CN104651474A - 一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，通过国际公认的13个甜瓜白粉菌生理小种鉴定寄主材料的子叶，对待鉴定白粉菌进行生理小种鉴定，即将待鉴定白粉菌用5％葡萄糖溶液和0.05％Tween-20配制成孢子液，使其浓度达到在10×10显微镜下观察视野中有25-30个；用毛笔将孢子液均匀的涂在13个鉴定寄主材料的子叶上，将子叶放在含有2层滤纸的18cm的培养皿中，滤纸需用无菌水润湿，肉眼可见游离水即可。封口膜封好培养皿，放在25℃光照(光照强度2000勒克斯)培养16h，之后于黑暗的环境下培养8h，培养7-10天，观察13个鉴定寄主子叶的发病情况。本发明鉴定周期短，鉴定材料用量少，操作简便，占用空间小，准确度较高。

Description

一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法

技术领域

本发明属于抗病育种技术领域，具体涉及一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法。

背景技术

甜瓜是我国重要的瓜类作物，自20世纪80年代以来，我国甜瓜的栽培面积和产量一直居于世界首位。近年来，甜瓜白粉病逐渐成为我国甜瓜露地和保护地栽培的主要病害，为害后使植株的光合作用减弱，叶片和茎蔓局部或全部硬化干枯，果实不能正常成熟，严重影响甜瓜的品质和产量，大大降低了其经济效益。

白粉病菌属于高度专化性寄生真菌，在寄主表皮细胞内产生吸器，而菌丝体则匍匐在寄主体表。白粉病菌主要侵染葫芦科作物的叶片，也为害叶柄、茎蔓，严重时果实也会受到感染，给农业生产带来巨大的损失。过去甜瓜白粉病仅在气候温和、潮湿多雨的地区发生。近年来，随着设施甜瓜种植面积的急剧增加、甜瓜种植密度的增大、氮肥施用量的增大，以及种植品种的单一，使得甜瓜白粉病为害日益严重。

为了减轻农业生产的损失，国内外研究者都在进行甜瓜抗白粉病品种的选育。但是，由于白粉菌生理小种较多，且存在变种的情况，因此目前国内还没未出现具有长效及广谱抗性的甜瓜品种。

选育抗病品种的前提，就是要了解当地白粉菌的生理小种。研究表明我国甜瓜白粉病主要由瓜单囊壳白粉菌Podosphaera xanthii和二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum这两种病原菌引起，而仅单囊壳白粉菌P.xanthii已经发现有11个生理小种，分别是生理小种0,1,2U.S,2France,3,4,5,6,7,N3和N4，而G.cichoracearum又有2个生理小种。目前，国内外对于白粉菌的生理小种的鉴定方法主要是活体鉴定，即种植13个鉴定寄主材料，等植株生长到具有一定数量的真叶时，再进行白粉菌的接种，然后放在温室或人工气候箱中控制生长环境，过一段时间观察发病情况。这种活体鉴定的方法需要巨大的工作量，不但要精心种植13个鉴定寄主，而且还要配置大量的孢子液。为了满足实验的重复性，往往需要很大的空间来育苗，在接种白粉菌之后，还要做好防护工作，防止空气中的孢子对实验结果产生影响。另外，从播种到接种后发病，至少要4周以上，同时接种后的发病情况还要依赖于甜瓜苗的生长情况，具有很多不确定性。因此，针对甜瓜白粉菌生理小种的鉴定需要建立一套简便、快捷、准确的快速鉴定体系，在可控的环境条件下，利用适当的接种方法，在短时间内对白粉菌未知生理小种进行鉴定，为甜瓜白粉病的抗病育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，解决了现有技术中存在的甜瓜白粉菌生理小种鉴定工作量大、时间长、鉴定过程不可控的问题。

采用的技术方案是，一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、育苗：在50孔的穴盘中，装入品氏基质后，播种已知的13个甜瓜白粉病鉴定寄主，每个寄主播种5～10株；选择6-7天苗龄刚刚平展的子叶作为鉴定材料；

步骤2、孢子液配制：取通过单孢在离体叶片上纯化繁殖的新鲜白粉病孢子，用5％葡萄糖溶液加0.05％吐温20溶液配制成孢子液，用血球计数板计数，使其浓度达到在10×10显微镜下观察视野中有25-30个，这个浓度可以保证感病材料发病程度较重，同时抗病材料有轻度发病症状；

步骤3、离体环境的构造：将两张18cm的双圈定性滤纸放在配套的培养皿中，在第一张滤纸上画好方格，并标上1～13的数字，用无菌水将双层滤纸润湿；将鉴定寄主1～13的子叶按标号放在方格内，保持叶片正面向上；

步骤4、白粉接种：用已灭菌的毛笔将配制好的白粉孢子液均匀地涂在13个鉴定寄主子叶上；

步骤5、培养：将培养皿用封口膜封好，放在25℃光照强度为2000勒克斯条件下光照培养16h，之后于黑暗的环境下培养8h；

步骤6、培养7-10天后，用肉眼观察13个鉴定材料的发病情况，根据发病情况对照国际标准鉴别寄主抗感反应表判定白粉菌的生理小种。

本发明的特点还在于，

已知的13个甜瓜白粉病鉴定寄主分别为：1为PI414723，2为IranH，3为PI124111，4为MR1，5为Topmark，6为WMR29，7为PMR6，8为Edisto47，9为PMR5，10为Vedrantais，11为PMR45，12为PI124112，13为Nantais oblong。所用的接种对象为培养6-7天的子叶，培养时间短，病虫害污染少，易于发病。

育苗的培养条件是：白天的温度控制在28～30℃之间，晚上的温度控制在20～22℃之间。

步骤6中根据发病情况对照国际标准鉴别寄主抗感反应表判定白粉菌的生理小种具体为：甜瓜子叶病情鉴定采用5级分级标准：0级：整个子叶没有病斑；1级：<25％子叶有病斑；2级：<＝25％，<50％子叶有病斑；3级：<＝50，<75子叶有病斑；4级：<＝75％子叶有病斑。病情指数＝Σ(病级×该病级株数)/(最高病级×调查总株数)×100。病指≤45为抗(R)；>45，≤100为感(S)。

本发明的有益效果是：(1)鉴定周期短，全过程仅需2周左右，而传统方法需4周左右；(2)工作量小，不需要配置大量孢子液喷在活体植株上，也不需要精心育苗至植株长出真叶；(3)占用空间小，先期育苗不需要大量的空间来种植活体植株，接种后在实验室即可完成培养，所需的条件也更加易于控制；(4)准确度高，在封闭的培养皿中可以排除空气中的孢子对实验结果的影响。(5)不受制于天气气候条件，在实验室进行实验可避免季节原因对实验的限制。

附图说明

图1是本发明中甜瓜白粉病国际公认13个鉴别寄主子叶在18cm培养皿中的示意图，其中，1为PI414723，2为IranH，3为PI124111，4为MR1，5为Topmark，6为WMR29，7为PMR6，8为Edisto47，9为PMR5，10为Vedrantais，11为PMR45，12为PI124112，13为Nantais oblong；

图2是本发明统计病情采用的不同级别甜瓜子叶发病示意图，其中，0级：整个子叶没有病斑；1级：<25％子叶有病斑；2级：<＝25％，<50％子叶有病斑；3级：<＝50,<75子叶有病斑；4级：<＝75％子叶有病斑。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，通过采用国际通用的甜瓜白粉病菌生理小种鉴定的一整套鉴别寄主的子叶，分别为：PMR5，PMR6，PMR45，WMR29，MR 1，Edisto 47，Nantais Oblong，Vedrantais，Topmark，Iran H，PI 1241ll，PI 124112，PI 414723，在室内进行白粉菌生理小种离体的鉴定，具体按照以下步骤实施：

步骤1、材料准备：在50孔穴盘中，装入品氏基质(丹麦品氏托普公司苔藓泥炭土0-6mm育苗基质)后，播种已知的13个甜瓜白粉病鉴定寄主，每个寄主播种5～10株；白天的温度控制在28～30℃之间，晚上的温度控制在20～22℃之间，5-7天的时间，甜瓜苗便可两片子叶展开，选择刚刚平展6-7天苗龄的子叶作为鉴定材料；

步骤2、孢子液配制：取通过单孢在离体叶片上纯化繁殖的新鲜白粉病孢子，用5％葡萄糖溶液加0.05％吐温20(Tween-20)溶液配制成孢子液，用血球计数板计数，使其浓度达到在10×10显微镜下观察视野中有25-30个；

步骤3、离体环境的构造：将两张18cm的双圈定性滤纸放在配套的培养皿中，在第一张滤纸上画好方格，并标上1～13的数字，用无菌水将双层滤纸润湿，加10ml水，并保持培养皿中有肉眼可见的游离水存在；将鉴定寄主1～13的子叶按标号放在方格内，保持叶片正面向上。培养皿中子叶所处的生长环境保持一致，确保排除环境因素导致的结果不准确。

步骤4、白粉接种：用已灭菌的毛笔将配制好的白粉孢子液均匀地涂在13个鉴定寄主的子叶上；用毛笔在叶片上涂孢子液可最大程度保证接种的孢子量一致，并能使叶片各区都接种到白粉孢子。

步骤5、培养：将培养皿用封口膜封好，放在25℃光照(光照强度为2000勒克斯)培养16h，之后于黑暗的环境下培养8h；

步骤6、鉴定：培养7-10天后，用肉眼观察13个鉴定材料的发病情况，根据发病情况对照国际标准鉴别寄主抗感反应表判定白粉菌的生理小种。甜瓜子叶病情鉴定采用5级分级标准：0级：整个子叶没有病斑；1级：<25％子叶有病斑；2级：<＝25％，<50％子叶有病斑；3级：<＝50,<75子叶有病斑；4级：<＝75％子叶有病斑。病情指数＝Σ(病级×该病级株数)/(最高病级×调查总株数)×100。病指≤45为抗(R)；>45，≤100为感(S)。

其中，配套的培养皿为直径18cm，可在一个培养皿中进行三次重复实验。

本发明最大程度减少了因为接种和环境因素对实验产生的干扰。

如图1所示，1-13分别表示13个鉴别寄主，具体见下表1，

表1 13个鉴别寄主的名称

实施例 苏州地区的甜瓜白粉菌生理小种的鉴定

分别采用上述离体鉴定方法和活体接种法对苏州地区甜瓜白粉病菌进行生理小种的鉴定，活体鉴定方法如下：白粉病菌13个鉴别寄主播种于50孔穴盘，一叶一心时进行喷雾接种，接种浓度为10^⁵个/ml，每个材料接10-15株苗，二次重复。鉴定所用苗子放置于长1.5m，宽1.2m,高1.5m的不锈钢架内，架子四周与顶部用塑料薄膜封闭，架子置于塑料大棚内，

大棚顶部覆盖遮阳网。不锈钢架内前两天保持90％湿度，后面通过顶部通风保持70％湿度，观察其发病情况，接种2周统计病情。结果如下表2所示：

表2 甜瓜白粉菌生理小种的发病情况

如表3所示，分别通过离体鉴定与活体鉴定的方法，对13个国际标准鉴别寄主进行苏州地区白粉病菌接种，13个材料的抗感反应是一致的，两种方法显示材料IranH，Topmark，Vedrantais，Nantais Oblong表现为感病，其他材料表现为抗病，两种方法统计显示强正相关，相关系数为0.962，在0.01水平显著相关。对照国际标准鉴别寄主抗感反应表，可推断苏州地区甜瓜白粉病菌为单囊壳白粉菌生理小种1。但活体鉴定需要更多的育苗空间，苗子需要长到一叶一心时间，且鉴定时需要进行隔离，本试验中活体鉴定采用了不锈钢架子覆盖薄膜进行隔离与保湿，温度湿度不易控制，费时费力，且受到季节限制，在夏季或冬季无法进行室外接种，春季或秋季又容易受到空气中孢子的影响。

表3 甜瓜白粉病菌生理小种的鉴别寄主及其抗感反应

相比之下本发明的有益效果是：(1)鉴定周期短，全过程仅需2周左右，而传统方法需4周左右；(2)工作量小，不需要配置大量孢子液喷在活体植株上，也不需要精心育苗至植株长出真叶；(3)占用空间小，先期育苗不需要大量的空间来种植活体植株，接种后在实验室即可完成培养，所需的条件也更加易于控制；(4)准确度高，在封闭的培养皿中可以排除空气中的孢子对实验结果的影响。(5)不受制于天气气候条件，在实验室进行实验可避免季节原因对实验的限制。

Claims (4)

1.一种甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、育苗：在50孔的穴盘中，装入品氏基质后，播种已知的13个甜瓜白粉病鉴定寄主，每个寄主播种5～10株；选择6-7天苗龄刚刚平展的子叶作为鉴定材料；

步骤2、孢子液配制：取通过单孢在离体叶片上纯化繁殖的新鲜白粉病孢子，用5％葡萄糖溶液加0.05％吐温20溶液配制成孢子液，用血球计数板计数，使其浓度达到在10×10显微镜下观察视野中有25-30个；

步骤3、离体环境的构造：将两张18cm的双圈定性滤纸放在配套的培养皿中，在第一张滤纸上画好方格，并标上1～13的数字，用无菌水将双层滤纸润湿；将鉴定寄主1～13的子叶按标号放在方格内，保持叶片正面向上；

步骤4、白粉接种：用已灭菌的毛笔将配制好的白粉孢子液均匀地涂在13个鉴定寄主子叶上；

步骤5、培养：将培养皿用封口膜封好，放在25℃光照强度为2000勒克斯条件下光照培养16h，之后于黑暗的环境下培养8h；

步骤6、培养7-10天后，用肉眼观察13个鉴定材料的发病情况，根据发病情况对照国际标准鉴别寄主抗感反应表判定白粉菌的生理小种。

2.根据权利要求1所述的甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，其特征在于，所述已知的13个甜瓜白粉病鉴定寄主分别为：1为PI414723，2为IranH，3为PI124111，4为MR1，5为Topmark，6为WMR29，7为PMR6，8为Edisto47，9为PMR5，10为Vedrantais，11为PMR45，12为PI124112，13为Nantais oblong。

3.根据权利要求1所述的甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，其特征在于，所述育苗的培养条件是：白天的温度控制在28～30℃之间，晚上的温度控制在20～22℃之间。

4.根据权利要求1所述的甜瓜白粉菌生理小种的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤6中根据发病情况对照国际标准鉴别寄主抗感反应表判定白粉菌的生理小种具体为：甜瓜子叶病情鉴定采用5级分级标准：0级：整个子叶没有病斑；1级：<25％子叶有病斑；2级：<＝25％，<50％子叶有病斑；3级：<＝50，<75子叶有病斑；4级：<＝75％子叶有病斑；病情指数＝Σ(病级×该病级株数)/(最高病级×调查总株数)×100；病指≤45为抗(R)；>45，≤100为感(S)。