelijk op een stuk DNA in het genoom geïntroduceerd worden. Verder is het voor te stellen dat met behulp van een inversie- of deletiesysteem de regulatie van gen-expressie kan worden beïnvloed van genen die in het eukaryotische genoom geïntroduceerd worden (Dale en Ow 1990).

Achtergrond Transpositie

De onderhavige uitvinding maakt tevens op een zodanige wijze gebruik van transpositie dat een groot aantal deleties in het eukaryotische genoom kan worden gecreëerd.

Veel onderzoek is gedaan naar transpositie in prokaryoten en eukaryoten. Vooral in prokaryoten is veel bekend over het mechanisme waarmee verschillende transposabele elementen zich verplaatsen in het genoom. Zowel het proces van conservatieve transpositie als het proces van replicatieve transpositie is in detail bestudeerd (Sherratt 1989). In gist en dierlijke cellen (Baltimore 1985) zijn ook een groot aantal transposabele elementen aanwezig. Veel van deze transposabele elementen stammen af van een retrovirus en deze transposeren via een conservatief mechanisme, hoewel er ook aanwijzingen zijn voor transposabele elementen die via een aan het replicatief mechanisme verwant mechanisme transposeren (Craig 1990).

Onderzoek aan transpositie in planten wordt al vele jaren gedaan in Zea mays en Antirrhinum maius (voor een overzicht zie Fedoroff 1989). Uit-Z. mays zijn verschillende transposabele elementen geïsoleerd, waaronder Mul, Spm/En en Ac. Van zowel Spm en Ac zijn ook niet-autonome elementen geïsoleerd, resp. dSpm en Ds, terwijl Mul zelf een niet-autonoom element lijkt te zijn.

Uit A. maius zijn ook een groot aantal elementen geïsoleerd, waaronder Taml en Tam3. Naast de op dit moment best bestudeerde elementen uit Z. mays en A. maius zijn er in een groot aantal plantesoorten transposabele elementen beschreven en geïsoleerd, waaronder het tabak transposabele element Tnt-1 (Grandbastien et al. 1989) en het Petunia hybrida element dTphl (Gerats et al. 1990). Introductie van transposabele elementen, zoals Spm/dSpm, Ac/Ds, Tam3/dTam3, in heterologe gastheren, heeft laten zien dat deze transposabele elementen ook als een twee-elementen systeem in een nieuwe gastheer actief kunnen zijn (Haring et al. 1991). Vooral het Ac/Ds systeem is na introductie in een groot aantal planten actief, zoals in tabak (Nicotiana tabacum), tomaat (Lycopersicon esculentum), Arabidopsis thalianaf aardappel (Solanum tuberosum). soya (Glycine max), Petunia hybrida. peen (Daucus carota) en rijst (Oryza sativa) (Baker et al. 1986; Van Sluys et al. 1987; Knapp et al. 1988; Yoder et al. 1988; Haring et al. 1989; Houba-Herin et al. 1990; Jing-liu et al. 1991). In een aantal van deze planten, waaronder tabak en tomaat, is aangetoond dat het Ac element kan exciseren vanuit de originele integratieplaats in het genoom, en vervolgens kan reïntegreren op een nieuwe positie in het plantegenoom. Verder is aangetoond dat in deze planten trans-activatie van het niet-autonome Ds element kan optreden, wanneer Ac of het gen voor het Ac-transposase in dezelfde cel actief is (Lassner et al. 1989; Rommens et al. 1991).

De eigenschap van een transposon om te reïntegreren op een nieuwe positie in het plantegenoom maakt transposabele elementen geschikt voor de isolatie van plantegenen (Hille et al. 1989). Net als in prokaryoten kunnen transposons zoals Ac/Ds in de plant gebruikt worden voor het muteren ("taggen") van een bepaald gen. Door de insertie van een transposon in een bepaald gen kan een fenotype ontstaan, waarna het transposon gebruikt kan worden als een "tag" bij de isolatie van dit gen. Deze zogeheten "transposon tagging" strategie is met succes toegepast in de oorspronkelijke gastheren, zoals A. maius en Z. mays. van transposabele elementen (Martin et al. 1985; Doring 1989) en wordt momenteel in een aantal laboratoria toegepast voor de isolatie van plantegenen uit heterologe plantesoorten, waarvan het genproduct niet bekend is (Haring et al. 1991).

Ten gevolge van de grootte van het plantegenoom zal de frequentie, waarmee een specifiek gen door een transposon wordt uitgeschakeld, laag zijn. Hierbij wordt namelijk geselecteerd op een insertie van het transposon in een gen of de regulerende sequenties van een gen (2-5 kbp) in een plantegenoom van 105-106 kbp. Om de frequentie waarmee een gen "getagged" kan worden te verhogen, wordt er op verschillende manieren onderzoek gedaan naar mogelijkheden om "transposon tagging" te optimaliseren. Hierbij wordt bijvoorbeeld gedacht aan de ontkoppeling van het transposon en het transposase om zodoende excisie en reïntegratie van het transposon te kunnen reguleren. Met een ontkoppeling van het transposon en het voor het transposase coderende gen, hetgeen normaal in het element zelf gelegen is, wordt bedoeld dat deze elementen apart in het plantegenoom worden geïntroduceerd. Het transposabele element is bijvoorbeeld door een deletie in het gebied van het transposase-gen niet-autonoom geworden (Ds). Zo'n Ds-element behoeft alleen de terminale repeats en delen van de subterminale sequenties om efficiënt te kunnen transposeren, na trans-activatie door een geïntroduceerd actief transposase-gen. Het Ds-element kan nu op de plaats van de deletie uitgerust worden met willekeurige sequenties, zonder dat dit het transpositieproces nadelig beïnvloed. Deze eigenschap van niet-autonome transposabele elementen maakt het mogelijk om deze elementen uit te rusten met sequenties die de detectie, selectie (marker-genen) en isolatie (bacteriële origin of replication [ori] en een antibioticum resistentie) van deze elementen mogelijk maakt. De ontkoppeling van een transposon in twee elementen maakt het tevens mogelijk om bijvoorbeeld de expressie van het transposase-gen te beïnvloeden. Dit kan onder andere gedaan worden door de insertie van nieuwe regulatorsequenties rond de coderende sequentie van het gen. Men zou bijvoorbeeld met behulp van een induceerbare promoter de timing en frequentie van transpositie kunnen reguleren.

Ten slotte is het bekend dat transposons niet naar volledig willekeurige posities in het genoom springen. Er lijkt een correlatie te bestaan tussen de afstand van transpositie en de frequentie waarmee deze gebeurtenissen optreden. Hoewel nog erg weinig onderzoek is gedaan naar het integratiepatroon van transposons in planten lijkt er toch een voorkeur voor integratie dicht bij de oorspronkelijke excisiepositie te zijn (Dooner en Belachew 1989; Jones et al. 1990; Dooner et al.

1991). Deze mogelijke eigenschap van transposons zoals Ac/Ds heeft tot gevolg dat het gunstig kan zijn om een "tagging" experiment te starten vanuit een positie, niet ver verwijderd van het locus waarin men geïnteresseerd is.

Hoewel een transpositiesysteem in de plant gebruikt kan worden voor de isolatie van insertiemutanten, kan dit systeem .niet leiden tot een efficiënte isolatie van deletiemutanten. Kleine deleties of veranderingen in de naast het transposon gelegen sequenties als gevolg van aberrante excisie komen in een klein percentage van de transpositiegebeurtenissen voor, maar deze gebeurtenissen zijn niet specifiek en daardoor niet reguleerbaar (Dooner et al. 1988). Om deleties in het plante-genoom te kunnen induceren, zal er dus aan het transpositie-systeem als zodanig iets moeten worden toegevoegd om na de transpositie het ontstaan van deleties te initiëren.

Samenvatting van de uitvinding

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het aanbrengen van een deletie- of inversie-mutatie in een plantegenoom, omvattende het integreren in het plantegenoom van recombinant DNA dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat, het doen plaats vinden van transpositie van het transposabele element met de daarin aanwezige recombinatiesequentie en het doen plaats vinden van recombinatie.tussen de achtergebleven en de versprongen recombinatiesequentie, waarbij afhankelijk van de onderlinge oriëntatie van de betrokken recombinatiesequenties een deletie dan wel een inversie van het tussen de twee recombinatiesequenties gelegen DNA optreedt.

De recombinatiesequenties kunnen elk voor zich uit een enkele recombinatiesequentie bestaan, of in inverted repeat aan een tweede exemplaar van dezelfde recombinatiesequentie zijn gekoppeld. De voorkeur heeft dat hetzij de in het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij de buiten het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij beide, in inverted repeat gekoppeld zijn aan een tweede exemplaar van de recombinatiesequentie. Hierdoor wordt verzekerd dat altijd een deletie kan worden geïnduceerd.

Volgens de uitvinding is het transposabele element bij voorkeur een niet-autonoom transposabel element, dat wel de voor transpositie noodzakelijke cis-elementen (terminale en subterminale sequenties) bevat maar niet de voor transpositie benodigde trans-elementen (transposase-genen). Het gebruik van een autonoom transposabel element, dat tevens de voor transpositie benodigde trans-elementen bevat, is weliswaar ook mogelijk, maar leidt tot complicaties en wordt daarom niet geprefereerd.

De transpositie van het niet-autonome transposabele element met de daarin aanwezige recombinatiesequentie wordt bij voorkeur bewerkstelligd door de voor transpositie benodigde transelementen (transposase-genen) in de plant te introduceren. Dit kan door middel van een transiënte expressie van in de plant gebrachte maar niet in het genoom ingebouwde transposase-genen, door re-transformatie of door te kruisen met een plant die de. benodigde transposase-genen in het genoom heeft.

In een voorkeursuitvoeringsvorm worden als niet-autonome transposabele element het Ds-element van Zea mays en als transelement voor transpositie het Ac-transposase gen van Zea mays toegepast.

De recombinatie.tussen de achtergebleven en de versprongen recombinatiesequentie wordt bij voorkeur bewerkstelligd door de voor recombinatie benodigde trans-elementen (recombinatie-genen) in de plant te introduceren. Ook hier zijn transiënte expressie, re-transformatie en inbrengen in het genoom van de benodigde recombinatie-genen door kruising met een plant die deze genen bevat, mogelijk.

In een voorkeursuitvoeringsvorm worden als recombinatiesequentie de loxP-sequentie van bacteriofaag Pl en als transelement voor recombinatie het Cre-recombinase gen van bacteriofaag Pl toegepast.

Voor de transformatie van planten en integratie in het genoom kunnen verschillende technieken worden toegepast, zoals directe transfer en transformatie met behulp van Aqrobacterium tumefaciens. De voorkeur heeft dat het integreren in het plantegenoom van het recombinante DNA, dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat, geschiedt met behulp van een

Agrobacterium tumefaciens stam die een T-DNA construct bevat, welk T-DNA construct de voor transfer naar planten noodzakelijke linker- en rechteruiteinden van het T-DNA omvat met daartussen een insertie van het genoemde recombinante DNA.

Wat de onderdelen van het recombinante DNA betreft heeft het de voorkeur dat in het transposabele element een bacteriële replicatie-oorsprong; een bacterieel markergen, bijvoorbeeld een chloramphenicol resistentie gen; en/of een in planten werkzaam markergen, zoals het β-glucuronidase gen (GUS) of het herbicide resistentie gen bar, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, is opgenomen; en dat het recombinante DNA een in planten werkzaam markergen bevat, zoals het hygromycine resistentie gen Hptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, waarbij het transposabele element tussen de promoter en het markergen is geïnserteerd; een in planten werkzaam markergen bevat, zoals het tms2-gen uit het octopine TL-DNA, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, dat selectie van planten waarin een deletie heeft plaats gevonden mogelijk maakt; en een in planten werkzaam markergen bevat, zoals het kanamycine resistentie-gen Nptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, dat selectie van getransformeerde planten mogelijk maakt.

De uitvinding strekt zich uit tot recombinant DNA, dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat, welk recombinant DNA bij de bovenstaand vermelde werkwijze kan worden toegepast, alsmede tot een plant, die een insertie van dit recombinante DNA bevat of ten gevolge van een genetische manipulatie door middel van de beschreven werkwijze voorzien is van een deletie- of inversie-mutatie in het genoom.

Uitvoerige beschrijving van de uitvinding

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de efficiënte inductie van deleties en inversies in het plantegenoom. Deze werkwijze omvat het in de plant brengen van ten minste een niet autonoom transposabel element uitgerust met een recombinatie site, gelijktijdig met een tweede recombinatie site die op hetzelfde stuk DNA gelegen is. De werkwijze omvat verder het inbrengen van het transposase-gen in dezelfde plant, waarna transpositie van het ingebrachte niet-autonome transposabele element kan plaatsvinden. Verder omvat de werkwijze het inbrengen van het recombinase-gen in deze zelfde plant, waarna recombinatie kan optreden tussen de recombinatiesequenties, aanwezig in het oorspronkelijk geïnserteerde DNA en het weggesprongen Ds-element, resulterend in inversies/deleties van de tussenliggende sequenties.

Het gebruik van transposons in combinatie met een plaats-specifiek recombinatiesysteem is uniek en biedt de mogelijkheid om een efficiënt recombinatiesysteem in de plant te gebruiken, met als doel het verkrijgen van een groot aantal onafhankelijke deletie- of inversiemutanten. Voorheen met alleen het gebruik van een transpositie- dan wel een recombinatiesysteem in de plant was dit niet mogelijk omdat de frequentie waarmee met deze systemen inversie- of deletiemutanten worden gegenereerd erg laag is. Door de combinatie van deze twee systemen is het mogelijk om in analogie met door transpositie geïnduceerde deleties in prokaryoten, deleties in eukaryoten te induceren na transpositie. Het verschil tussen dit nieuwe systeem en het prokaryotische systeem is dat in prokaryoten transposons als Tn3 transposeren via een replicatief mechanisme, met als gevolg dat behalve een nieuw geïntegreerde kopie van het transposon de originele kopie ook nog steeds aanwezig is in het genoom. Hierdoor kan in deze gevallen homologe recombinatie optreden tussen de twee kopieën van het transposon (Sherratt 1989). In eukaryotische cellen zijn vooralsnog vooral transposabele elementen bekend, waarbij de transpositie verloopt volgens een niet-replicatief mechanisme, met als gevolg dat op de originele positie geen transposonsequentie achterblijft ("empty donor site"). Hierdoor is het bij gebruik van deze transposons niet mogelijk om na transpositie homologe recombinatie te induceren en wanneer toch een vorm van replicatieve transpositie optreedt, is de homologe recombinatiefrequentie in planten te laag om efficiënte recombinatie tussen de twee transposonkopieën toe te staan. Wanneer het transposon nu echter wordt geïntroduceerd in het plantegenoom, tesamen met een recombinatiesequentie en het transposabele element zelf ook is uitgerust met een recombinatiesequentie, zal na transpositie een van de recombinatiesequenties met het transposon reïntegreren op een nieuwe positie in het genoom, terwijl de tweede recombinatiesequentie keurig achterblijft vlak naast de originele positie ("empty donor site") van het gesprongen transposon. Wanneer de recombinatiesequenties dan een bepaalde afstand van elkaar verwijderd liggen in het plantegenoom, kan recombinatie worden geïnduceerd tussen de oorspronkelijke en de nieuwe positie van het transposon door het recombinase dat aangrijpt op de betreffende recombinatiesequenties in de cel te brengen. Een voordeel van deze werkwijze is dat van de zo verkregen deleties/ inversies in het plantegenoom het startpunt bekend is, namelijk de recombinatiesequentie in het oorspronkelijk in de plant binnengebrachte DNA. Tevens is een voordeel dat de frequentie van de door het recombinase geïnduceerde plaats-specifieke recombinatieproces veel hoger is dan de frequentie waarmee recombinatie optreedt tussen twee homologe sequenties in de plant.

Gezien het feit dat een transposon in staat is naar een groot aantal onafhankelijke plaatsen in het plantegenoom te transposeren, kan men op deze wijze dus een groot aantal deleties en/of inversies verkrijgen uitgaande van een en dezelfde oorspronkelijke DNA insertie. Deze primaire DNA

insertie in het plantegenoom moet uit slechts twee essentiële onderdelen bestaan. Ten eerste moet dit stuk DNA een transposabel element bevatten, dat in staat is te exciseren en te reïntegreren op een nieuwe positie in het plantegenoom. In dit transposabele element moet zich dan een van de recombinatie-sequenties bevinden van een recombinatiesysteem dat in staat is recombinatie in het plantegenoom te induceren. Deze sequentie moet zodanig in het element geïnserteerd zijn dat dit element nog steeds in staat is te transposeren. Ten tweede moet zich naast dit transposabele element een tweede recombinatiesequentie bevinden, welke tijdens het transpositieproces niet met het transposabele element meespringt, maar achterblijft vlak naast de originele positie ("empty donor site") van het gesprongen element. Naast dit primaire DNA construct moeten bij gebruik van twee-elementen systemen ook de genen die betrokken zijn bij transpositie en recombinatie in de plant worden geïntroduceerd. Afhankelijk van welk systeem gebruikt wordt, kan dit inhouden dat een of meerdere genen betrokken bij transpositie moeten worden geïntroduceerd. Voor Ds transpositie is hiervoor het Ac-transposase voldoende. Ook is het afhankelijk van het gekozen recombinatiesysteem hoeveel genen, betrokken bij het recombi-natieproces, moeten worden geïntroduceerd. Voor het Cre/loxP systeem en het FLP recombinatiesysteem betreft dit slecht een gen, resp. het Cre-recombinase gen (of Cre-gen) en het FLP-gen.

De ingebrachte genen voor transpositie en recombinatie dienen in elk geval een in de beoogde gastheer werkzame promoter te bevatten. Een sterke promoter heeft de voorkeur, om een zo hoog mogelijke frequentie van transpositie en recombinatie te verkrijgen. Ook is het mogelijk om gereguleerde of reguleerbare promoters te gebruiken om een bepaald expressiepatroon van deze genen te verkrijgen. Daarnaast dienen de ingebrachte genen bij voorkeur een 3' flankerend gebied te bevatten met daarin een in de beoogde gastheer functioneel polyA additiesignaal.

Tenslotte is het bekend van plantetransposons dat een groot deel van de transposities over kleine afstanden op hetzelfde chromosoom plaatsvindt, terwijl maar een klein percentage naar een ander chromosoom lijkt te transposeren (Greenblatt 1984; Jones et al. 1990; Dooner et al. 1991). Dit betekent dat met gemak een serie deleties/inversies kan worden verkregen op een chromosoom, uitgaande van de originele positie van het transposon op dit chromosoom.

Figuurbespreking

De uitvinding wordt nader geïllustreerd in de schematische figuren, waarvan

Fig. 1 schematisch een deel van een plantegenoom weergeeft met daarin een insertie van recombinant DNA volgens de uitvinding, omvattende T-DNA met daarin een recombinatiesequentie Lox en een niet-autonoom transposabel element Ds met daarin een tweede exemplaar van de recombinatiesequentie Lox (boven); alsmede schematisch de situatie weergeeft die ontstaat ten gevolge van een met Ac-transposase geïnduceerde transpositie (midden); en schematisch situaties weergeeft die ontstaan ten gevolge van een met Cre-recombinase geïnduceerde deletie (onder);

Fig. 2 schematisch een T-DNA construct weergeeft dat tussen de linker- en rechteruiteinden (LB resp. RB) van het T-DNA een Ac-transposase gen met eigen 3'-uiteinde en de CaMV 35S promoter alsmede het chloramphenicol resistentie gen CAT (boven) of het kanamycine resistentie gen Nptll (onder), beide voorzien van in planten werkzame promoter en terminator sequenties, bevat;

Fig. 3 schematisch een T-DNA construct weergeeft dat tussen de linker- en rechteruiteinden van het T-DNA een Cre-recombinase gen alsmede het kanamycine resistentie gen Nptll, beide voorzien van in planten werkzame promoter en terminator sequenties, bevat;

Fig. 4 schematisch een DNA construct weergeeft dat tussen de terminale en subterminale sequenties van het niet-autonome transposabele element Ds bevat: een dubbele loxP sequentie, een bacteriële replicatie-oorsprong (ori), een bacterieel chloramphenicol resistentie gen (Cm) alsmede het β-glucuronidase gen GUS (boven) of het BastaR herbicide resistentie gen bar (onder), beide voorzien van in planten werkzame promoter en terminator sequenties;

Fig. 5 een BamHI fragment met daarin de loxP sequentie (boven), een HindiII fragment met daarin een Notl site en de loxP sequentie (midden), en een HindlII fragment met daarin twee in inverted repeat geordende loxP sequenties, gescheiden door een Notl site (onder) weergeeft;

Fig. 6 schematisch het gedeelte van de vector pMH2057 weergeeft dat het hygromycine resistentie gen Hptll, voorzien van in planten werkzame promoter en terminator sequenties, en het tms2 gen uit het octopine TL-DNA bevat;

Fig. 7 schematisch een T-DNA construct weergeeft dat een loxP sequentie en een kanamycine resistentie gen Nptll bevat naast het in fig. 6 getoonde gedeelte van pMH2057 met daarin een insertie - in de tussen het Hptll gen en de CaMV 35S promoter gelegen BamHI site - van de in fig. 4 getoonde DNA constructen met GUS gen (boven) resp. bar gen (onder);

Fig. 8 schematisch een drietal strategieën voor de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding weergeeft; en Fig. 9 schematisch een deel van een plantegenoom weergeeft dat de sporen draagt van een werkwijze volgens de uitvinding waarbij een deletie heeft plaats gevonden van een van de twee dubbele loxP sequenties en het tussen de niet-versprongen loxP site en de versprongen loxP site gelegen DNA.

Voorbeelden

De hierboven beschreven uitvinding heeft betrekking op het gebruik van transpositie en recombinatie en met name de combinatie van deze twee systemen in de plant. Als voorbeeld dient het geprefereerde, goed bestudeerde transpositiesysteem uit mais, bestaande uit twee elementen (Ac en Ds), alsmede een plaats-specifiek recombinatiesysteem uit bacteriofaag PI, bestaande uit twee elementen (34bp loxP-sequenties en het Cre-eiwit) in tomaat.

Transposabele elementen

Uit verschillende planten, zowel dicotylen en monocotylen, zijn transposons geïsoleerd. Een aantal van deze transposabele elementen uit Zea mays (mais) en Antirrhinum maius (leeuwebek) zijn inmiddels getest in heterologe planten. Het transposabele element, Tam3, uit A. maius kan in tabak transposeren maar wordt geïnactiveerd door methylatie, terwijl het uit mais afkomstige transposabele element En/Spm zowel in tabak als aardappel transposeert met een relatief lage frequentie. Met het uit mais afkomstige Ac element en het niet-autonome Ds-element is transpositie aangetoond in een groot aantal heterologe gastheren, waaronder Nicotiana tabacum. Lycopersicon esculentum, Daucus carota. Solanum tuberosurn, Glycine max, Qryza sativa en Arabidopsis thaliana (zie Haring et al. 1991).

Het Ac/Ds transpositie systeem is tot nu toe het meest betrouwbaar gebleken in heterologe gastheren en het systeem is zeer goed bestudeerd. Daarom gaat de voorkeur uit naar het gebruik van Ac/Ds voor het verkrijgen van transpositie in de plant, hoewel in principe van elk transpositie-element gebruik kan worden gemaakt voor de realisatie van de hier beschreven werkwijze.

Recombinatie systemen

Recentelijk zijn verschillende plaats-specifieke recombinatiesystemen, waaronder het Cre/loxP systeem uit bacteriofaag PI en het FLP-recombinatïesysteem uit gist, met succes geïntroduceerd in dierlijke en plantecellen (Odell et al. 1990; O'Gorman et al. 1991). Beide plaats-specifieke recombinatiesystemen zijn zeer goed bestudeerd, zowel in de prokaryoot Escherichia coli als in gist, als ook in vitro (Broach en Hicks 1980; Sternberg en Hamilton 1981; Abremski et al. 1983). Het recombinatieproces is zeer eenvoudig, in de zin dat het slechts uit twee componenten bestaat, het recombinase (Cre-eiwit of FLP-eiwit) en de recombinatiesequenties (34 bp loxP-sequenties of FRT-sequenties). Recombinatie tussen twee recombinatiesequenties treedt op wanneer het Cre-eiwit, dan wel het FLP-eiwit aanwezig is en resulteert, afhankelijk van de relatieve positie van de recombinatiesequenties, in een deletie van de tussenliggende sequentie (recombinatiesequenties in "direct repeat") of in een inversie van de tussenliggende sequentie (recombinatiesequenties in "inverted repeat").

Behalve in gist werkt het FLP plaats-specifieke recombinatiesysteem ook in dierlijke cellen (O'Gorman et al. 1991), terwijl het Cre/loxP recombinatiesysteem behalve in de prokaryoot E. coli en in vitro tevens functioneert in gist (Sauer 1987), dierlijke cellen (Sauer en Henderson 1989) en plantecellen (Dale en Ow 1990; Odell et al. 1990). Introductie van de loxP-sequenties en het gen dat codeert voor het Cre-recombinase was voldoende om zowel inversie- als deletievorming in tabakscellen aan te tonen (Dale en Ow 1990) . Deze eerste proeven tonen aan dat dit recombinatiesysteem efficiënt werkt in de plant. Daarom gaat de voorkeur uit naar het gebruik van het Cre/loxP recombinatiesysteem in de hier beschreven werkwijze. In principe kunnen ook het FLP recombinatiesysteem of andere plaats-specifieke dan wel homologe recombinatiesystemen, zoals het recombinatiesysteem van bacteriofaag lambda, voor dit doeleinde worden gebruikt. Deze systemen zijn echter nog niet uitvoerig getest in plantecellen.

Gastheren en introductie DNA

Met de keuze van de gastheer hangt sterk de keuze van de transformatietechniek samen. De introductie van een deletie-systeem zoals hier wordt beschreven, is interessant voor alle gewassen, waarvan het genoom bestudeerd wordt en waarin zich in het genoom interessante genen bevinden die voor isolatie in aanmerking komen. Op het toegepaste vlak wordt hierbij met name gedacht aan sier- en voedingsgewassen. Genen betrokken bij de vorming van de producten van deze gewassen zoals bijvoorbeeld de bloem, vrucht, wortel, blad, etc. zijn interessante genen om te isoleren. Verder zijn de genen die bij het afweersysteem van de plant een rol spelen interessante genen die voor isolatie in aanmerking komen. Het is daarom van belang dat het hier beschreven systeem geïntroduceerd kan worden in gastheren zoals sier- en voedingsgewassen. Verder moet gedacht worden aan gastheren van niet commerciële plantensoorten, zoals wilde variëteiten en voorouders van de huidige cultuurgewassen. In principe is het mogelijk het beschreven systeem in elke willekeurige plant te introduceren, wanneer een transformatiemethode bestaat voor de beoogde gastheer. Als voorbeelden van een gastheer voor het beschreven systeem wordt gebruik gemaakt van tabak (Nicotiana tabacum), tomaat (Lycopersicon esculentum) en Arabidopsis thaliana.

De introductie van DNA in het plantegenoom kan op een aantal manieren worden gerealiseerd. Een mogelijkheid is de introductie van DNA direct in de plantecel, waarna integratie in het plantegenoom plaats vindt volgens een onbekend integratie-mechanisme (Hain et al. 1985). Een tweede mogelijkheid is de introductie van vreemd DNA in de plantecel met behulp van de grondbacterie Aarobacterium tumefaclens. Van deze bacterie is bekend dat een specifiek stuk DNA (T-DNA) netjes wordt geïnjecteerd en vervolgens geïntegreerd in het plantegenoom (Melchers and Hooykaas 1987). Van beide transformatiesystemen is bekend dat het DNA min of meer willekeurig integreert in het plantegenoom. Wel lijkt er een lichte voorkeur te bestaan voor de integratie van het T-DNA in DNA dat actief getranscribeerd wordt, hoewel hiervoor nog niet voldoende gegevens voorhanden zijn.

Werkwijzen waarbij DNA direct in de plantecel wordt geïntroduceerd, worden vooralsnog voor een groot aantal gewassen beperkt door de mogelijkheid van regeneratie van het getransformeerde planteweefsel, terwijl het aan de andere kant nog niet duidelijk is of alle planten, met name monocotylen, door Aarobacterium getransformeerd kunnen worden. Wel zijn er voorbeelden bekend van de introductie van het T-DNA door A, tumefaciens in monocotylen (Hooykaas-van Slogteren et al. 1984).

Het gebruik van A. tumefaciens voor de introductie van DNA in het plantegenoom heeft de voorkeur boven het gebruik van directe DNA transfer, omdat bij deze transformatiemethode de integratie van een specifiek stuk DNA gecontroleerd plaats vindt in tegenstelling tot de integratie na directe DNA transfer.

Wanneer JV. tumefaciens niet in staat is een bepaalde plant te transformeren, kan echter gebruik gemaakt worden van andere transformatietechnieken zoals de directe DNA transfer. Directe introductie van DNA wordt gerealiseerd door onder andere PEG/Ca transformatie, electroporatie, microinjectie, laser technieken en via "partical bombardment".

Inductie van deleties/inversies met behulp van Ac/Ds en Cre/loxP

Zowel het transpositie- als het recombinatiesysteem kunnen als twee-elementen systemen worden geïntroduceerd in tomaat, namelijk het Ac/Ds transpositiesysteem en het Cre/loxP recombinatiesysteem. Door de loxP-sequenties te inserteren in enerzijds een Ds element en anderzijds het T-DNA waarmee dit Ds element in de plant wordt geïntroduceerd, kunnen deze systemen met elkaar worden verbonden. Door transactivatie van het Ds element (m.b.v. "Ac-transposase"), zal excisie van dit element uit het T-DNA optreden, met vervolgens reïntegratie op een positie elders in het plantegenoom. Met het Ds element zal ook de loxP-sequentie, aanwezig in Ds, wegspringen van de loxP-sequentie die aanwezig is in het T-DNA. Nadat de loxP-sequenties door onafhankelijke transpositiegebeurtenissen over verschillende afstanden van elkaar verwijderd zijn, kan door introductie van het Cre-eiwit recombinatie op de loxP-sequenties worden geïnduceerd, resulterend in deleties van verschillende grootte startend vanuit het T-DNA (zie figuur 1).

Wanneer inversies of deleties worden gevormd in het plantegenoom, kan bestudeerd worden of dit resulteert in een mutant fenotype. De combinatie van het Cre/loxP systeem en Ac/Ds transpositie in tomaat geeft dus de mogelijkheid met verhoogde frequentie mutaties (deleties/inversies) te induceren in het plantegenoom.

Beschrijving van de constructen

Allereerst worden het recombinatiesysteem en het transposonsysteem in de plant geïntroduceerd. Met behulp van A. tumefaciens worden transgene planten die het "Ac-transposase" gen bevatten, planten met het Cre-recombinase gen en planten met het Ds-element en de loxP-sequenties gemaakt.

Het Ac-transposase is een gen afkomstig uit het Ac transposabele element. Het codeert voor het transposase, essentieel voor het transpositieproces van Ac en Ds elementen. Hoewel dit gen in monocotylen en dicotylen tot expressie komt, kan de coderende sequentie voor dit eiwit (het transposase) gereguleerd worden door verschillende promoter (5'-uiteinde) en transcriptie terminator (3'-uiteinde) sequenties. In dit voorbeeld is er voor gekozen om het gen te voorzien van een sterke constitutieve plantepromoter, nl. de CaMV 35S promoter afkomstig van het cauliflower mosaic virus genome (Odell et al. 1985), terwijl gebruik wordt gemaakt van de eigen transcriptie terminatie sequenties van het transposase-gen (zie figuur 2).

Twee verschillende constructen met CaMV 35S-transposase zijn voorhanden. Het eerste CaMV 35S-transposase construct is gemaakt door eerst een HindlII/Smal fragment afkomstig uit pBI121 (Jefferson et al. 1987), met daarop de CaMV 35S promoter, te doneren in de E. coli vector pUC19 (Yanisch-Perron et al.

1985). Daarnaast werd in de Smal en EcoRI sites een Nael/EcoRI fragment (ca. 3,8 kbp) uit Ac gedoneerd met daarop gelegen de gehele coderende sequentie van het transposase en het 3'-uiteinde met de polyA additiesignalen. De hele insertie is vervolgens overgezet in een andere E. coli vector, pSK-bluescript (Stratagene) als een Pstl/Clal fragment (pTT261). Vanuit deze vector werd het CaMV 35S-transposase construct als een Sacl/Sall fragment overgezet in een binaire vector met een chloramphenicol resistentie gen, zoals beschreven door Haring et al. (1991; zie figuur 2). Het tweede CaMV 35S-transposase construct werd gemaakt door het BamHI/XhoI fragment in het binaire construct pTT230 (Rommens et al. 1991) te vervangen door het BamHI/XhoI fragment uit het hierboven beschreven pTT261 construct (zie figuur 2).

Het Cre gen afkomstig uit bacteriofaag PI is voorzien van prokaryotische transcriptie regulatie sequenties, daarom is ook hier het 5'-uiteinde van dit gen vervangen door de CaMV 35S promoter sequenties, terwijl het 3'-uiteinde van het nopaline synthase gen, met daarin een polyA additiesignaal, gebruikt is als transcriptie terminator sequentie voor dit construct (zie figuur 3). Het gebruikte construct is een afgeleide van het construct pED32 dat in detail is beschreven door Dale en Ow (1990). Dit CaMV 35S-Cre construct is als een XhoI/HindlII fragment in de SalI/HindlII sites van de binaire vector Bin 19 gezet (Jefferson et al. 1978, figuur 3).

Voor het doel van de hier beschreven werkwijze kan in principe gebruik worden gemaakt van elke regulerende sequentie, met als resultaat de vorming van actief transposase of recombinase, maar hier wordt de voorkeur gegeven aan de sterke CaMV 35S promoter voor het transposase en Cre-gen, om een hoge transpositie- en recombinatiefrequentie te induceren.

Als Ds-element wordt in dit voorbeeld gebruik gemaakt van een element bestaande uit de terminale inverted repeats en de sub-terminale sequenties, die noodzakelijk zijn voor transpositie. Dit Ds-element is afgeleid van het Ac element afkomstig uit het waxy-m7 allel van mais (Behrens et al. 1984) . Het is mogelijk om tussen de sequenties van de twee Ds uiteinden DNA te inserteren, dat vervolgens tijdens transpositie met het transposabele element meespringt naar nieuwe locaties in het genoom. In dit voorbeeld is het Ds-element naast de voor transpositie noodzakelijke sequenties uitgerust met een detecteerbare of selecteerbare marker, een bacteriële oorsprong van replicatie (ori), en een synthetisch gemaakte sequentie bestaande uit de loxP-sequentie: ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT SEQ ID NR:1 en de herkenningssequentie (GCGGCCGC) voor het restrictie-enzym Notl. Van deze sequenties is alleen de loxP-sequentie noodzakelijk voor het functioneren van het hier beschreven systeem. De andere sequenties die hier in het Ds-element gezet zijn, worden als hulpmiddel gebruikt tijdens de analyse van de transgene planten. De geïnserteerde replicatie-oorsprong (ori) sequentie en de Notl restrictie site worden bijvoorbeeld gebruikt om de isolatie van de elementen uit het plantegenoom voor of na transpositie te vereenvoudigen, terwijl de insertie van een markergen in het Ds-element het mogelijk maakt om planten eenvoudig te testen voor de aanwezigheid van het transposabele element. Van het hier beschreven Ds element is aangetoond dat het kan exciseren en reïntegreren wanneer het is getransformeerd naar het plantegenoom (Rommens et al. 1991).

Om deze Ds-elementen te construeren is uitgegaan van de E. coli vector pACYC184 (Chang en Cohen 1978) . Het SphI/NruI fragment van pACYC184 is vervangen door een SphI/NruI fragment met daarop gelegen de uiteinden van het Ac element (586 bp 5'-uiteinde en 448 bp 3'-uiteinde), gescheiden door een BglII site, zoals beschreven in Haring et al. 1989. Hierdoor is het aldus verkregen Ds-element (pACYC-Ds) al voorzien van een bacteriële replicatie-oorsprong met een antibioticumresistentie voor chloramphenicol. Vervolgens kunnen het gekozen markergen en de loxP-sequenties geïntroduceerd worden in het vectorgedeelte van dit construct, waardoor de geïnserteerde sequenties eveneens tussen de uiteinden van het Ds-element komen te liggen (zie figuur 4). In figuur 4 zijn beide mogelijke oriëntaties van het loxP fragment schematisch weergegeven.

In dit voorbeeld worden twee verschillende Ds-markergenen beschreven; de detecteerbare marker β-glucuronidase (GUS) en de selecteerbare marker tegen het herbicide BastaR, het bar-gen. Beide genen worden in dit voorbeeld gereguleerd door de CaMV 35S promoter sequenties en het GUS gen is voorzien van de nopaline synthase transcriptie terminator sequenties, terwijl het bar-gen voorzien is van de transcriptie terminator sequenties van transcript 7 van het octopine T-DNA (figuur 4).

Het CaMV 35S-GUS construct is beschreven door Jefferson et al. (1978) en werd als een HindlII/EcoRI fragment uit pBI121 geïnserteerd in de HindiII en Xbal sites van het pACYC-Ds construct. Voor dit doel werden de Xbal en EcoRI sites opgevuld met behulp van DNA-polymerase. Het CaMV 35S-bar construct is beschreven door De Block et al. (1987) en werd als een HindlII/EcoRI fragment uit pGSFR280 geïnserteerd in de HindlII en Asel sites van het pACYC-Ds construct. De synthetische loxP/NotI sequenties werden vervolgens geïnserteerd in de HindlII site van deze constructen bij voorkeur met de NotI site naast het markergen en de loxP-sequentie direct naast het uiteinde van het Ds element (zie figuur 4). De sequenties van twee verschillende loxP/NotI HindlII fragmenten staan vermeld in figuur 5. In het geval van de inserties met de dubbele loxP sequenties met ertussen de Notl site is de oriëntatie van het fragment natuurlijk niet van belang.

Er is bij de constructie van de Ds-elementen gekozen voor elementen met een enkele loxP sequentie en met dubbele loxP sequenties, omdat het een voordeel kan zijn als een dubbele loxP sequentie in het element aanwezig is. In deze dubbele loxP sequenties liggen twee loxP-sequenties in inverted repeat ten opzichte van elkaar (figuur 5), dit heeft als voordeel dat altijd een van deze loxP-sequenties in "direct repeat" aanwezig zal zijn ten opzichte van de loxP-sequentie die na transpositie is achtergebleven in het.T-DNA, onafhankelijk van de oriëntatie waarin het Ds element is gereïntegreerd in een nieuwe locatie in het genoom. Er kan dan dus in theorie altijd een deletie worden geïnduceerd tussen de loxP-sequentie in het T-DNA en het weggesprongen Ds element. Tussen de loxP-sequenties die naast elkaar in het Ds-element aanwezig zijn, kan echter alleen inversie optreden, zodat er in principe niets aan het construct verandert na recombinatie tussen deze twee loxP-sequenties. In tegenstelling tot deze constructen met dubbele loxP-sequenties, is het voor Ds-elementen met een enkele loxP-sequentie afhankelijk van de oriëntatie van reïntegratie of er een deletie dan wel een inversie zal optreden tussen de loxP-sequentie in het nieuw geïntegreerde Ds-element en de loxP-sequentie in het T-DNA.

De verschillende hierboven beschreven Ds elementen worden vervolgens geïnserteerd tussen de promoter (CaMV 35S) en de coderende sequentie van het resistentie gen voor hygromycine (Hptll) in pMH2057 (figuur 6). pMH2057 is verkregen door insertie van het Sphl CaMV 35S-HptII fragment uit pTT218 zoals beschreven door Haring et al. (1989) en het tms2 gen uit het octopine TL-DNA (3490 bp Sphl/Xhol fragment) in de E. coli vector pUC19 (Yanisch-Perron et al. 1985, zie figuur 6). De promoter sequentie voor het Hptll gen bestaat wederom uit sequenties van de CaMV 35S promoter, terwijl het gen als transcriptie terminator het nopaline synthase 3'-uiteinde bevat. De insertie van de verschillende Ds-elementen als een BglII fragment in de BamHI site van dit construct, tussen de promoter en de coderende sequentie van een selecteerbare marker, heeft als voordeel dat hierdoor voor excisie van het Ds-e.lement uit dit construct kan worden geselecteerd. Na excisie van het Ds-element uit het T-DNA kan het Hptll gen tot expressie komen en is de cel dus hygromycine resistent geworden. Insertie van het tms2 gen naast het Ds-element geeft de mogelijkheid om voor bepaalde deletiegebeurtenissen te selecteren. Het tms2 gen kan namelijk gebruikt worden als een negatief selecteerbaar gen, hetgeen betekent dat selectie op het verlies (door deletie) van dit gen mogelijk is. Hoewel dit niet noodzakelijk is voor de hier beschreven werkwijze kan de aanwezigheid van een negatief selecteerbaar gen zoals het tms2 gen de selectie van planten waarin deleties zijn opgetreden aanzienlijk vereenvoudigen.

De verschillende zo verkregen constructen kunnen nu tenslotte worden overgezet in een binaire vector waarin zich al een selecteerbare marker en een ΙοχΡ-sequentie bevindt. De selecteerbare marker, in dit geval het gen voor kanamycine resistentie (Nptll gen), is in deze vector voorzien van de mannopine 5'- en 3'-regulatiesequenties en wordt gebruikt voor de selectie van transgene planten na transformatie. De in dit voorbeeld gebruikte binaire vector pCGN1548 is beschreven door McBride en Summerfelt (1990). In de BamHI site van deze vector is het synthetische BamHI fragment met de loxP-sequentie geïnserteerd (zie figuur 5). Daarnaast worden dan de verschillende Ds-bevattende constructen als een Kpnl fragment geïnserteerd. De constructen liggen dan binnen de "direct repeats" van het T-gebied, dat door A. tumefaciens wordt overgedragen naar de plantecel (zie figuur 7).

De verschillende T-DNA constructen zoals boven beschreven worden met behulp van A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al 1983) getransformeerd naar M· tabacum en L. esculentum via de "leaf disk" methode (Fillatti et al. 1987) en naar A. thaliana via de wortel transformatie techniek (Valvekens et al. 1988), om in deze verschillende gastheren het systeem te testen. De primaire transformanten worden onderzocht op het aantal T-DNA inserties (kopie-aantal) en tevens wordt de locatie van de T-DNA inserties in het plantegenoom bepaald in het geval van transformatie met het Ds/loxP construct.

Volgroeide planten waarin het Ds/loxP element aanwezig is, worden nu in eerste instantie gekruist met de "Ac-transposase" bevattende planten, om zodoende transpositie van het Ds-element met een van de loxP-sequenties te induceren. De nakomelingen van deze kruising worden door middel van selectie op hygromycine onderzocht op de excisie van het Ds element uit de oorspronkelijke positie in het T-DNA en de reïntegratie van het element elders in het genoom. Vervolgens worden de aldus verkregen planten gekruist met de Cre-gen bevattende planten, om plaats-specifieke recombinatie tussen de loxP-sequenties in deze planten te induceren. Het is echter ook mogelijk om beide genen tegelijkertijd in te kruisen in de Ds/loxP planten, waarna directe selectie op deletie- of inversiegebeurtenissen plaats kan vinden (zie figuur 8) .

Een andere manier om transpositie en recombinatie in de Ds/loxP plant te induceren is door gebruik te maken van de mogelijkheid om het transposase en recombinase transiënt tot expressie te brengen in protoplasten van de Ds/loxP bevattende planten. Wanneer deze methode gevolgd wordt, is het niet noodzakelijk dat integratie van het transposase en/of het recombinase-gen in het plantegenoom plaats vindt. Transiënte expressie van het gen is voldoende om zowel transpositie als recombinatie in het plantegenoom te induceren (zie figuur 8).

De verkregen deletie/inversie mutanten (en de nakomelingen van de volgende generatie na zelfbestuiving) kunnen vervolgens geanalyseerd worden voor de grootte van de opgetreden deletie/ inversie en het optreden van een fenotypische verandering, met vervolgens de mogelijkheid het gen, dat verantwoordelijk is voor deze mutatie, te karakteriseren en eventueel te isoleren.

Wanneer na recombinatie tussen de loxP-sequenties van de hierboven beschreven constructen een deletie wordt gecreëerd in het plantegenoom, zal van zowel het T-DNA als het weggesprongen Ds-element een deel achterblijven in het genoom. De deletie zal er toe leiden dat er maar één loxP-sequentie overblijft in het genoom en dat daardoor dus geen Cre-geïnduceerde recombinatie meer kan optreden, terwijl ook maar één uiteinde van het Ds-element overblijft zodat ook geen transpositie meer kan optreden van dit element (zie figuur 9).

De hier beschreven werkwijze kan bijvoorbeeld gebruikt worden voor de deletie van een of meerdere plantegenen. Het kan hier gaan om plantegenen aanwezig in het plantegenoom, of nieuw geïntroduceerde genen. Deze zo verkregen deletiemutanten kunnen bestudeerd worden op moleculair niveau, door de isolatie van de flankerende sequenties van het na de recombinatiegebeurtenis overgebleven T-DNA segment. Tevens kan deze werkwijze leiden tot de isolatie van mutanten waarbij chromosoomsegmenten zijn gedeleteerd of geïnverteerd. In deze mutanten kan de organisatie van een chromosoom veranderd zijn, met mogelijk gevolg voor de gen-regulatie van een of meerdere plantegenen. Ook kan met behulp van deze werkwijze inter-chromosomale recombinatie optreden, met als gevolg dat de organisatie van het genoom verandert, hetgeen tot verschillende fenotypes kan leiden. Behalve de deletie van specifieke of. willekeurige plantegenen kan ook inversie van een specifiek of willekeurig plantegen worden geïnduceerd met als gevolg dat het expressiepatroon van dat gen wordt veranderd of zelfs reguleerbaar wordt.

Referenties:

Abremski, K., Hoess, R. and Sternberg, N. (1983) Studies on the properties of PI site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell 32, 1301-1311.

Baker, B., Schell, J., Lorz, H. and Fedoroff, N.V. (1986) Transposition of the maize controlling element "Activator" in tobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4844-4848.

Baltimore, D. (1985) Retroviruses and retrotransposons: the role of reverse transcription in shaping the eukaryotic genome. Cell 40, 481-482

Behrens, U., Federoff, N., Laird, A., Muller-Neumann, M., Starlinger, P. and Yoder, J. (1984) Cloning of Zea mays controlling element Ac from the wx-m7 allele. Mol. Gen. Genet. 194, 346-347

Bollag, R.J., Waldman, A.S. and Liskay, R.M. (1989) Homologous recombination in mammalian cells. Annu. Rev. Genet. 23, 199-225 Broach, J.R. and Hicks, J.B. (1980) Replication and recombination functions associated with the yeast plasmid 2μ circle. Cell 21, 501-508.

Craig, N.L. (1990) P element transposition. Cell 62, 399-402. Dale, E.C. and Ow, D.W. (1990) Intra- and intermolecular site-specific recombination in plant cells mediated by bacteriophage PI recombinase. Gene 91, 79-85.

De Block, M., Botterman, J., Vandewiele, M, Dockx, J., Thoen, C., Gossele, V., Rao Movva, N., Thompson, C., Van Montagu, M. and Leemans, J. (1987) Engeneering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme. EMBO J. 6, 2513-2518.

Dooner, H.K., English, J.and Ralston, E.J. (1988) The frequency of transposition of the maize element Activator is not affected by an adjacent deletion. Mol. Gen. Genet. 211, 485-491.

Dooner, H.K. and Belachew, A. (1989) Transposition pattern of the maize element Ac from the bz-m2 (Ac) allel. Genetics 122, 447-457.

Dooner, H.K., Keller, J., Harper, E. and Ralston, E. (1991) Variable patterns of transposition of the maize element activator in tobacco. The Plant Cell 3, 473-482.

Doring, H.P.(1989) Tagging genes with maize transposable elements. An overview. Maydica 34, 73-88.

Errampalli, D. Patton, D., Castle, L., Mickelson, L., Hansen, K., Schnall, J., Feldmann, K. and Meinke, D. (1991) Embryotic lethals and T-DNA mutagenesis in Arabidopsis. The Plant Cell 3, 149-157.

Fedoroff, N.V. (1989) Maize transposable elements, in: Mobile DNA (eds D.E. Berg and M.M. Howe) pp. 375-411. American Society for Microbiology.

Fillatti, J.J., Kiser, J., Rose, R. and Comai, L. (1987) Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector. Bio/Technology 5, 726-730.

Gerats, A.G.M., Huits, H., Vrijlandt, E., Marana, C., Souer and Beld, M. (1990) Molecular characterization of a nonautonomous transposable element (dTphl) of petunia. The Plant Cell 2, 1121-1128.

Grandbastien, M.A., Spielmann, A. and Caboche, M. (1988) Tnt-1 a mobile retroviral like transposable element of tobacco isolated by plant cell genetics. Nature 337, 376-380.

Greenblatt, I. (1984) A chromosome replication pattern deduced from pericarp phenotypes resulting from movements of the transposable element Modulator in maize. Genetics 108, 471-485. Hain, R., Stabel, P. Czernilofski, A.P. Steinbiss, H.H., Herrera-Estrella, L. and Schell, J. (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene in plant protoplasts. Mol. Gen. Genet. 199, 161-168.

Haring, M.A., Gao, J., Volbeda, T., Rommens, C.M.T., Nijkamp, H.J.J. and Hille, J. (1989) A comparative study of Tam3 and Ac transposition in transgenic tobacco and petunia plants. Plant Mol. Biol. 13, 189-201.

Haring, M.A., Rommens, C.M.T., Nijkamp, H.J.J. and Hille, J. (1991) The use of transgenic plants to understand transposition mechanisms and to develop transposon tagging strategies. Plant Mol. Biol. 16, 449-461.

Hille, J., Koornneef, M., Ramanna, M.S. and Zabel, P. (1989) Tomato: a crop species amenable to improvement by cellular and molecular methods. Euphytica 42, 1-23.

Hoekema A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1983) A binary vector strategy based on separation of vir and T-region of'the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. Nature 303, 179-181.

Hooykaas-van Slogteren, G.M.S., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1984) Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens. Nature 311, 763-764.

Houba-Herin, N., Becker, D., Post, A., Larondelle, Y. and Starlinger, P. (1990) Excision of a DS-like maize transposable element (AcA) in a transient assay in Petunia is enhanced by a truncated coding region of the transposable element Ac. Mol.

Gen. Genet. 224, 17-23.

Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. (1987) GUS fusions: β-glucoronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.

Jing-liu, Z., Xiao-ming, L., Rui-zhu, C., Rui-xin, H. and Meng-min, H. (1991) Transposition of maize transposable element Activator in rice. Plant Science 73, 191-198.

Jones, J.D.G., Carland, F., Lim, E., Ralston, E. and Dooner, H.K. (1990) Preferential transposition of the maize element Activator to linked chromosomal locations in tobacco. The Plant Cell 2, 701-707.

Knapp, S., Coupland, G., Uhrig, H., Starlinger, P. and Salamini, F. (1988) Transposition of the maize transposable element Ac in Solanum tuberosum. Mol. Gen. Genet. 213, 285-290.

Lassner, M.W., Palys, J.M. and Yoder, J.I. (1989) Genetic transactivation of Dissociation elements in transgenic tomato plants. Mol. Gen. Genet. 218, 25-32.

Martin, C., Carpenter, R, Sommer, H., Seadler, H.and Coen, E.S.(1985) Molecular analysis of instability in flower pigmentation of Anthirrhinum majus, following isolation of the pallida locus by transposon tagging. EMBO J. 4, 1625-1630. McBride, K.E. and Summerfelt, K.R. (1990) Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 14, 269-276.

Melchers, L.S. and Hooykaas, P.J.J. (1987) Virulence of Agrobacterium, in: Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology 4, 167-220

Odell, J.T., Knowlton, S., Lin, W. and Mauvais, C.J. (1988) Properties of an isolated transcription stimulating sequence derived from the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Plant mol. Biol. 10, 263-272.

Odell, J., Caimi, P., Sauer, B. and Russell, S. (1990) Site-directed recombination in the genome of transgenic tobacco. Mol. Gen. Genet. 223, 369-378.

Offringa, R., De Groot, M.J.A., Haagsman, H.J., Does, M.P., Van Den Elzen, P.J.M. and Hooykaas, P.J.J. (1990) Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cells after Agrobacterium mediated transformation. EMBO J. 9, 3077-3084. O'Gorman, S., Fox, D.T. and Wahl, G.M. (1991) Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science 251, 1351-1355.

Rommens, C.M.T., Kneppers, T.J.A., Haring, M.A., Nijkamp, H.J.J. and Hille, J. (1991) A transposon tagging strategy with Ac on plant cell level in heterologous plant species. Plant Science 74, 99-106. ,

Rommens, C.M.T., van Haaren, M.J.J., Buchel, A.S., Mol, J.N.M., van Tunen, A.J., Nijkamp, H.J.J. and Hille, J. (1991) Transactivation of Ds by Ac-transposase gene fusions in tobacco. Mol. Gen. Genet, in press.

Sherratt, D. (1989) Tn3 and related transposable elements: site-specific recombination and transposition, in: Mobile DNA (eds D.E. Berg and M.M. Howe) pp. 163-184. American Society for Microbiology.

Paszkowski, J., Baur, M., Bogucki, A., Potrykus, I. (1988) Gene targeting in plants. EMBO J. 7, 4021-4026.

Peterhans, A., Schlupmann, H., Basse, C. and. Paszkowski, J.

(1990) Intrachromosomal recombination in plants. EMBO J. 9, 3437-3445.

Putcha, H. and Hohn, B. (1991) A transient assay in plant cells reveals a positive correlation between extrachromosomal recombination rates and length of homologous overlap. Nucleic Acids Res. 19, 2693-2700.

Sauer, B. (1987) Functional expression of the cre-lox site-specific recombination System in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cel. Biol. 7, 2087-2096.

Sauer, B. and Henderson, N. (1989) Cre-stimulated recombination at loxP-containing DNA sequences placed into the mammalian genome. Nucleic Acids Res. 17, 147-161.

Sauer, B. and Henderson, N. (1990) Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase. The New Biologist 2, 441-449.

Sternberg, N. and Hamilton, D. (1981) Bacteriophage PI site-specific recombination I. recombination between loxP sites. J. Mol. Biol. 150, 467-486.

Valvekens, D., Van Montagu, M. and Van Lijsebettens, M. (1988) Agrabacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540.

Van Sluys, M.A., Tempe, J. and Federoff, N. (1987) Studies on the introduction and mobility of maize Activator element in Arabidopsis thaliana and Daucus carota. EMBO J. 6, 3881-3889. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Improved M13 cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119.

Yoder, J.I., Palys, J., Alpert, K. and Lassner, M. (1988) Ac transposition in transgenic tomato plants. Mol. Gen. Genet 213, 291-296.

SEQUENTIE LIJST SEQ ID NR:1 SEQUENTIE TYPE: nucleotide SEQUENTIE LENGTE: 34 nucleotiden ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT 34

Claims (28)

1. Werkwijze voor het aanbrengen van een deletie- of inversie-mutatie in een plantegenoom, omvattende het integreren in het plantegenoom van recombinant DNA dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatie-sequentie omvat, het doen plaats vinden van transpositie van het transposabele element met de daarin aanwezige recombinatie-sequentie en .het doen plaats vinden van recombinatie.tussen de achtergebleven en de versprongen recombinatiesequentie, waarbij afhankelijk van de onderlinge oriëntatie van de betrokken recombinatiesequenties een deletie dan wel een inversie van het tussen de twee recombinatiesequenties gelegen DNA optreedt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij hetzij de in het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij de buiten het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij beide, in inverted repeat gekoppeld zijn aan een tweede exemplaar van de recombinatiesequentie.

3. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-2, waarbij het transposabele element een niet-autonoom transposabel element is, dat wel de voor transpositie noodzakelijke cis-elementen (terminale en subterminale sequenties) bevat maar niet de voor transpositie benodigde trans-elementen (transposase-genen).

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij de transpositie van het niet-autonome transposabele element met de daarin aanwezige recombinatiesequentie wordt bewerkstelligd door de voor transpositie benodigde trans-elementen (transposase-genen) in de plant te introduceren.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij als niet-autonome transposabele element het Ds-element van Zea mays en als transelement voor transpositie het Ac-transposase gen van Zea mays worden toegepast.

6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-5, waarbij de recombinatie.tussen de achtergebleven en de versprongen recombinatiesequentie wordt bewerkstelligd door de voor recombinatie benodigde trans-elementen (recombinatie-genen) in de plant te introduceren.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij als recombinatiesequentie de loxP-sequentie van bacteriofaag PI en als transelement voor recombinatie het Cre-recombinase gen van bacteriofaag PI worden toegepast.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-7, waarbij het integreren in het plantegenoom van het recombinante DNA, dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat, geschiedt met behulp van een Acrrobacterium tumefaciens stam die een T-DNA construct bevat, welk T-DNA construct de voor transfer naar planten noodzakelijke linker- en rechteruiteinden van het T-DNA omvat met daartussen een insertie van het genoemde recombinante DNA.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij in het transposabele element een bacteriële replicatie-oorsprong is opgenomen.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-9, waarbij in het transposabele element een bacterieel markergen, bijvoorbeeld een chloramphenicol resistentie gen is opgenomen.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-10, waarbij in het transposabele element een in planten werkzaam markergen, zoals een β-glucuronidase gen of het herbicide resistentie-gen bar, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, is opgenomen.

12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-11, waarbij het recombinante DNA een in planten werkzaam markergen, zoals het hygromycine resistentie-gen Hptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat waarbij het transposabele element tussen de promoter en het markergen is geïnserteerd.

13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-12, waarbij het recombinante DNA een in planten werkzaam markergen, zoals het tms2-gen uit het octopine TL-DNA, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat dat selectie van planten waarin een deletie heeft plaats gevonden mogelijk maakt.

14. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-13, waarbij het recombinante DNA een in planten werkzaam markergen, zoals het kanamycine resistentie-gen Nptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat dat selectie van getransformeerde planten mogelijk maakt.

15. Recombinant DNA, dat een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat.

16. Recombinant DNA volgens conclusie 15, waarbij hetzij de in het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij de buiten het transposabele element gelegen recombinatiesequentie, hetzij beide, in inverted repeat gekoppeld zijn aan een tweede exemplaar van de recombinatiesequentie.

17. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-16, waarbij het transposabele element een niet-autonoom transposabel element is, dat wel de voor transpositie noodzakelijke ciselementen (terminale en subterminale sequenties) bevat maar niet de voor transpositie benodigde trans-elementen (transposase-genen) .

18. Recombinant DNA volgens conclusie 17, waarbij het niet-autonome transposabele element het Ds-element van Zea mavs is.

19. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-18, dat als recombinatiesequentie de loxP-sequentie van bacteriofaag PI bevat.

20. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-19, omvattende de voor transfer naar planten noodzakelijke linker-en rechteruiteinden van T-DNA met daartussen een insertie die een transposabel element en zowel in als buiten het transposabele element een recombinatiesequentie omvat.

21. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-20, waarin het transposabele element een bacteriële replicatie-oorsprong bevat.

22. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-21, waarin het transposabele element een bacterieel markergen, bijvoorbeeld een chloramphenicol resistentie gen bevat.

23. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-22, waarin het transposabele element een in planten werkzaam markergen, zoals een β-glucuronidase gen of het herbicide resistentie-gen bar, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat.

24. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-23, dat een in planten werkzaam markergen bevat, zoals het hygromycine resistentie-gen Hptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, waarbij het transposabele element tussen de promoter en het markergen is geïnserteerd.

25. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-24, dat een in planten werkzaam markergen, zoals het tms2-gen uit het octopine TL-DNA, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat dat selectie van planten waarin een deletie heeft plaats gevonden .mogelijk maakt.

26. Recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-25, dat een in planten werkzaam markergen, zoals het kanamycine resistentie-gen Nptll, voorzien van in planten werkzame transcriptie-promoter en transcriptie-terminator sequenties, bevat dat selectie van getransformeerde planten mogelijk maakt.

27. Plant, die ten gevolge van een genetische manipulatie door middel van een werkwijze volgens een van de conclusies 1-14 voorzien is van een deletie- of inversie-mutatie in het genoom.

28. Plant, die ten gevolge van een genetische manipulatie in het genoom voorzien is van een insertie van recombinant DNA volgens een van de conclusies 15-26.