CN112358977B - 一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌及其分离应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，分类命名为苜蓿根瘤菌属SA‑17(Sinorhizobium SA‑17)，于2020年7月10日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2020300，本发明还公开了一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的分离方法和应用方法，本发明苜蓿根瘤菌不同于现有的氢氧化细菌，丰富了氢氧化细菌资源，能够促进植物生长。

Description

一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌及其分离应用方法

技术领域

本发明属于土壤微生物技术领域，涉及一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌及其分离应用方法。

背景技术

在农业生产系统中利用植物根际促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)已经成为了目前一种主流的思想，因为它在植物生长调节和应对非生物胁迫方面效率很高。这些细菌通过产生植物激素和相关代谢产物来促进植物生长，并使植物具有应对土壤中病害和非生物胁迫的潜力，例如改善植物与水的关系和植物的营养状况，并激发防御机制来克服不利的环境条件。在豆科植物中根瘤菌与宿主植物产生根瘤，在根瘤中类菌体和豆科植物共建一个共生体系，形成了高度复杂的系统。根瘤菌把空气中的氮气转化为氨，并输出到豆科植物，这一共生机制和它带来的经济效益一直是各国科学家研究的热点。氢气作为豆科植物固氮过程中释放的副产物，对于根际促生菌具有十分重要的影响，对于能够利用氢气作为电子供体，二氧化碳作为唯一能源的这一类细菌称为氢氧化细菌。

在农耕生活中，人们发现豆科植物的轮作间作可以起到增产的作用，在这些豆科植物的根际土壤中分离筛选氢氧化细菌。许多研究发现分离的氢氧化细菌产IAA，产铁载体，产ACC脱氨酶等能力都较高，且一些盆栽实验证明植物的穗长，株长也确实有增加。作为豆科植物根际土壤微生物一类特殊的种群，研究此类微生物对农业的发展具有重要的价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，不同于现有的氢氧化细菌，丰富了氢氧化细菌资源，能够促进植物生长。

本发明的第二个目的是提供一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的分离方法。

本发明的第三个目的是提供一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的应用方法。

本发明所采用的第一技术方案是，一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，分类命名为中华根瘤菌SA-17(Sinorhizobium sp.SA-17)，于2020 年7月10日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉保藏编号为CCTCC NO：M2020300。

本发明的技术特征还在于，

苜蓿根瘤菌能够在矿质盐培养基上形成乳白色的圆形菌落。

苜蓿根瘤菌的个体形态是杆状，革兰氏染色为阴性。

本发明所采用的第二技术方案是，一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的分离方法，包括以下步骤：

步骤1，样品采集，采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

步骤2，土壤富集，将采集的根际土壤置于持续通H₂的培养装置中，富集土壤中的苜蓿根瘤菌；

步骤3，菌种分离与纯化，将土壤稀释涂布于矿质盐培养基的平板表面，置入密闭容器中，室温倒置培养，待平板上长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，获得纯化后菌落；

步骤4，菌种筛选，采用气相色谱仪对纯化后菌落进行检测，并筛选出其中的苜蓿根瘤菌种。

步骤1中，不含吸氢酶的结瘤豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，采集根际土壤的范围是距离根瘤5mm以内。

步骤2具体包括将采集的根际土壤置于锥形瓶中，然后在锥形瓶中加入无菌水，将根际土壤倍比稀释至10^-9～10^-12，涂布于矿质盐培养基上，倒置在改良的气体培养体系中，所述气体培养体系中的氢气含量为1.4mmol/L，常温下富集培养土壤中的苜蓿根瘤菌。

步骤3中的矿质盐培养基组分为：NaNO₃·1.8g～2.2g，KH₂PO₄·0.13g ～0.15g，K₂HPO₄·1.0g～1.3g，酵母膏0.01g～0.03g，MgSO₄·7H₂O·0.4～0.6g， Fe(SO₄)·3H₂O0.0lg～0.02g，KCl 0.5g，琼脂15g～17g，蒸馏水0.9L～1.1L， pH值7.1～7.3。

步骤4中采用的气相色谱仪内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N₂，流速20mL·min^-1，进样口温度：148℃～155℃，检测器温度： 158℃～162℃，检测温度：38℃～42℃，分析时间3min～5min。

本发明所采用的第三技术方案是，一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的应用方法，将苜蓿根瘤菌稀释液与吸附剂混合，制成固体菌剂或有机化肥。

本发明在具体使用时，是将其制成微生物菌剂。

苜蓿根瘤菌制剂的具体制备过程如下：

(1)菌株：上述分离纯化出的较强氧化能力H₂的氢氧化细菌苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium，SA-17)；

(2)发酵培养：接种新鲜的氢氧化细菌到三角瓶，放入摇床，转速 180r/min，28℃摇瓶培养36h；

(3)菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂；

(4)田间试验：在西北大学试验田进行。设SA-17、营养液、空白对照3 个处理，每个处理用土埂隔开，每隔5天调查促生效果。

本发明的有益效果是，苜蓿根瘤菌SA-17是一种不同于现有氢氧化细菌的新型氢氧化细菌，丰富了氢氧化细菌资源，可将其制备成处理种子的菌液或有机肥料，能够促进植物生长，提高农作物产量、肥效和抗逆能力；也能制成植物病原生长抑制剂。

附图说明

图1是本发明实施例中α-酮丁酸标准曲线；

图2是牛血清蛋白标准曲线；

图3是IAA标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1苜蓿根瘤菌SA-17的分离纯化和氧化氢能力测定

本发明的苜蓿根瘤菌SA-17为在28℃的MSA培养基中培养的革兰氏阴性杆状细菌。其鉴定特征如下：

1、生理生化特征

SA-17的生理生化特征显示在表1中，SA-17菌株呈杆状，革兰氏染色阴性。在MSA半固体培养基上28℃培养可形成菌落，呈圆形、乳白色。

表1 SA-17菌株生理生化特征

附注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。

2、对苜蓿根瘤菌SA-17菌株的16SrDNA扩增以及序列测定

菌株的16SrDNA序列测定及系统发育树构建按如下步骤进行，模板 DNA的提取按照UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒上的标准步骤执行，具体步骤如下：

(1)收集并裂解细菌SA-17

A.向离心管中加入1mL活化24h(30℃，180r/min)的待测菌悬液，于离心机中10000r/min离心30s，收集菌体沉淀，弃上清液；

B.取180μL Digestion Buffer加入离心管中，于漩涡振荡器上轻轻振荡使菌体重悬，然后向菌体悬浮液中加入20μL Proteinase K溶液，并充分混匀。水浴锅中56℃水浴30min，期间将离心管轻轻颠倒混匀，直至菌体细胞完全裂解。

(2)向上述离心管中加入200μL BD Buffer，70℃水浴10min使溶液澄清，期间将离心管反复颠倒混匀。

(3)取200μL无水乙醇加入上述离心管中，充分颠倒混匀。

(4)将吸附柱放入收集管中，将离心管中溶液和悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，离心后(12000r/min，3min)弃上清。取500μL PW Solution 加入吸附柱中，离心后(10000r/min，1min)再次弃上清。取500μL Wash Solution再次加入吸附柱中，离心后(10000r/min，1min)弃上清。吸附柱放回收集管中后继续离心(12000r/min，2min)，去除残留的乙醇。取干净的 1.5mL离心管放入吸附柱，于吸附膜中央处加入100μL的ElutionBuffer(2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，事先预热至60℃)，静置3min后离心(10000r/min，1min)收集DNA，得到的DNA溶液-20℃保存或用于后续试验。

(5)基因组DNA得到后，以27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)为通用引物对菌株的16S rDNA 片断进行扩增。PCR反应体系为：模板DNA 0.5μL，5×Buffer 2.5μL，dNTP (各2.5mM)1μL，上下游引物各0.5μL，加dd H₂O至25μL。PCR循环条件为：98℃预变性3min，98℃25s，55℃25s，72℃1min，第2～4步30个循环，72℃10min终止延伸，4℃终止反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 (琼脂糖浓度为1％，电泳条件为150V，20min)后，观察电泳结果。PCR 产物由生工生物(上海)有限公司进行纯化和测序，序列在NCBI数据库中经 BLAST比对后，结果显示，菌株SA-17的序列与Sinorhizobium序列相似度为100％，据此可以确定菌株SA-17在分子系统发育分类学上属于 Sinorhizobium。

本发明的苜蓿根瘤菌SA-17的分离培养方法首先是利用持续通H₂的培养装置实现对土壤样品的富集，然后将其稀释涂布于MSA培养基平板，筛选能够以H₂为能源并同化CO₂为唯一碳源的菌株，进而纯化并转接MSA培养基斜面，再进行氢化酶和菌株自养能力的鉴定，从而筛选菌株。最后分析该菌株在促进植物生长中的作用。

苜蓿根瘤菌SA-17最优菌株的筛选具体包括以下步骤：

(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物大豆根际土壤；

(2)土壤富集与分离纯化：采集的根际土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养。待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，将菌株转接斜面培养基，放入密闭干燥器中，按上述通H₂的量培养，备用；

(3)菌种筛选：将上述氢氧化细菌经牛肉盖蛋白胨培养基活化后，接种于配置有10mL MSA培养基的玻璃培养瓶中，待长出完整菌苔后，利用进样器在培养瓶中注入氢气，每株氢氧化细菌设置三个重复。每株氢氧化细菌均设立未经氢气处理的空白对照。将密闭玻璃培养瓶在28℃水平放置于摇床上90r/min培养72h，在同样的气相色谱条件下检测氢气的终浓度。色谱条件见表2，通过计算培养72h后玻璃培养瓶内氢气浓度差，检测菌株是否具有氧化氢气的能力及氧化氢气能力的大小。筛选出具有较强氧化能力H₂的氢氧化细菌—Sinorhizobium SA-17。

表2气相色谱仪thermo trace1300色谱条件

上述步骤(1)中的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5mm以内。

上述步骤(2)采集的根际土壤加入无菌水置于锥形瓶中，稀释至10^-11，涂布于矿质盐培养基上，倒置在改良的气体培养体系中，氢气含量为1.4 Mmol/L，常温下富集培养土壤中的苜蓿根瘤菌SA-17。其中，矿质盐培养基： NaNO₃ 2.0g，KH₂PO₄ 0.14g，K₂HPO₄ 1.2g，酵母膏0.02g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，Fe(SO₄)·3H₂O 0.0l g，KCl 0.5g，琼脂16g，蒸馏水1L，pH值7.2。

实施例2SA-17菌株ACC脱氨酶活性的测定：

ACC脱氨酶即1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨 (1-aminocyclopropane-1-carboxylatedeaminase)活性测定方法是根据Penrose 的方法进行改进，该方法是测量ACC脱氨酶分解ACC时产生的α-酮丁酸的量。通过比较样品在540nm处的吸光度与α-酮丁酸在0.1-1.0mmol范围内的标准曲线，确定了该反应生成的α-酮丁酸的摩尔数。

标准浓度曲线的绘制：在0.1M Tris-HCl(pH8.5)中制备1mMα-酮丁酸原液，并在4℃下储存，使用前稀释为10mM的溶液，并制成0.1-1.0mmol 的α-酮丁酸标准液，取标准液400μL加入3.2mL 0.6mol/L HCl和600μL 2， 4-二硝基苯肼试剂，充分搅拌，30℃水浴30min(α-酮丁酸酯衍生化为苯腙) 加入4mL 2M氢氧化钠使苯腙充分显色，混合均匀后在540nm处测定吸光度，α-酮丁酸标准曲线如图1所示。

制备细菌细胞悬液：细菌首先在牛肉膏蛋白胨固体培养基中活化培养，然后转移到含有ACC的MSA培养基中。细菌细胞生长到对数中期，将15mL MSA培养基分装两个培养管中，每管接种5mL菌株。培养物在200r/min、 28℃条件下培养24h。在4℃下离心10min，去除上清液，收集积累的菌体沉淀，用5mL DF盐培养基缓慢洗涤细胞。在4℃、6000r/min离心15min 后，将细胞悬浮在7.5mL DF盐培养基中，将冷冻的0.5M ACC溶液解冻，并向细胞悬液中加入45mL等量的ACC以获得3.0mM的最终ACC浓度。在200r/min、28℃、24h后收集细菌，在4℃下6000r/min离心15min，除去上清液，并将细胞颗粒悬浮在5mL0.1M pH7.6 Tris-HCl中。在4℃、6000 r/min离心15min后，去掉上清液。重复洗涤三次。保存于-20℃冰箱备用。将细胞悬液转移至1.5mL的微离心管中。15000r/min离心5min，除去上清液。再悬浮在900mL0.1M(pH8.5)Tris-HCl中，加入45μL甲苯，震荡30 s，300mL储存在4℃下，进行蛋白质分析。

ACC脱氨酶活性测定：剩余的甲苯化细胞悬液立即检测ACC脱氨酶活性。所有样品均分为三份。将200μL甲苯化细胞放入1.5mL的微离心管中，向悬液中加入20mL 0.5M ACC，短暂搅拌，28℃下水浴20min。加入1mL 0.56M盐酸，摇匀并8000r/min条件下离心20min。将1mL上清液与600mL 0.6M盐酸混匀，加入300mL的2,4-二硝基苯肼试剂，震荡，在28℃水浴下30min。随后加入2mL 2M NaOH混合均匀，在540nm处测量混合物的吸光度。并测定菌体蛋白含量，计算出ACC脱氨酶活性，以每毫克蛋白质每小时产生的α-酮丁酸(μmol/mg h)表示，牛血清蛋白标准曲线如图2所示。

结果显示：苜蓿根瘤菌SA-17的ACC脱氨酶的活力为72.85μmol/mg·h

实施例3SA-17菌株分泌IAA能力的测定：

IAA标准曲线的绘制

精确配置各种浓度的IAA标准液，用流动相对其定容并充分溶解，标准液放入棕色瓶中备用，利用高效液相色谱仪进行测定，利用色谱面积绘制标准曲线(见图3)。

菌株IAA含量的测定：

将筛选出的氢氧化细菌在MSA液体培养基中培养16h，以1800r/min 离心20min，然后用Whatman GF/F滤纸过滤。过滤后，每个培养基样本都添加1000ng氘代吲哚-3-乙酸(D2-IAA)。冰冻琼脂样品解冻，加入甲醇，琼脂中加水。然后加入氘代吲哚-3-乙酸(500ng)，样品在-15℃下萃取24h，过滤后，液体和琼脂提取物在真空中取到水溶液中。在pH为3的条件下，萃取物与乙醚进行3次分配，然后将结合的醚相蒸发至干燥。最后，样品溶于 40％甲醇0.1M醋酸溶液中，进行高效液相色谱分析。分离过程的所有阶段都在铝箔覆盖的容器中进行的。

高效液相色谱使用Hypersil ODS色谱柱分次进行。流速为5cm/3min，用40％甲醇0.1M醋酸溶液洗脱。每分钟收集一次组分，IAA在6到7次后洗脱。将含有IAA的馏分干燥。

结果显示：菌株SA-17的分泌能力为30.247μg/mL。

实施例4菌株产铁载体能力的测定：

将氢氧化细菌稀释液涂布在MKB培养基平板上，待菌落长出后覆盖一层CAS蓝色培养基，观察菌落周围颜色变化，15min内与CAS发生颜色变化的菌株为PSSP(Potentiallystrong siderophore producers)；而12h颜色变化不明显的菌株被定义为BSP(Borderlinesiderophore producers)，将PSSP 菌株划线纯化。挑取单菌落于液体MKB培养基中，28℃、250r/min培养24 h后，8000r/min离心10min，取4mL上清液与4mL CAS溶液混合，室温下静置1.5h，在680nm下测定吸光度。用铁载体活性单位(Siderophore units， SU)表示铁载体的产量，计算方式如下：

SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％

式中，Ar是未接种的培养基与等体积CAS混合A680；As是菌株上清与等体积CAS混合A680。

此外，对细菌产铁载体能力进行划分，As/Ar＝0-0.2记作“++++”每增加 0.2就减少一个“+”。

结果显示：菌株SA-17为铁载体阳性菌株。

实施例5盆栽实验

用无菌水将玉米种子浸泡24h。将保存的SA-17菌种在牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化，并在摇床中培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，离心，去上清，将沉淀菌体用无菌水重悬，即得到处理种子的菌液。营养土和蛭石配比为1：1， 121℃灭菌20min。在托盘中放入蛭石，将预处理的种子进行萌发，待幼苗长至两叶一心时，选取长势一致的幼苗移栽至花盆中，每盆移2株，移栽时记录幼苗的根长和株高，并把幼苗移栽至相同高度。4种处理组合如下：空白对照组记作KA组。加菌组：记作KB组。其中：加菌方式为根灌方式，每次在根际周围浇1mL的处理种子菌液，每隔2d浇一次；每种组合3次重复，室温培养，每个托盘每次浇1.5L的水，每隔3d浇一次水，室温培养15 d后，测量移栽前和移栽后培养15d后的株高和根长，并计算株高和根长变化量。结果显示在表3：

表3苜蓿根瘤菌SA-17对玉米幼苗生长的影响

由表3中内容可知，经苜蓿根瘤菌SA-17处理过的玉米幼苗与空白对照组相比，根的长度比无菌的空白对照组增加了约41.67％，植株高度比无菌的空白对照组降低了约54.55％，鲜重比无菌的空白对照组增加了约104％，干重比无菌的空白对照组增加了约100％，表明本申请苜蓿根瘤菌SA-17能够显著促进玉米根部的生长，抑制玉米枝茎的向上生长，进而提高玉米植株的抗倒伏性和抗逆能力。

Claims (4)

1.一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，其特征在于，所述苜蓿根瘤菌的分类命名为中华根瘤菌SA-17(Sinorhizobiumsp.SA-17)，于2020年7月10日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2020300。

2.根据权利要求1所述的一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，其特征在于，所述苜蓿根瘤菌能够在矿质盐培养基上形成乳白色的圆形菌落。

3.根据权利要求2所述的一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌，其特征在于，所述苜蓿根瘤菌的个体形态是杆状，革兰氏染色为阴性。

4.如权利要求1-3中任一所述的一种具有促生作用的苜蓿根瘤菌的应用方法，其特征在于，将苜蓿根瘤菌稀释液与吸附剂混合，制成固体菌剂或有机化肥。

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