CN105886632A

CN105886632A - 一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法

Info

Publication number: CN105886632A
Application number: CN201610305190.7A
Authority: CN
Inventors: 祁鹏飞; 张亚洲; 郭帧儒; 魏育明; 郑有良
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2016-08-24

Abstract

本发明提供了一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：1)亚油酸合成酶基因(FgLAI12；FGSG_02668)的敲除；2)亚油酸合成酶基因缺失突变株(ΔFgLAI12)的鉴定；3)亚油酸合成酶基因缺失突变株代谢性能检测，包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的合成。本研究方法通过基因的敲除及敲除基因后的突变株的代谢性能检测，能够快速的研究出所敲除基因的功能以及所述基因与禾谷镰刀菌致病能力的联系。

Description

一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法

技术领域

本发明涉及基因功能研究方法领域，尤其涉及一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法。

背景技术

引起赤霉病的主要致病菌是禾谷镰刀菌，禾谷镰刀菌是最早被发现的赤霉病致病菌，也是最重要的致病菌。禾谷镰刀菌产生的次级代谢产物-单端孢霉烯，是引发赤霉病的主要毒素，会造成寄主植物的死亡，严重危害小麦，大麦，玉米等农作物，引起产量损失，并且可破坏食用者免疫系统，引起呕吐、腹泻、头晕等症状，严重危害人类健康。但现有技术中传统育种和化学防治赤霉的方法防治收效甚微情况下，因此科学认识禾谷镰刀菌致病机理变得十分重要。

硬脂酸对植物抵抗禾谷镰刀菌侵染十分重要，亚油酸是硬脂酸重要的上游合成物质。将亚油酸氧化为硬脂酸过程中，亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase LAI)是其重要限速酶之一。目前主要已知LAI主要有Cis-9LAI和Cis-12LAI，主要通过异构亚油酸，从而进一步被生化还原为硬脂酸。LAI且LAI对于真菌生长、有性生殖、控制毒素合成和色素合成代谢中起重要作用。但目前，对于禾谷镰刀菌中亚油酸代谢为硬脂酸的机理知之甚少，迫切的需要开发一种高效的研究禾谷镰刀中亚油酸代谢为硬脂酸的方法，对进一步揭开禾谷镰刀菌致病机理十分重要。本研究以禾谷镰刀菌中Cis-12LAI(FgLAI12；FGSG_02668)为例，发明了一种禾谷镰刀菌LAI功能基因研究方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：

1)采用农杆菌介导的方法敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因，所述亚油酸合成酶基因为FGSG_02668；

2)采用PCR筛选法鉴定所述敲除亚油酸合成酶基因后的突变株，确定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；

3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能，所述代谢性能包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的代谢。

优选的，所述PCR筛选法所用的引物为：

a：ACATGCCATTGTGATTG；

b：AGGTGCGGTTGCTG；

c：CTGACCAGTTGCCTAA；

d：ACAGTTCATTCCGAGAC。

优选的，所述的亚油酸的代谢通过HPLC-MS的方法和GC-MS的方法测定。

优选的，所述的细胞色素合成酶P450的代谢通过P450-CO复合物吸收光谱检测。

优选的，所述步骤1)具体为：亚油酸合成酶基因FGSG_02668的敲除包括以下步骤：

a1)构建T-DNA载体；

a2)进行T-DNA载体转化农杆菌及阳性克隆的筛选；

a3)敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因。

6.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述步骤a3)具体为：

培养禾谷镰刀菌孢子；

诱导培养农杆菌；

共培养禾谷镰刀菌和农杆菌；

敲除突变体的潮霉素筛选和分离纯化。

优选的，所述步骤a1)具体为：

获取禾谷镰刀菌基因序列信息；

提取禾谷镰刀菌基因组DNA；

将所述提取到的基因组DNA进行PCR扩增，得到亚油酸合成酶基因；将所述扩增得到的亚油酸合成酶基因和与其连接的Prf-HU2载体进行双酶切，得到亚油酸合成酶基因酶切片段和Prf-HU2载体酶切片段；回收上述酶切片段，将上述酶切片段进行连接，得到带有亚油酸合成酶基因的T-DNA载体。

优选的，所述PCR扩增用的引物为：

FgLAI12-LB-F：GGAAGCTT CAAAGCGGCAACA；

FgLAI12-LB-R：GGACTAGT TTCCCATCAACAACATA；

FgLAI12-RB-F：GCGGGCCC GGCTTATCTCAACGACA；

FgLAI12-RB-R：GCGAGCTC TACCCTGAATCCAACAT。

优选的，步骤a2)中所述的T-DNA载体转化的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

优选的，步骤a2)中所述的阳性克隆的筛选中的检测引物为：

P1：CTTTTCTCTTAGGTTTACCCG；

P2：TAATGCAGGAGTCGCATAAG；

P3：CCCAAAAAGTGCTCCTTCAA；

P4：TGTGCTGCAAGGCGATTAA。

本发明提供的谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法通过基因的敲除及敲除基因后的突变株的代谢性能检测，能够快速的研究出所敲除基因的功能以及所述基因与禾谷镰刀菌致病能力的联系。

附图说明

图1为本发明技术方案路线图。

图2为敲除突变株代谢产物检测结果，图2(A)为敲除突变体和野生型中代谢产物的HPLC的检测结果；图2(B)为亚油酸标准品HPLC的检测结果；图2(C)是HPLC检测亚油酸含量的变化数据结果；图2(D)是P450酶含量的变化数据结果。

图3为突变株代谢产物GC-MS的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：

1)采用农杆菌介导的方法敲除亚油酸合成酶基因，FGSG_02668，得到亚油酸合成酶基因缺失突变株；

2)采用PCR筛选法鉴定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；

3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能。

本发明所述的禾谷镰刀菌为本领域所公知的禾谷镰刀菌，对于具体的菌株无特殊限定，可直接从环境中分离得到或者购买市售的禾谷镰刀菌，具体的本发明实施例中使用的禾谷镰刀菌为发明人从环境中分离得到的禾谷镰刀菌Fg180378菌株。

本发明在进行敲除亚油酸合成酶基因之前，优选首先从禾谷镰刀菌数据库(http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/)，在NCBI上Blast禾谷镰刀菌亚油酸合成酶基因功能基因序列，运用MEGA软件进行对比分析。根据如图1所示的定点敲除功能基因方法，运用引物设计软件：Primer5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.htmL分别设计目的基因上游和下游片段。

本发明进行禾谷镰刀菌基因组DNA的提取，优选的禾谷镰刀菌基因组DNA的提取方法为CTAB法，具体的包括以下步骤：

1)培养禾谷镰刀菌；

2)用无菌microcloth过滤培养基，滤液在室温下离心；

3)将所述离心得到的沉淀孢子转移到YPD液体培养基中，经过培养得到菌丝；

4)将所述菌丝干燥后在冷冻条件下进行研磨，得到菌丝粉末；

5)将所述菌丝粉末与CTAB提取缓冲液混合，得到悬浮液；

6)将所述悬浮液65℃静置30分钟，每隔10分钟翻转离心管混匀；

7)加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇到离心管混匀，轻摇20分钟后，离心得上清液1；

8)将上清液转入新的离心管中，重复步骤10)的操作，得上清液2；

9)将上清液2转移到新的离心管，加入RNaseA到终浓度5-50ug/mL，然后37℃静置30-60分钟；

10)加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇，然后翻转离心管5分钟后离心得到上清液3，将上清液3转移到新的离心管中；

11)用体积比为24：1的氯仿：异戊醇再抽提一次，去除酚，得到上清液4；

12)将上清4转移到新的离心管，加入1/10体积的NaAc后再加入2倍体积的100％乙醇(-20℃)或者0.6-1体积的异丙醇；

13)4℃，10000rpm离心10分钟，沉淀DNA；

14)用10mL 70％乙醇洗涤沉淀，将沉淀悬浮；

15)再用10mL100％乙醇洗涤沉淀。

16)将DNA干燥并用无菌的DDW或者TE 0.5-2mL，4℃溶解过夜并于-20℃保存得到基因组DNA。

其中所述培养禾谷镰刀菌优选的将禾谷镰刀菌从PDA培养基转接到CMC液体培养基中，23～27℃，120～180rpm培养60～84小时；

所述禾谷镰刀菌沉淀孢子转移到YPD液体培养基中培养得到菌丝步骤中具体的培养条件为：23～27℃，160～200rpm，,10～14小时。

步骤4)中在冷冻状态下进行研磨具体的为将菌丝转入到用液氮预冷5～10min的研钵中，加入液氮研磨，研磨过程中保持菌丝处于冷冻状态；

研磨后的菌丝使用无菌药匙转移到离心管中；

步骤5)中优选的以干重为0.5～1.5g的菌丝加入10～30mLCTAB缓冲液将粉末振荡悬浮；

本发明中，所述PDA平板培养基优选的包括：马铃薯8～10g/L，琼脂粉8～10g/L，余量的水。所述CMC液体培养基优选的为：KH₂PO₄0.5～1.5g/L，NH₄NO₃ 0.5～1.5g/L，酵母粉0.5～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25～0.75g/L，CMC 10～20g/L，余量的水；所述的YPD培养基优选的为：酵母膏8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，葡萄糖8～12g/L，余量的水。本发明培养基中所述的水为双蒸水，所述的培养基为121℃高压蒸汽灭菌30min后的培养基。

本发明在提取得到禾谷镰刀菌基因组DNA后，以禾谷镰刀菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增亚油酸合成酶基因。在本发明中，所述PCR扩增用的引物为：FgLAI12-LB-F：GGAAGCTTCAAAGCGGCAACA，FgLAI12-LB-R：GGACTAGTTTCCCATCAACAACATA，FgLAI12-RB-F：GCGGGCCCGGCTTATCTCAACGACA，FgLAI12-RB-R：GCGAGCTCTACCCTGAATCCAACAT；

在本发明中，所述PCR扩增体系优选采用25μl体系具体的为：

在本发明中，所述PCR反应程序优选为：

本发明得到PCR的扩增产物后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收亚油酸合成酶基因片段。回收方法参照TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行。

本发明得到回收后的亚油酸合成酶基因片段后，对亚油酸合成酶基因片段和载体Prf-HU2进行双酶切，得到亚油酸合成酶基因酶切片段和Prf-HU2载体酶切片段。在本发明中，所述双酶切优选采用上游酶切HindIII、SpeI和下游酶切SacI、ApaI。

本发明中酶切体系优选的为25μl酶切体系，具体的为：

37℃过夜(一般为12h)酶切。

本发明在完成亚油酸合成酶基因和载体Prf-HU2酶切后回收酶切片段，将上述所得酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收酶切片段。回收方法参照TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行。

本发明得到回收后的酶切片段，将酶切片段进行连接，得到带有亚油酸合成酶基因的T-DNA载体。在本发明中，所述连接体系优选为25μL体系，具体如下，

16℃过夜(一般为12h)连接。

所述酶切片段中亚油酸合成酶基因酶切片段和载体Prf-HU2酶切片段的体积摩尔比优选的为1:2～10。

本发明在连接目的基因亚油酸合成酶基因和载体Prf-HU2之后，将带有亚油酸合成酶基因的T-DNA载体转化至大肠杆菌感受态细胞。连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，充分混匀，冰上放置30min；然后42℃热激90s，冰上放置150s后，加入液体800μL LB液体培养基，220r/min 37℃振荡培养1h，均匀涂在含有kana霉素(50μg/mL)的LB平板上过夜培养。挑取过夜培养的培养平板上生长良好的单菌落，在含有kana霉素(50μg/mL)的LB平板上过夜划单线进行扩大培养；

本发明中所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法优选包括如下步骤：1)菌种的活化；2)菌种的液体培养；3)菌体收集；4)CaCl₂处理菌体制备感受态细胞；5)感受态细胞的保存。其中菌种的活化优选的将保藏于-70℃冰箱的菌种取出划线接种于的LB平板，35～40℃过夜培养10～16h；菌种的液体培养，优选的将LB平板上的菌落，接种于1～3mL无抗生素的LB液体培养基中，35～40℃，200～250rpm/min振荡培养10～16h，取培养的活化菌液加入40～60mLLB液体培养基中，35～40℃200～250rpm/min振荡培养培养至OD₆₀₀＝0.5的培养液；菌体的收集，优选的将培养液冰浴后离心去上清，更优选的冰浴18～22分钟，在4℃的离心机中3500～4500rpm/min离心8～12min去上清液；CaCl₂处理菌体制备感受态细胞优选的，在收集到的菌体沉淀中加入18～22mL 1.5M CaCl₂均匀悬浮菌体后，冰浴20-30min；然后再4℃的离心机中3500～4500rpm/min离心8～12min去上清液；感受态细胞的保存优选的在上述沉淀中加入4～6mL(0.1M CaCl₂+15％甘油)均匀悬浮菌体后迅速放入液氮中速冻，然后放入-70℃保存。

本发明在将连接有目的基因的载体转入大肠杆菌后，优选的对成功转入的阳性克隆的进行筛选，所述筛选优选的用克隆载体的随机引物对划线的单菌落做PCR检测，收集检测为阳性的克隆，所述的PCR检测的引物为P1CTTTTCTCTTAGGTTTACCCG和P2TAATGCAGGAGTCGCATAAG或者P3CCCAAAAAGTGCTCCTTCAA和P4TGTGCTGCAAGGCGATTAA。

所述的PCR检测体系优选的为25μl，具体的为：

所述的PCR检测反应程序优选的为：

本发明在选出阳性克隆后，提取阳性克隆中的质粒，测序，-20℃中保存备用。本发明中具体的质粒提取步骤参照TIANGEN试剂盒中说明书进行。

本发明将提取到的质粒采用冻融法转入到农杆菌中，具体的步骤为：1)冻融法转入质粒；2)YEB培养基选择培养导入质粒的农杆菌；3)导入质粒的农杆菌的划线检测；4)导入质粒的农杆菌的诱导培养。

所述的冻融法转入质粒优选的为将1-2μL质粒加到90～110μL的农杆菌感受态中，轻摇混匀，冰浴25～35min，液氮速冻3～8min，35～40℃水浴3～8min，再迅速冰浴1～3min，加入600～1000μL YEB液体培养基，28℃轻摇4-6小时。

所述的YEB培养基选择培养导入质粒的农杆菌，优选的包括以下步骤，将步骤1)中得到的农杆菌在3500-4000rpm/min离心2～4min，去除上清液，留下100-200μL菌液，混匀，均匀涂在含(Rif50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB选择培养基上，28℃培养2-2.5d，所述的含(Rif50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB培养基为普通市售的YEB培养基添加50ug/mL的Rif和50ug/mLKana。

本发明所述的导入质粒的农杆菌的划线检测优选的为挑取单菌落于新的含(Rif50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB选择培养基，进行划线检测，若可以生长即为导入质粒的农杆菌阳性菌落，挑取所述阳性菌落用30～50μL含(Rif 50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB液体培养基上培养1-2d，至OD₆₀₀＝0.6～1.0，加入40％甘油，于-70℃保存备用。

本发明所述的导入质粒的农杆菌的诱导培养，优选的在含Kan(卡纳青霉素)100mg/L的LB培养基上划线，18～24h后挑取单菌落放入含Kan 100mg/L、Rif(利福平)25mg/L的MM培养基中，25～30℃、160～200r/min震荡培养1.5～2.5d，2500～3500r/min离心3～8min，收集菌体，以等体积，含200μM AS的IM培养基重悬菌体，25～30℃、160～200r/min震荡培养5～7h，使农杆菌的OD₆₀₀＝0.6～1.0。

本发明中禾谷镰刀菌孢子的培养，优选的包括以下步骤，将Fg180378的菌株接种于SNA培养基，25℃下培养4-5d；挑取活化后菌丝放入CMC培养基中，25℃下106～200r/min震荡培养3-4d；使用双层纱布过滤掉菌丝，滤液在2500～3500r/min下离心3～8min收集孢子；用15～25mL灭菌后的ddH₂O重悬孢子，2500～3500r/min离心3～8min后弃上清；用2～8mL灭菌后的ddH₂O重悬孢子，保存于-20℃下备用；孢子使用前需进行记数，并用灭菌后的ddH₂O将孢子浓度调到1×10⁶个/mL。

本发明将上述诱导后的农杆菌与禾谷镰刀菌进行共培养敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因，农杆菌与禾谷镰刀菌孢子悬浮液按1:1～2的比例混合，取150～250μL的混合液样品喷洒到尼龙膜上(3×3cm)，置于含200μM AS的IM固体培养基上，25℃避光培养2d。

本发明之后进行筛选成功敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因的突变株，所述的筛选优选的包括以下步骤，将禾谷镰刀菌与农杆菌共培养2d后的尼龙膜剪成2～4×0.1cm的块状，反向放入含100mg/L潮霉素B、100μM的链霉素和200μM的氨噻肟头孢霉素的SNA培养基中，25℃避光培养5-7d；挑出能在培养基上生长的菌落，转入含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中；5-7d后选取能在培养基中稳定生长的菌落，转入普通SNA培养基中活化3-5d；将活化后的菌落转入CMC培养基中培养孢子；将获得的孢子梯度稀释10^-3、10^-4、10^-5倍，取100μL均匀涂在普通SNA培养基中，25℃培养2～4d；挑取长出的单菌落，转移到含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中，25℃避光继续培养4～6d；将在含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中能稳定生长的单菌落转到普通SNA培养基中，25℃下继续培养3-5d，得到成功敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因的突变株，将长出的菌丝放入20％的甘油溶液中，置于-70℃的超低温冰箱中保存。

本发明在得到亚油酸合成酶基因缺失突变株后，采用PCR筛选法对其进行鉴定。具体的根据潮霉素基因和亚油酸合成酶基因内部基因序列设计引物，若没有扩增到与野生型一样的条带，就说明在该突变体中，潮霉素基因已经成功地替换目的基因，反之，说明潮霉素并没有正确地进行同源重组。在此基础上，再以亚油酸合成酶基因上游序列设计正向引物和潮霉素基因内部设计反向引物进行PCR检测，检测引物为a:ACATGCCATTGTGATTG，b：P6AGGTGCGGTTGCTG，c：CTGACCAGTTGCCTAA，d:P8ACAGTTCATTCCGAGAC。以野生型FG180378作为阴性对照，扩增得到预期片段，并测序与预期序列对比验证。

本发明在得到筛选鉴定后的亚油酸合成酶基因缺失突变株对其进行亚油酸合成酶活性测定，优选的采用HPLC-MS的方法测定亚油酸代谢产物，优选的采用GC-MS的方法分析亚油酸合成酶基因缺失突变株中亚油酸含量变化。

本发明在得到筛选鉴定后的亚油酸合成酶基因缺失突变株后对其进行细胞色素P450酶检测，优选的采用P450-CO复合物吸收光谱检测的方法。

下面结合实施例对本发明提供的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 CTAB法提取基因组DNA

1)接种PDA平板上的赤霉菌饼到装有100mL CMC液体培养基的250mL三角瓶中，25℃，150rpm培养72小时。

2)用无菌microcloth过滤培养基，滤液在室温下4000rpm离心8分钟。

3)弃掉上清液，将孢子转移到含有100mL YEPD液体培养基的250mL三角瓶中，25℃，175rpm摇12小时。

4)将干燥的菌丝转入到研钵中(用液氮预冷)，加入液氮慢慢将其研磨成小片。

5)用力下压并旋转将菌丝磨碎，整个过程保持菌丝处于冷冻状态。

6)等液氮挥发完后加入液氮，并继续研磨。通常研磨三次(三次加入液氮)最后要研磨成粉末状。

7)等液氮挥发完全后将研磨好的粉末用无菌钥匙(用液氮预冷)转移到50mL离心管中。

8)加入10-20mL预热的CTAB缓冲液(55-65℃)，将粉末振荡悬浮。通常干重为1g的菌丝加入20mL提取缓冲液。

9)65℃静置30分钟，每隔10分钟翻转离心管混匀。

10)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到离心管混匀，室温下轻摇20分钟后，4000rpm离心5分钟。

11)将上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻摇20分钟后，4000rpm离心5分钟。

12)将上清液转移到新的离心管，加入RNaseA到终浓度5-50ug/mL，然后37℃静置30-60分钟.

13)加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)然后轻轻翻转离心管5分钟。

14)4℃，4000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。

15)用等体积的氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一次，去除酚。

16)将上清液转移到新的离心管，加入1/10体积的NaAc后再加入2倍体积的100％乙醇(-20℃)或者0.6-1体积的异丙醇。

17)4℃，10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀。

18)用10mL 70％乙醇洗涤沉淀，将沉淀悬浮即可。

19)再用10mL100％乙醇洗涤沉淀。

20)将DNA干燥并用无菌的DDW或者TE 0.5-2mL，4℃溶解过夜并于-20℃保存。干净的DNA块体几个小时将完全溶解。必要的话加热到70℃，5min将DNA溶解。提取过程从第10步开始要注意动作不要太剧烈防止基因组DNA链断裂。

实施例2 亚油酸合成酶基因的PCR扩增及T-DNA载体的构建

以禾谷镰刀菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，以FgLAI12-LB-F：GGAAGCTT CAAAGCGGCAACA和FgLAI12-LB-R：GGACTAGT TTCCCATCAACAACATA；或者FgLAI12-RB-F：GCGGGCCC GGCTTATCTCAACGACA；和FgLAI12-RB-R：GCGAGCTC TACCCTGAATCCAACAT为引物扩增亚油酸合成酶基因。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段。回收方法参照TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行(注意：第一次加入EB后，室温放置2～3分钟后，12000r/min离心1min，离心后应将回收产物用枪回加回吸附柱离心，重复2～3次该操作，以提高回收效率)。

酶切：用与上游酶切HindIII、SpeI和下游酶切SacI、ApaI对实验材料以及载体Prf-HU2进行双酶切。

回收酶切产物：将上述所得酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段。回收方法参照TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行(注意在第一次加入EB溶解后，先放置2～3分钟后再离心，离心后应将回收产物用枪回加如吸附柱离心，重复2～3次，以提高回收效率)。

酶切产物与目标载体连接：

DNA片段加入体积与载体加入体积计算方法的摩尔比为1:6。

实施例3 基因敲除与突变体的鉴定

禾谷镰刀菌孢子的培养：

1)从超低温冰箱中取出保存好的Fg180378的菌株，接种于SNA培养基，25℃下培养4-5d。

2)挑取活化后菌丝放入CMC培养基中，25℃下180r/min震荡培养3-4d。

3)使用双层纱布过滤掉菌丝，滤液在3000r/min下离心5min收集孢子。

4)用20mL灭菌后的ddH₂O重悬孢子，3000r/min离心5min后弃上清。

5)用5mL灭菌后的ddH₂O重悬孢子，保存于-20℃下备用(若想长期保存则加入20％的甘油保存于-70℃的超低温冰箱)。

6)孢子使用前需进行记数，并用灭菌后的ddH₂O将孢子浓度调到1×10⁶个/mL。

农杆菌诱导培养：

1)将已转入pRF-HU2载体的农杆菌ALG-1在含Kan(卡纳青霉素)100mg/L的LB培养基上划线。

2)约24h后挑取单菌落放入含Kan 100mg/L、Rif(利福平)25mg/L的MM培养基中，28℃、180r/min震荡培养2d。

3)室温3000r/min离心5min，收集菌体。

4)以等体积，含200μM乙酰丁香酮(AS)的IM培养基重悬菌体，28℃、180r/min震荡培养6h，使农杆菌的OD₆₀₀＝0.8。

禾谷镰刀菌和农杆菌的共培养：

使用诱导培养后的农杆菌与新鲜的禾谷镰刀菌孢子悬浮液按1:1的比例混合，取200μL的混合液样品喷洒到尼龙膜上(3×3cm)，置于含200μM AS的IM固体培养基上，25℃避光培养2d。

敲除突变体的潮霉素筛选和分离纯化：

1)取出禾谷镰刀菌与农杆菌共培养2d后的尼龙膜，将其剪成小块(3×0.1cm)，反向放入含100mg/L潮霉素B、100μM的链霉素和200μM的氨噻肟头孢霉素的SNA培养基中，25℃避光培养6d。

2)挑出能在培养基上生长的菌落，转入含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中。

3)6d后选取能在培养基中稳定生长的菌落，转入普通SNA培养基中活化4d。

4)将活化后的菌落转入CMC培养基中培养孢子，孢子的培养方法按2.1进行。

5)获得的孢子梯度稀释10^-3、10^-4、10^-5倍，取100μL均匀涂在普通SNA培养基中，25℃培养3d。

6)挑取长出的单菌落，转移到含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中，25℃避光继续培养5d，观察这些单菌落是否能够生长。

7)将在含100mg/L潮霉素B的SNA培养基中能稳定生长的单菌落转到普通SNA培养基中，25℃下继续培养3-5d。将长出的菌丝放入20％的甘油溶液中，置于-70℃的超低温冰箱中保存。

敲除突变体的分子鉴定：

本实施例采用PCR筛选法，对潮霉素基因和目的基因内部基因序列设计引物，若没有扩增到与野生型一样的条带，就说明在该突变体中，潮霉素基因很可能已经成功地替换目的基因，反之，说明潮霉素并没有正确地进行同源重组。在此基础上，再以目的基因上游序列设计正向引物和潮霉素基因内部设计反向引物进行PCR检测，检测引物为P5ACATGCCATTGTGATTG和P6AGGTGCGGTTGCTG，P7CTGACCAGTTGCCTAA和P8ACAGTTCATTCCGAGAC，以野生型FG180378作为阴性对照，扩增得到预期片段，并测序与预期序列对比验证。

实施例4 亚油酸合成酶活性测定和细胞色素P450酶检测

亚油酸代谢产物HPLC-MS的测定：取1×10⁵个禾谷镰刀菌分生孢子，放入我们改良的SNA(1g KH₂PO₄,1g KNO₃,0.5g MgSO₄,0.5g KCl,5g glucose,5g sucrose,and 1L ddH₂O)液体培养基中，在28度，130r/min，培养6天。然后加入50mg亚油酸进行诱导培养5-6小时。然后用液氮研磨粉碎，加入10ml改良后的磷酸缓冲液(0.2mol/L/蔗糖，100mmol/L Tris,10mmol/L EDTA,10mmol/L DTT,15％甘油)。放入冰上10min。然后9000r/min,离心5min，取上清液，加入20mg亚油酸，在冰上放置30min。用SepPak/C18固相萃取柱进行萃取，用2ml甲醇溶解。然后上超高校液相质谱检测(HPLC-electrosprayionization-MS)。HPLC柱子选用Agllent technologles公司(5μm,250×4.6mm；C₁₈ 100A)。UHPLC-MS选用UHPLC-Xevo^TMTQ-MS。程序采用下表程序,毛细管温度为230度，毛细管电压为4.5KV，碰撞能量为40％的MS-MS分析。

HPLC程序：

表1亚油酸代谢产物HPLC-MS的测定HPLC的程序设定

GC-MS分析亚油酸含量变化：采用6890N Network GC system(Agilent Technologies,china)仪，柱子采用非极性柱子(30m,DB-5；J&W Scientific,Folsom,CA；film,0.25μm；diameter,0.25mm；carrier gas He,15psi)，然后用5973Network Mass selective Detector(made in USA foreign components)分析。程序采用80to 200℃at40℃/min,to 260℃at 28℃/min,然后以3℃/min升高温度到285℃，分流比为20:0。

细胞色素P450酶检测

取1×105个禾谷镰刀菌分生孢子，放入我们改良的SNA(1g KH2PO4,1g KNO3,0.5g MgSO4,0.5g KCl,5g glucose,5g sucrose,and 1LddH2O)液体培养基中，在28度，130r/min，培养6天。然后用双层纱布过滤，液氮研磨。加入1ml改良过的磷酸缓冲液。然后9000r/min,离心30min，取上清液，然后16000r/min离心60min，将微粒体细胞色素P450酶液加4ml AS1缓冲液，加入5mg连二亚硫酸钠，反应4min，将其平分到比色皿中，在紫外分光光度计上扫描基线，然后向样品杯中通入CO60s，稳定5min，在波长400—500nm范围内扫描得到P450-CO复合物吸收光谱。根据以下方法测定细胞微粒中蛋白质含量和CO的实验室制备，并根据计算公式出细胞色素P450酶含量。蛋白质含量的测定：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％的乙醇中，加入100ml85％(W/V)的磷酸，待用时将溶液稀释到1000ml。称取50mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容到50ml容量瓶中，配成浓度为1mg/ml的标准蛋白溶液。取7支试管分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml 1mg/mL标准液，用蒸馏水补足2ml。取8支试管，0号试管加0.1ml的蒸馏水，1—7号试管分别加入0.1ml(2)中的标准蛋白稀释液，然后加5ml考马斯亮蓝染色剂，充分振荡，反应2分钟后于595nm处测定吸光值。绘制标准曲线。将样品稀释到蛋白浓度约为0.1—0.8mg/ml，取0.1ml样品再加5ml考马斯亮蓝G-250，混匀后振荡，反应2分钟后于595nm处测定OD值，以蒸馏水为空白凋零。在依据标准曲线，算出样品蛋白浓度。根据图2(D)所示的突变株中P450酶的含量也有显著降低。

HPLC的具体检测结果见图2(A)和(B)，图2(A)为敲除突变体和野生型中代谢产物的HPLC的检测结果，图2(B)为亚油酸标准品HPLC的检测结果。由HPLC检测结果可知，确定这两种物质为亚油酸和硬脂酸。

GC-MS检测结果见图3，通过质谱分析，进一步确定了这两种物质为亚油酸和硬脂酸。

图2(C)是HPLC检测亚油酸含量的变化数据结果。

图2(D)是P450酶含量的变化数据结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述PCR筛选法所用的引物为：

a：ACATGCCATTGTGATTG；

b：AGGTGCGGTTGCTG；

c：CTGACCAGTTGCCTAA；

d：ACAGTTCATTCCGAGAC。

3.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述的亚油酸的代谢通过HPLC-MS的方法和GC-MS的方法测定。

4.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述的细胞色素合成酶P450的代谢通过P450-CO复合物吸收光谱检测。

5.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：亚油酸合成酶基因FGSG_02668的敲除包括以下步骤：

a1)构建T-DNA载体；

a2)进行T-DNA载体转化农杆菌及阳性克隆的筛选；

a3)通过农杆菌侵染，敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因。

培养禾谷镰刀菌孢子；

诱导培养农杆菌；

共培养禾谷镰刀菌和农杆菌；

敲除突变体的潮霉素筛选和分离纯化。

7.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述步骤a1)具体为：

获取禾谷镰刀菌基因序列信息；

提取禾谷镰刀菌基因组DNA；

8.根据权利要求7所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述PCR扩增用的引物为：

FgLAI12-LB-F：GGAAGCTT CAAAGCGGCAACA；

FgLAI12-LB-R：GGACTAGT TTCCCATCAACAACATA；

FgLAI12-RB-F：GCGGGCCC GGCTTATCTCAACGACA；

FgLAI12-RB-R：GCGAGCTC TACCCTGAATCCAACAT。

9.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，步骤a2)中所述的T-DNA载体转化的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

10.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，步骤a2)中所述的阳性克隆的筛选中的检测引物为：

P1：CTTTTCTCTTAGGTTTACCCG；

P2：TAATGCAGGAGTCGCATAAG；

P3：CCCAAAAAGTGCTCCTTCAA；

P4：TGTGCTGCAAGGCGATTAA。