BR102015021321A2 - métodos e composições para a recombinação de cepas deficientes de gene de agrobacterium tumefaciens - Google Patents

Abstract

métodos e composições para a recombinação de cepas deficientes de gene de agrobacterium tumefaciens. a presente invenção refere-se a novas composições e métodos para a produção e uso de cepas de agrobacterium tumefaciens (por exemplo, lba4404) que são deficientes de atividade reca relativa com a cepa progenitora. as combinações com outros genes deficientes nas cepas de agrobacterium tumefaciens são também descritas. especificamente, são fornecidos dois reca exemplares menos as cepas, uia777 onde o gene de resistência ao cloranfenicol interrompe o gene de reca e uia770 onde o gene de resistência à canamicina interrompe o gene de reca.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A RECOMBINAÇÃO DE CEPAS DEFICIENTES DE GENE DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à transformação mediada por Agrobacterium de plantas a qual resulta na integração de um T-Filamento dentro do genoma da célula da planta. O T-filamento contém cassetes de expressão de genes que são compostos de elementos de regulação de genes que foram precisamente projetados para conectar um promotor de um gene de interesse e a região 3' não traduzida (UTR). As sequências são engenharia de precisão em relação uns aos outros para dirigir de forma óptima a expressão do gene de interesse para a produção de proteína. A estabilidade dos elementos de regulação do gene é essencial para a expressão óptima do gene de interesse. Pequena modificação das sequências de polinucleotídeos que são contidas dentro do T-Filamento pode reduzir ou até mesmo eliminar a expressão do gene de interesse.

[002] A cepa Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) é usada para integrar um T-filamento dentro do genoma da célula da planta. Vide Ooms, G., Hooykaas, P.J.J., Van Veen, RJM, Van Beelen, P., Re-gensburg-Tuienk, T.J.G., e R.A. Schilperoort (1982 "Mutantes de dele-ção de octopina Ti-plasmídeo de Agrobacterium tumefaciens com ênfase no lado direito da T-região". Plasmid 7: 15 a 29; Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J., e R.A. Schilperoort (1983) "Uma estratégia de vetor de planta binário baseado na separação de vir- e T-região do Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmídeo " Nature 303: 179 a 180; e, Frammond, A.J., Barton K.A., e Chilton M.D. (1983) "Mini-Ti:. uma nova estratégia de vetor para a engenharia genética de plantas " Biotechnology 1: 262 a 269.

[003] Apesar do uso extensivo de A. tumefaciens (LBA4404) ao longo dos últimos trinta anos, tem-se observado que os plasmídeos transformados dentro desta cepa se tornam instáveis mediante a transformação dentro da cepa. Os elementos de regulação de genes, em especial os elementos que se repetem, têm sido observados para recombinar dentro da cepa de A. tumefaciens (LBA4404). Esta instabilidade resulta em uma redução da eficiência de transformação de plantas e a necessidade para a tela totalmente completa das plantas transgênicas potenciais para as sequências de T-filamento inalteradas. Dada a instabilidade dos plasmídeos transformados dentro desta cepa, existe uma necessidade para o desenvolvimento de cepas Agrobacte-rium tumefaciens (LBA4404) que não possuem propriedades de re-combinação, e que podem manter estavelmente um plasmídeo sem rearranjos dos elementos genéticos localizados no interior do plasmídeo.

[004] Dessa maneira, permanece uma necessidade para as cepas de Agrobacterium tumefaciens com melhorada estabilidade do plasmídeo. Em particular, o desenvolvimento de cepas de Agrobacterium tumefaciens com deficiência em vias de recombinação genética seria desejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção proporciona novas composições e métodos para a produção e uso de cepas de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, LBA4404) que são deficientes em atividade RecA relativa com a cepa progenitora. As combinações com outros genes deficientes em cepas de Agrobacterium tumefaciens são também descritas. Especificamente são fornecidos dois recA exemplares menos as cepas, UIA777 onde o gene de resistência ao cloranfenicol interrompendo o gene de recA e UIA770 onde o gene resistente à canamicina interrompe o gene de recA.

[006] Em um aspecto, são fornecidas as cepas de Agrobacterium tumefaciens modificadas, em que a referida cepa é modificada deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora.

[007] Em uma modalidade, a cepa modificada é deficiente em, pelo menos, uma via de recombinação selecionada a partir do grupo que consiste em RecA, RecB, RecD, RecF, RecG, RecJ, RECN, Re-cO, RecQ, RecR, e RecX. Em outra modalidade, a cepa modificada é deficiente em atividade de RecA. Em uma outra modalidade, o gene de recA compreende uma sequência de polinucleotídeo possuindo pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10 ou 11. Em uma outra modalidade, a cepa modificada é também deficiente em uma atividade selecionada a partir do grupo que consiste em RecB, Recd, RecF, RecG, RecJ, RECN, RecO, RecQ, RecR, e RecX.

[008] As sequências do gene de recA e a proteína RecA são estabelecidas na SEQ ID NOs: 10 e 12, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recB e RecB estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recD e RecD estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recF e RecF estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente. As sequências de proteína do gene recG e RecG estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recJ e RecJ estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recN e RecN estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente. As sequências de proteína do gene recO e as RecO estão descritas na SEQ ID NO: 25 e 26, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recQ e RecQ estão descritas na SEQ ID NO: 27 e 28, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recR e RecR estão descritas na SEQ ID NO: 29 e 30, respectivamente. As sequências de proteínas do gene recX e RecX estão descritsa na SEQ ID NO: 31 e 32, respectivamente.

[009] Em outra modalidade, um gene de recA genômico é modificado por meio de uma deleção, um rearranjo, ou uma inserção de uma sequência no gene de recA. Em outra modalidade, um gene de recA genômico é modificado através da inserção de uma sequência dentro do gene de recA, interrompendo, dessa maneira, a expressão da proteína RecA. Em uma outra modalidade, a sequência inserida compreende um gene marcador de seleção. Em uma outra modalidade, o marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir do grupo que consiste em um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, o gene de resistência a antibiótico compreende um gene de resistência ao cloranfenicol ou um gene de resistência à canamicina.

[0010] Em uma modalidade da cepa modificada, a atividade RecA é indetectável em extratos preparados a partir da referida cepa. Em outra modalidade, a proteína RecA é indetectável usando a análise de Western blot. Em outra modalidade, mRNA RecA não é detectável usando a análise Northern blot. Em outra modalidade, o gene de recA não é detectável usando a análise Southern blot.

[0011] Em uma modalidade, o gene de recA codifica uma proteína de SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade, a cepa compreende um Ti plasmídeo. Em uma outra modalidade, o Ti plasmídeo compreende um plasmídeo pAL4404 Ti, ou seja derivado do Ti plasmídeo pAL4404.

[0012] Em uma modalidade, a cepa compreende um plasmídeo binário. Em uma outra modalidade, o plasmídeo binário compreendendo um gene de uma característica agronômica selecionado a partir do grupo que consiste em um característica de resistência à inseticida, característica de resistência à herbicida, característica de eficiência do uso de nitrogênio, característica de eficiência do uso da água, característica de qualidade nutricional, característica de ligação ao DNA, característica de marcador de seleção, e as combinações dos mesmos. Em outra modalidade, a cepa compreende um plasmídeo ternário. Em uma outra modalidade, a cepa progenitora é Agrobacterium tumefadens (LBA4404).

[0013] Em outro aspecto, são proporcionados os plasmídeos contendo um gene de recA modificado de Agrobacterium tumefaciens, em que o gene de recA tem, pelo menos, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11 antes de modificação, e o gene de recA modificado é deficiente na expressão da proteína RecA.

[0014] Em uma modalidade, a modificação compreende a inserção de uma sequência de doador de dentro do gene de recA ou SEQ ID NO: 10 ou 11. Em uma outra modalidade, a sequência de doador compreende um gene marcador de seleção. Em uma outra modalidade, o gene marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao cloran-fenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, o gene de resistência a antibiótico compreende um gene de resistência ao cloranfenicol ou um gene de resistência à canamicina. Em outra modalidade, pelo menos uma das extremidades da sequência de doador é flanqueada por meio de pelo menos um fragmento de 43 pares de bases da SEQ ID NO: 10 ou 11.

[0015] Em outro aspecto, são proporcionados um método de geração de cepa Agrobacterium tumefaciens deficiente em uma via de re- combinação genética em relação à sua cepa progenitora. Os métodos compreendem [0016] (a) fornecimento de um plasmídeo de nocaute direcionado para o gene de recA] [0017] (b) introdução do plasmídeo de nocaute para o Agrobacte-rium tumefaciens;

[0018] (c) seleção e o rastreio das colônias que compreendem uma mutação genômica; e, [0019] (d) identificação de pelo menos um de Agrobacterium tumefaciens transformado com uma mutação genômica de recA.

[0020] Em uma modalidade, o gene de recA tem, pelo menos, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11. Em uma outra modalidade, o plasmídeo de nocaute induz uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em uma deleção genômica, um rearran-jo genômico, uma inserção genômica, e as combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, a inserção compreende uma sequência genômica que codifica um marcador de seleção. Em uma outra modalidade, o gene marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao clo-ranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, o gene de resistência a antibiótico compreende um gene de resistência ao cloran-fenicol ou um gene de resistência à canamicina.

[0021] Em outro aspecto, são fornecidos casos transgênicos compreendendo (a) uma inserção de T-filamento flanqueado por meio de uma sequência da extremidade de DNA genômica a montante e (b) sequências das extremidades do DNA genômico a jusante, em que a modificação genética compreende a integração do T-Filamento a partir de uma cepa modificada de Agrobacterium tumefaciens, que é deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora.

[0022] Em uma modalidade, o T-filamento modificado a partir da cepa de Agrobacterium tumefaciens é integrado no genoma de células de plantas específicas que são usados para regenerar o caso transgê-nico. Em outra modalidade, os casos transgênicos ainda compreendem uma característica agronômica. Em uma outra modalidade, a característica agronômica é selecionada a partir do grupo que consiste em um característica de resistência à inseticida, característica de resistência à herbicida, característica de eficiência do uso de nitrogênio, característica de eficiência do uso de água, característica da qualidade nutricional, característica de ligação de DNA, característica de marcador de seleção, e as combinações dos mesmos. Em outra modalidade, o caso transgênico é uma planta dicotiledônea ou uma planta monoco-tiledônea.

[0023] Em uma outra modalidade, a planta dicotiledônea ou a planta monocotiledônea está selecionada a partir do grupo que consiste em cevada, canola, café, milho, algodão, linho, vinha, lúpulo, mostarda, nozes, aveia, papoila, colza, arroz, plantas de borracha, centeio, girassol, sorgo, soja, cana-de-açúcar, chá, tabaco e trigo. Em uma outra modalidade, a planta dicotiledônea ou a planta monocotiledônea está selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, algodão, arroz, soja, e a canola. Em uma outra modalidade, a planta dicotiledônea ou a planta monocotiledônea está selecionada a partir do grupo que consiste em banana, abacaxi, citrinos, uvas, melancia, melão, cantalupe, e outros melões, maçã, pêssego, pêra, cereja, kiwi, manga, nectarina, goiaba, mamão, caqui, romã, abacate, figo, frutas cítricas, e bagas.

[0024] Em outro aspecto, são proporcionados os métodos de pro- dução de uma planta transgênica. Os métodos compreendem [0025] (a) contactar as células de plantas específicas, com uma cepa de Agrobacterium tumefaciens modificada, que é deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora;

[0026] (b) seleção das células de plantas e de triagem compreendendo DNA a partir da referida cepa de Agrobacterium integrado no genoma das células das plantas-alvo; e [0027] (c) regeneração de plantas inteiras a partir de células trans-gênicas de plantas selecionadas/rastreadas na etapa (b).

[0028] Em uma modalidade, a etapa de selecionar é levada a cabo usando um marcador de seleção. Em uma outra modalidade, o gene marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à especti-nomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade adicional, o gene de resistência a antibiótico compreende um gene de resistência ao cloranfenicol ou um gene de resistência à canamicina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] A FIGURA 1 ilustra uma inserção de fragmentos de mapas de plasmídeos usados para mutagênese recA. A FIGURA 1A mostra o gene de recA e sua sequência circundante em PWM-RecAnei. B, mapa de restrição Xhol do fragmento de DNA a partir de LBA4404 em PCP-MMSR2. C, substituição de recA com cassetes que codificam resistência a antibiótico Cm ou Km.

[0030] A FIGURA 2 ilustra um relacionamento de recA a partir de A. tumefaciens (LBA4404) com o gene de recA de outras cepas de Agrobacterium. A árvore filogenética é gerada usando phyML (disponível na internet em phylogeny.fr) (Dereeper A, Guignon V, Blanc G, Au-dic S, S Buffet, Chevenet F, Dufayard JF, Guindon S, V Lefort, Lescot M, Claverie JM, Gascuel O. (2008) Phylogeny.fr: análise filogenética robusta para o não especialista. Nucleic Acids Research 36 (problema de servidor Web): W465-9). O fragmento de 969 pb interno do recA (34-1005 pb) é usado para realizar esta análise de alinhamento. As outras cepas são selecionadas a partir dos genomovars recA representativos (G-) no gênero Agrobacterium e as taxas relacionadas, como indicado (Costechareyre et al., 2010).

[0031] A FIGURA 3 ilustra as taxas de crescimento dos dois exemplares A. tumefaciens mutantes recA (LBA4404) menos cepas, UIA777 e UIA770 em comparação com as cepas do tipo selvagem e complementadas. Para estes ensaios é usado meio de MGL.

[0032] A FIGURA 4 ilustra um mapa de plasmídeo de plasmídeo binário, pDAB108700, que mostra o desenho do constructo e a duplicação do promotor da ubiquitina-1 Zea mays dentro do constructo. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] Na presente invenção, são descritas as novas composições e métodos para a produção e uso de cepas Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) que são deficientes em atividade RecA relativa com a cepa progenitora. Além disso, é descrito um local de integração cro-mossômico para a integração de um fragmento de polinucleotídeo dentro do genoma de Agrobacterium tumefaciens (LBA4404). As novas composições e métodos descritos são úteis para a produção de casos transgênicos com espécies de plantas.

[0034] A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado que o normalmente entendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica à qual esta descrição diz respeito. Em caso de conflito, o presente pedido de Patente incluindo as definições irá controlar. A menos que seja exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos no plural incluem o singular. Todas as pu- blicações, patentes e outras referências mencionadas na presente invenção são incorporadas por meio de referência na sua totalidade para todos os fins, como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por meio de referência, a não ser que apenas as seções específicas de patentes ou publicações de patentes sejam indicadas para serem incorporadas por meio de referência.

[0035] A fim de esclarecer ainda mais esta descrição, os seguintes termos, abreviaturas e definições são fornecidos.

[0036] Tal como usados na presente invenção, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação deste, se destinam para ser não exclusivo ou aberto. Por exemplo, uma composição, uma mistura, processo, método, um artigo, ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente listados ou inerentes a esse composição, mistura, processo, método, artigo, ou aparelho. Além disso, a menos que seja expressamente indicado de uma outra forma, "ou" refere-se a um ou in-clusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição de A ou B é satisfeita por meio de qualquer um dos seguintes procedimentos: A é verdadeira (ou presente) e B falso (ou não está presente), A falso (ou não está presente) e B é verdadeira (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[0037] Tal como usado na presente invenção, "sequência endóge-na" define a forma nativa de um polinucleotídeo, ou gene do poiipeptí-deo na sua localização natural no organismo ou no genoma de um organismo.

[0038] Tal como usados na presente invenção, os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são usados indiferentemente, e podem incluir um ácido nucleico singular; ácidos nucleicos plurais; um fragmento de ácido nucleico, variante, ou derivado do mesmo; e o constructo de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e o DNA plasmídico (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de comprimento completo, ou um fragmento do mesmo, incluindo as sequências não traduzidas 5' e/ou 3' e a (s) se-quência(s) de codificação. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser um que consiste em qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirri-bonucleotídeo, o qual pode incluir ribonucleotídeos ou desoxirribonu-cleotídeos não modificados ou ribonucleotídeos ou desoxirribonucleo-tídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de DNA de filamento único e de filamento duplo; DNA que é uma mistura de regiões simples e de filamento duplo; RNA simples e de filamento duplo; e RNA que é uma mistura de regiões simples e de filamento duplo. As moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA podem ser de filamento único, filamento duplo, ou uma mistura de regiões simples e de filamento duplo. Os termos precedentes incluem as formas quimicamente, enzimaticamente, e metabolica-mente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.

[0039] Entende-se que um DNA específico refere-se também ao complemento desta, cuja sequência é determinada de acordo com as regras de empareihamento de bases de desoxirribonucleotídeo.

[0040] Tal como usado na presente invenção, o termo "gene" refe-re-se a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptídeo/proteína). Um gene pode incluir as sequências de regulação que precedem (sequências 5' não codificante) e/ou a sequência seguinte (sequências 3' não codificantes) que codifica o produto funcional.

[0041] Tal como usado na presente invenção, o termo "sequência de codificação" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Uma "sequência de regulação" refere-se a uma sequência de nucleotídeos localizada a montante (por exemplo, sequências 5' não codificantes), dentro ou a jusante (por exemplo, sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante, que influenciam a transcrição, processamento ou a estabilidade de RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. As sequências de regulação incluem, por exemplo, e sem limitação: os promotores; sequências líder de tradução; íntrons; as sequências de reconhecimento de poliadenilação; Os locais de processamento de RNA; locais de ligação efetores; e as estruturas de haste laçada.

[0042] Tal como usado na presente invenção, o termo "polipeptí-deo" inclui um polipeptídeo singular, polipeptídeos plurais, e os fragmentos dos mesmos. Este termo refere-se a uma molécula constituída por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por meio de ligações de amida (também conhecido como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico ou o tamanho do produto. Dessa maneira, os peptídeos, os dipeptídeos, tripeptí-deos, oligopeptídeos, proteínas, cadeia de aminoácidos, e qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídas dentro da definição de "polipeptídeo" e os termos que se seguem são usados alternadamente na presente invenção com "polipeptídeo". Um polipeptídeo pode ser isolado a partir de uma fonte biológica natural ou produzida por meio da tecnologia recombinante, mas um polipeptídeo específico não é necessariamente traduzido a partir de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer modo adequado, incluindo, por exemplo, e sem limitação, através de síntese química.

[0043] Em contraste, o termo "heterólogo" refere-se a um polinu- cleotídeo, polipeptídeo ou gene que não é normalmente encontrado na sua localização na referência (hospedeira) com o organismo. Por exemplo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é normalmente encontrado no organismo de referência em um local genômico diferente. A título de exemplo adicional, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que não se encontra normalmente no organismo de referência. Um organismo hospedeiro que compreende um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser produzido através da introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro. Em exemplos particulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou uma porção do mesmo, que é reintroduzida no organismo uma fonte de uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. Em exemplos particulares, compreende um gene heterólogo que codifica uma sequência nativa, ou uma porção do mesmo, que é reintroduzido no organismo uma fonte de uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma sequência de codificação nativa, que é uma porção de um gene quimérico incluindo as regiões de regulação não nativas, que é reintroduzido no hospedeiro nativo. Em exemplos particulares, um polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo nativo que é reintroduzido no organismo uma fonte de uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente.

[0044] Um gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser um gene ou polipeptídeo que compreende um polipeptídeo funcional ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcional, que é acoplado a um outro gene ou polipeptídeo para produzir um polipeptídeo quimérico ou de fusão, ou um gene que codifica para a mesma. Os genes e proteínas de modalidades particulares incluem especificamente as sequências de comprimento total exemplificadas e por- ções, segmentos, os fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e eliminações internas e/ou terminais em comparação com as moléculas de comprimento completo), variantes, mutantes, quiméricos, e fusões destas sequências.

[0045] Tal como usado na presente invenção, o termo "alteração" pode referir-se a uma mudança de um polinucleotídeo descrito na presente invenção que resulta em atividade reduzida, ou substancialmente eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo, bem como uma alteração em um polipetídeo descrito na presente invenção eliminado que resulta em atividade reduzia, ou substancialmente eliminada do polipeptídeo eliminado. Alternativamente, o termo "alteração" pode referir-se a uma mudança de um polinucleotídeo descrito na presente invenção que resulta em atividade aumentada ou melhorada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo, bem como uma alteração em um polipeptídeo descrito na presente invenção que resulta em atividade aumentada ou melhorada do polipeptídeo. Tais alterações podem ser feitas por meio dos métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, exclusão, mutação (por exemplo, mutagênese espontânea, mutagênese aleatória, mutagênese causadas por genes mutadores, ou mutagênese por transposões), substituindo, inserindo a regulação, alterando a localização celular, alterando o estado do polinucleotídeo ou polipeptídeo (por exemplo, metilação, fosforilação ou ubiquitinação), a remoção de um cofator, a introdução de um RNA/DNA antissenso, introdução de um RNA/DNA de interferência, modificação química, modificação covalente, irradiação com UV ou raios-X, a recombinação homóloga, a recombinação mitótica, métodos de substituição do promotor e/ou as combinações dos mesmos. Uma orientação para determinar quais os nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos podem ser modificados, pode ser encontrada por meio da comparação da sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo particular com a de polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos, por exemplo, levedura ou bacteriana, e a maximização do número de modificações feitas nas regiões de elevada homologia (regiões conservadas) ou sequências de consenso.

[0046] O termo "derivado", tal como usado na presente invenção, refere-se a uma modificação de uma sequência apresentada na presente invenção. Ilustrativos de tais modificações seria a substituição, inserção e/ou deleção de uma ou mais bases, relativamente a uma sequência de ácido nucleico de uma sequência de codificação descrita na presente invenção que preserva, altera ligeiramente, ou aumenta a função de uma sequência de codificação descrita na presente invenção em espécies de cultura. Tais derivados podem ser prontamente determinados por meio de uma pessoa versada na técnica, por exemplo, usando as técnicas de modelação computacional para prever a estrutura e sequência de optimização. O termo "derivado" também inclui, portanto, as sequências de ácidos nucleicos possuindo a identidade de sequências substancial com as sequências de codificação descritas na presente invenção tais que elas são capazes de ter as funcionalidades descritas para uso na produção de modalidades da presente descrição.

[0047] O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de ácido nucleico co-dificadora ou RNA funcional. Nos exemplos, a sequência de codificação controlada está localizada 3' para uma sequência promotora. Um promotor pode ser derivado na sua totalidade a partir de um gene nativo, um promotor pode ser um que consiste em diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou um promotor pode mesmo compreender os segmentos de DNA concebidos racionalmente. É compreendido por aqueles que são versados na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em tecidos ou tipos de célula diferentes, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Exemplos de todos os promotores anteriores são conhecidos e usados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Os promotores que dirigem a expressão de um gene na maioria dos tipos de células na maioria das vezes são comummente referidos como "promotores constitutivos". Além disso, enquanto aqueles na técnica tem (em muitos casos sem sucesso) a tentativa para delinear as extremidades exatas de sequências de regulação, isto tem vindo a ser compreendido que os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem possuir atividade de promotor idêntica. A atividade do promotor de um ácido nucleico particular pode ser ensaiada usando as técnicas familiares aos que são versados na técnica.

[0048] O termo "operativamente ligado" refere-se a uma associação de sequências de ácido nucleico em um único ácido nucleico, em que a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência codificante, quando o promotor é capaz de efetuar a expressão da referida sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Uma sequência codificante pode ser ligada operativamente a uma sequência de regulação em uma orientação antissenso ou senso.

[0049] O termo "expressão", tal como usado na presente invenção, pode referir-se à transcrição e acumulação estável do senso (mRNA) ou antissenso derivado de RNA de um DNA. A expressão também pode se referir a tradução de mRNA em um polipeptídeo. Tal como usado na presente invenção, o termo "sobreexpressão" refere-se à expressão que é mais elevada do que a expressão endógena do mesmo gene ou um gene relacionado. Dessa maneira, um gene heterólogo é "sobreexpresso" se a sua expressão é mais elevada do que a de um gene endógeno comparável.

[0050] Tal como usado na presente invenção, o termo "transformação" ou "transformante" refere-se à transferência e integração de um ácido nucleico ou um fragmento do mesmo, para um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros que contêm um ácido nucleico transformador são referidos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".

[0051] Tal como usado na presente invenção, o termo "ligação" refere-se a uma interação não covalente específica da sequência entre as macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação necessitam de ser específicos da sequência (por exemplo, os contatos com os resíduos de fosfato em uma estrutura principal do DNA), desde que a interação como um todo seja específica da sequência. Tais interações são geralmente caracterizadas por meio de uma constante de dissociação (Kd) de 10-6 M-1 ou inferior. "Afinidade" refere-se à força de ligação: afinidade de ligação aumentada a ser correlacionada com um Kd inferior.

[0052] Uma "proteína de ligação" é uma proteína que é capaz de se ligar de modo não covalente a uma outra molécula. Uma proteína de ligação pode ligar-se a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação ao DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação de RNA) e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação a proteína). No caso de uma proteína de ligação a proteína, que pode ligar-se a si próprio (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode ligar-se a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais do que um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, as proteínas de dedo de zinco tem, atividade de ligação ao RNA e proteína de ligação de ligação de DNA.

[0053] Os termos "plasmídeo" e "vetor", como usado na presente invenção, referem-se a um elemento cromossômico adicional que podem transportar um ou mais gene(s) que não fazem parte do metabolismo central da célula. Os plasmídeos e vetores são tipicamente moléculas de DNA de filamento duplo circular. No entanto, os plasmídeos e vetores podem ser ácidos nucleicos lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de filamento único ou de filamento duplo, e pode transportar DNA essencialmente derivado de qualquer fonte, nos quais um número de sequências de nucleotídeos foi unido ou recombinado em um único constructo que é capaz de introduzir um fragmento do promotor e uma sequência de DNA codificante, juntamente com qualquer sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula. Nos exemplos, os plasmídeos e vetores podem incluir sequências de replicação autônomas para a propagação em hospedeiros bacterianos.

[0054] Os termos polipeptídeo e "proteína" são usados na presente invenção indiferentemente e incluem uma cadeia molecular de dois ou mais aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. Os termos não se referem a um comprimento específico do produto. Dessa maneira, "peptídeos" e "oligopeptídeos" estão incluídos na definição de polipeptídeo. Os termos incluem modificações pós-translacionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e similares. Além disso, os fragmentos de proteínas, análogos, mutantes ou proteínas variantes, proteínas de fusão e similares estão incluídos no âmbito do significado do polipeptídeo. Os termos também incluem moléculas de ácido em que os análogos de um ou mais aminoácidos ou aminoácidos não canônicos ou não naturais são compreendidos como podem ser sintetizados ou expressos de forma recombinante usando as técnicas de engenharia de proteínas conhecidas. Além dis- so, as proteínas de fusão da presente invenção podem ser derivatiza-das, tal como descrito na presente invenção por meio das técnicas bem conhecidas de química orgânica.

[0055] O termo "proteína de fusão" indica que a proteína inclui os componentes de polipeptídeo derivados de mais do que uma proteína ou polipeptídeo parental. Tipicamente, uma proteína de fusão é expressa a partir de um gene de fusão em que uma sequência de nucle-otídeos que codifica uma sequência polipeptídica de uma proteína é anexada na estrutura com, e, opcionalmente, separada por meio de um ligante a partir de, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de polipeptídeo a partir de uma proteína diferente. O gene de fusão pode então ser expresso por meio de uma célula hospedeira recombinante, como uma única proteína.

[0056] A expressão "sequências de controle" refere-se coletivamente a sequências promotoras, locais de ligação ao ribossoma, sequências de terminação da transcrição, domínios de regulação a montante, estimuladores e similares, que coletivamente proporcionam a transcrição e tradução de uma sequência de codificação em uma célula hospedeira. Nem todas estas sequências de controle sempre necessitam de estar presentes em um vetor recombinante desde que o gene desejado seja capaz de ser transcrito e traduzido.

[0057] O termo "recombinação" refere-se ao rearranjo de seções de sequências de DNA ou de RNA entre as duas moléculas de DNA ou RNA. O termo "recombinação homóloga" ocorre entre duas moléculas de DNA que hibridam em virtude de sequências de nucleotídeos homólogos ou complementares presentes em cada molécula de DNA.

[0058] Os termos "condições rigorosas" ou "hibridação sob condições rigorosas" refere-se a condições sob as quais uma sonda irá hi-bridar de preferência com a sua subsequência alvo e em uma menor extensão, ou não em todas, de outras sequências. "Hibridação rigoro- sa" e "condições de lavagem de hibridação rigorosa" no contexto de experiências de hibridação de ácidos nucleicos, tais como hibridações do sul e norte dependem da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Técnicas de Laboratório em Bioquímica e Biologia Molecular - Hibridização de Ácido Nucleico com Sondas parte I, capítulo 2 Visão geral dos princípios de hibridação e a estratégia de ensaios de sonda de ácido nucleico, Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, as condições de hibridação e lavagem altamente rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5 Ό inferior ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica, a uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50 % da sequência alvo hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito rigorosas são selecionadas para serem iguais à Tm de uma sonda particular.

[0059] Um exemplo de condições de hibridação rigorosas para hibridação de ácidos nucleicos complementares que têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma transferência de sul ou de norte é formamida a 50 % com 1 mg de heparina a 42 Ό, com a hibridação ser realizada fora durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente rigorosas é de NaCI a 0,15 M a 72 Ό durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem rigorosas é a lavagem de 0,2x SSC a 65 Ό em 15 minutos (vide, Sam-brook et al (1989) Clonagem Molecular - Um Manual Laboratorial (2nd Ed) Vol 1-3, Laboratório de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, para uma descrição de tampão SSC). Muitas vezes, uma lavagem de condições altamente rigorosas é precedida por meio de uma lavagem de baixo rigor para remover o sinal de fundo da sonda. Um exemplo de lavagem de rigor médio para um filamento duplo de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1 x SSC a 45 O du- rante 15 minutos. Um exemplo de lavagem de baixo rigor para um du-plex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6xSSC a 40 O durante 15 minutos. Em geral, uma relação sinal-ruído de 2x (ou superior) do que a observada para uma sonda não relacionada no teste de hibridação particular indica a detecção de uma hibridação específica. Os ácidos nucleicos que não hibridam uns com os outros sob condições rigorosas, são ainda substancialmente idênticos, se os polipeptí-deos que codificam forem substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico que é criada usando o máximo permitido pelo códon de degenerescência do código genético.

[0060] A presente invenção também diz respeito a um polinucleo-tídeo isolado de hibridização sob condições rigorosas, de preferência sob condições altamente rigorosas, com um polinucleotídeo a partir da presente descrição.

[0061] Tal como usado na presente invenção, o termo "hibridação" destina-se a descrever condições para hibridação e lavagem sob quais as sequências de nucleotídeos, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, mais de preferência pelo menos cerca de 80 %, ainda mais de preferência pelo menos cerca de 85 % a 90 %, mais de preferência pelo menos 95 % de homolo-gia um com o outro tipicamente permanecem hibridizadas entre si.

[0062] Em uma modalidade, um ácido nucleico da descrição é, pelo menos, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou mais homólogo a uma sequência de ácido nucleico apresentada nesta aplicação ou o complemento do mesmo.

[0063] Outro exemplo não limitante de condições de hibridação rigorosas é a hibridação em cloreto de sódio 6x/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 Ό, seguido por uma ou mais lavagens em 1 x SSC, 0,1 % SDS a 50 Ό, de preferência a 55 Ό mais de prefe rência a60 Oe ainda mais de preferência a 65 Ό.

[0064] As condições altamente rigorosas podem incluir as incubações a 42 Ό durante um período de vários dias, tal como 2 a 4 dias, usando uma sonda de DNA marcado, tal como uma sonda de DNA marcado com digoxigenina (DIG), seguido por meio de um ou mais lavagens em 2 x SSC, SDS a 0,1 % à temperatura ambiente e uma ou mais lavagens em 0,5xSSC, SDS a 0,1 % ou 0,1 x SSC, 0,1 % SDS a 65 a 68 Ό. Em particular, condições altamente rigo rosas incluem, por exemplo, 2 horas a 4 dias de incubação a 42 Ό usan do uma sonda de DNA marcada com DIG (preparada por exemplo usando um sistema de marcação DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma solução de tal como solução DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH), com ou sem DNA de esperma de salmão a 100 ug,/ml ou uma solução compreendendo 50 % de formamida, 5 x SSC (NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), 0,02 % de sulfato de do-decilo de sódio, 0,1 % de N- lauroilsarcosina, e 2 % de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH), seguido de lavagem dos filtros duas vezes durante 5 a 15 minutos em 2 x SSC e SDS a 0,1 % à temperatura ambiente e, em seguida, lavando duas vezes durante 15 a 30 minutos em 0,5xSSC e 0,1 % de SDS ou 0,1 x SSC e 0,1 % SDS a 65 a 68 *C.

[0065] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da descrição que hibrida sob condições altamente rigorosas com uma sequência de nucleotídeos da descrição pode corresponder a uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural. Tal como usado na presente invenção, uma molécula "de ocorrência natural" de ácido nucleico refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma sequência nucleotídica que ocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural).

[0066] Uma pessoa que é versada na técnica saberá quais as condições para se candidatar a condições de hibridação rigorosas e altamente rigorosas. A orientação adicional em relação a tais condições é prontamente disponível na técnica, por exemplo, em Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Har-bor Press, NY.; e Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY). Os termos "homologia" ou "porcentagem de identidade" são usados na presente invenção indiferentemente. Para a finalidade da presente invenção, define-se na presente invenção que, a fim de determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ópti-ma (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para um alinhamento óptimo com um segundo amino ou sequência de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada por meio do mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeos como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas por meio das sequências (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (isto é, posições de sobreposição x 100)). De preferência, as duas sequências são de mesmo comprimento.

[0067] A pessoa que é versada na técnica está ciente do fato de que vários diferentes programas de computador estão disponíveis para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e de determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a porcentagem de identidade entre as sequências de dois aminoácidos é determinada através do Needleman e Wunsch (J. Mol Biol (48): 444 a 453 (1970)) algoritmo que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível na internet como Accelrys em accelrys.com), usando uma matriz de Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um comprimento em peso de 1,2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa que é versada na técnica irá apreciar que todos esses parâmetros diferentes irão produzir resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem de identidade global de duas sequências não é alterada significativamente quando se usam diferentes algoritmos.

[0068] Em ainda outra modalidade, a porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível na internet como Accelrys em accelrys.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso do comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em uma outra modalidade, a porcentagem de identidade entre as sequências de nucleotídeos ou de dois aminoácidos é determinada usando o algoritmo de E.. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11 a 17 (1989), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) (disponível na Internet, no website da vega, mais especificamente ALIGN - IGH Montpellier, ou mais especificamente, http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade da lacuna de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade da lacuna de 4.

[0069] As sequências de ácidos nucleicos e de proteína da presente invenção podem ainda ser usadas como uma "sequência de busca" para realizar uma procura contra bases de dados públicas, por exemplo, identificando outros membros da família ou sequências rela- cionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas BLASTN e BLASTX (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 10. Pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para se obter as sequências de nucleotídeos homólogas com as moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Pesquisas BLAST de proteínas podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para se obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da presente invenção. Para obter alinhamentos em lacuna para fins de comparação, BLASTs em lacunas podem ser usados como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 a 3402. Quando se usa os programas BLAST e BLAST em lacuna, podem ser usados os parâmetros por defeito dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN). (Disponível na Internet no site do NCBI, por exemplo, em ncbi.nlm.nih.gov).

[0070] O termo "quimérico", tal como usado na presente invenção, significa composto por meio das sequências que são "recombinadas". Por exemplo, as sequências estão "recombinadas e não são encontradas juntas na natureza".

[0071] O termo "recombinar" como usado na presente invenção significa qualquer método de ligação de polinucleotídeos. O termo inclui uma junção de uma extremidade à outra, e a inserção de uma sequência para outra. O termo pretende abranger incluir as técnicas de união físicas, tais como a ligação adesiva da extremidade e a ligação das extremidades cegas. Tais sequências podem também ser artificialmente sintetizadas por via recombinante ou para conter as sequências recombinadas.

[0072] As plantas apropriadas para a presente invenção podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em flores, frutos, de planta, viveiro, relva e plantas ornamentais. Em uma outra modalidade, o fruto é selecionado de entre o grupo que consiste em amêndoa, maçã, abacate, banana, bagas (incluindo morango, mirtilo, de framboesa, amora, correntes e outros tipos de bagas), carambola, cereja, citrinos (incluindo as laranjas, limão, limão, tangerina, toranja, e outros citrinos), coco, figo, uva, goiaba, kiwi, manga, nectarina, melões (incluindo melão, melão, melancia, e outros melões), azeitona, mamão, maracujá, pêssego, pêra, caqui, abacaxi, ameixa e romã. Em uma outra modalidade, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em aspargos, beterraba (por exemplo beterraba sacarina e beterraba for-rageira), feijão, brócolis, couve, cenoura, mandioca, couve-flor, aipo, pepino, beringela, alho, pepino, folhas de verduras (alface, couve, espinafre e outras folhas verdes), alho-poró, lentilhas, cogumelos, cebola, ervilha, pimenta (por exemplo, pimenta doce, pimentão e pimenta), batata, abóbora, batata doce, feijão verde, squash e tomate. Em outra modalidade, o berçário da planta ou flor ou parte da flor é selecionado entre o grupo que consiste em respiração do bebê, cravo, dália, narciso, gerânio, gerbera, lírio, orquídea, peônia, laço da rainha Anne, rosa, snapdragon, ou outros cortes de flores ou flores ornamentais, flores em vasos, bolbos de flores, arbustos, árvores de folha transitivas ou coníferas.

[0073] O Ti plasmídeo - Em algumas modalidades, Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) deficiente em atividade de RecA compreende um Ti plasmídeo. O Ti plasmídeo (também conhecido como um plasmídeo auxiliar) compreende as regiões de vir necessárias para a produção e a transferência da região de T-DNA. Os plasmídeos Ti (por exemplo, pAL4404, pTiBo542, pTiC58 [e o comum pTi 15955 derivado], pTiAch5, ou um pTiChryõ) incluem, entre outras características genéticas, genes que sintetizam octopina, oncogenes, genes virulentos (a seguir genes vir), e sequências de extremidade T-DNA de repitição imperfeita que flanqueiam o T-filamento. A maioria dos plasmídeos Ti que são usados em cepas de Agrobacterium para a transformação da planta estão desarmados. Dessa maneira, as regiões de vir e de genes onc que estão localizadoas dentro do T-filamento de tipo selvagem, as cepas virulentas Agrobacterium foram removidas ou mutadas. No entanto, as extremidades de T-DNA permanecem, e são modificadas para incluir uma sequência de polinucleotídeos entre as extremidades de T-DNA direita e esquerda. Um Ti plasmídeo desarmado ainda é capaz de transformar um T-filamento dentro do DNA genômico da planta, mas o T-Filamento é modificado para reduzir ou remover as propriedades oncogênicas que são encontradas em um T-filamento do tipo selvagem e virulento. Em uma modalidade, um T-filamento do tipo selvagem e virulento que tenha sido modificado para reorganizar, mutação, apagar, adicionar, inverter, ou translocar uma sequência de po-linucleotídeo é referido na presente invenção como um derivado do Ti plasmídeo. Em uma modalidade, a região de T-DNA foi modificada para conter pelo menos um gene do cassete de expressão que expressam uma característica agronômica. Tais plasmídeos Ti-derivados, tendo genes vir funcionais e faltando todos ou substancialmente todos os da T-região e elementos associados são apresentados na presente invenção como uma modalidade.

[0074] Em modalidades posteriores, o plasmídeo é um Ti plasmídeo pTiBo542. Em uma modalidade, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pTiBo542 (Hood, EE; Helmer, GC; Fraley, RT;. Chilton, MD. A hipovirulência de Agrobacterium tumefaciens A281 é codificada na região de PtiB0542 fora do DNA-T J. Bacteriol 168: 1291 a 1301; 1986, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Em modalidades posteriores, o plasmídeo é um Ti plasmídeo pTiC58 (Holsters et al, The Functional Organization of the Nopali-ne A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid 3 (2); 212 a 230, 1980, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade) Em uma modalidade, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pTiC58. Em modalidades posteriores, o plasmídeo é um Ti plasmídeo pTiAchõ (Gielen, J.; De Beuckeleer, M.; Seurinck, J.; Debo-eck F.; De Greve H.; Lemmers, M.; Van Montagu M.; Schell J. The Complete Nucleotide Sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAchõ. The EMBO Journal 3 (4): 835 a 846; 1984, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade) Em uma modalidade, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pTiAchõ. Em modalidades posteriores, o plasmídeo é um Ti plasmídeo pTiChryõ (Kovacs LG; Pueppke SG Mapping and Genetic Organization of pTiChryõ, a Novel Ti Plasmid from a Highly Virulent Agrobacterium tumefaciens Strain, Mol Gen Genet 242(3): 327 a 336, 1994, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade). Em uma modalidade, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pTiChryõ. Em modalidades posteriores, o Ti plasmídeo é um plasmídeo pTi15995 (Barker, RF, polia, KB, Thompson, DV e Kemp JD, Nucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTi15955, Plant Mol. Biol. 2 (6), 335 a 350, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade). Em uma modalidade, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pTi 15995. Em uma outras modalidades, o Ti plasmídeo é um derivado de um plasmídeo pAL4404 (van der Serve et al, (2000) Plant Molec. Biol 43. 495 a 502, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade).

[0075] Vetor binário - Em algumas modalidades os Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) deficientes em atividade de RecA compreendem um vetor binário. Em outras modalidades, o segundo plasmídeo é um vetor binário. Exemplos não limitativos de vetores binários incluem; pBIN vetor binário (Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vetors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12: 8711 a 872, na presente invenção incorporados por meio de referência na sua totalidade), o vetor PGA binário (An G (1987) Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods Enzymol 153: 292 a 305 G, Watson BD, Stachel S, Graxon MP, EW Nester (1985) New cloning vehicles for transformation of higher plants. EMBO J 4: 277 a 284, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade), vetor SEV binário (Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB, Eichholtz DA, Flick JS, Fink CL, Hoffmann NL, Sanders PR (1985) The SEV system: a new disarmed Ti plasmid vetor system for plant transformation. Bio-technology (NY) 3: 629 a 635, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade), vetor pEND4K binário (Klee HJ, Yanofsky MF, EW Nester (1985) Os vetores para a transformação de plantas superiores. Biotechnology (NY) 3: 637 a 642, na presente invenção incorporado por meio de referência na sua totalidade), vetor pBI binário (Jefferson RA, Kavanagh TA, BevanMW (1987) GUS fusi-ons: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6:3901 a 3907, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pCIBIO binário (Rothstein SJ, Lahners KN, Lotstein RJ, Carozzi NB, Jayne SM, Rice DA (1987) Promoter cassettes, antibiotic-resistance genes, and vetors for plant transformation. Gene 53: 153 a 161, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pMRK63 binário (Vilaine F, Casse-Delbart F (1987) A new vetor derived from Agrobacterium rhizogenes plasmids: a micro-Ri plasmid and its use to construct a mini-Ri plasmid. Gene 55: 105 a 114, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pGPTV binário (Becker D (1990) Binary vectos which allow the exchange of plant selectable markers and repórter genes. Nucleic Acids Res 18: 203, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pCGN1547 binário (McBride KE, Summerfelt KR (1990) Improved binary vetors for Agrobacterium-mediated plant trans-formation. Plant Mol Biol 14: 269 a 276, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pART binário (Gleave AP (1992) A versatile binary vetor system with a T-DNA organizational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome. Plant Mol Biol 20: 1203 a 1207, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pGKB5 binário (Bouchez D, Camilleri C, Ca-boche M(1993) A binary vetor based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C R Acad Sei Ser III Sei Vie 316: 1188 a 1193, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pMJD80 binário (Day MJD, Ashurst JL, Dixon RA (1994) Plant expression cassettes forenhanced translational efficiency. Plant Mol Biol Rep 12: 347 a 357, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pMJD81 binário (Day MJD, Ashurst JL, Dixon RA (1994) Plant expression cassettes forenhanced translational efficiency. Plant Mol Biol Rep 12: 347 a 357, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pPZP binário (Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobac-terium binary vetors for plant transformation. Plant Mol Biol 25: 989 a 994, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pBINPLUS binário (van Engelen FA,Molthoff JW, Conner AJ, Nap JP, Pereira A, StiekemaWJ (1995) pBINPLUS: an improved plant transformation vetor based on pBIN19. Transgenic Res 4: 288 a 290, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pRT100 binário (Uberlacker B, Werr W (1996) Vetors with rarecutter restriction enzyme sites for expression of open reading frames in transgenic plants. Mol Breed 2: 293 a 295, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pCB binário (Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, Oliver DJ (1999) A mini binary vetor series for plant transformation. Plant Mol Biol 40: 711 a 717, incorporado na presente inven- ção por meio de referência), vetor pGreen binário (Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Muilineaux PM (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vetor for Agrobacteriummediated plant transformation. Plant Mol Biol 42: 819 a 832, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pPZP-RCS2 binário (Goderis IJWM, De BolleMFC, Francois lEJA.Wouters PFJ, BroekaertWF, Cammue BPA (2002) A set of modular plant transformation vetors al-lowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol Biol 50: 17 a 27, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pMDC binário (Curtis MD, Grossniklaus U (2003) A gateway clo-ning vetor set for highthroughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol 133: 462 a 469, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pRCS2 binário (Chung SM, Frankman EL, Tzfira T (2005) A versatile vetor system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sei 10: 357 a 361, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pEarleyGate binário (Earley KW, Haag JR, Pontes O, Opper K, Juehne T, Song K, Pikaard CS (2006) Gateway-compatible vetors for plant functional genomies and proteo-mies. Plant J 45: 616 a 629, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pGWTAC binário (Chen QJ, Zhou HM, Chen J, Wang XC (2006) A Gateway-based platform for multigene plant transformation. Plant Mol Biol 62: 927 a 936, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pORE binário (Coutu C, Bran-dle J, Brown D, Brown K, Miki B, Simmonds J, Hegedus DD (2007) pORE: A modular binary vetors series suited for both monocot and di-cot plant transformation. Transgenic Res 16: 771 a 781, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pSITE binário (Chakrabarty R, Banerjee R, Chung SM, Farman M, Citovsky V, Hoge-nhout SA, Tzfira T, Goodin M (2007) pSITE vetors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol Plant Microbe Interact 20: 740 a 750, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pMSP binário (Lee LY, Kononov ME, Bassuner B, Frame BR, Wang K, Gelvin SB (2007) Novel plant transformation ve-tors containing the superpromoter. Plant Physiol 145: 1294 a 1300, incorporado na presente invenção por meio de referência), vetor pCAM-BIA binário (http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vetors), e vetor pGD binário (MM Goodin, Dietzgen RG, Schichnes D, Ruzin s, AO Jackson (2002) pGD vetors: versatile tools for the expression of green and red fluorescent protein fusions in agroinfiltrated plant leaves. Plant J. 31: 375 a 383, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade). Vide, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Os vetores binários geralmente contêm um número de características importantes, tais como as sequências de extremidade de T-DNA, origens de replicação que são funcionais em ambas as cepas de Escherichia coli e Agrobacterium, os genes de resistência a antibióticos que são compatíveis com outros resistência aos antibióticos abrigados por plasmídeo PTI/pRi e/ou ge-noma Agrobacterium, e outros recursos que melhoram a eficiência de transformação de plantas (por exemplo, sequência esgotada). Outras características de vetores binários são conhecidas por meio daqueles que são versados na técnica, vide, por exemplo, Lee e Gelvin (2008) Plant Physiology, 146; 325 a 332 (aqui incorporado por meio de referência), que descreve muitas das características descritas acima dos plasmídeos/vetores binários.

[0076] Vetor ternário - Em algumas modalidades, Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) deficiente em atividade de RecA compreende um vetor ternário. Foi descrito um vetor "ternário", (ou seja, três plasmídeo) em que uma cópia do gene mutante constitutivo virGN54D de pTil5955 é corresidente em um plasmídeo derivado de pBBRI em cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que continha o Ti plasmídeo auxiliar desarmado pAL4404 e um vetor binário albergando os genes para a transformação de plantas. Vide van der Serve et al., (2000) Plant Molec. Biol. 43: 495 a 502, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Os exemplos não limitativos adicionais de um vetor ternário são descritos em maior detalhe no Pedido de Patente Européia N ° 2042602A1 e Pedido de Patente US N ° 2010/0132068A1, que descrevem os vetores binários de cosmídeos e plasmídeos "Booster", que, quando presente em uma célula de Agrobacterium abrigam um Ti plasmídeo auxiliar, constituem outros exemplos de sistemas plasmídicos ternários, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Finalmente, o Pedido de Patente Internacional No. 2012016222A2 descreve um sistema ternário de plasmídeo para uso em Agrobacterium, incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[0077] Plasmídeos - Em algumas modalidades, um plasmídeo compreendendo um gene de recA é uma modalidade da presente descrição. Os plasmídeos são atribuídos a grupos de incompatibilidade (designação genotípica: inc; grupo de designação: Inc) com base nas SEQuências contidas no plasmídeo. O determinante Inc tipicamente serve para impedir que outros plasmídeos do mesmo grupo de incompatibilidade ou relacionados coexistam a partir do mesmo hospedeiro, e ajuda a manter um certo número de cópias do plasmídeo na célula. Vide, por exemplo, Fernandez Lopez, et al. (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30: 942 a 66; e Adamczyk e Jagura Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50: 425 a 53. Dois plasmídeos são incompatíveis se for menos estável na presença do outro do que é por si só. A competição pelos recursos de células pode resultar quando dois plasmídeos do mesmo grupo de incompatibilidade são encontrados na mesma célula. Qualquer plasmídeo que seja é capaz de se replicar rapidamente, ou fome- ce alguma outra vantagem, será representado a um grau desproporcionado entre as cópias permitidas por meio do sistema de incompatibilidade. Surpreendentemente, os plasmídeos também podem ser incompatíveis quando ambos possuem as mesmas funções, para dividir-se em células filhas.

[0078] Os plasmídeos tipicamente caem em apenas um dos muitos grupos de incompatibilidade existentes. Há mais de 30 grupos de incompatibilidade conhecidos. Os plasmídeos pertencentes ao grupo de incompatibilidade RIPC têm sido estudados exaustivamente e um grande número de plasmídeos que derivam de este grupo IncP foram construídos (Schmidhauser et al (1988) Biotechnology 10: 287 a 332). Exemplos de plasmídeos que contêm o grupo de incompatibilidade RIPC incluem: pMP90RK, pRK2013, pRK290, pRK404, e pRK415. Estes plasmídeos podem ser mantidos em várias espécies bacterianas, incluindo E. coli e Agrobacterium tumefaciens. Exemplos de outros grupos de incompatibilidade incluem, mas não estão limitados a; INCN, IncW, INCL/M, INCT, incu, IncW, Incy, JIFE/O, IncFII, Incll, INCK, lncCom9, IncFI, IncFII, IncFIII, IncHII, lncHI2, IncX, INCA/C, InCD, IncFIV, IncFV/FO, IncFVI, IncHI 3, IncHII, Inc12, INCI, INCJ, INCV, IncQ, e similares, incluindo as variantes dos memsos, por exemplo, exibindo sequências substanciais ou relação funcional.

[0079] Além disso, um plasmídeo adequado usado para transformar as células de plantas usando os métodos descritos na presente invenção podem conter um gene marcador de seleção que codifica uma proteína que confere resistência às células da planta transformada a um antibiótico ou herbicida. O gene marcador de seleção usado individualmente pode, consequentemente, permitir a seleção de células transformadas ao mesmo tempo o crescimento de células que não contêm o DNA inserido pode ser suprimido por meio do composto seletivo. O(s) gene marcador de seleção determinado(s) usado(s) po- de(m) depender da concepção experimental ou de preferência, mas qualquer um dos seguintes marcadores de seleção pode ser usado, assim como qualquer outro gene que não são na presente invenção listados que poderíam funcionar como um marcador de seleção. Exemplos de marcadores de seleção incluem, mas não estão limitados a, genes que conferem resistência ou tolerância a antibióticos tais como canamicina, G418, higromicina, bleomicina e metotrexato, ou a herbicidas, tais como fosfinotricina (bialafos), glifosato, imidazolinonas, sulfonilureias, triazolopirimidinas, clorossulfuron, bromoxinil, e dalapon.

[0080] Cassetes de expressão de gene de codificação de Características agronômicos - Em modalidades posteriores, as células de plantas são selecionadas para regenerar as plantas a partir das referidas células. Em outras modalidades da presente descrição, o T-DNA contém um cassete de expressão do gene que codifica uma característica agronômica. Em modalidades adicionais, a característica agronômica produz um produto de base.

[0081] Em uma modalidade, a descrição refere-se à introdução de um ou mais cassetes de expressão de genes que são inseridos dentro do genoma da planta. Em algumas modalidades, os cassetes de expressão de genes compreendem uma sequência de codificação. A sequência de codificação pode codificar, por exemplo, um gene que confere uma característica agronômica. Em uma outras modalidades, a característica agronômica é selecionada a partir do grupo que consiste em um característica de resistência ao inseticida, característica de resistência à herbicida, característica da eficiência do uso de nitrogênio, característica da eficiência do uso de água, característica da qualidade nutricional, característica de ligação ao DNA, e característica do marcador de seleção. Em modalidades adicionais, as características agronômicas são expressas na planta. Uma modalidade da presente descrição inclui uma planta que compreende uma ou mais características agronômicas.

[0082] Em algumas modalidades, a planta transgênica compreende um cassete de expressão do gene. As técnicas de DNA e de clonagem molecular recombinante convencionais para o constructo de um cassete de expressão do gene, tal como usado na presente invenção são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Segunda Edição, Laboratório de Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); e por Silhavy et al, Experiments with Gene Fusi-ons, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1984).; e por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bio-logy, publicado por Greene Publishing Assoe, e Wiley Interscíence (1987).

[0083] Uma série de promotores que expressam de forma direta um gene em uma planta pode ser empregue em um cassete de expressão do gene. Tais promotores podem ser selecionados a partir de promotores constitutivos, quimicamente regulados, induzíveis, específicos de tecidos, e de semente preferida. O promotor usado para a expressão direta de um ácido nucleico depende da aplicação particular. Por exemplo, um forte promotor constitutivo adequado para a célula hospedeira é normalmente usado para a expressão e purificação das proteínas expressas.

[0084] Exemplos não limitantes de promotores de plantas preferidas incluem as sequências promotoras derivadas de A. thaliana ubi-quitina-10 (UBI-10) (Callis et al, 1990, J. Biol Chem, 265: 12486 a 12493); A. tumefaciens manopina sintase (Amas) (Petolino et al, Patente US No. 6.730.824.); (Verdaguer et al, 1996, Plant Molecular Bio-logy 31: 1129 a 1139) e/ou do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV). Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35S do vírus do núcleo mosaico da couve-flor (Odell et al (1985) Nature 313: 810 a 812); promotor de actina de Arroz (McElroy et al (1990) Plant Cell 2: 163 a 171.); promotor da ubiquitina de Milho (Patente US Número 5.510.474; Christensen et al (1989) Plant Mol Bi-ol 12: 619 a 632 e Christensen et al (1992) Plant Mol Biol 18: 675 a 689); promotor pEMU (Last et al (1991) Theor Appl Genet 81: 581 a 588); Promotor do ALS (Patente U.S. N 5.659.026); promotor de histo-na de Milho (Chabouté et al Plant Molecular Biology, 8: 179 a 191 (1987)); e similar.

[0085] Outros promotores de plantas úteis incluem tecido específico e promotores induzíveis. Um promotor induzível é um que é capaz de, direta ou indiretamente, ativar a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de DNA ou genes não serão transcritas. Tipicamente, o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento de regulação induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é então, direta ou indiretamente, convertida à forma ativa por meio do indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, de regulação do crescimento, herbicida ou fenólico composto ou uma cepa fisiológica diretamente aplicada pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente por meio da ação de um agente patogênico ou agente causador de doença, tais como um vírus. Tipicamente o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento de regulação induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é então, direta ou indiretamente, convertida à forma ativa por meio do indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, de regulação do crescimento, herbicida ou fenólico composto ou uma cepa fisiológica diretamente aplicada pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente por meio da ação de um agente patogênico ou agente causador de doença, tais como um vírus. Uma célula de planta que contém um elemento de regulação induzível pode ser exposta a um indutor aplicando-se o indutor externamente à célula ou planta, tal como por pulverização, rega, aquecimento ou métodos semelhantes.

[0086] Qualquer promotor induzível pode ser usado nas modalidades da presente descrição. Vide Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361 a 366 (1993). Exemplos de promotores indutiveis incluem os promotores do receptor da ecdisona (Patente US N ° 6.504.082); os promotores do sistema de ACE1 que respondem ao cobre (Mett et al, Proc Natl Acad Sei USA 90: 4567 a 4571 (1993)); gene In2-1 e ln2-2 do milho que respondem a fitoprotetores de benzenossulfonamida herbicidas (Patente US N ° 5.364.780; Hershey et al, Mol Gen. Genetics 227: 229 a 237 (1991) e Gatz et al, Mol Gen Genetics 243: 32 a 38 (1994)); re-pressor Tet de Tn10 (Gatz et al, Mol Gen. Genet 227: 229 a 237 (1991); ou os promotores de um gene de hormônio esteroide, a atividade de transcrição dos quais é induzida por meio de um hormônio glucocorticosteroide, Schena et al, Proc Natl Acad Sei EUA 88: 10421 (1991) e McNellis et al, (1998) Plant J. 14 (2): 247 a 257; o promotor de GST de milho, que é ativado por meio dos compostos eletrófilos hidrófobos que são usados como herbicidas pré-emergentes (vide a Patente US N °5.965.387 e o Pedido de Patente Internacional, Publicação N °WO 93/001294); e o promotor de tabaco PR- 1A, o qual é ativado por meio do ácido salicílico (vide Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescense Reproter System" Biosci Biotechnol Biochem 2011 setembro 23; 75 (9): 1796 a 800). Outros promotores regulados químicos de interesse incluem os promotores reprimíveis da tetraciclina e induzíveis de tetra-ciclina (vide, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229 a 237, e as Patentes U.S. 5,814,618 e 5,789,156).

[0087] Outros promotores de regulação de interesse incluem um elemento frio responsivo de regulação ou um elemento de regulação de choque de calor, a transcrição da qual pode ser efetuada em resposta à exposição ao frio ou de calor, respectivamente (Takahashi et al, Plant Physiol 99: 383 a 390, 1992); o promotor do gene de álcool-desidrogenase (Gerlach et al, PNAS EUA 79: 2981 a 2985 (1982); Walker et al, PNAS 84 (19): 6624 a 6628 (1987)), induzível por meio das condições anaeróbias; e o promotor induzível por luz derivado do gene ou do gene psaDb pea rbcS de ervilha (Yamamoto et al, (1997) Plant J. 12 (2): 255 a 265); um elemento de regulação induzível por luz (Feinbaum et al, Mol Gen. Genet 226: 449, 1991; Lam e Chua, Science 248: 471, 1990; Matsuoka et al (1993) Proc Natl Acad Sei EUA 90 (20): 9586 a 9590; Orozco et al (1993) Plant Mol Bio 23 (6): 1129 a 1138), um elemento de regulação induzível do hormônio da planta (Yamaguchi-Shinozaki et al, Plant Mol Biol. 15: 905, 1990; Kares et al, Plant Mol Biol 15: 225, 1990), e similares. Um elemento de regulação induzível pode também ser o promotor do gene de milho In2-1 ou In2-2, que responde aos fitoprotetores de benzenossulfonamida herbicidas (Hershey et al, Mol Gen. Gene 227: 229 a 237, 1991; Gatz et al., Mol Gen. Genet 243: 32 a 38, 1994), e o repressor Tet de transposão Tn10 (Gatz et al, Mol Gen. Genet 227: 229 a 237, 1991). Os promotores in-duzíveis de tensão incluem sal/promotores de induzíveis de tensão aquáticos, como P5CS (Zang et al, (1997) Plant Sciences 129: 81 a 89); promotores induzíveis frios, tais como, cor15a (Hajela et al, (1990) Plant Physiol 93: 1246 a 1252), cor15b (Wilhelm et al, (1993) Plant Mol Biol. 23: 1073 a 1077), (wsc1 ouellet et al, (1998) FEBS Lett 423 a 324-328), CI7 (Kirch et al, (1997). Plant Mol Biol 33: 897 a 909), CÍ21A (Schneider et al, (1997) Plant Physiol 113: 335 a 45);. promotores induzíveis secos, tais como TRG-31 (Chaudhary et al, (1996) Plant Mol Biol 30: 1247 a 57), rd29 (Kasuga et al, (1999) Nature Biotechnology 18: 287 a 291); promotores induzíveis, tais como osmóticos (Rab17 Vilardell et al, (1991) Plant Mol Biol 17: 985 a 93) e osmotina (Ra-ghothama et al, (1993) Plant Mol Biol. 23: 1117 a 1128); e promotores induzíveis ao calor, tais como proteínas de choque de calor (Barros et al, (1992) Plant Mol. 19: 665 a 75; Marrs et al (1993) Dev Genet 14: 27 a 41), (Waters smHSP et al, (1996) J. Experimental Botany. 47: 325 a 338), e o elemento induzível de choque de calor a partir do promotor da ubiquitina da salsa (WO 03/102198). Outros promotores induzíveis de tensão incluem rip2 (Patente US N °5.332.808 e US 2003/0217393 Publicação N °) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al, (1993) Mol Gen. Genetics 236: 331 a 340). Alguns promotores induzíveis são por ferimento, incluindo o promotor de Agrobacterium PMAS (Guevara-Garcia et al, (1993) Plant J. 4 (3): 495 a 505) e o promotor de Agrobacterium ORF13 (Hansen et al, (1997) Mol. Gen. Genet. 254 (3): 337 a 343).

[0088] Os promotores preferidos do tecido podem ser usados como alvo para o reforço da transcrição e/ou expressão em um tecido de planta em particular. Quando se refere à expressão preferencial, o que se quer dizer é expressão a um nível superior no tecido da planta particular, do que em outros tecidos da planta. Exemplos destes tipos de promotores incluem sementes de expressão preferidas, como a fornecida por meio do promotor de faseolina (Bustos et al., (1989) The Plant Cell vol. 1, 839 a 853), e o gene do milho de globulina-1 (Belanger et. al (1991) Genetics 129: 863 a 972). Para dicotiledôneas, os promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a, feijão β-faseolina, napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina, e similares. Para monocotiledôneas, os promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitadas a, milho zeína de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, γ-zeína, cerosos, encolhidos 1, encolhidos 2, de globulina 1, etc. Os promotores das sementes também preferidos incluem os promotores que oferecem a expressão direta do gene pre- dominantemente a tecidos específicos dentro da semente, tais como, por exemplo, o promotor preferencial de endosperma de γ-zeina, o promotor críptico de tabaco (Fobert et al., (1994) T-DNA tagging for a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4:. 567 a 577), o promotor do gene P a partir de milho (Chopra et al, (1996). Os alelos do gene P de milho com especificidades de tecidos distintos codificam as proteínas homólogas-Myb com as substituições de C-terminal. Plant Ceil 7: 1149 a 1158, Errata em Plant Cell.1997, 1: 109), o promotor da globulina-1 a partir de milho (Belenger e Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Glubulin-1 gene. Genetics 129: 863 a 972), e promotores de expressão direta para o revestimento da semente ou casco de grãos de milho, por exemplo, a glutamina sinte-tase do promotor específico do pericarpo (Muhitch et al, (2002). O isolamento de uma sequência promotora do Gene de Glutamina Sinte-tasei_2 capaz de conferir ao tecido específico a Expressão Gênica em transgênico de milho. Plant Science 163: 865 a 872).

[0089] Além do promotor, o cassete de expressão do gene (que pode ser, por exemplo, um vetor) contém tipicamente uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais necessários para a expressão do ácido nucleico nas células hospedeiras, procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico contém assim um promotor ligado operativamente a uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto gênico (por exemplo, uma proteína). O cassete de expressão do gene pode também incluir os elementos adicionais que são ligados de forma operacional de acordo com métodos conhecidos da técnica: sinais requeridos para a poliadenilação eficiente do transcrito, terminação da transcrição, locais de ligação ao ribossoma ou terminação da tradução. Além disso, o cassete de expressão pode incluir intensificadores e/ou sinais de fa-tiamento heterólogo.

[0090] Outros componentes do cassete de expressão de genes são proporcionados como modalidades. Os exemplos incluem os marcadores de seleção, como alvo ou sequências de regulação, sequências de peptídeos de trânsito, tais como a sequência do peptídeo de trânsito optimizado (vide Patente US No. 5.510.471), tais como as sequências de estabilização RB7 MAR (vide Thompson e Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687 a 692 e Publicação da Patente Internacional N ° WO9727207) ou as sequências líderes, íntrons etc. As descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de plantas e genes repórter podem ser encontrados em Gruber, et al, "Vetors for Plant Trans-formation", em Methods in Plant. Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press páginas 89 a 119 (1993). A seleção de um vetor de expressão apropriado irá depender do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão de genes, também vai incluir no terminal 3' da sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de terminação da transcrição e tradução funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a sequência de nucleotídeos do promotor de modalidades da presente invenção, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis do Ti plasmídeo de A. tu-mefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina-sintase e nopalina-sintase (NOS) (Depicker et al, Mol Appl Genet 1: 561 a 573 (1982) e Shaw et al (1984) Nucleic Acids Research 12, vol, 20, No. Páginas 7831 a 7846 (NOS)); vide também Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262: 141 a 144 (1991); Proudfoot, Cell 64: 671 a 674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5: 141 a 149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2: 1261 a 1272 (1990); Munroe et al. Gene 91: 151 a 158 (1990); Bailas et al., Nucleic Acids Res. 17: 7891 a 7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15: 9627 a 9639 (1987).

[0091] Os cassetes de expressão do gene podem conter, adicionalmente, as sequências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aumentar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, os líderes de picornavírus, líder de EMCV (região não codificante da encefalomiocardite 5'), Elroy-Stein et al., Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 86: 6126 a 6130 (1989); líderes poty-virus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Vírus) Carrington e Freed Journal of Virology, 64: 1590 a 1597 (1990), líder MDMV (vírus mosaico do milho anãos), Allison et al, Virology 154: 9 a 20 (1986); proteína de ligação da imunoglobulina humana de cadeia pesada (BiP), Mace-jak et al, Nature 353: 90 a 94 (1991); líder não traduzido a partir do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4), Jobling et al, Nature 325: 622 a 625 (1987); líder do vírus mosaico de tabaco (TMV), Gallie et al, (1989) Biologia Molecular do RNA, páginas 237 a 256.; e líder do vírus do milho mosqueado clo-rótico(MCMV) Lommel et al, Virology 81: 382 a 385 (1991). Vide também Della-Cioppa et al, Plant Physiology 84: 965 a 968 (1987).

[0092] O constructo do gene do cassete de expressão também pode conter sequências que aumentam a tradução e/ou estabilidade do mRNA, tais como íntrons. Um exemplo de um tal íntron é o primeiro íntron do gene da variante II da histona H3.III de Arabidopsis thaliana. Chaubet et al, Journal of Molecular Biology, 225: 569 a 574 (1992).

[0093] Naqueles casos em que é desejável que o cassete de expressão venha a expressar um produto do gene que é dirigido para um organelo particular, particularmente o plasto, amiloplasto, ou para o retículo endoplasmático, ou segregados na superfície da célula ou ex-tracelularmente, o kit de expressão pode ainda compreender uma sequência de codificação para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, peptídeo de trânsito para a proteína portadora de acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSP sintase de plantas e Helian-thus annuus (Patente US N ° 5.510.417), Zea mays Brittle-1 do peptí-deo de trânsito do cloroplasto (Nelson et al, Plant Physiol 117 (4): 1235 a 1252 (1998); Sullivan et al, Plant Cell 3 (12): 1337 a 1348; Sullivan et al, Plant (1995) 196 (3): 477 a 84; Sullivan et al, J. Biol Chem (1992) 267 (26): 18999 a 9004) e similares.. Além disso, os peptídeos de trânsito dos cloroplastos quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o peptídeo de trânsito optimizado (Patente US N °5.510.471). os peptídeos de trânsito dos cloroplastos adicionais foram descritos previamente nas Patentes US N °5.717.084 e Patente US No. 5.728.925. Uma pessoa que é versada na técnica apreciará de imediato as muitas opções disponíveis para expressar um produto para um organelo particular. Por exemplo, a sequência de alfa-amilase de cevada é frequentemente usada para dirigir a expressão para o retículo endoplasmático (Rogers, J. Biol Chem 260: 3.731 a 3.738 (1985)).

[0094] Será apreciado por meio de uma pessoa versada na técnica que o uso de tecnologias de DNA recombinante pode melhorar o controle da expressão de moléculas de ácido nucleico transformado por meio da manipulação, por exemplo, o número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeira, a eficiência com a qual as moléculas de ácido nucleico são transcritas, a eficiência com que as transcrições resultantes são traduzidas, e a eficiência de modificações pós-traducionais. Além disso, a sequência do promotor pode ser geneticamente modificada para melhorar o nível de expressão em comparação com o promotor nativo. As técnicas recombinantes úteis para controlar a expressão de moléculas de ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitadas a, a integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomas da célula hospedeira, a adição de sequências de estabilidade do vetor aos plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exem- pio, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinais de controle de tradução (por exemplo, ribossomas de locais de ligação, sequências Shine-Dalgarno ou Kozak), a modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de có-dons da célula hospedeira, e supressão de sequências que desestabi-lizam os transcritos.

[0095] Os genes repórter ou de marcação para a seleção de células transformadas ou tecidos ou partes de plantas ou plantas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores de seleção incluem aqueles que conferem resistência a anti-metabolitos, tais como herbicidas, ou antibióticos, por exemplo, di-hidrofolato redutase, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol (Life Sei Adv) 13: 143 a 149, 1994; vide também Herrera Estrella etal, Nature 303: 209 a 213, (1983); Meijer etal, Plant Mol Biol 16: 807 a 820, (1991)); neomicina fosfotransferase, que confere resistência à neomicina a aminoglicosídeos, kanamicina e paromicina (Her-rera-EstrelIa, EMBO J. 2: 987 a 995, 1983 e Fraley et al, Proc Natl Acad Sei EUA 80: 4803 (1983)) e higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32: 481 a 485, (1984); vide também Waldron et al, Plant Mol Biol 5: 103 a 108, (1985); Zhijian et al, Plant Science 108: 219 a 227, (1995)); trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc Natl Acad Sei, EUA 85: 8047, (1988)); isomerase de manose-6-fosfato, que permite que as células utilizem manose (Pedido de Patente Internacional WO 94/20627 N °); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, 2 (difluorometil)-DL ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Asper-gillus terreus, que confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci Biotechnol Biochem 59: 2336 a 2338, (1995)).

[0096] Os marcadores de seleção adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência a imi-dazolinona ou sulfonilureia (Lee et al, EMBO J. 7: 1241 a 1248, (1988)), um psbA mutante, que confere resistência ao atrazina (Smeda et al, Plant Physiol. 103: 911 a 917, (1993)), ou um mutante de proto-porfirinogênio oxidase (vide Patente US N °5.767.3 73), ou outros marcadores que conferem resistência a um herbicida, tais como glufosina-to. Exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam a resistência ao clo-ranfenicol (Herrera Estreila et al, EMBO J. 2:. 987 a 992, (1983)); es-treptomicina (Jones et al, Mol Gen. Genet 210: 86 a 91, (1987)); es-pectinomicina (Bretagne-Sagnard et al, Transgenic Res 5: 131 a 137, (1996)); bleomicina (Hille et al, Plant Mol Biol 7: 171 a 176, (1990)); sulfonamida; (Guerineau et al, Plant Mol Biol 15 127 a 136, (1990)) bromoxinil (Stalker et al, Science 242: 419 a 423, (1988).); glifosato (Shaw et al, Science 233: 478 a 481, (1986)); fosfinotricina (DeBlock et al, EMBO J. 6: 2513 a 2518, (1987)), e similares.

[0097] Uma opção para o uso de um gene seletivo é uma resistência de glufosinato que codifica DNA e em uma modalidade pode ser a fosfinotricina acetil transferase (PAT), gene pat de milho optimizado ou o gene bar sob o controle do promotor do vírus mosaico de nervura de mandioca. Estes genes conferem resistência a bialafos. Vide, (vide, Wohlleben et al, (1988) Gene 70: 25 a 37.); Graxon-Kamm et al, Plant Cell 2:. 603; 1990; Uchimiya et al, Biotecnologia. 11: 835, 1993; White et al., Nuci. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625 a 631, 1990; e Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219: 492, 1989). Uma versão do gene pat é o gene pat milho optimizado, descrito na Patente US No. 6.096.947.

[0098] Além disso, podem ser empregues os marcadores que faci- litam a identificação de uma célula de planta que contenha o polinu-cleotídeo que codifica o marcador. Os marcadores contáveis ou ras-treáveis são úteis, em que a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto, sem destruição da célula da planta. Exemplos incluem um β-glucuronidase, ou o gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, Patente U.S. Nos 5.268.463 e 5.599.670.); cloranfenicol-acetil-transferase (Jefferson et al A EMBO Journal vol 6 No. 13 páginas 3.901 a 3.907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é o beta-caroteno ou provitamina A (Ye et al, Science 287: 303 a 305 (2000)). O gene foi usado para melhorar a nutrição de arroz, mas neste caso é usado em vez de um marcador detectável, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada por meio da cor dourada fornecida. Ao contrário da situação em que o gene é usado para a sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para fins de marcação. Outros marcadores rastreáveis incluem os genes antocianinas/de flavonoides em geral (vide discussão no Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2: 115 a 127) incluindo, por exemplo, um gene R-local, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianinas (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellapor-ta et al, Chromossome Structure and Function, Kluwer Academic Pub-lishers, Appels e Gustafson eds, páginas 263 a 282 (1988));. Os genes que controlam a biossíntese dos pigmentos flavonoides, tais como o gene do milho C1 (Kao et al, Plant Cell (1996) 8: 1171 a 1179; Scheffler et al, Mol Gen. Genet (1994) 242: 40 a 48) e milho C2 (Wie-nand et al, Mol Gen. Genet (1986) 203: 202 a 207); o gene B (Chan-dler et al, Plant Cell (1989) 1: 1175 a 1183.), o gene p1 (Grotewold et al, Proc Natl Acad Sei EUA (1991) 88: 4587 a 4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76: 543 a 553; Sidorenko et al, Plant Mol Biol (1999) 39: 11 a 19); os genes do local de bronze (Ralston et al, Genetics (1988) 119: 185 a 197; Nash et al, Plant Cell (1990) 2 (11): 1039 a 1049), entre outros.

[0099] Outros exemplos de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) (Boite et al, (2004) J. Cell Science 117: 943 a 54 e Kato et al, (2002) Plant Physiol 129: 913 a 42), o gene da proteína fluorescente amarela (a partir de Evrogen PHIYFP™; vide Boite et al, (2004). J. Cell Science 117: 943 a 54); um gene lux, a qual codifica uma luciferase, a presença do qual pode ser detectada usando, por exemplo, filme de raios X, contagem de cintila-ção, espectrofotometria fluorescente, câmaras de vídeo de baixa luminosidade, câmaras de contagem de fótons ou luminometria com múltiplas cavidades (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8: 343); um gene da proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al, Plant J. (1995) 8 (5): 777 a 84); e DsRed2 onde as células de planta transformadas com o gene marcador são de cor vermelha, e, dessa maneira, visualmente de seleção (Dietrich et al, (2002) Biotechniques 2 (2): 286 a 293). Exemplos adicionais incluem um gene da beta-lactamase (Sutcliffe, Proc Natl Acad Sei EUA (1978) 75: 3737), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PA-DAC, uma cefalosporina cromogênico); um gene xylE (Zukowsky et al, Proc Natl Acad Sei EUA (1983) 80: 1101), que codifica uma dioxige-nase de catecol que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de a-amilase (Ikuta et al, Biotech (1990) 8: 241); e um gene de tirosi-nase (Katz et al, J. Gen. Microbiol (1983) 129: 2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona, que por sua vez se condensa para formar o composto melanina facilmente de-tectável. Claramente, muitos desses marcadores estão disponíveis e são conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[00100] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos do transgene que codifica um produto gênico em um cassete de expressão pode ser opcionalmente combinada com outra sequência de nucleotídeos de interesse no cassete e/ou na planta. Por exemplo, em certas modalidades, o transgene pode ser combinado ou "empilhado" com outra sequência de nucleotídeos de interesse, que proporciona uma resistência adicional ou tolerância ao glifosato ou um outro herbicida e/ou fornece a resistência para selecionar insetos ou doenças e/ou melhorias nutricionais, e/ou características agronômicas melhoradas e/ou proteínas ou outros produtos úteis em alimentos para animais, alimentos, industrial, farmacêutica ou para outros usos. O "empi-Ihamento" de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse dentro de um genoma de planta pode ser conseguido, por exemplo, através de reprodução convencional de plantas com dois ou mais casos de transformação, uma planta com umo constructo que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica, ou adição de novas características através da integração através de recombinação homóloga.

[00101] Tais sequências de nucleotídeos de interesse incluem, mas não estão limitadas a, os exemplos de genes ou sequências de codificação que conferem (1) resistência a pragas ou doença, (2) resistência a herbicidas, e (3) valor acrescentado às características fornecidas abaixo: 1. Genes ou sequências de codificação (por exemplo, iRNA) que conferem resistência a pragas ou doença [00102] (A) Genes de resistência a doenças da planta. As defesas da planta são muitas vezes ativadas por meio da interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (AVR) no fungo patogênico. Uma variedade de planta pode ser transformada com o gene de resistência clonado para engenharia de plantas que são resistentes a agentes patogênicos de cepas específicas. Exemplos de tais genes incluem, o gene Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al, 1994, Science 266: 789), o gene Pto de tomate, o qual codifica uma proteína-quinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al, 1993 Science 262: 1432), e o gene de Arabidopsis RSSP2 para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al, 1994 Cell. 78: 1089).

[00103] (B) uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado do mesmo, ou um polipeptídeo sintético modelado, tal como, uma sequência de nucleotídeos de um gene Bt δ-endotoxina (Geiser et al, 1986 Gene. 48: 109), e um gene vegetativo inseticida (VIP) (vide, por exemplo, Estruch et al, (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 5389 a 94). Além disso, as moléculas de DNA que codificam genes de ô-endotoxina podem ser compradas na American Type Culture Collec-tion (Rockville, Md.), Sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995e 31998.

[00104] (C) Uma lectina, tais como, as sequências nucleotídicas de vários genes de lectina de ligação a manose c(Van Damme et al, 1994 24 Plant Molec. Biol:. 825).

[00105] (D) Uma proteína, tal como homólogos de avidina e avidina que são úteis como larvicidas contra pragas de insetos de ligação da vitamina. Vide a Patente U.S. N °5.659.026.

[00106] (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor da protease ou um inibidor da amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de proteinase de cisteína de arroz (Abe et al, 1987, J. Biol Chem 262:16793), um inibidor de proteinase de tabaco I (Huub et al, 1993 Plant Molec Biol 21: 985), e um inibidor de α-amilase (Sumitani et al, 1993 Biosci Biotech Biochem. 57: 1243).

[00107] (F) Um hormônio específico de inseto ou feromonas tal co- mo um ecdiesteroide e uma variante do hormônio juvenil do mesmo, um respectivo com base em mimético, ou um antagonista ou um ago-nista do mesmo, tal como a expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil (Ham-mock et al, 1990 Nature 344: 458).

[00108] (G) Um peptídeo específico de insetos ou neuropeptídeo que, após expressão, perturba a fisiologia da praga afetadas (J. Biol Chem 269: 9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurética de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989), e específico inseto, neurotoxinas paralisantes (Patente US 5.266.361).

[00109] (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc, tal como um peptídeo insetotóxico de escorpião (Pang, (1992) Gene 116: 165).

[00110] (i) um enzima responsável por uma hiperacumulação do monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, um ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida.

[00111] (J) uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-tradução de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, de enzimas glicolíticas, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, um elastase, quitinase e glucanase, seja natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem, um gene calas (PCT publicado WO93/02197), as sequências que codificam quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, a partir de ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase de ancilóstomo de tabaco (Kramer et al., (1993) Insect Molec Biol 23: 691 (Kawalleck et al, (1993) 691), e o gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa Plant Molec. Biol 21: 673).

[00112] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem as sequências de nucleotídeos de clones de cDNA de calmodulina de feijão mung (Botella et al, (1994) Plant Molec. Biol 24: 757). E uma sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de milho (Griess et al, (1994) Plant Physiol 104: 1467).

[00113] (L) Um peptídeo momento hidrofóbico. Vide a Patente U.S. N °s 5.659.026 e 5.607.914.; este último ensina os peptídeos antimi-crobianos sintéticos que conferem resistência a doenças.

[00114] (M) Um permease da membrana, um canal anterior ou um bloqueador do canal, tal como um análogo de peptídeo lítico cecropi-na-β (Jaynes et al., (1993) Plant Sei. 89: 43) que torna as plantas de tabaco transgênicas resistentes aos Pseudomonas solanacearum.

[00115] (N) Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa dela derivada. Por exemplo, a acumulação de proteínas de revestimento viral em células de planta transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento da doença efetuada por meio do vírus a partir do qual o gene da proteína de revestimento é derivado, bem como por meio dos vírus relacionados. A resistência mediada pela proteína de revestimento foi conferida mediante as plantas transformadas contra o vírus do mosaico alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus do risco de tabaco, virus X da batata, virus Y da batata, vírus da gravura de tabaco, vírus do chocalho de tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Vide, por exemplo, Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopa-thol. 28: 451.

[00116] (O) um anticorpo específico do inseto ou uma imunotoxina derivada dos mesmos. Dessa maneira, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica no intestino do inseto pode inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al., (1994) Resumo # 497, Seventh lnt'l. O simpósio nas interações do micróbio da planta molecular mostra a inativação enzimática em tabaco trans-gênico através da produção de fragmentos de anticorpo de filamento único.

[00117] (P) Um anticporpo específico de vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki et al, (1993) Nature 266: 469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam os genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra o ataque de vírus.

[00118] (Q) Uma proteína arrestiva desenvolvida produzida na natureza por meio de um agente patogênico ou um parasita. Dessa maneira, endo cc-1,4-D poligalacturonases fúngicas facilita a colonização fúngica libertação de nutrientes de plantas através da solubilização da parede celular da planta homo-a-1,4-D-galacturonase (Lamb et al, (1992) Bio/Technology 10: 1436). A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora de endopoligalacturonase de feijão é descrita por (Toubart et al, (1992) Plant J. 2: 367).

[00119] (R) Uma proteína arrestiva desenvolvida produzida na natureza por meio de uma planta, tal como o gene inativador de ribossoma de cevada, que fornece uma maior resistência à doença fúngica (Lon-gemann et al, (1992) Bio/Technology 10: 3305).

[00120] (S) RNA de interferência, em que um polinucleotídeo de DNA que codifica uma molécula de RNA é usado para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA, em um exemplo, é parcialmente ou totalmente de filamento duplo, o que desencadeia uma resposta de silenciamento, resultando em divagem do dsRNA em pequenos RNA interferentes, que são em seguida incorporados em um complexo de direcionamento que destrói os mRNAs homólogas. Vide, por exemplo, Fire et al, Patente US N °6.506.559.; Graham et al., Patente U.S. No. 6.573.099. 2. Os genes ou sequências de codificação que conferem resistência a um herbicida [00121] (A) Os genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a ponto ou meristema em crescimento, tal como um imidazalinona, sulfonanilida ou herbicida de sulfonilureia. Genes exemplificativos neste código de categoria para uma enzima ALS mutante (Lee et al, (1988) EMBOJ 7: 1241), que também é conhecida como enzima AHAS (Miki et al, (1990) Theor Appl Genet 80: 449).

[00122] (B) Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato conferida pelos genes de EPSP sintase e aroA mutantes, ou através de inativação metabólica por genes, tais como GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono tais como glufosinato; ácidos ariloxifeno-xipropiônicos (genes de codificação do inibidor ACCase) e ciclohexa-nodionas (genes pat e bar DSM-2). Vide, por exemplo, Patente USN ° 4.940.835, que descreve a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida na instituição ATCC com o Número de Acesso 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é descrita na Pat. U.S. No. 4.769.061. O pedido de patente europeia n °0 333 033 e Patente US No. 4.975.374 descrevem as sequências de nucleotídeos dos genes de glutamina sinte-tase que conferem resistência a herbicidas, tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de acetil-transferase de fos-finotricina é fornecida no pedido de Patente Europeia N °0 242 246. Greef et al., (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam os genes quiméricos bar que codificam para a atividade fosfinotricina acetil transferase. Exemplos de genes de resistência aos ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclohexanodi-onas, tais como setoxidim e haloxifope, são os genes Accl-S1, S2 e Accl-Accl-S3 descritos por Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83: 435.

[00123] (C) Os genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tais como uma triazina (genes psbA e gs+) e um benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla et al, (1991) Plant Cell 3:. 169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam os genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. As sequências de nucleotídeos para os genes de nitrilase na Patente US N ° 4810648, e as moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis na ATCC com os números de acesso 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codifica para uma glutationa-S-transferase é descrita por Hayes et al., (1992) Biochem. J. 285: 173.

[00124] (D) Os genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga a hidroxifenilpiruvato (HPPD dioxigenases), enzimas que catalisam a reação em que para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isto inclui herbicidas, tais como isoxazóis (Patente Européia N ° 418175, Patente Européia No. 470.856, a Patente Européia No. 487.352, a Patente Européia N ° 527036, Patente Européia No. 560.482, a Patente Européia No. 682.659, Patente US N ° 5.424.276), em particular, isoxaflutol, que é um herbicida seletivo do milho, dicetonitrilas (Patente Européia N ° 496630, e na Patente Européia No. 496.631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropi!-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2fenil)propano-1,3-diona, tricetonas (Patente Européia N ° 625.505, Patente Européia No. 625.508, Patente US No. 5.506.195), em particular a sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz um excesso de HPPD nas plantas pode proporcionar resistência ou tolerância a esses herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos na Patente U.S. N °s. 6.268.549 e 6.245.968 e na Patente dos Estados Unidos No. de publicação 20030066102.

[00125] (E) Os genes que codificam a resistência ou tolerância a herbicidas da auxina fenóxi, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (AAD-1), descrito na Patente US No. 7.838.733.

[00126] (F) Os genes que codificam a resistência ou tolerância a herbicidas da auxina fenóxi, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas da auxina, piridilóxi, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (AAD-12), descrito no documento WO 2007/053482 A2.

[00127] (G) Os genes que codificam resistência ou tolerância a di-camba (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. de publicação 20030135879).

[00128] (H) Os genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a oxidase de protoporfirinogênio (PPO) (vide Patente US N °5.767.373).

[00129] (I) Os genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (tal como atrazina) e derivados de ureia (tal como diuron) herbicidas que se ligam às proteínas do núcleo dos centros reacionais fotossistema II (PS II) (vide Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8 (4): 1237 a 1245. 3. Genes que conferem ou contribuem para uma característica de adição de valor [00130] (A) Metabolismo de ácidos graxos modificados, por exemplo, por meio da transformação de milho ou Brassica com um gene antissenso ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 89: 2624.

[00131] (B) Diminuição do conteúdo de fitato.

[00132] (1) Introdução de um gene que codifica fitase, tal como o gene fitase Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al, (1993) Gene 127: 87), aumenta a desagregação de fitato, adicionando mais fosfato livre para a planta transformada.

[00133] (2) Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. No milho, este, por exemplo, pode ser conseguido por meio da clonagem e depois reintroduzindo o DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho, caracterizado por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al, (1990) Maydica 35: 383).

[00134] (C) Composição de carboidratos de modificação efetuada, por exemplo, por meio da transformação de plantas com um gene que codifica para uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem, gene frutosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza et al, (1988) J. Bacteriol 170: 810), gene levansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al, (1985) Mol Gen. Genel 200: 220), α-amilase Bacillus licheniformis (Pena et al, (1992). Bio/Technology 10: 292), os genes do tomate invertase (Elliot et al, (1993), gene amilase de cevada (Sogaard et al, (1993) J. Biol. Chem 268: 22480), e enzima de ramificação de amido do endosperma de milho II (Fisher et al, (1993). Plant Physiol 102: 10450).

[00135] Produtos de base - Em outras modalidades da presente descrição, a planta transgênica produz um produto de base. Em uma modalidade, o produto de base é selecionado a partir do grupo que consiste em concentrado de proteína, isolado de proteína, grão, farelo, farinha de trigo, óleo, ou de fibra.

[00136] Um produto de base refere-se a qualquer produto que é composto de material derivado de uma planta ou semente de planta e é vendido ao consumidor. As plantas cultivadas são a maior fonte de proteínas, carboidratos e óleo da planta para consumo. As plantas transgênicas podem ser usadas para a fabricação de produtos de ba- se. As plantas e/ou sementes de plantas podem ser transformadas em farinha, farinha ou óleo, bem como ser usadas como uma fonte de proteínas ou de óleo em alimentos para animais para ambos os animais terrestres e aquáticos. Os feijões de soja e óleos de soja podem ser usados na fabricação de muitos produtos diferentes, mas não limitados a, todo ou sementes transformadas, alimentação animal, óleo da planta, refeição, farinha, plásticos não tóxicos, tintas de impressão, lubrificantes, ceras, fluidos hidráulicos, transformador elétrico líquido, solventes, cosméticos, produtos para o cabelo, natto, tempeh, concentrado protéico, proteína isolada, proteína texturizada e hidrolisada e bio-diesel.

[00137] Classificação de plantas - Em modalidades adicionais, o assunto refere-se a uma planta transgênica, em que a planta está selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledônea. Em uma outras modalidades, a descrição refere-se ao assunto das plantas comestíveis, incluindo as plantas de cultura e as plantas usadas para os seus óleos, proteínas ou carboidratos. Deste modo, qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada como descrito mais abaixo.

[00138] Em algumas modalidades, as plantas que são geneticamente modificadas de acordo com a presente invenção (por exemplo, células hospedeiras de planta) incluem, mas não estão limitadas a, todas as plantas superiores, incluindo ambas as plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas e as plantas particularmente consumíveis, incluindo as plantas de cultura. Tais plantas podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo: alfafa, soja, algodão, colza (também descrito como canola), sementes de linho, milho, arroz, Brachiaria, trigo, saf-flowers, sorgo, beterraba sacarina, girassol, tabaco e gramíneas. Deste modo, qualquer espécie de planta ou célula da planta pode ser selecionada. Em modalidades, as células de plantas usadas na presente invenção, e as plantas cultivadas ou derivadas a partir das mesmas, incluem, mas não estão limitadas a, células que podem ser obtidas a partir de sementes de colza (Brassica napus)·, mostarda indiana (Bras-sica juncea); Mostarda Etíope (Brassica carinata)', nabo (Brassica rapa)·, repolho (Brassica oieracea)', soja (Glycine max)\ linhaça (Linum usitatissimum); milho (também descrito como milho) (Zea mays)', cár-tamo (Carthamus tinctorius)', girassol (Helianthus annuus)·, tabaco (Ni-cotiana tabacum)·, Arabidopsis thaliana; Castanha do Brasil (Betholettia excelsa); mamona (Ricinus communis)', coco (Cocus nucifera)', coentro (Coriandrum sativum)·, algodão (Gossypium spp.); amendoim (Arachis hypogaea)·, jojoba (Simmondsia chinensis); óleo de palma (Elaeis gui-neeis)·, oliveira (Olea eurpaea)', arroz (Oryza sativa)', abóbora (Cucurbi-ta maxima)·, cevada (Hordeum vulgare); cana de açúcar (Saccharum officinarum)·, arroz (Oryza sativa)', trigo (Triticum spp incluindo Triticum durum e Triticum aestivum.); e lentilha (Lemnaceae sp.). Em algumas modalidades, o fundo genético dentro de uma espécie de planta pode variar.

[00139] Os ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir as características desejadas essencialmente em qualquer planta. Uma grande variedade de plantas e sistemas celulares de plantas podem ser manipulados para as características fisiológicas e agronômicas desejadas na presente invenção descritas usando os constructos de expressão do gene da presente invenção e os vários métodos de transformação mencionados acima. Em modalidades, as plantas alvo e as células de plantas para a engenharia incluem, mas não estão limitadas a, aquelas plantas monocotiledô-neas e dicotiledôneas, tais como culturas, incluindo culturas de cereais (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), culturas de frutas (por exemplo, tomate, maçã, pêra, morango, laranja), culturas de for-rageiras (por exemplo, alfafa), hortaliças de raiz (por exemplo, cenou- ra, batata, beterraba, inhame), hortaliças folhosas (por exemplo, alface, espinafre); plantas com flores (por exemplo, petúnia, Rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinho abeto, abetos); plantas usadas na fitoterapia (por exemplo, plantas acumulando metal pesado); oleaginosas (por exemplo, de girassol, de colza) e plantas usadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Dessa maneira, os métodos e composições descritos têm uso, ao longo de uma ampla variedade de plantas, incluindo, mas não limitado a, espécies dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna, e Zea mays.

[00140] De acordo com outros aspectos do assunto da descrição, os sistemas, composições e métodos descritos na presente invenção referem-se a uma célula de planta ou planta transgênica. Em outras modalidades, a célula da planta ou planta transgênica é produzida fazendo contactar as células de planta com uma cepa A. tumefaciens (LBA4404) deficiente em atividade de RecA.

[00141] Os ensaios in vitro - Em uma modalidade, o assunto da descrição refere-se a um ensaio in vitro para avaliar a atividade de RecA dentro da cepa de A. tumefaciens (LBA4404). Vários ensaios in vitro são conhecidos por meio daqueles que são versados na técnica. Vários métodos exemplares são ainda mais descritos abaixo.

[00142] Os sinais moleculares têm sido descritos para uso em detecção de sequências. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotí-deo FRET é concebida que se sobrepõe ao flanqueamento genômico e a junção de inserção de DNA. A estrutura única da sonda FRET resulta na mesma contendo uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de têmpera em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA e um inserto na sequência genômica flanqueadora) se sucederam na presença de uma polimerase termostável e os dNTP. Após amplificação por PCR bem sucedida, a hibridação da(s) sonda(s) de FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e a separação espacial da fluorescência e porções de têmpera. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência que flanqueia ain-serção genômica/transgene devido à amplificação e hibridação bem sucedida. Tal ensaio molecular para a detecção como uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.

[00143] A hidrólise do ensaio de sonda, de outra forma conhecida como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.) é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é concebida com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica flanqueadora para a detecção de casos específicos. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA e um inserto na sequência genômica flanqueadora) se sucederem na presença de uma polimerase termostável e os dNTP. A hibridação da sonda FRET resulta na divagem e na libertação do grupo fluorescente de distância a partir da porção de têmpera da sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção de flanqueamen-to/transgene devido à amplificação e hibridação bem sucedida. Tal ensaio de sonda de hidrólise como para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.

[00144] Os ensaios KASPar® são um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Resumidamente, a amostra de DNA genômico compreendendo o polinucleotídeo do cassete de expressão gene integrado é peneirado usando um ensaio com base na reação em cadeia da polimerase (PCR) conhecida como um sistema de ensaio KASPar®. O ensaio KASPar® usado na prática da presente descrição pode usar uma mistura de ensaio KASPar® PCR que contém múltiplos iniciadores. Os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciadore direto e pelo menos um iniciador reverso. O iniciador direto contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA, e o iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Além disso, os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um dos iniciadores diretos e pelo menos um iniciador reverso. Por exemplo, a mistura de ensaio KASPar® PCR pode usar dois iniciadores diretos, correspondente a dois alelos diferentes e um iniciador reverso. Um dos iniciadores diretos contém uma sequência correspondente à região específica da sequência genômica endógena. O segundo iniciador direto contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA. O iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Tal ensaio KASPar® para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente descrição.

[00145] Em algumas modalidades o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em um corante HEX fluorescente, um corante FAM fluorescente, um corante JOE fluorescente, um corante TET fluorescente, um corante Cy 3 fluorescente, um corante Cy 3,5 fluorescente, um corante Cy 5 fluorescente, um corante Cy 5,5 fluorescente, um corante Cy 7fluorescente, e um corante ROX fluorescente.

[00146] Em outras modalidades, a reação de amplificação é executada usando um segundo corante de DNA fluorescente adequado que é capaz de corar o DNA celular a uma gama de concentrações detec-táveis por meio da citometria de fluxo, e têm um espectro de emissão fluorescente que é detectável por meio de um termociclador em tempo real. Deve ser apreciado por meio daqueles que são versados na técnica que outros corantes de ácidos nucleicos são conhecidos e estão continuamente a serem identificados. Qualquer corante de ácido nu-cleico adequado com excitação apropriada e espectros de emissão podem ser empregues, tal como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYT011®, SYT012®, SYT013®, BOBO®, YOYO®, e TO-TO ®. Em uma modalidade, um segundo corante de DNA fluorescente é SYT013® usado em menos do que 10 uM, menos do que 4 um, ou menos do que 2,7 uM.

[00147] Em modalidades adicionais, a sequenciamento de Próxima Geração (NGS) pode ser usada para detecção. Tal como descrito por Brautigma et al., 2010, a análise da sequência de DNA pode ser usada para determinar a sequência nucleotídica do fragmento isolado e amplificado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e sub-clonados em um vetor e sequenciados usando o método de terminador de cadeia (também referido como o sequenciamento de Sanger) ou a sequenciamento do terminador de corante. Além disso, o fragmento amplificado pode ser sequenciado com o sequenciamento de Próxima Geração. As tecnologias NGS não requerem a etapa de subclonagem, a sequenciamento e várias leituras podem ser completadas em uma única reação. Três plataformas de NGS estão disponíveis comercialmente, Genome Sequencer FLX ™ da 454 Life Sciences/Roche, a lllumina Genome Analyzer ™ da Solexa e Applied Biosystems ' SO-LiD™ (sigla para: ' Sequenciamento por meio da Ligação e Detecção de oligo '). Além disso, existem dois métodos de sequenciamento de moléculas individuais que estão atualmente a ser desenvolvidos. Estes incluem o verdadeiro Sequenciamento de molécula única (TSMS) de Helicos Bioscience ™ e o sequenciamento em Tempo real de molécula única ™ (SMRT) da Pacific Biosciences.

[00148] Sequencher Genoma FLX ™ que é comercializado por 454 Life Sciences/Roche é um NGS de leitura longa, que usa a emulsão PCR e o pirossequenciamento para gerar a leitura de sequenciamento. Os fragmentos de DNA de 300 - 800 pb ou as bibliotecas contendo fragmentos de 3 - 20 kpb podem ser usados. As reações podem produzir mais de um milhão de leitura sobre 250 a 400 bases por ensaio para um rendimento total de 250 a 400 megabases. Esta tecnologia produz a mais longa leitura, mas a produção total da sequência por execução é baixa em comparação com outras tecnologias de NGS.

[00149] lllumina Genoma Analyser ™ que é comercializado por So-lexa ™ é um NGS de leitura curta que usa o sequenciamento por meio do método de síntese com nucleotídeos terminadores fluorescentes reversíveis marcados com corante e baseia-se na ponte PCR em fase sólida. O constructo de bibliotecas de sequenciamento de extremidade emparelhada contendo os fragmentos de DNA de 10 kb até pode ser usado. As reações produzem mais de 100 milhões de leitura curta que são 35 a 76 bases de comprimento. Estes dados podem produzir a partir de 3 a 6 gigabases por execução.

[00150] O sequenciamento pelo sistema de Detecção e Ligação de Oligo (SOLiD) comercializado pela Applied Biosystems ™ é uma tecnologia de leitura curta. Esta tecnologia NGS usa DNA de filamento duplo fragmentado, que são até 10 kbp de comprimento. O sistema usa o sequenciamento por meio da ligação de iniciadores de oiigonu-cleotídeos marcados com corante e emulsão de PCR para gerar um bilhão de leitura curta que resulta em uma potência total da sequência de até 30 gigabases por execução.

[00151] tSMS de Helicos Bioscience™ e SMRT da Pacific Bioscien-ces ™ aplicam um método diferente que usa moléculas de DNA de filamento simples para as reações de sequência. O sistema TSMS Helicos ™ produz até 800 milhões de leitura curta que resultam em 21 gigabases por execução. Estas reações são concluídas usando nucle-otídeos de terminadores virtuais marcados com corantes fluorescentes que são descritos como uma abordagem de "sequenciamento por síntese".

[00152] O sistema de Sequenciamento de Próxima geração SMRT comercializado por Pacific Biosciences ™ usa um sequenciamento em tempo real através de síntese. Esta tecnologia pode produzir as leituras de até 1.000 pb de comprimento, como resultado de não ser limitado por meio dos terminadores reversíveis. A leitura de rendimento bruto que é equivalente para a cobertura de uma dobra de um genoma humano diploide pode ser produzida por dia, usando esta tecnologia.

[00153] Em outra modalidade, a detecção pode ser concluída usando ensaios de manchamento, incluindo Western blots, Northern blots, e Western Southern. Tais ensaios de manchamento são técnicas vulgarmente usadas em investigações biológicas para a identificação e quantificação de amostras biológicas. Estes ensaios incluem primeiro a separação dos componentes da amostra em géis por meios eletrofo-réticos, seguido por meio da transferência dos componentes separados eletroforeticamente do gel para transferir as membranas que são feitas de materiais tais como nitrocelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), ou náilon. Os analitos podem também ser diretamente manchados nestes suportes ou dirigidos a regiões específicas sobre os suportes por meio da aplicação a vácuo, a ação capilar, ou pressão, sem separação prévia. As membranas de transferência são então normalmente submetidas a um tratamento de pós-transferência para aumentar a capacidade dos analitos a serem distinguidos uns dos outros e detectados, quer visualmente ou por meio dos leitores automáticos.

[00154] Em uma outra modalidade a detecção pode ser efectuada usando um ensaio ELISA, que usa um imunoensaio enzimático de fa- se sólida para detectar a presença de uma substância, normalmente um antigênio, em uma amostra líquida ou amostra úmida. Os antigéni-os da amostra são ligados a uma superfície de uma placa. Em seguida, um novo anticorpo específico é aplicado sobre a superfície, de modo que se pode ligar ao antigênio. Este anticorpo é ligado a uma enzima, e, no passo final, uma substância contendo o substrato da enzima é adicionado. A reação subsequente produz um sinal detectável, mais geralmente uma alteração de cor no substrato.

[00155] Transformação - a transformação de células hospedeiras A. tumefaciens LBA (4404) com o(s) vetor(s) descrito(s) na presente invenção pode ser realizada usando qualquer metodologia de transformação conhecida na técnica, e as células hospedeiras bacterianas podem ser transformadas em células intactas ou como protoplastos (ou seja, incluindo citoplastos). Metodologias de transformação exem-plificativas incluem "metodologias formadores de poros, por exemplo, eletroporação, fusão de protoplastos, conjugação bacteriana, e tratamento de cátions bivalentes (tratamento ou cloreto de cálcio CaCI2 ou tratamento CaCI2/Mg2+), ou outros métodos bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, J. Bact, 132:. 349 a 351 (1977); Clark-Curtiss Curtiss &, Methods in Enzymology, 101: 347 a 362 (Wu et al, eds,) 1983, Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed 1989.); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Au-subel et al., eds., 1994)). Outros métodos de transformação conhecidos específicos são descritos por Guérout-Fleury, AM, Frandsen, N. e Stragier, P. (1996). Os plasmídeos para integração ectópica em Baci-llus subtilis. Gene 180 (1-2), 57 a 61.

[00156] Integração do local - as modalidades da presente invenção incluem os métodos para a identificação e integração de um fragmento de polinucleotídeo dentro de um local genômico de A. tumefaciens (LBA4404). A integração dentro do local genômico recA, ou dentro dos fragmentos de polinucleotídeos diretamente a jusante ou a montante do local genômico recA está proporcionada na presente invenção. O local genômico para integrar o fragmento de polinucleotídeo é proporcionado como SEQ ID NO: 11. Aquelas pessoas que são versadas na técnica apreciarão que a variação alélica de uma sequência de polinucleotídeo genômico descrita pode ser observada dentro de SEQ ID NO: 11 de A. tumefaciens (LBA4404). Por conseguinte, a descrição refere-se a uma sequência polinucleotídica com 80 %, 82,5 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 99 %, 99,5 % ou 99,9 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[00157] Outras modalidades da presente invenção podem incluir a integração de um polinucleotídeo no genoma de A. tumefaciens (LBA4404) no local genômico recA, e o empilhamento subsequente de um segundo polinucleotídeo, no mesmo local. Em que, o local genômico dentro do genoma de A. tumefaciens (LBA4404) é usado como um local de preferência para introduzir os polinucleotídeos adicionais. Em uma modalidade, qualquer local dentro de SEQ ID NO: 11 serve como um local de integração neutro para a integração de um polinucleotídeo para o genoma de A. tumefaciens (LBA4404).

[00158] Outras modalidades da presente invenção podem incluir a integração de um polinucleotídeo contendo um cassete de expressão do gene para o genoma de A. tumefaciens (LBA4404) no local genômico recA, e a remoção subsequente de um cassete de expressão do marcador de seleção integrado do polinucleotídeo. Em que, o método usado para remover o cassete de expressão do marcador de seleção é um cruzamento duplo ao longo do método, usando um método de excisão-CRE LOX, usando um método de excisão FLP-FRT, ou um método de excisão, usando o kit RED/ET RECOMBINATION® (Gene-bridges, Heidelberg, Alemanha), além de outros métodos de excisão conhecidos na técnica.

[00159] Outras modalidades da presente invenção podem incluir a integração de um polinucleotídeo no genoma de A. tumefaciens (LBA4404) no local genômico recA como uma alternativa ao uso de plasmídeos estranhos replicantes. Em que, um ou mais plasmídeos estranhos replicantes são incompatíveis devido à presença de origens semelhantes ou replicação, grupos de incompatibilidade, marcador de seleção redundante, ou outros elementos de genes. Em que, um ou mais plasmídeos estranhos não replicantes são funcionais em A. tumefaciens (LBA4404) devido à especificidade do sistema de modificação de restrição de A. tumefaciens (LBA4404). Em que, um ou mais plasmídeos estranhos replicantes não estão disponíveis, ou facilmente transformáveis funcionais dentro do genoma de A. tumefaciens (LBA4404).

[00160] Outras modalidades da presente invenção podem incluir os métodos para aumentar a eficiência de recombinação homóloga em uma célula procariótica. Os métodos que se apoiam sobre a recombinação homóloga mediada por enzimas introduzidas, tais como 're-combinantes' vermelho lambda e abordagens análogas são úteis em um número limitado de classes de bactérias, especialmente Escheri-chia (Datsenko e Wanner (2000) Proc Natl Acad Sei US A. 97: 6640 a 5) e Salmonella. Os métodos que se apoiam sobre a recombinação específica do local mediado por enzimas introduzidas, tais como inte-grases de fagos, FLP/FRT ou Cre/loxP, também podem ser usados, mas são dependentes da presença de locais pré-existentes dentro do DNA alvo (Wirth et al (2007) Current Opinions in Biotecnology 18, 411 a 419). Métodos alternativos exploram os vírus ou elementos móveis, ou seus componentes (por exemplo, fagos, transposons ou íntrons móveis).

[00161] No entanto, os métodos que suportam a recombinação ho- móloga mediada pelo hospedeiro são, de longe, o tipo mais comumen-te usado de modificações no DNA cromossômico. Em uma aplicação típica microbiana de recombinação homóloga mediada por hospedeiro, um plasmídeo com uma região única de identidade de sequência com o cromossoma é integrado no cromossoma por meio da integração de um único cruzamento, por vezes referido como "a integração do tipo Campbell Depois de um tal caso, os genes introduzidos no plasmídeo são replicados como parte do cromossoma, o que pode ser mais rápido do que a replicação do plasmídeo. Dessa maneira, o crescimento em um meio de seleção com um gene marcador de seleção de origem de plasmídeo pode fornecer uma pressão seletiva para a integração. A integração do tipo Campbell pode ser usada para inativar um gene cromossômico através da colocação de um fragmento interno de um gene de interesse no plasmídeo, de modo que depois da integração, o cromossoma não irá conter uma cópia de comprimento total do gene. O cromossoma de uma célula integrante do tipo Campbell não é estável, porque o plasmídeo integrado é flanqueado por meio das sequências homólogas que dirigem a integração. Um outro acontecimento de recombinação homóloga entre estas sequências conduz à excisão do plasmídeo, e a reversão do cromossoma com o tipo selvagem. Por esta razão, pode ser necessário manter a seleção para o gene marcador de seleção de origem de plasmídeo para manter o clone integrante.

[00162] Um aperfeiçoamento do método básico de integração de cruzamento único de modificação cromossômica é duplamente cruzado em relação à recombinação homóloga, também referida como a troca alélica, que envolve dois casos de recombinação. O alelo modificado desejado é colocado em um plasmídeo flanqueado por meio das regiões de homologia com as regiões que flanqueiam o alelo alvo no cromossoma ('braços de homologia '). Um primeiro caso de integração pode ocorrer em qualquer um dos pares de braços de homologia, que conduz à integração do plasmídeo no cromossoma da mesma maneira como a integração do tipo Campbell. Após o primeiro caso de cruzamento, o cromossoma contém dois conjuntos alternativos de sequências homólogas que podem dirigir um segundo caso de recombinação. Se as mesmas sequências que dirigiram o primeiro caso recombinam, o plasmídeo vai ser excisado, e a célula irá reverter para o tipo selvagem. Se o segundo caso de recombinação é dirigido pelo outro braço de homologia, um plasmídeo vai ser excisado, mas o alelo cromossô-mico original será trocado para o alelo modificado introduzido no plasmídeo; a modificação cromossômica desejada terá sido alcançada. Tal como acontece com a integração do tipo Campbell, o primeiro caso de recombinação é tipicamente detectado e isolado usando vantagem seletiva conferida por meio da integração de um gene marcador de seleção de origem do plasmídeo.

[00163] As modalidades da presente descrição são ainda exemplificadas nos Exemplos seguintes. Deve ser entendido que estes exemplos são dados a título de ilustração unicamente.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Construção de uma biblioteca qenômica de Aarobac-terium tumefaciens (LBA4404) e o isolamento de recA mais os clones de cosmídeo [00164] Uma biblioteca de DNA genômico é construído para isolar e identificar o gene de recA anteriormente não caracterizada a partir de Agrobacterium tumefaciens (LBA4404). O DNA genômico de A. tumefaciens (LBA4404) é parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A1 (New England Biolabs, Ipswich, MA), e é fraccionado por centri-fugação em um gradiente de sacarose descontínuo de 10-40% em um tampão (20 mM Tris-HCI, pH 8,0; EDTA a 10 mM; e, 50 mM de NaCI). As frações que contêm fragmentos de DNA genômicos com tamanhos que abrangem uma gama de cerca de 20-40 kb são reunidas e ligado no vetor cosmídeo de largo gama de hospedeiros, pCP13 / B (resistente à tetraciclina) (Dessaux Y, J Tempe, Farrand SK., 1987. A análise genética de mannityl opinar catabolismo in-tipo octopina Agrobacterium tu-mefaciens estirpe 15955. Mol Gen Genet 208 (1-2):. 301-8). Este vetor de cosmideo é tratado com BamHI e fosfatase alcalina antes do seu uso na reação de ligação. A mistura de ligação é processada usando Packagene® Lambda sistema de Empacotamento de DNA da Promega (Promega, Madison, Wl) e transfectado em Escherichia coli (HB101). O banco biblioteca resultante contém cerca de 5.000 transductantes cos-mídicos resistentes à tetraciclina que representam cerca de vinte vezes a cobertura da A. tumefaciens (LBA4404) genoma.

[00165] Para isolar os clones de cosmídeo que suportam o gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404), as cepas bacterianas E. coli (HB101) são isoladas a partir da biblioteca e espalhadas em placas de caldo Luria contendo 0,01% de éster de metila do ácido metanossulfô-nico (MMS). Uma vez que E. coli (HB101) é um mutante recA, e, portanto, sensível a MMS, as colônias resistentes a MMS que cresceram no meio são supostas para conter os cosmídeos que codificam o gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) (Farrand SK, O' Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Construction of an Agrobacterium tumefaciens C58 reCA mutant. J Bacteriol 171 (10): 5314 a 21). As centenas de clones de cosmídeo resistentes a MMS são obtidas, e vinte e quatro deles são adicionalmente purificados e analisados por meio da digestão com enzimas de restrição com Xhol. Nove das colônias que tinham um subconjunto comum de fragmentos Xhol são submetidas ao se-quenciamento final usando iniciadores; pCP13 / esquerda B e pCP13 / direita B (Tabela 1). Partindo do princípio de sintenia entre os cromossomas de A. tumefaciens (LBA4404), e a cepa de A. tumefaciens (C58) sequenciado, os cosmídeos são pesquisados para as sequên- cias de junção que previram que recA estaria localizado no meio do inserto. Um tal cosmídeo, PCP-MMSR2, é sujeito ao sequenciamento para confirmar a presença de um gene de recA putativamente identificado usando os iniciadores, conforme descrito na Tabela 1.

Exemplo 2 - Clonagem, caracterização e análise da sequência do gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) [00166] Para construir as cepas de nocaute do gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404), a localização do gene de recA é avaliada para determinar se a localização do gene de recA está presente no mesmo contexto genômico como outros genes recA isolados de Agrobacteríum e espécies de Rhizobium (Goodner B et al, 2001. Sequência do genoma do patógeno de plantas e agente de biotecnologia Agrobacteríum tume-faciens C58 Sciense 2942323 a 2328; e, Slater SC et al, 2009. Sequências do genoma de três biovares de Agrobacteríum ajudam a elucidar a evolução dos genomas multi-cromossômicos em bactéria. J Bacteriol 191 (8): 2501 a 11). Por conseguinte, as sequências vizinhas localizadas a montante e a jusante de recA de A. tumefaciens (C58), A. Vitis (S4), A. radiobactor (K84), Rhizobium leguminosarum e Rhizobium sp. NGR234 são pesquisadas para as sequências altamente conservadas para conceber os iniciadores (M-recAnei e R-RecAnei na Tabela 1). Estas sequências encontram-se cerca de 1,5 kb a montante e a jusante do gene de recA. Estas sequências são amplificadas por meio de PCR usando os iniciadores que se ligam a uma região contendo o gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404). O fragmento de PCR de 3,7 kb resultante é clonado no plasmídeo pWM91 para gerar um novo plasmí-deo, que é rotulado como PWM-recAnei (vide Figura 1) (Metcalf WW, Jiang W, Daniels LL, Kim SK, Haldimann A, Wanner BL. 1996. Os plasmídeos condicionalmente replicativos e conjugativos transportando alfa lacZ para clonagem, mutagênese e substituição de alelo em bactérias. Plasmid. 35 (1): 1 a 13). O fragmento amplificado por meio de PCR do gene de recA está apresentado para o sequenciamento usando os iniciadores recAnei como listados na Tabela 1. Os dados de sequenciamento identificaram o gene de recA a partir de A. tumefaciens (LBA4404), que é apresentado como SEQ ID NO: 10. Além disso, os dados de sequenciamento indicaram que o gene de recA de A. tumefaciens contém o mesmo contexto genômico como outras cepas relativas; que é flanqueado por Alas na direcção de jusante e Atu1875, um hidrato de carbono quinase, na direção a montante (a sequência genômica con- tendo o gene de recA e as sequências de flanqueamento a montante e a jusante também são fornecidas como SEQ ID NO: 11).

[00167] O gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) é quase idêntico na sequência para o gene de recA a partir de isolados genomovar-1 de cepas de Agrobacterium biovar 1, tais como S 377, TT111 e ATCC4720. Além disso, o gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) compartilha 92 % de identidade na sequência nucleica com o gene de recA da cepa genomovar-8, isto é, C58 (Costechareyre et al., 2010). O relacionamento global do gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404), em comparação com o gene de recA de outras cepas de Agrobacterium e taxa relacionadas, pode ser comparado, e uma árvore filogené-tica desta comparação é mostrada na FIGURA 2. Os resultados da comparação da sequência do gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) sugerem que algumas regiões do genoma de A. tumefaciens (LBA4404) continha sequências de DNA genômico alheias aos de A. tumefaciens (C58). Outras comparações da sequência indicam que os polimorfismos cromossômicos existem mesmo entre os biovar 1 isolados de Agrobacterium spp estreitamente relacionados.

Exemplo 3 - Substituição e disrupção do gene de recA em cosmí-deos-resistentes a MMS com um cassete de resistência a canami-cina ou cloranfenicol [00168] A recombinação vermelha baseada em bacteriófago λ é usada para introduzir os cassetes de resistência aos antibióticos no gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) realizado em PCP-MMSR2 (Datsenko KA, Wanner BL. 2000. Uma etapa de inativação de genes cromossômicos em Escherichia coli K-12, usando produtos de PCR Proc Natl Acad Sei US A. 97 (12): 6640 a 5). Resumidamente, usando os iniciadores F-recA-FRT e R-RecA-frt listados na Tabela 1, os fragmentos de DNA que codificam o cloranfenicol e os genes de resistência a antibiótico de canamicina são amplificados a partir de pKD3 e pKD4, respectivamente. Estes fragmentos de PCR amplificados codificam os cassetes antibióticos que são ladeados com 43 pb das sequências localizadas a montante e a jusante do gene de recA. As sequências incluíram mais 9 pb a partir de cada extremidade do gene de recA. Os produtos resultantes da amplificação por PCR linear são ele-troporados em cepas E. coli (HB101) que abrigavam os cosmídeos Resistentes a MMS, PCP-MMSR2 e pKD20, para a recombinação mediada por vermelho. O plasmídeo pKD20 fornece a recombinase vermelha e pode ser curado por meio da recombinação a seguir do crescimento das cepas transformadas a 42 Ό. Em seguida , a disrupção do gene de recA dentro do cosmídeo é confirmada testando a sua incapacidade de restaurar a resistência a MMS de E. coli (HB101) e por meio da análise de sequência usando os iniciadores F3-recAnei e R2-RecAnei (Tabela 1). Vários desses constructos atenderam ao requisito de serem incapazes de complementar a mutação recA em E. coli (HB101). Um de cada classe de resistência aos antibióticos, PCP-MMSRArecAkan e PCP-MMSRArecACm é retida para o constructo das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404).

Exemplo 4 - A substituição e disrupção do gene de recA no cromossoma de A. tumefaciens (LBA4404) com um cassete de resistência a canamicina ou cloranfenicol [00169] Os dois clones de cosmídeos de disrupção de recA acima descritos são transformados em A. tumefaciens (LBA4404) para o marcador de troca do gene de recA interrompido do cosmídeo para o gene de recA de A. tumefaciens (LBA4404) cromossômico. Resumidamente, após a eletroporação dos cosmídeos recA interrompidos em A. tumefaciens (LBA4404), os transformantes são selecionados e purificados em placas de agar nutriente contendo tetraciclina e canamicina ou cloranfenicol. Em seguida, os transformantes foram inoculados em cultura líquida contendo apenas a canamicina ou cloranfenicol. Estas cultu- ras são subcultivadas três vezes para aumentar a probabilidade de casos de cruzamento duplo e perda do clone de cosmídeo. Volumes de cinquenta microlitros de 1000 vezes cultura diluída estão espalhados em placas contendo os antibióticos adequados, e cerca de 100 a 200 colônias são escolhidas e selecionadas para os cruzamentos duplos por meio de testes de resistência a canamicina ou cloranfenicol e sensibilidade para ambas as tetraciclina e MMS. As cepas Agrobacterium de nocaute recA canditado resultantes são isoladas e rotuladas como UIA777 (Cm) e UIA770 (Kan). As cepas de nocaute recA isoladas são ainda confirmadas por meio de PCR e análise de sequência usando os iniciadores listados na Tabela 1. O processo completo de construção do gene de recA nocaute em A. tumefaciens é ilustrado na FIGURA 1. Exemplo 5 - Caracterização de propriedades de crescimento das cepas recA das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens [00170] As duas cepas A. tumefaciens (LBA4404) de nocaute recA, UIA777 e UIA770, observam-se taxas de crescimento de bactérias. Observa-se que as cepas de nocaute recA exibiram um atraso de crescimento de uma hora, em comparação com a cepa de tipo selvagem quando inoculadas em meio líquido MGL (vide Figura 3). Outras observações indicam que ambas as cepas de nocaute recA cresceram ainda mais lento em placas de agar de nutriente sólidos. Por exemplo, observa-se que as cepas de nocaute recA necessárias ao longo de três dias para as colônias atingiram cerca de 1 a 2 mm de diâmetro, enquanto que a cepa de tipo selvagem aumentou para o mesmo diâmetro de 1 a 2 mm de tamanho de cerca de dois dias.

[00171] As duas cepas A. tumefaciens (LBA4404) de nocaute recA, UIA777 e UIA770, são observadas para a sensibilidade ao metano-sulfonato de metila (MMS) e irradiação ultra-violeta (UV). A sensibilidade à MMS e à irradiação UV, é uma características comum de bac- térias cepas de nocaute recA (Farrand SK, 0'Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Construção de um mutante recA Agrobacterium tumefaciens C58. J Bacteriol 171 (10): 5314 a 21). As culturas durante a noite das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404) são diluídas 100 vezes em 3 ml de meio MGL e crescidas com agitação da fase inicial-estacionária. As culturas resultantes são, em seguida, dez vezes diluídas em série em NaCI a 0,9 % e as amostras de 5-ul são vistas sobre a superfície de placas de agar nutriente. Para o tratamento MMS, 0,01 % MMS está incluído no meio. Para a irradiação UV, as placas são expostas a uma fonte de luz UV (Amersham-Pharmacía Biotech, Pitts-burgh, PA) para administrar doses precisas de UV tal como medido por meio de um dosímetro UV interno. Imediatamente após a exposição, as placas são cobertas e incubadas em uma caixa à prova de luz negra a 28 Ό durante 24 horas. A titulação da cult ura na diluição zero é usada para determinar a sobrevivência de células na presença de MMS ou após a exposição a várias doses de irradiação UV. Como mostrado na Tabela 2, as duas cepas de nocaute recA A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, são sensíveis a ambos MMS e irradiação de UV em comparação com A. tumefaciens de tipo selvagem (LBA4404).

Exemplo 6 - Complementação das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens ÍLBA4404) [00172] O plasmídeo pSOM301, um derivado do pCP13 / B conten- do o gene de recA de C58 (SK Farrand, 0'Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Constructo de um mutante recA de Agrobacterium tumefaciens C58. J Bacteriol 171 (10): 5314 a 21), é testado para a sua capacidade para complementar o crescimento lento, MMS e sensibilidade UV da cepa de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA770. O plasmídeo pSOM301 restaurou o atraso do crescimento e uma pequena colônia de fenótipo UIA770 (Figura 3). Ele também pode restaurar a resistência de UIA770 para MMS e irradiação UV para níveis semelhantes aos apresentados por meio de A. tumefaciens do tipo selvagem (LBA4404) (Tabela 2).

Exemplo 7 - Caracterização de plasmídeo isolado a partir das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404) [00173] A cepa A. tumefaciens (LBA4404), de tipo selvagem, abriga o plasmídeo auxiliar vir pAL4404 (Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJJ, Schilperoort de 1983. A estratégia de vetor de planta binário baseada na separação da região vir e T do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Nature 303: 179 a 180). O plasmídeo auxiliar de pAL4404 (isto é, o Ti plasmídeo) é isolado a partir de cepas de nocaute recA. Em seguida, o plasmídeo auxiliar é submetido à análise ele-troforética em gel. A análise em gel resultante indicou que os plasmí-deos isolados a partir das cepas de A. tumefaciens (LBA4404) UIA777 e UIA770, abrigavam ambos um único plasmídeo que migra com a mesma mobilidade que pAL4404.

Exemplo 8 - Introdução do plasmídeo ternário das cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404 [00174] O plasmídeo ternário (pDAB9292) como anteriormente descrito no Pedido de Patente Internacional N ° PCT/US 2011/046.028, incorporado na presente invenção por meio de referência, é transformado em duas cepas de nocaute recA A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770. A introdução do plasmídeo ternário nas cepas de Agrobacte- rium é confirmada por meio dos ensaios de confirmação molecular (isto é, a digestão com enzimas de restrição e sequenciamento).

Exemplo 9 - Estabilidade de um plasmídeo binário contendo elementos de gene repetidos nas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404) [00175] As cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404) são testadas para avaliar a estabilidade de um plasmídeo binário contendo os elementos repetidos de genes. Em experiências anteriores observou-se que o uso de elementos repetidos de genes dentro do plasmídeo binário se reorganiza quando o plasmídeo binário é clonado de A. tumefaciens (LBA4404). O plasmídeo binário, pDAB108700 (SEQ ID NO: 12), está ilustrado na FIGURA 4. Como mostrado, pDAB108700 contém dois cassetes de expressão de genes, ambos impulsionados por meio do mesmo promotor. O primeiro cassete de expressão contém o gene de Zea mays do promotor da ubiquitina-1 (promotor Ubi 1 Zm V2) ligado à proteína fluorescente da sequência de Phi-amarelo (PhiYPF V3) do gene e terminado com a peroxidase de Zea mays 5 UTR 3' (3'UTR ZmPer5 V2). O segundo cassete de expressão contém o gene de Zea mays do promotor da ubiquitina-1 (promotor Ubi 1 Zm V2) ligado à sequência do gene de fosfinotricina acetil-transferase (PAT v9) e terminado com o Zea mays lipase UTR 3' (3'UTR ZmLíp V1).

[00176] O plasmídeo binário, pDAB108700, é transformado nas ce- pas de A. tumefaciens da Tabela 3. Após a transformação, duas colônias de bactérias são isoladas a partir da transformação de cada cepa bacteriana. Cada colônia é cultivada e o DNA de plasmídeo binário é isolado para validação com uma série de digestões com enzimas de restrição (ou seja, Notl, EcoRI, Fsol, digere e Pstl). Em seguida, uma colônia específica a partir do primeiro experimento é selecionada e com riscada no meio sólido. Dez das colônias que cresceram no meio sólido são colhidas e crescidas. O DNA de plasmídeo binário é isolado para uma outra ronda de validação com uma série de digestões com enzimas de restrição (isto é, digestos Notl, EcoRI, Fsol, e Pstl). Os padrões de bandas das digestões por meio das enzimas de restrição são observados para a produção de fragmentos de DNA de plasmídeo de tamanho esperado. As colônias que produziram padrões de bandas com tamanhos aberrantes e inesperados de fragmentos de DNA de plasmídeo são identificadas como instáveis. As colônias que formam as bandas produzidas padrão com um tamanho previsto de fragmentos de DNA de plasmídeo são identificados como estável. A porcentagem total de plasmídeos que não exibem qualquer rearranjo diferente para cada cepa é calculada e os resultados são apresentados na Tabela 3.

Exemplo 10 - Transformação da planta mediada com as cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404) [00177] As espécies de plantas são transformadas de acordo com as modalidades da presente descrição, usando as técnicas que são conhecidas na literatura. As duas cepas de nocaute recA. De A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário são usadas para as transformações mediadas por planta. Como um resultado da transformação, um cassete de expressão do gene contendo um marcador de seleção é integrado como um T-filamento em um local genômico dentro do cromossoma da planta. A integração do T-Filamento dentro do local genômico a montante e a jusante das sequências flanqueadoras resulta em uma modificação genética, esta-velmente integrada no genoma de uma planta transgênica.

[00178] As plantas de milho podem ser transformadas com uma ou outra das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário, usando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo 8 do documento WO 2007/053482. A transformação resultante incorpora um cassete de expressão do gene contendo uma característica agronômica que é integrada como um T-filamento em um local genômico dentro do cromossoma da planta.

[00179] As plantas de soja podem ser transformadas com qualquer um das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário, usando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo 11 ou Exemplo 13 de WO 2007/053482. A transformação resultante incorpora um cassete de expressão do gene contendo uma característica agronômica que é integrada como um T-filamento em um local genômico dentro do cromossoma da planta.

[00180] As plantas de algodão podem ser transformadas com qualquer um das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário, usando as mesmas técnicas descritas anteriormente nos Exemplos 14 do pedido de patente US Patent n°. 7838733 ou Exemplo n° 12 de WO 2007/053482 (Wright et al.). A transformação resultante incorpora um cassete de expressão do gene contendo uma característica agronômica que é integrado como um T-filamento em um local genômico dentro do cromossoma da planta.

[00181] As plantas de canola podem ser transformadas com qualquer uma das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário, usando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo 26 do pedido de patente US Patent n°. 7838733 ou Exemplo 22 de WO 2007/053482 (Wright et al.). A transformação resultante incorpora um cassete de expressão do gene contendo uma característica agronômica que é integrado como um T-filamento em um local genômico dentro do cromossoma da planta.

[00182] Para a transformação mediada por Agrobacterium de centeio, vide, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.), plants instantly maker-free transge-nic rye." Transgenic Res.: Outubro de 2003; 12 (5): 587 a 96). Para a transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, vide, por exemplo, Zhao et al., " Agrobacterium-mediated sorghum transformation" Plant Mol Biol.: Dezembro de 2000; 44 (6): 789 a 98. Para a transformação mediada por Agrobacterium de cevada, vide, "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformations", por exemplo, Tingay et al, The Plant Journal, (1997). 11: 1369 a 1376. Para a transformação mediada por Agrobacterium de trigo, vide, por exemplo, Cheng et al., "Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens,'' Plant Physiol.: Novembro de 1997; 115 (3): 971 a 980. Para a transformação mediada por Agrobacterium de arroz, vide, por exemplo, Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. 1997 setembro; 35 (1-2): 205 a 18.

[00183] Os nomes em latin para estas e outras plantas são dados abaixo. Deve ficar claro que as plantas podem ser transformadas com uma ou outra das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário. Como resultado, qualquer uma das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, podem ser usadas para trans- formar uma característica agronômica em estas e outras plantas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a; Milho (Zea mays), trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. E Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (augusta Abroma e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), açúcar e beterraba sacarina (spp Beta.), cana-de-açúcar (Arenga pinnata), tomate (Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp., e Cyphomandra betacea), batata (Solanum tuberosum), batata doce (Ipomoea batatas) , centeio (Secale spp.), pimentão (Capsicum annuum, chinense e frutescens), alface (Lactuca sativa, perennis, e pulchella), repolho (Brassica spp.), aipo (Apium graveolens), berinjela (Solanum melongena), amendoim (Arachis hypogea), sorgo (Sorghum spp.), alfafa (Medicago sativa), cenoura (Daucus carota), feijão (Phaseolus spp. e outros gêneros), aveia (Avena sativa e strigosa), ervilhas (Pisum, Vigna, e Tetragonolo-bus spp.), girassol (Helianthus annuus), abóbora (Cucurbita spp.), pepino (Cucumis sativa), tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabi-dopsis thaliana), relva (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon, e outros gêneros), herbáceos (Trifolium), ervilhaca (Vicia). A transformação de plantas tais com qualquer um das duas cepas de nocaute recA de A. tume-faciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário, por exemplo, está contemplada como uma modalidade da presente descrição.

[00184] As duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário podem ser usadas para a transformação de muitossistemas de cultivo de madeira de folha perene e cadocifólias. Espécies de madeira transgêni-cas iria aumentar a flexibilidade do uso do topo desses herbicidas sem problemas com lesões. Estas espécies incluem, mas não estão limitadas a; amieiros (Alnus spp.), cinzas (Fraxinus spp.), Aspen e espécies de álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Bétula spp.), cereja (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira (Carya spp.), dbordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.), e pinheiros (Pinus spp.).

[00185] O uso de qualquer um das duas cepas de nocaute recA de A. tumefaciens (LBA4404), UIA777 e UIA770, contendo um plasmídeo binário para a transformação de plantas ornamentais e de fruto, também está dentro do âmbito das modalidades da presente presente invenção. Exemplos incluem, mas não estão limitados a; Rosa (Rosa spp.), sarça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begônia spp.), rododendros (Rhododendron spp.), goiabada (crabap-ple) ou maçã (Malus spp.), pêra (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.), e malmequeres (Tagetes spp.). Enquanto os aspectos da presente invenção foram descritos em certas modalidades, podem ainda ser modificados dentro do espírito e âmbito desta descrição.

[00186] A presente descrição deste Pedido de Patente é, portanto, destinada a cobrir quaisquer variações, usações ou adaptações de modalidades da presente invenção, usando os seus princípios gerais. Além disso, este Pedido de Patente é destinado a cobrir tais desvios da presente descrição como vêm dentro da prática conhecida ou habitual na especialidade a que pertencem estas modalidades e que se mantenham dentro dos limites das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (38)

1. Cepa de Agrobacterium tumefaciens modificada, caracterizada pelo fato de que a referida cepa modificada é deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora.

2. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa é deficiente em, pelo menos, uma via de recombinação selecionada a partir do grupo que consiste em RecA, RecB, recD, RecF, RecG, RecJ, RecN, RecO, RecQ, RecR, e RecX.

3. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a cepa é deficiente em atividade de RecA.

4. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene de recA compreende uma sequência de polinucleotídeo possuindo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11.

5. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a cepa é também deficiente em uma atividade selecionada a partir do grupo que consiste em RecB, recD, RecF, RecG, RecJ, RecN, RecO, RecQ, RecR, e RecX.

6. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que um gene de recA genômico é modificado por meio de uma deleção, um rearranjo, ou uma inserção de uma sequência no gene de recA.

7. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que um gene de recA genômico é modificado por meio da supressão de uma sequência genômica compreendendo o gene de recA.

8. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que um gene de recA genômico é modificado através da inserção de uma sequência dentro do gene de recA, interrompendo, dessa maneira, a expressão da proteína RecA.

9. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a sequência inserida compreende um gene do marcador de seleção.

10. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir do grupo que consiste em um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos.

11. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a atividade de RecA é indetectável em extratos preparados a partir da cepa modificada.

12. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína RecA é indetectável usando análise de Western blot modificada.

13. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que RecA mRNA não é detectável usando a análise Northern blot.

14. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o gene de recA não é detectável por meio de análise de Southern blot.

15. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene de recA codifica uma proteína de SEQ ID NO:

16. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa compreende um Ti plasmídeo.

17. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o Ti plasmídeo compreende um plasmídeo pAL4404 Ti, ou é derivado do Ti plasmídeo pAL4404.

18. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que a cepa compreende um plasmídeo binário.

19. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o plasmídeo binário compreende um gene de uma característica agronômica selecionado a partir do grupo que consiste em uma característica de resistência ao inseticida, característica de resistência à herbicida, característica da eficiência do uso de nitrogênio, característica da eficiência do uso de água, característica qualidade nutricional, característica de DNA modificado, característica do marcador de seleção e as combinações dos mesmos.

20. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa compreende um plasmídeo terná-rio.

21. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa parental é Agrobacterium tumefa-ciens (LBA4404).

22. Plasmídeo que compreende um gene de recA modificado de Agrobacterium tumefaciens, caracterizado pelo fato de que o gene de recA tem pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11 antes de modificação, e o gene de recA modificado é deficiente na expressão da proteína RecA.

23. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende a inserção de uma sequência de doador de dentro do gene de recA ou SEQ ID NO: 10 ou 11.

24. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência de doador compreende um gene do marcador de seleção.

25. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o gene do marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gen-tamicina, ou as combinações dos mesmos.

26. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das extremidades da sequência de doador é flanqueada por meio de pelo menos um fragmento de par de base 43 da SEQ ID NO: 10 ou 11.

27. Método de produção de uma cepa de Agrobacterium tumefaciens deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um plasmídeo de nocaute direcionado para o gene de recA, (b) introdução do plasmídeo de nocaute para Agrobacterium tumefaciens; (c) seleção e o rastreio das colônias que compreendem uma mutação genômica; e, (d) identificação de pelo menos um de Agrobacterium tumefaciens transformado com uma mutação genômica de recA.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o gene de recA tem pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o plasmídeo de nocaute induz uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em uma deleção genômica, um rearranjo genômico, uma inserção genômica, e as combinações dos mesmos.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a inserção compreende uma sequência genômica que codifica um marcador de seleção.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o gene do marcador de seleção compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à espectinomicina, um gene de resistência à gen-tamicina, ou as combinações dos mesmos.

32. Caso transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma inserção de T-filamento flanqueado por meio de uma sequência de extremidade do DNA genômico a montante e (b) sequências genômicas de extremidade de DNA a jusante, em que a modificação genética compreende a integração do T-filamento a partir de uma cepa modificada de Agrobacterium tu-mefaciens, que é deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora.

33. Caso transgênico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o T-filamento a partir da cepa de Agrobacterium tumefaciens modificada é integrado no genoma de células de plantas específicas que são usadas para regenerar o caso transgênico.

34. Caso transgênico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma característica agronômica.

35. Caso transgênico de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a característica agronômica é selecionada a partir do grupo que consiste em um característica de resistência ao inseticida, característica de resistência à herbicida, característica da eficiência do uso de nitrogênio, característica da eficiência do uso de água, característica da qualidade nutricional, característica de ligação ao DNA, característica do marcador de seleção, e as combinações dos mesmos.

36. Caso transgênico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o caso transgênico é uma planta dicotile-dônea ou uma planta monocotiledônea.

37. Método de produção de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar as células de plantas específicas, com uma cepa de Agrobacterium tumefaciens modificada, que é deficiente em uma via de recombinação genética em relação à sua cepa progenitora; (b) seleção das células de plantas e de triagem compreendendo o DNA a partir da referida cepa de Agrobacterium integrada no genoma das células das plantas-alvo; e (c) regeneração de plantas inteiras a partir de células trans-gênicas de plantas selecionadas/rastreadas na etapa (b).

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção é realizada usando um marcador de seleção que compreende um gene de resistência a antibiótico selecionado a partir de um gene de resistência ao cloranfenicol, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à especti-nomicina, um gene de resistência à gentamicina, ou as combinações dos mesmos.