CN109161500B - 暹罗芽孢杆菌zj-2018-1及降解霉菌毒素的菌剂和应用 - Google Patents

暹罗芽孢杆菌zj-2018-1及降解霉菌毒素的菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJ‑2018‑1及其菌剂和应用。本发明从猪粪中分离得到暹罗芽孢杆菌，其对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1具有良好的降解作用，暹罗芽孢杆菌的制剂具有生产成本低、安全性高的特点。

Description

暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1及降解霉菌毒素的菌剂和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJ-2018-1及降解霉菌毒素的菌剂和应用。
背景技术
霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的对动物、人类和农作物具有较大毒性的次级代谢产物。目前对人和动物危害较大且被广泛研究的霉菌毒素主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)、T-2毒素、赭曲霉毒素A(OTA)以及伏马毒素(FUM)。
根据不同的技术原理，现有的脱毒方法可以大致可分为三类，即物理、化学和生物脱毒法。虽然物理、化学方法都能起到一定的去毒作用，但对霉菌毒素的去除效果不稳定，营养成分损失较大，成本高，难以规模化生产。生物脱毒法是利用微生物、植物及其代谢产物产生的酶来破坏毒素的结构，同时生成无毒降解产物的方法，此法具有条件温和，特异性强，脱毒效率高，产物无毒害等优势，另外，自然界微生物种类和数量都十分庞大，基因资源丰富，降解有机污染物的潜力巨大，几乎所有的环境有机污染物都能被微生物分解。
因此，为了避免物理、化学去毒法产生的不良效果，现在亟需从大量的自然资源中寻找和筛选能够高效降解霉菌毒素的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够降解霉菌毒素的暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)菌株。
本发明的再一目的在于提供含有上述暹罗芽孢杆菌菌株的液体菌剂。
本发明的再一目的在于提供含有上述暹罗芽孢杆菌菌株的固体菌剂。
本发明的再一目的在于提供上述暹罗芽孢杆菌菌株的应用。
根据本发明的具体实施方式，本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJ-2018-1，于2018年07月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCCNo.16137。
根据本发明的具体实施方式，本发明的暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1的生物学特性为在LB培养基平板上，37℃，培养24h，菌落形态为菌落呈象牙白，不透明，不规则的圆形，表面扩散，边缘整齐，有褶皱凸起，好氧；细胞短杆状，常单个存在，革兰氏阳性；接触酶阳性，氧化酶阳性，明胶水解阳性，过氧化氢酶阳性，甲基红试验阴性，能水解淀粉，利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇。
根据本发明的具体实施方式，用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将暹罗芽孢杆菌原活化后，接种于试管斜面上，得到试管菌种；
(2)将步骤(1)的试管菌种接种到含有LB培养基的三角瓶中，培养至对数期，得到菌液；
(3)将步骤(2)的菌液按5％的接种量接种到含有LB培养基的种子罐中，培养至对数期，得到种子液；
(4)将步骤(3)的种子液按5％的接种量接种到含有LB培养基的发酵罐中发酵培养，得到所述液体菌剂。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，步骤(3)中，菌液的培养条件：搅拌速度为150～250r/min，无菌空气通入量为1:0.8～1，培养时间9-14h。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，步骤(4)中，种子液的发酵条件：搅拌速度为200～240r/min，无菌空气通入量为1:0.8～1，培养时间16～36h，pH为6.5～7.5。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，步骤(4)得到的液体菌剂中的菌体数量大于1×1010cfu/mL。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将暹罗芽孢杆菌原活化后，接种于试管斜面上，得到试管菌种；
(2)将步骤(1)的试管菌种接种到含有LB培养基的三角瓶中，培养至对数期，得到菌液；
(3)将步骤(2)的菌液按5％的接种量接种到含有LB培养基的种子罐中，培养至对数期，得到种子液；
(4)将步骤(3)的种子液按5％的接种量接种到含有LB培养基的发酵罐中发酵培养，得到液体菌剂；
(5)将步骤(5)得到的液体菌剂的浓缩液与谷物皮壳按照体积质量比1:2～4混合后，风干至水分含量低于10％，得到所述固体菌剂。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，将步骤(4)得到的液体菌剂浓缩至液体菌剂原有体积的1/4，得到所述浓缩液。
根据本发明具体实施方式的用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，步骤(5)中，谷物皮壳包括麸皮、玉米芯粉和/或稻壳粉。
根据本发明的具体实施方式的暹罗芽孢杆菌的(Bacillus siamensis)ZJ-2018-1可用于降解玉米赤霉烯酮，或用于降解黄曲霉毒素B1，或者用于同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1。
本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJ-2018-1，该菌株从猪粪便中分离，能降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1，对玉米赤霉烯酮的降解率能达到100％，对黄曲霉毒素B1的降解率能达到90％以上；在解决毒素污染过程中，不存在二次污染。使用暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1生产降解霉菌毒素的各种制剂具有生产成本低、使用安全、抗逆性强、易于保存等特点，在开发新的生物解毒菌剂方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1培养液对玉米赤霉烯酮的降解作用色谱图；
图2为暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1培养液对黄曲霉毒素B1降解作用色谱图。
暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJ-2018-1，于2018年07月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.16137。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
LB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)和氯化钠(NaCl)，溶剂为水；胰蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为1％，酵母提取物在LB液体培养基中的浓度为0.5％，NaCl在LB液体培养基中的浓度为1％，所述％均为质量体积百分比(g/100mL)，pH 7.0～7.2。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g:100mL)，得到LB固体培养基。
实施例1.获得暹罗芽孢杆菌ZJ-2018-1
1.菌株的分离
从河北保定汉唐牧业养殖场采集猪粪便样品，称取0.5-1g左右粪便样品到10mL无菌水中，100rpm摇床震荡3h后静置10min，取上清液100μL加入到10mL含终浓度30ppm ZEA的LB液体培养基中摇床驯化培养，摇床转速为180r/min，摇床温度37℃，驯化时间为一周。如此传代驯化2-3次。
将最后一次驯化培养后的菌液用无菌水进行浓度梯度稀释后涂后在LB培养基平板上，37℃条件下培养48h，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株一一验证对玉米赤霉烯酮的降解效果。将降解玉米赤霉烯酮能力最强的菌株命名为ZJ-2018-1。
2.菌株的鉴定
提取暹罗孢杆菌ZJ-2018-1总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，得到长度约为1382bp的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序。把测序结果在GenBank进行BLAST比较，确定ZJ-2018-1的系统发育进化地位，将菌株ZJ-2018-1鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)。
该菌株的生物学特性为在LB培养基平板上，37℃，培养24h，菌落形态为菌落呈象牙白，不透明，不规则的圆形，表面扩散，边缘整齐，有褶皱凸起，好氧；细胞短杆状，常单个存在，革兰氏阳性；接触酶阳性，氧化酶阳性，明胶水解阳性，过氧化氢酶阳性，甲基红试验阴性，能水解淀粉，利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇。
实施例2.制备液体菌剂
(1)将ZJ-2018-1菌株原种在LB固体培养基上活化，并测试降解性能，接种于LB试管斜面上获得试管菌种备用。
(2)挑取斜面菌种接种到含200mL LB新鲜培养基的1L三角瓶中，37℃，200rpm摇床培养至对数期，获得菌液。
(3)将上述培养好的菌液按5％接种量接种入200L种子罐含中进行培养，种子罐中含130L LB培养基，此培养基经121℃高压蒸汽灭菌并冷却至37℃。培养条件：搅拌速度为200r/min，无菌空气通入量为1:0.8，培养时间9-14h，培养至对数生长期，获得种子液。
(4)将获得的种子液按5％接种量接种入2吨发酵罐进行发酵生产，发酵罐中含1400L LB培养基，发酵条件：搅拌速度为220r/min，无菌空气通入量为1:0.8，培养时间16～36h，pH控制在6.5-7.5之间，在线补加消泡剂。发酵结束后菌体数量达到1×1010cfu/mL以上，出罐形成ZJ-2018-1液体菌剂。
实施例3.固体菌剂的制备
将实施例2中生产出来的液体菌剂浓缩至原体积的1/4体积，与麸皮按1:3(L:kg)的比例混合均匀，经自然风干至水分含量低于10％，从而制成ZJ-2018-1固体菌剂。
实施例4.验证对玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1的降解作用
1.ZJ-2018-1培养液对玉米赤霉烯酮的降解作用
(1)玉米赤霉烯酮溶液的配制
将10mg玉米赤霉烯酮标准品(Sigma-Aldrich，货号Z2125)溶解于10mL色谱纯甲醇中获得浓度为1000ppm的玉米赤霉烯酮溶液。
(2)降解玉米赤霉烯酮
实验组：取200μL 1000ppm玉米赤霉烯酮溶液加入到含10mL LB培养基的三角瓶中，使其终浓度约为20ppm。按107cfu/mL接种ZJ-2018-1菌液，充分混匀，在37℃，转速为200r/min的条件下振荡培养48h。
对照组：以不接种ZJ-2018-1培养液的含玉米赤霉烯酮的LB培养基作为对照组。
(3)玉米赤霉烯酮的检测
将实验组和对照组的反应液与甲醇以(1:1)的比例涡旋1min进行提取，12000r/min离心10min，取上清液过0.22μm的尼龙滤膜，最后使用HPLC-FLD对样品滤液进行检测。
HPLC检测条件为流动相乙腈:水:甲醇＝46:46:8(V:V:V)；流速1.0mL/min；色谱柱为C18 150mm×4.6mm×5μm；激发波长为235nm，检测波长为460nm；柱温30℃；进样量10μL。
玉米赤霉烯酮降解率(％)＝(对照组残留玉米赤霉烯酮含量-实验组残留玉米赤霉烯酮含量)/对照组残留玉米赤霉烯酮含量×100％。
色谱结果如附图1所示，对照组中玉米赤霉烯酮的保留时间约为7.1min，实验组色谱图中7.1min处没有色谱峰洗出，说明ZJ-2018-1培养液对玉米赤霉烯酮具有较好的降解效果，降解率达到100％。
2.ZJ-2018-1培养液对黄曲霉毒素B1的降解作用
配制100ppm黄曲霉毒素B1甲醇溶液，取400μL 100ppm黄曲霉毒素B1溶液加入到含10mL LB培养基的三角瓶中，使其终浓度约为4ppm。按107cfu/mL接种ZJ-2018-1菌液，充分混匀，在37℃，转速为200r/min的条件下振荡培养48h。以不接种ZJ-2018-1培养液的含黄曲霉毒素B1的LB培养基作为对照组。
将实验组和对照组的反应液与甲醇以(1:1)的比例涡旋1min进行提取，12000r/min离心10min，取上清液过0.22μm的尼龙滤膜，最后使用HPLC-FLD对样品滤液进行检测。
HPLC检测条件为流动相乙腈:水:甲醇＝22:56:22(V:V:V)；流速1.0mL/min；色谱柱为C18 150mm×4.6mm×3.5μm；激发波长为365nm，检测波长为430nm；柱温35℃；进样量10μL。
黄曲霉毒素B1降解率(％)＝(对照组残留黄曲霉毒素B1-实验组残留黄曲霉毒素B1含量)/对照组残留黄曲霉毒素B1×100％。
色谱结果如附图2所示，结果表明，ZJ-2018-1培养液对黄曲霉毒素B1具有较好的降解效果，降解率达到92.2％。
3.ZJ-2018-1菌剂对饲料原料中玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的脱毒效果
将受到霉菌污染的玉米粒粉碎，过筛，平均分成6份，分为实验组和对照组，每组设置三个重复，将实施例3中制成的固体菌剂按照10％的比例添加到实验组饲料中，混匀。
将对照组和实验组均按1:1(g:ml)的比例加入LB培养基，37℃作用48h后，分别10000rpm离心10min，取上清液，用LC-MS/MS检测上清液中玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的含量，并计算得出ZJ-2018-1固体制剂对不同种毒素的脱毒效果，结果如表1所示：
表1 ZJ-2018-1固体菌剂对ZEN和AFB1的脱毒效果
毒素 ZEN AFB1
脱毒效果(％) 94.4±2.3 88.3±3.1

Claims (10)

1.暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1的保藏编号为CGMCC No.16137。
2.用于降解霉菌毒素的菌剂，其特征在于，所述菌剂包含暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis）ZJ-2018-1，所述暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1的保藏编号为CGMCC No.16137。
3.用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1原种活化后，接种于试管斜面上，得到试管菌种；
（2）将步骤（1）得到的试管菌种接种到含有LB培养基的三角瓶中，培养至对数期，得到菌液；
（3）将步骤（2）得到的菌液按5%的接种量接种到含有LB培养基的种子罐中，培养至对数期，得到种子液；
（4）将步骤（3）得到的种子液按5%的接种量接种到含有LB培养基的发酵罐中发酵培养，得到用于降解霉菌毒素的液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述菌液的培养条件为：搅拌速度为150~250 r/min，无菌空气通入量为1:0.8~1，培养时间9~14 h。
5.根据权利要求3所述的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，种子液的发酵条件为：搅拌速度为200~240 r/min，无菌空气通入量为1:0.8~1，培养时间16~36 h，pH为6.5~7.5。
6.根据权利要求3所述的用于降解霉菌毒素的液体菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）得到的液体菌剂中的菌体数量大于1×1010 cfu/mL 。
7.用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1原种活化后，接种于试管斜面上，得到试管菌种；
（2）将步骤（1）得到的试管菌种接种到含有LB培养基的三角瓶中，培养至对数期，得到菌液；
（3）将步骤（2）得到的菌液按5%的接种量接种到含有LB培养基的种子罐中，培养至对数期，得到种子液；
（4）将步骤（3）得到的种子液按5%的接种量接种到含有LB培养基的发酵罐中发酵培养，得到液体菌剂；
（5）将步骤（4）得到的液体菌剂的浓缩液与谷物皮壳按照体积质量比1:2～4混合，风干至水分含量低于10%，得到所述用于降解霉菌毒素的固体菌剂。
8.根据权利要求7所述的用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，其特征在于，将步骤（4）得到的液体菌剂浓缩至液体菌剂原有体积的1/4，得到浓缩液。
9.根据权利要求7所述的用于降解霉菌毒素的固体菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述谷物皮壳包括麸皮、玉米芯粉和/或稻壳粉。
10.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）ZJ-2018-1在降解玉米赤霉烯酮和/或降解黄曲霉毒素B1中的应用。
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