CN104025843B - 基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法，主要包括步骤：去除动物区系、添加土壤滤液、植物种植、添加试验动物、取样分析等。本发明通过利用高温灭菌杀死剔除土壤动物成体及卵、利用土壤滤液复原农田原位微生物，同时结合实验室标准化土壤动物饲喂，在近自然的原位土壤中评估转基因植物种植对单一土壤动物存活率、单代及多代繁殖率的影响。本发明改进了之前所用的田间调查不能有效控制环境因素、室内培养皿饲喂不能充分反映田间土壤环境的缺欠。本发明具有转基因植物种植原位评估和特定敏感类群研究的双重优势，综合建立了近自然状态下评估转基因植物种植对单一敏感土壤动物类群影响的方法体系。

Description

基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法

技术领域

本发明属于农业生产领域，具体涉及一种通过遗传工程获得的植物的生态风险评价方法。

背景技术

土壤动物是指长期或生活史中某一个阶段在土壤或地表凋落物层中度过的动物。土壤动物在凋落物分解、土壤肥力提高、地下生态系统物质循环与能量流动方面有重要影响。以往关于转基因植物对土壤非靶标动物影响的研究，一方面集中在样地原位调查方面，即在转基因植物和对照品种田中，通过原位取样、土壤动物分离来评估转基因植物对土壤动物种群的影响；另一方面主要为利用培养基，通过室内喂饲，研究转基因植物凋落物残体对土壤动物特定类群的影响。前一种方法为田间实际情况调查，存在的问题是所有动物集中在一起，不能剥离区分特定敏感类群对转基因植物种植的响应；后一种方法可以单独评估转基因植物种植对特定土壤敏感类群的影响，但不足之处是实验条件为培养基，不是真实反应田间土壤状态，进而真实反映转基因植物种植的自然土壤环境。

发明内容

针对本领域研究方面的不足，本发明的目的是提出一种基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法，包括步骤：

1)去除动物区系：将转基因植物种植区农田原位土壤取出后，过2mm筛，去除大土块，然后进行高温灭菌，对整个动物区系进行去除，之后分装到容器中,土壤填入10cm深。

2)添加土壤滤液：将土壤滤液20ml添加到去除土壤动物区系的原位土壤中，还原微生物区系。

3)植物种植：将转基因植物和对照品种种子分别种植到步骤1)和2)处理后得到的农田土壤中；

4)添加试验动物：在已种植的转基因植物及对照品种的桶中添加试验动物，每个容器添加实验室培养的单一土壤动物类群10头个体。

5)取样：实验开始后20天、35天、70天进行取样，利用体视镜下人工计数法，采集试验动物种群数量，计算存活率、单一世代和多世代繁殖率，比较种植转基因植物和对照品种的土壤，评估转基因植物种植对单一土壤动物类群适合度的影响。

实验开始20天后(此时土壤动物尚未完成一个世代)计算存活率，公式为：

存活率＝20天后个体数/原本加入个体数(10头)(1)

35天后(土壤动物已完成繁殖并且幼虫已孵化出来)计算单一世代繁殖率，公式为：

单一世代繁殖率＝35天后个体数/20天后个体存活数(2)

70天后计算多世代繁殖率，公式为：

多世代繁殖率＝70天后个体数/20天后个体存活数。(3)

以上结果与利用培养皿饲养所得结果进行验证，各参数间无特别加权。

优选地，所述转基因植物为旱作转基因植物，如转基因玉米、大豆、棉花、小麦等。

其中，所述步骤1)高温灭菌的条件为110-120℃，25-35min。

其中，所述步骤2)中土壤滤液按如下方法制备：原位根际土100g，加500ml蒸馏水搅匀后静置24小时，依次用1mm，180μm，75μm，45μm，45μm和20μm孔径的筛网进行过滤，滤掉土壤动物成体及卵。

优选地，其特征在于，所述步骤3)中每个作物品种设置5个重复。

其中，所述步骤3)中植物种植后，将种植环境设置为植物和土壤动物的最适温度和湿度重合区间，具体为温度15-25℃和湿度50％-75％，其他环境条件为正常室内条件，无特殊要求。

或者，所述步骤3)中植物种植后，将种植环境设置未来气候变化的温度和/或湿度条件，例如将种植环境设置为温度增加2℃和湿度增加25％，具体为温度17-27℃和湿度75％-100％，扩展到未来气候变化条件下转基因植物的风险评价研究。该气候变化条件下的评价可在气候室中进行。

其中，所述步骤4)中单一土壤动物的培养方法为：土壤动物实验培养采用ISO标准方法(ISO11267:1999(E))，在石膏：活性炭＝9:1的培养皿中培养，添加啤酒酵母作为食物，全黑暗培养，培养温度为20±1℃，相对湿度90-100％，每周用去离子水调节一次，保持整个培养基湿润。

优选地，单一土壤动物的培养需要同步化，将三天内产的卵收集到一起，卵孵化成幼虫后的第12天(12日龄)，将幼虫添加到已经种植的转基因植物及对照品种的容器中。

其中，所述单一土壤动物选自根结线虫、跳虫、变形虫或螨虫。

本发明的有益效果在于：

提供了转基因植物种植对于单一敏感类群评价的近自然方法，改进了之前所用的田间调查不能有效控制环境因素和室内培养皿实验不能充分反映田间土壤环境的缺欠。

本发明具有转基因植物种植原位评估和特定敏感类群研究的双重优势，解决了自然状态下评估转基因植物种植对单一敏感类群影响的方法体系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中，使用的转基因植物为转基因玉米Bt799、对照品种为郑58，种子由中国农业大学提供；实施例2中，使用的转基因植物为转基因玉米NC6304YGRR、对照品种为NC6304，种子由孟山都公司提供。

单一土壤动物为实验室标准化土壤动物白符跳，FCDK系列，取自中国科学院上海植物生理生态研究所柯欣实验室。

实施例1：

1)去动物区系：将0.1m³(长×宽×高＝1m×1m×0.1m)转基因植物种植区原位土壤从农田中取出后，过2mm筛，去除大的土块，然后进行高温(110℃，30分钟)灭菌，对整个生物区系进行去除，得到去除动物区系的土壤分装到10个透明玻璃容器(高15cm，直径10cm),土壤填入10cm深。

2)土壤滤液制备和加入土壤滤液：用原位根际土100g，加500ml蒸馏水搅匀后静置24小时，依次用1mm，180μm，75μm，45μm，45μm和20μm孔径筛网进行过滤，滤掉土壤动物成体及卵，将准备好的土壤滤液20ml添加到盛装去除土壤动物区系的土壤的容器中，还原微生物区系。

3)植物种植：转基因玉米Bt799和对照品种郑58种子种植到步骤2)中的土壤内，每个品种设置5个重复。种植环境为植物和土壤动物的最适温度和湿度重合区间，具体为温度15-25℃和湿度50％-75％，其他环境条件为正常室内条件，无特殊要求。

4)土壤动物培养：白符跳实验培养，在石膏：活性炭＝9:1的培养皿中培养，添加啤酒酵母作为食物，全黑暗培养，培养温度为20±1℃，相对湿度接近100％，每周用去离子水调节一次，保持整个培养基湿润。同步化时需将三天内产的卵收集到一起，于12日龄可以进行实验，将实验室培养的单一土壤动物类群10个个体添加到已经种植的转基因及对照品种的容器中。

5)取样及分析，植物正常农作管理后，实验开始的20天、35天、70天后进行采样，计算单一物种数量，计算存活率、单一世代和多世代繁殖率，评估转基因作物种植对单一土壤动物类群的适合度影响。

具体数据见表1，存活率及繁殖率计算公式如(1)至式(3)。式(1)中原本加入个体数为10头。研究发现在去除土壤动物区系的玉米农田土壤中，白符跳存活率为100％；转基因玉米种植对白符跳单一世代和二个世代后的繁殖率均无显著影响。

表1、转基因玉米Bt799和对照品种郑58中跳虫存活率、单一世代和多个

世代繁殖率(平均值±标准误差)，不同小写字母表示显著影响。

	Bt799	郑58
			存活率(20天后)	1	1
单一世代繁殖率(35天后)	5.24±1.79a	8.55±2.74a
			二个世代后繁殖率(70天后)	15.36±4.21a	22.11±6.53a

实施例2：

1)去动物区系：将原位土壤从农田中取出后，过2mm筛，去除大的土块，然后进行高温(110℃，30分钟)灭菌，对整个生物区系进行去除，得到去除动物区系的土壤。

2)、土壤滤液制备和加入：用原位根际土100g，加500ml蒸馏水搅匀后静置24小时，依次用1mm，180μm，75μm，45μm，45μm和20μm孔径筛网进行过滤，滤掉土壤动物成体及卵，将准备好的土壤滤液20ml添加到去除土壤动物区系的原位土壤中，还原微生物区系。

3)作物种植：转基因玉米NC6304YGRR和对照品种NC6304种子种植到步骤2)得到的土壤内，每个品种设置5个重复。

4)根据未来气候变化控制条件：将步骤3)种植植物后的容器置于气候室，根据同时间日常温度，控制气候室内温度高于日常温度2℃，具体为17-27℃，湿度为75-100％。

5)土壤动物培养：白符跳实验培养在石膏：活性炭＝9:1的培养皿中培养，添加啤酒酵母作为食物，全黑暗培养，培养温度为20±1℃，相对湿度接近100％，每周用去离子水调节一次，保持整个培养基湿润。同步化时需将三天内产的卵收集到一起，于12日龄可以进行实验，将实验室培养的单一土壤动物类群10个个体添加到已经种植的转基因及对照品种的容器中。

6)取样及分析植物正常农作管理后，实验开始的20天、35天、70天后进行采样，计算单一物种数量，计算存活率、单一世代和多世代繁殖率，评估转基因作物种植对单一土壤动物类群的适合度影响。

具体数据见表2，存活率及繁殖率计算公式为式(1)/(2)、(3)。式(1)中原本加入个体数为10头。研究发现在去除土壤动物区系的玉米农田土壤中，白符跳存活率与实例一中相同，同为100％，说明标准化土壤动物白符跳在此种土壤环境条件下存活正常。与实例一相同，证明未来气候变化条件下，即增温2℃和湿度增加25％，转基因玉米种植对白符跳单一世代和二个世代后的繁殖率均无显著影响。

表2、转基因玉米NC6304YGRR和对照品种NC6304中跳虫存活率、单一世代和多个世代繁殖率(平均值±标准误差)，不同小写字母表示显著影响。

	NC6304YGRR	NC6304
			存活率(20天后)	1	1
单一世代繁殖率(35天后)	8.95±2.73a	6.55±1.98a
			二个世代后繁殖率(70天后)	21.36±6.37a	19.32±7.18a

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于土壤动物区系去除的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，包括步骤：

1)去除动物区系：将转基因植物种植区农田原位土壤取出后，过2mm筛，剔除大土块，然后进行高温灭菌，对整个动物区系进行去除，之后分装到容器中，土壤填入10cm深；

2)添加土壤滤液：将土壤滤液20ml添加到去除土壤动物区系的原位土壤中，还原微生物区系；所述土壤滤液按如下方法制备：原位根际土100g，加500ml蒸馏水搅匀后静置24小时，依次用1mm，180μm，75μm，45μm，45μm和20μm孔径的筛网进行过滤，滤掉土壤动物成体及卵；

3)植物种植：将转基因植物和对照品种种子分别种植到步骤2)处理后得到的农田土壤中；

4)添加试验动物：在已种植转基因植物及对照品种的容器中添加试验动物，每个容器添加实验室培养的单一土壤动物类群10头个体；

5)取样：添加试验动物后20天、35天、70天进行取样，利用体视镜进行人工计数，采集试验动物种群数量，计算存活率、单一世代和多世代繁殖率，比较种植转基因植物和对照品种的土壤，评估转基因植物种植对单一土壤动物类群适合度的影响。

2.根据权利要求1所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述步骤1)高温灭菌的条件为110-120℃，25-35min。

3.根据权利要求1所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述步骤3)中每个作物品种设置5个重复。

4.根据权利要求1-3任一所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述步骤3)中植物种植后，将种植环境设置为植物和土壤动物的最适温度和湿度重合区间,具体为温度15-25℃和湿度50％-75％。

5.根据权利要求1-3任一所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述步骤3)中植物种植后，将种植环境设置为温度增加2℃和湿度增加25％，具体为温度17-27℃和湿度75％-100％。

6.根据权利要求1所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述步骤4)中单一土壤动物的培养方法为：在石膏：活性炭＝9:1的培养皿中培养，添加啤酒酵母作为食物，全黑暗培养，培养温度为20±1℃，相对湿度90-100％，每周用去离子水调节一次，保持整个培养基湿润。

7.根据权利要求6所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，单一土壤动物的培养后需要同步化，将三天内产的卵收集到一起，卵孵化成幼虫后的第12天，将幼虫添加到已经种植转基因植物及对照品种的容器中。

8.根据权利要求6所述的转基因植物种植风险评价方法，其特征在于，所述单一土壤动物选自根结线虫、跳虫、变形虫或螨虫。