CN102344968A

CN102344968A - 一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法

Info

Publication number: CN102344968A
Application number: CN2011103624855A
Authority: CN
Inventors: 虞云龙; 董斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明公开了一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，包括：(1)分别采集转基因水稻在分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期的根际土壤，将根际土壤在20-30℃下风干，过2-3mm筛后溶于缓冲液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的总DNA，以该总DNA为模板，PCR扩增所述微生物的16SrDNA V3片段，扩增产物经温度梯度凝胶电泳分离，染色得到所述微生物的DNA指纹图谱；(3)对各生长阶段转基因水稻根际土壤微生物的DNA指纹图谱进行分析，得到转基因水稻根际土壤微生物的结构变化情况。本发明检测方法操作简便，有效克服了土壤腐殖质的干扰，能够对转基因水稻根际土壤微生物结构变化做出准确测定。

Description

一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法

技术领域

本发明涉及生态环境保护领域，主要涉及一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法。

背景技术

转基因作物的研制与应用是提高我国农业生产效率、有效解决我国的粮食安全问题的重要途径。转基因作物的释放与规模生产对农业生态环境可能产生一定的影响，客观评价转基因作物对农业生态环境的可能影响是转基因作物研究和发展的重要基础和现实问题。

土壤是农业生产的载体，转基因作物种植与土壤生态系统间将发生一系列交互作用，转基因作物的外源基因及其表达产物可通过多种途径进入土壤生态系统，其中最直接的途径有：1)根系分泌物：转基因作物根系表达的毒素蛋白和根系分泌物不断地向作物根际周围土壤释放外源基因及其表达产物；2)作物残茬：转基因作物的外源基因及其表达产物可通过收割前后遗留在田间的根茬和残枝落叶等进入土壤；3)转基因作物花粉的散布使外源基因逃逸并进入土壤。

转基因作物的外源基因及其表达产物进入土壤，与土壤微生物接触，对其产生不同程度的影响。研究表明转基因作物种植会对某些特定的微生物发生影响，如抗草甘膦大豆的种植会促进大豆根腐镰刀菌(Fusariumspp.)的生长和定殖，使该转基因大豆品种的应用受到一定的制约。转Bt基因水稻(克螟稻)秸秆还田对水田土壤反硝化细菌和产甲烷细菌种群有显著的抑制作用，对厌氧发酵细菌种群有显著的刺激作用，对厌氧固氮细菌种群有轻微刺激作用。特定微生物的改变将反映在土壤微生物结构和功能上的变化，如，转基因油菜根际微生物组成的差异导致转和非转基因油菜品种根际微生物在碳素利用方式和脂肪酸甲基酯图谱方面明显不同。已知多种作物的多个转基因品系及其残体可以改变土壤微生物群体的组成，但这些改变也同时受检测技术、田间土壤性状、季节变化等的影响。因此，准确检测转基因种植土壤微生物变化是评估转基因作物释放生态风险的重要基础。

发明内容

本发明提供了一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，为转基因水稻对土壤生态系统安全评估提供技术手段。

一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，包括：

(1)分别采集转基因水稻在分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期的根际土壤，将根际土壤在20-30℃下风干，过2-3mm筛后溶于缓冲液，得到混合液；

(2)提取混合液中微生物的总DNA，以该总DNA为模板，PCR扩增所述微生物的16SrDNAV3片段，扩增产物经温度梯度凝胶电泳分离，染色得到所述微生物的DNA指纹图谱；

(3)对各生长阶段转基因水稻根际土壤微生物的DNA指纹图谱进行分析，得到转基因水稻根际土壤微生物的结构变化情况。

所述的温度梯度凝胶电泳采用的凝胶溶液为放置30天后的聚丙烯酰胺凝胶溶液。

所述的温度梯度凝胶电泳的条件为：电压160-200V、温度42-50℃，电泳时间3-4h。

所述的提取混合液中微生物的总DNA的方法为：采用FastPrep核酸提取仪和FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒提取。

所述PCR扩增所采用的正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明检测方法操作简便，TGGE图谱条带丰富，检测的土壤细菌完整性强，且有效克服了土壤腐殖质的干扰，能够对转基因水稻根际土壤微生物结构变化做出准确测定。

附图说明

图1为华池B6、嘉早935、中九B种植期间不同生长期的土壤样品16S rDNA V3区TGGE指纹图谱，其中，1-3泳道为华池B6，4-6泳道为嘉早935，7-9用到为中九B；A分蘖期，B抽穗期，C灌浆期，D成熟期；

图2为华池B6、嘉早935、中九B第一年种植期间不同生长期的土壤样品16S rDNAV3区TGGE指纹图谱主成分分析图，其中：A分蘖期，B抽穗期，C灌浆期，D成熟期。

具体实施方式

水稻材料

Bt水稻华池B6、亲本嘉早935和远缘亲本中九B

田间试验与采样

田间实验在浙江省建德市苗木基地进行，试验田划分为9个小区，分别种植这三个水稻品种，每个品种均设3个重复小区，每个小区26-28行×12株/行≥300株，不同品种的小区间隔设置。

在水稻的分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期分别取样。将水稻连同其根部的泥土用小铲一起拔出并带回实验室，每个小区取三株水稻样品。取回的样品在室温下适度风干后，抖落并收集根际周围的土壤，在除去植物残根和石砾等杂物后，过2mm筛后备用。

土壤总DNA的提取

土壤总DNA的提取采用FastPrep核酸提取仪和FastDNA SPIN Kit forsoil试剂盒(Qbiogene，Carlsbad，CA，USA)进行提取，提取的土壤总DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。土壤中DNA提取的步骤按照试剂盒上的要求进行，具体步骤如下：(1)称取0.5g土样加入到裂解E管中；(2)分别加入978μl磷酸盐缓冲液(pH 8.0)和122μl MT缓冲液；(3)将裂解E管置于FastPrep FP120核酸提取仪中，振荡速度为6.0m/s，细胞裂解40s；(4)14000×g离心10min；(5)转移上清液到干净的离心管中，加入250μlPPS，用手上下摇晃数次，使其充分混匀；(6)14000×g离心5min，转移上清液至2ml离心管中，加入1ml结合基体混合液；(7)旋涡振荡5min以使结合基体与DNA充分结合，混合好后静置3min；(8)弃500μl上清液，将剩余的上清液和结合基体充分混匀后取680μl到过滤管中，14000×g离心1min，弃上清液并将剩余的混合液混匀后加入到过滤管中，再14000×g离心1min并将上清液倒去；(9)加入500μl SEMS-M至过滤管中，14000×g离心1min，弃滤液，把过滤管重新放入收集管中，14000×g离心1min去除剩余的SEMS-M洗涤液；(10)把过滤管放入新的收集管中，于室温下干燥5min；(11)加50μl DES与过滤管中，旋涡使其充分混合，14000×g离心1min，将DNA洗脱至收集管中，-20℃冰箱中保存。

土壤微生物16S rDNA扩增

土壤微生物16S rDNA进行PCR扩增的引物Primer 1(341f-GC)、Primer2(534r)由上海生工生物技术服务公司合成，其序列见表1，主要用于扩增16rDNA V3区段。

PCR反应体系为51μl：DNA模板(基因组)0.5μl；dNTP(10μM)1.5μl；MgCl₂(25mM)3.0μl；10×buffer 5.0μl；Primer 1(10μM)1.0μl；Primer 2(10μM)1.0μl；Taq酶(5U/μl)0.15μl；ddH₂O 38.75μl。

PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，最后在72℃延伸10min。

反应结束后取10μl PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。电泳条件为：120V(恒压)，25min。

表1PCR扩增的引物

温度梯度凝胶电泳(TGGE)

3μl PCR产物加入到聚丙烯酰胺凝胶(表2，放置30天)中，在200V、1×TAE buffer的条件下电泳3h，温度范围为42-50℃，采用Sanguinetti染色方法染色，得到TGGE指纹图谱，结果如图1所示。

图1是转基因华池B6、亲本嘉早935、远缘亲本中九B三个品种的水稻在水稻分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期的土壤样品16S rDNA V3区TGGE指纹图谱。从图1可看出，在水稻的四个生长期华池B6、嘉早935和中九B三个品种的条带数量无显著差异(表3)，仅存在亮度上的差异，表明三个水稻品种根际土壤微生物群落结构无显著差异。在水稻分蘖期，华池B6条带1、2，中九B条带3的亮度显著高于其他处理，同时华池B6和中九B的条带4的亮度高于嘉早935；在水稻抽穗期，嘉早935条带5的亮度显著高于其他处理；在水稻灌浆期，华池B6和嘉早935条带6的亮度显著高于中九B，嘉早935和中九B条带7的亮度要高于华池B6，而中九B条带8在其他处理中未发现；在水稻成熟期，嘉早935条带9的亮度高于其他处理。

表2凝胶溶液配方

表3华池B6、嘉早935、中九B第一年种植期间不同生长期土壤TGGE谱图条带数目

TGGE指纹图谱分析

为进一步分析转基因水稻种植对根际土壤微生物群落结构多样性的影响，利用Quantity-one软件对不同生长期的TGGE胶片进行分析并做PCA统计分析，结果如图2所示。从图2可看出，PC1和PC2轴数值之和在87％-96％之间，能够很好的解释大部分变量的变化趋势。在水稻分蘖期、抽穗期和成熟期，华池B6、嘉早935和中九B根际土壤都很好的聚合在一起，表明土壤微生物群落结构组成无显著差异；而在水稻灌浆期，嘉早935在PC1和PC2轴上的数值与华池B6和中九B有一定的差异，较为分散，说明这一时期其微生物群落结构组成有一定的变化。

Claims

1.一种检测转基因水稻根际土壤微生物结构变化的方法，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度梯度凝胶电泳采用的凝胶溶液为放置30天后的聚丙烯酰胺凝胶溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度梯度凝胶电泳的温度范围为42～50℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增所采用的正向引物和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。