CN104611271A - 一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法 - Google Patents

一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株，其菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日；该菌株是一株能够与紫花苜蓿建立良好的共生关系、固氮能力强的根瘤菌菌株，可有效提高紫花苜蓿的种植产量；同时，本发明还提供该根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，方法科学合理、简单易操作、能够较为精准地筛选出适合于当地气候、土壤以及与紫花苜蓿建立良好共生关系的高效固氮根瘤菌菌株。

Description

一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法
技术领域
本发明涉及的根瘤菌菌株及其筛选方法，具体地说是一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法。
背景技术
紫花苜蓿，原名：紫苜蓿，又名：苜蓿，拉丁文名：Medicago sativa ，豆科、属多年生草木植物，根粗壮，深入土层，根颈发达，是一种适口性好、营养价值和开发价值很高的牧草，业内有“牧草之王”的称号。紫花苜蓿的生长主要依靠根瘤菌与其建立共生关系共生固氮完成的。研究表明，根瘤菌与紫花苜蓿共生关系的建立是细菌、植物及环境三方相互作用的结果，所以无论是在紫花苜蓿的原产地还是引种地，只有接种适应于当地环境的根瘤菌并与紫花苜蓿建立良好的共生关系，才能有效保证紫花苜蓿的高产。目前，为提高紫花苜蓿产量，行业内主要通过以下两种方法来筛选菌株并接种生产的：第一、对分离紫花苜蓿的根瘤菌进行接种生产，一般以所结根瘤数较多的菌株作为筛选的菌株；该方法对分离的菌株未进行分类及剔除，所以筛选的菌株中部分可能不是根瘤菌菌株，而且从我们研究的结果也显示了部分所结根瘤数多的植株其干重并不一定高，也就是固氮效果并不一定好；第二、进行田间接种试验，仅依靠所结根瘤数和植物生长干重等来确定高效苜蓿根瘤菌菌株；这种方法虽在适应当地土壤环境较第一种方法有些许改善，但是仍然存在筛选菌株不纯的问题。可见，以上两种方法均依靠经验判断来筛选菌株，其方法欠科学、精准性差、所接种的根瘤菌杂菌多、纯度低、固氮效率低，更主要的是应用于某些特定土壤环境（如中度和中低度盐碱地土壤、滨海盐碱地、内陆盐碱地、南方酸性土壤，稻田土壤或山地土壤）等，难以与紫花苜蓿建立良好的共生关系以实现紫花苜蓿的高产目标。因此，能够研发出一种高效固氮根瘤菌菌株精准有效的筛选方法，并培育出适合于当地气候、土壤环境并与紫花苜蓿有效匹配共生固氮的高效新菌株，是当前行业内积极探索的课题。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法，以解决现有筛选方法得到的根瘤菌菌株类型混杂、固氮效率低、应用于紫花苜蓿生产中无法实现高产的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株，所述菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的高产紫花苜蓿根瘤菌菌株，其生物学特征如下：生长最适温度为28℃，好氧性培养物，在YMA培养基上菌落呈半透明，乳白色，圆形，边缘薄，中间厚，稀薄，生长时间48-72小时，菌落大小为3-5mm；细菌菌体杆状，具有折光性强的羟脂酸颗粒，占细胞的1/3体积，两端略圆，大小为2-3μm×3-5μm，革兰氏阴性菌，革兰氏染色为红色。
一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，包括以下步骤：
（a）对土壤种植的紫花苜蓿的根瘤进行取样，每颗根瘤经过分离和纯化获得一个菌株，得若干菌株；
（b）将所述若干菌株进行16S rDNA序列测定，将所测菌株的序列与GENEBANK数据库中根瘤菌类群的标准序列进行比对，将不属于根瘤菌类群的菌株剔除，将归属于根瘤菌类群的菌株保留；
（c）将保留的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE的电泳图谱指纹测定，得原接种菌株图谱类型；
（d）将保留的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，得菌体混悬液；
（e）在花盆中盛放由所述土壤、蛭石和沙子组成的混合培养基，播种紫花苜蓿种子，待种子发芽后，消毒，催芽至胚根为0.5-1.0cm时，即可将所述菌体混悬液中的菌株接种到种子上；生长45天后，检测其单株的根瘤数和干重，以其所结根瘤数多和单株干重高为综合选择目标，筛选出综合排名前5-10名的菌株；
（f）对步骤（e）筛选出的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，将菌体离心收集，并悬浮于生理盐水中；
（g）在小区试验地点的土壤环境中播种紫花苜蓿种子，接种步骤（f）所获得的悬浮于生理盐水中的菌株，待紫花苜蓿生长至开花初期，对植物单株干重、结瘤率以及氮含量进行检测，以单株干重、结瘤率以及氮含量高为综合指标，筛选3-4株备选菌株；
（h）同时对步骤（g）小区试验地点种植的紫花苜蓿开花初期的根瘤取样，将所采集的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记检测，将检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型比对，选出检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型一致性最高的菌株为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌的预定菌株；
（i）通过检测的指标值验证判断步骤（h）的预定菌株与步骤（g）的备选菌株的对应性，如果预定菌株为检测指标最理想的备选菌株，则为阳性，步骤（g）所筛选到的预定菌株即为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株；反之，若为假阳性，剔除，则选综合指标值次之的菌株与预定菌株进行对应，以此类推，得到高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株。
本发明中步骤（a）、步骤（e）和步骤（g）所述的土壤为普通土壤、酸性土壤、水稻土壤、山地土壤或盐碱地中的一种。
本发明中步骤（a）和步骤（g）所述的取样采用5点取样法，每个植株选择大颗的根瘤3-5个。
本发明中步骤（d）和步骤（f）所述的菌株斜面培养到对数生长期，所用的培养基为YMA，培养基的pH值为6.8−7.2，培养温度为28℃，所述YMA每升中含有：甘露醇10.00g、酵母粉0.80g、K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4 0.12g、NaCl 0.10g以及琼脂粉15.00g。
本发明中步骤（e）所述土壤、蛭石和沙子的比例为5:3:2。
本发明中步骤（h）中通过检测的指标值验证判断步骤（g）筛选到的预定菌株是否为阳性的评判方法是观察所检测到的紫花苜蓿的植物干重、结瘤率以及植物氮含量的值是否出现明显偏低及异常的情况，如果明显偏低及异常则为假阳性。
建议保藏方法：（1）盛有YMA的试管斜面加质量浓度为0.2%的CaCO3，室温保藏2个月为限，4℃冷藏可保存6个月，（2）甘油管保藏：将YMA培养的斜面菌体刮下，置于质量浓度为20%甘油，-80℃可保藏2年。
本发明以土壤中种植的紫花苜蓿的根瘤菌为取样前提，采用分子标记技术进行菌株的剔除和选择，最终筛选出适合当地土壤环境及紫花苜蓿的高效固氮根瘤菌菌株；其方法科学合理、简单易操作、能够较为快速和精准地筛选出适合于当地气候、土壤以及与紫花苜蓿建立良好共生关系的高效固氮根瘤菌菌株。本发明所筛选到的中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，是一株能够与紫花苜蓿建立良好的共生关系、固氮能力强、适应性好的根瘤菌菌株，该菌株与紫花苜蓿匹配亲和性好，在接种于紫花苜蓿的生产实践中，接种该菌株可使紫花苜蓿的种植产量得到显著提高。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
（1）采样及分离纯化：对河北沧州黄骅周边地区种植的紫花苜蓿，选择了长势较好且健壮的植株，在紫花苜蓿开花初期进行根瘤的采样，每个采样地点，采取5点取样法进行取样，每点取样面积1m2，每株植物选择饱满呈粉色的根瘤，选择大颗的根瘤3个，选择了两个地点，每个地点选择45颗根瘤，两个地点共获得90颗根瘤；
对所选根瘤分离纯化菌株，具体步骤：
（a）选取完整无破损的根瘤，将其放入无菌水中充分浸泡；
（b）根瘤表面消毒：95%乙醇3 min—0.5%次氯酸3 min—无菌水冲洗6-8次；
（c）平板划线分离：将消毒完毕的根瘤用牙签压碎，接种环挑取根瘤内的菌液，于YMA培养基上划线，28℃倒置培养；待YMA平板上长出菌落后，采用稀释划线法对菌株进行纯化：接一环菌体到2ml无菌水中，进行YMA平板划线，获得单菌落可再次进行纯化，2次纯化后的单菌落即为纯培养；接一环菌到盛有YMA培养基的试管中培养2-3天，进行斜面培养保藏；其中培养基YMA每L中含有：甘露醇10.00g、酵母粉0.80g、 K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4 0.12g、NaCl 0.10g、琼脂粉15.00g，其pH值为7.0。
通过以上分离纯化，每颗根瘤经过分离和纯化获得一个菌株，共分离纯化后得90株菌株。
（2）测序：将步骤（1）得到的90株菌株进行16S rDNA序列测定，具体步骤：
DNA的提取：将各菌株经YMA斜面活化后，接种于TY斜面，待斜面长满菌苔后，用无菌生理盐水从斜面上洗下菌体，于1.5 mL Eppendorf离心管中10000 rpm离心3 min收集菌体；用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH8.0）离心洗涤3次，之后反复冻融数次以破碎细胞，再加入600 μL 4M GUTC缓冲液，漩涡振荡充分混匀后室温静置15 min，加入60 μL 硅藻土悬浮液，漩涡振荡充分混匀后室温静置15 min，10000 rpm离心3 min，弃上清；加入500 μL 4M GUTC缓冲液，漩涡振荡充分混匀后室温静置15 min，10000 rpm离心3 min，弃上清；用500 μL 洗涤缓冲液离心洗涤两次后加入600 μL 75%乙醇离心洗涤一次，弃上清；于超净工作台内干燥沉淀物至硅藻土变白，最后加入50 μL无菌超纯水，55-65℃保温10 min，离心收集上清液，经电泳检测后于-20℃保存备用。16S rDNA 序列分析：以总DNA为模板，引物采用
Pl：5’-AGAGTTTGArCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’，
P6：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCC-3’
进行PCR扩增，PCR扩增体系为：5.0 μL的10×Taq Buffer、1.0 μL的10mM dNTPs、1.0 μL的20μM fD1、1.0 μL的20μM rD1、50至100 ng的模板DNA、0.3 μL的Taq DNA聚合酶（5U/μL）、补无菌超纯水至50 μL；其扩增程序为：
然后进行PCR扩增产物的检测：取3 μL 16S rDNA扩增产物与0.6 μL 6×Loading Buffer混匀后上样于1%琼脂糖凝胶（含EB）板，5V/cm电压电泳检测；电泳完毕后在凝胶成像仪中扫描照相，检查扩增片段长度及浓度，合格后送测序公司测序。
（3）将所有菌株的测定得到的序列与GENEBANK数据库中根瘤菌类群的标准序列比对，将不属于根瘤菌类群的剔除后，将归属于根瘤菌类群的68株菌株保留，将保留菌株从YMA培养的斜面菌体刮下，置于20%甘油中保藏菌株，备用。
（4）指纹图谱检测：将步骤（3）所得的68株菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE的电泳图谱指纹检测，将保存的菌株转接到YMA试管斜面培养基上，待菌株长到对数生长期，用10 mmol的Tris-盐酸收集斜面的菌体，加入适量的2×样品缓冲液，将其置于沸水中20 min，使其变性，然后置于-20℃下保存作为蛋白样品。采用的是SDS-PAGE凝胶不连续电泳，凝胶体系中浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为15%，其具体操作步骤参见郭尧君编著的蛋白质电泳实验技术中制胶及电泳132-146页（1999年，科学出版社）。指纹图谱检测后，将属于相同图谱类型的归为一个菌株类型，得33个菌株图谱类型，即为原接种菌株图谱类型。
（5）培养：将上述33个菌株图谱类型中每个图谱类型选择在不同采集地点的3株菌株，用斜面培养到对数生长期，每个菌株6个重复，斜面培养同步骤（1）所述，用YMA，28℃培养，用生理盐水收集斜面的菌体，得菌体混悬液。
（6）盆栽试验：在花盆中盛放有土壤、蛭石和沙子按重量比为5:3:2组成的混合培养基，培养基中土壤须用钴60照射进行灭菌处理，播种紫花苜蓿种子，待种子发芽后，消毒（95%乙醇3 min—0.5%次氯酸5min—无菌水冲洗6-8次），催芽（放置于低氮营养液配好的琼脂平板上，倒置培养）到种子胚根至0.5-1.0cm时，即可将步骤（5）所得菌体混悬液中的菌株接种到种子上；在25℃、50%的湿度和1000hx的光照条件下，生长45天后，观察其所结根瘤数、植株干重，见表1。
表1 盆栽试验的结果
注：采用Turky检验，a b c为不同的子集，以上数据为每个图谱类型菌株的平均值。
以兼顾结根瘤数多和植物单株干重大，且每个图谱类型中仅选择一株菌株为综合选择目标，从上述数据中筛选出综合排名前10的菌株，分别是HBU317014、HBU317019、HBU317020、HBU317026、HBU317031、HBU317063、HBU317071、HBU317090、HBU317096、HBU317099。
（7）高效固氮菌株的筛选：对步骤（6）筛选出的10株菌株培养到对数期，经过镜检确认其无污染，将菌体离心收集，并悬浮于生理盐水中，本实施例选择了沧州黄骅盐碱地土壤环境作为小区设计试验地点，一个菌株5个小区，小区面积3-5×4-5m2，紫花苜蓿开花初期进行根瘤菌取样，取样同步骤（1）所述，将所采集的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记检测，其全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记检测具体步骤同步骤（4）所述，将检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型比对，结果见表2。
表2 接种根瘤菌全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术检测结果
注:表中括号内数字为具有该图谱的菌株数目。对照组为未接种根瘤菌，其他实验条件与实验组相同。
从表2中数据显示，其检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型比对一致性最高，即占瘤率（占瘤率=该菌株接种产生的根瘤经分离获得的所有图谱类型的根瘤数除该菌株接种产生的根瘤经分离获得的与原出发菌株一致的图谱类型的根瘤数的百分率）最高的菌株为编号为HBU317031的菌株，该菌株为高效固氮紫花苜蓿菌株的预定菌株。
（8）小区试验验证：同时对步骤（7）在小区试点中种植的紫花苜蓿的根瘤数、植物干重以及植物氮含量进行考察，在所述紫花苜蓿开花初期对每平方米紫花苜蓿的植物干重、结瘤率以及植物氮含量进行检测，取样面积1m2。其中：
植物干重的检测方法为：收割的植物，进行110℃烘干，直到植物恒重为止，此时为植物干重。
结瘤率的检测方法：结瘤率=已有根瘤的植物株数/统计的总植物株数×100%
植物氮含量测定方法：凯氏定氮法
检测结果如表3所示。
表3 筛选出的根瘤菌菌株的在小区试点种植后的性状表现
注：采用Tukey检验，a b c为不同的子集，以上数据为每个菌株平行试验的平均值。对照组为未接种根瘤菌，其他实验条件与实验组相同。
从表3中的植物干重、结瘤率以及植物氮含量的数据可知，接种HBU317031、HBU317026、HBU317020和HBU317063菌株的紫花苜蓿，植物干重较对照分别增加了60.7%、58.7%、45.8%、36.4%，这几株菌株植物的氮含量和结瘤率也较高，可以确定该些菌株均为固氮性能较高的备选菌株，其中HBU317031从三项指标综合考察为最理想的备选菌株，那么步骤（7）所筛选的预定菌株（编号为HBU317031）与最理想的备选菌株，其指标植物干重、结瘤率及植物氮含量均未出现异常偏低情况，且编号HBU317031的植物干重最高，植物干重是判断菌株高效的最关键因素，所以可以判断步骤（7）筛选的预定菌株为真阳性，该预定菌株即为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株，其菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日。
可见，本发明采用的分子标记筛选高效固氮菌株的方法准确性很高，通过小区实验验证之后所得到的菌株为最适合当地的土壤环境的高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株。
在实际应用中，该验证试验也可以以植物干重为主，以结瘤数以及氮含量的数据为辅，来验证判断其分子标记方法筛选的菌株是否为假阳性，如果为假阳性，可以剔除，可以选一致性其次的菌株作为高校固氮菌株，依次类推，最终获得高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株。
实施例2 菌株的鉴定
本发明所提供的菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的高产紫花苜蓿根瘤菌菌株，生长最适温度为28℃，好氧性培养物，在YMA培养基上菌落呈半透明、乳白色、圆形、边缘薄、中间厚、稀薄，生长时间48-72小时，菌落大小为3-5mm；细菌菌体杆状，具有折光性强的羟脂酸颗粒，占细胞的1/3体积，两端略圆，大小为2-3μm×3-5μm，革兰氏阴性菌，革兰氏染色为红色。
实施例3 新菌株的应用
实验方法：将本发明实施例1获得菌株接种到田间种植（黄骅周边）的紫花苜蓿上，其接种方法、接种面积以及采样检测方法同实施例1的步骤8所示；同时，采用与此相同的实验条件，接种美国菌株（AM185H2）和澳洲菌株（AU128）作为对比实验。
实验结果：
表4 菌种应用结果
注：采用Tukey检验，a b c为不同的子集，以上数据均为试验五点采样，三次平行试验测定指标的平均值。
由表中看出，来自于澳洲和美国的菌株并没有本发明筛选的菌株对紫花苜蓿提高产量的效果好。由此可见，本发明所使用的筛选方法科学精准，得到的菌株固氮高效，非常适合于当地的种植环境，在紫花苜蓿的生产中能够产生巨大的经济效益。
对比例1
对分离紫花苜蓿的根瘤菌进行接种试验，选择所结根瘤数较多的菌株作为筛选的菌株，方法同本发明的盆栽试验及小区实验。
本对比例中对所结根瘤数较多的菌株选取10株进行田间试验，根瘤数（每株植物所结根瘤数，粉红色，饱满的统计，白色的无效瘤不统计）、干重同上述，根长为子叶痕迹到根尖的距离。
实验结果如下表所示：
表5. 紫花苜蓿根瘤菌接种试验
注：采用Tukey检验，a b c为不同的子集，以上数据为每个菌株平行试验的平均值。
表中CK为对照组，对照组为未接种根瘤菌，其他实验条件与实验组相同。
从表5中的数据中，我们发现接种菌株C2的植物所结根瘤数目较其他菌株为高，接种菌株51号植物生长的根长较高，但是后经测序，这两个菌株均非根瘤菌，而为肠杆菌属的类群。同时，在以上数据中，107号和B2根瘤数较多，而植物干重并不是最高的，这说明该其根瘤菌固氮能力并不高。可见，该方法存在问题是未对分离的菌株未进行分类学研究，以致有些菌株可能不是根瘤菌菌株，而且该方法筛选的菌种准确性差，固氮效果也较差。
对比例2
田间接种试验，仅依靠所结根瘤数和植物生长干重等来确定高效苜蓿根瘤菌菌株。
实验方法：同本发明阐述的筛选方法，只是统计结果的不同。
其检测结果如表6所示。
表6 利用BOX-PCR检测根瘤菌接种菌株的占瘤率结果
从上表数据中可见，在进行山西右玉补播紫花苜蓿的根瘤菌接种试验中，我们选择了分子标记进行试验，发现接种菌株的占瘤率最高占53.3%，其占瘤率=与出发菌株一致的图谱的菌株数目/出发菌株结瘤的测试图谱的总体菌株数目；而90号菌株占瘤率为17.6%，说明结瘤菌株并非都是出发菌株形成的根瘤，可见，没有进行分子指纹验证，该方法的准确性也是得不到正证实的。其他为田间分离的非实验菌株图谱。

Claims (6)

1.一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株，其特征在于，所述菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日。
2.一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）对土壤种植的紫花苜蓿的根瘤进行取样，每颗根瘤经过分离和纯化获得一个菌株，得若干菌株；
（b）将所述若干菌株进行16S rDNA序列测定，将所测菌株的序列与GENEBANK数据库中根瘤菌类群的标准序列进行比对，将不属于根瘤菌类群的菌株剔除，将归属于根瘤菌类群的菌株保留；
（c）将保留的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE的电泳图谱指纹测定，得原接种菌株图谱类型；
（d）将保留的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，得菌体混悬液；
（e）在花盆中盛放由所述土壤、蛭石和沙子组成的混合培养基，播种紫花苜蓿种子，待种子发芽后，消毒，催芽至胚根为0.5-1.0cm时，即可将所述菌体混悬液中的菌株接种到种子上；生长45天后，检测其单株的根瘤数和干重，以其所结根瘤数多和单株干重高为综合选择目标，筛选出综合排名前5-10名的菌株；
（f）对步骤（e）筛选出的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，将菌体离心收集，并悬浮于生理盐水中；
（g）在小区试验地点的土壤环境中播种紫花苜蓿种子，接种步骤（f）所获得的悬浮于生理盐水中的菌株，待紫花苜蓿生长至开花初期，对植物单株干重、结瘤率以及氮含量进行检测，以单株干重、结瘤率以及氮含量高为检测指标，筛选3-4株备选菌株；
（h）同时对步骤（g）小区试验地点种植的紫花苜蓿开花初期的根瘤取样，将所采集的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记检测，将检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型比对，选出检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型一致性最高的菌株为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌的预定菌株；
（i）通过检测的指标值验证判断步骤（h）的预定菌株与步骤（g）的备选菌株的对应性，如果预定菌株为检测指标最理想的备选菌株，则为阳性，步骤（g）所筛选到的预定菌株即为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株；反之，若为假阳性，剔除，则将选检测指标值次之的菌株与预定菌株进行对应，以此类推，得到高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株。
3.根据权利要求2所述的高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，其特征在于，步骤（a）和步骤（g）所述的取样采用5点取样法，每个植株选择大颗的根瘤3-5个。
4.根据权利要求2所述的高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，其特征在于，步骤（d）和步骤（f）所述的菌株斜面培养到对数生长期，所用的培养基为YMA，培养基的pH值为6.8-7.2，培养温度为28℃。
5.根据权利要求4所述的高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，其特征在于，所述YMA每升中含有：甘露醇10.00g、酵母粉0.80g、K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4 0.12g、NaCl 0.10g以及琼脂粉 15.00g。
6.根据权利要求2所述的高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，其特征在于，步骤（e）所述土壤、蛭石和沙子的比例为5:3:2。
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