CN115517145A - 一种室内枯萎病抗性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种室内枯萎病抗性鉴定方法。本发明直接将枯萎病菌液体菌液接种在品氏拓普基质后直接播种，省却了单独培养病菌的步骤，结合枯萎病发生规律，优化并建立了一种方便、快捷的室内枯萎病抗性鉴定方法。与根部浸染法和撕底蘸根法相比，本发明省时省力，所需空间小，发病均匀，适合大规模操作。与病土接菌法相比，本发明省去中间麦粒或玉米沙粒混合物中培养枯萎病菌的过程，可以显著节省时间，减少操作过程，达到减少病菌污染的风险。因此，该枯萎病鉴定方法具有方便、省工、快捷、发病快、发病均匀，且适合大规模操作的特点。
Description
技术领域
本发明属于枯萎病抗性鉴定技术领域，具体涉及一种室内枯萎病抗性鉴定方法。
背景技术
枯萎病(Fusarium wilt)是土传性植物真菌病害，其病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，寄主多达上百种，其对作物的危害严重限制我国农业生产。棉花枯萎病是棉花的最主要病害之一，病原菌是尖孢镰刀菌萎蔫专化型真菌(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)，属半知菌亚门镰刀菌属。1891年，Hamesen首次在美国亚拉巴马州发现了棉花枯萎病。目前，棉花枯萎病几乎遍布全球各植棉国，地理分布非常广泛。1931年，我国的棉作专家冯肇传先生首先在华北地区发现该病害，之后，随着植棉区不断扩大，棉花种子的大量繁殖和多地区转运等多种原因，使棉花枯萎病的蔓延、传播加快，棉花枯萎病病区逐年扩大。20世纪70-80年代初期，全国各主要产棉区每年因此病损失皮棉约200万担。随着抗病陆地棉品种大面积推广，该病在主要陆地棉产区基本得到控制。但张国丽等在新疆47个植棉点进行病株采样和分离，北疆的853个样品中枯萎病菌占比11.1％，南疆的391个样品中枯萎病占比为18.2％，部分地区枯萎病占比达到30％。该研究表明目前新疆部分地区的陆地棉枯萎病时有发生，且个别地块特别严重。随着我国地膜覆盖及直播棉种植模式的推广，枯萎病的发病有抬头的趋势。近年来，随着枯萎病生理小种的变异，棉花枯萎病在世界范围内有越来越严重的趋势。如随着枯萎病4号生理小种在美国植棉区的出现和传播，棉花枯萎病在美国有逐年加重的趋势，目前还没有任何一个品种对该生理小种表现抗性，如果没有有效的应对策略，有造成更大威胁的可能。因此，陆地棉中“老病新发”的问题应该引起足够的重视。
枯萎病是目前新疆海岛棉生产面临的最主要威胁。随着新疆海岛棉种植面积的逐渐扩大，以及各棉区常年连作，海岛棉枯萎病的发生日益严重，已成为新疆海岛棉发展的重要制约因素。据估计，新疆海岛棉产区80％以上的棉田都存在因枯萎病危害而减产的问题，其中15％为重病田，部分田块甚至会出现绝产绝收的情况。目前，我国对海岛棉枯萎病的抗性改良主要有两个途径，一是通过海、陆种间杂交，将陆地棉抗病位点向海岛棉转育。由于海、陆杂交存在一定程度的连锁累赘，且早代出现大量花粉败育现象，选育优质、高产、抗病的长绒棉品种周期长，进展缓慢；二是利用海岛棉种内杂交达到培育抗病品种的目的。由于海岛棉遗传基础狭窄，利用现有的少量抗病资源做抗源，会导致海岛棉的遗传基础更加狭窄。因此，克隆海岛棉抗枯萎病关键基因，解析海岛棉抗枯萎病机制，通过基因工程方法来培育抗枯萎病海岛棉新品种(系)将是今后海岛棉抗枯萎病育种的主要方向。
近年来，棉花枯萎病抗性大多关注蕾铃期抗性，忽视了对棉花苗期抗性鉴定，导致选育的品种多为苗期枯萎病抗性弱，蕾铃期枯萎病抗性强。因此枯萎病主效基因的克隆，提高棉花苗期枯萎病抗性水平将是棉花枯萎病抗性育种的主要方向，而建立一种高效、准确的枯萎病苗期抗性鉴定方法将是实现以上目地的关键。目前，棉花枯萎病苗期抗性鉴定的主要是利用撕底蘸根法、根部浸染法和病土接种法。撕底蘸根法即将棉花种植于纸杯中，在棉花幼苗长至两叶一心时，将纸杯撕掉，达到伤根目地，将其放到另一个装有菌液的新纸杯中，即完成接菌处理；根部浸染法即将生长到一定时期的棉花幼苗根部清洗干净，浸泡在一定浓度的枯萎病菌孢子悬浮液中，随后放置在适合发病的环境中，接菌处理即完成；病土接菌法是将液体枯萎病悬浮液接种到麦粒或玉米沙粒混合物中，待麦粒或玉米沙粒混合物中的枯萎病菌生长到一定程度后，倒出并自然阴干(该步骤所用时间并不固定，受多种因素影响，另外，病菌培养物在自然阴干的过程中容易被污染)，与基质混合均匀，将种子播种到含有病菌的基质中。使用每一种方法接菌后，根据发病情况，统计单株病级，评价不同棉花品种苗期枯萎病抗性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种室内枯萎病抗性鉴定方法，该方法能够背景技术中提到的现有技术中存在的问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种室内枯萎病抗性鉴定方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将保存的枯萎病菌液滴在固体马铃薯培养基上，菌斑为0.5-1.0cm；晾干，封口放置在避光25℃恒温培养箱中培养；
(2)5天后将枯萎病菌菌块放入液体马铃薯培养基中培养，7天后使用纱布过滤菌液，使用血球计数板在显微镜下计数枯萎病菌的孢子浓度；
(3)将品氏托普基质(PINDSTRUP substrate，丹麦，纤维长度：0-6mm，PH＝6.0，www.pindstrup.com)敲散，反复揉碎，达到基质没有成团，颗粒大小均匀为标准；
(4)将浓度为1×107-5×107孢子/ml枯萎病菌菌液倒入揉碎的基质中，多次搓揉，将病菌与基质充分混匀；
(5)将接菌的基质装入72孔穴盘中，将多个装好基质的穴盘摞在一起，从上面施压，在穴盘的每个孔中形成播种穴；
(6)将棉花种子播种在穴盘播种穴中，穴盘上盖土，放在28℃的环境中，浇水，覆膜；
(7)出苗后，及时去除薄膜，实时监测感病对照的发病情况，根据发病情况调查枯萎病发病病级情况；棉花枯萎病发病病级的分级标准为：0级，棉株健康，生长正常，无病叶；1级，棉株四分之一以下叶片表现病状；2级，棉株四分之一以上，二分之一以下叶片表现病状；3级，棉株二分之一以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。
(8)整个苗期至少调查3次，每次间隔7-10天，根据单株病级，计算不同品种的抗病指数和死亡率，评估棉花的枯萎病抗性水平。
优选地，步骤(3)所述品氏拓普基质颗粒均匀较细，内容物单一，吸水性能好，容易与病菌充分混匀；基质充分揉碎，不能成团。
优选地，在步骤(5)中将接菌的基质装入穴盘，基质填装不需按压，穴盘中的基质与穴盘齐平即可。
优选地，在步骤(7)中的感病对照，棉花幼苗出现2片真叶，感病棉花品种即开始显著出现病症，即可进行第一次调查。
并且，本发明比较了不同浓度的枯萎病菌孢子对枯萎病抗性的鉴定效果，与枯萎病菌孢子浓度为1×107个孢子/ml相比，使用枯萎病菌孢子浓度为5×107个孢子/ml时，达到一定发病程度所需时间较短，且发病较重，因此，选用的枯萎病菌孢子浓度为5×107个孢子/ml最佳。
本发明的优点：
本发明结合枯萎病发生规律，优化并建立了一种方便、快捷的室内枯萎病抗性鉴定方法。相比其它枯萎病鉴定方法相比，该枯萎病鉴定方法具有方便、省工、快捷、发病快、发病均匀，且适合大规模操作的特点。
与根部浸染法和撕底蘸根法相比，本发明介绍的枯萎病苗期抗性鉴定方法省时省力，所需空间小，发病均匀，适合大规模操作。与病土接菌法相比，本发明介绍的枯萎病苗期抗性鉴定方法省去中间麦粒或玉米沙粒混合物中培养枯萎病菌的过程，可以显著节省时间，减少操作步骤，可减少病菌污染的风险。
本发明的另一个创新之处在于使用品氏拓普基质来制备病土：植物发病需要保持环境的湿度，品氏拓普基质保水和透气性好，基质吸足水分后，多余的水会及时从基质中流出，不易引起烂根；基质中杂质少，粉末少，基质纤维长度固定，颗粒大小均匀，易于与病菌混合均匀；出苗后，根系易于将基质固定，浇水时基质不易溅出，而且基质经过灭菌处理，抗病鉴定不易受其它病菌的影响。
目前常用的普通基质是由多种物质混合而成，理化性质不稳定，不同批次之间相差巨大，普通基质的颗粒存在较大差异，太粗的基质持水性能不足，不利植物发病，太细，透水性能差，易引起植物烂根；而且普通基质的粒径和组成不好把握，不利于病菌和基质的充分混匀，影响抗性鉴定的准确性。另外，普通基质很少经过无病菌处理，抗病鉴定易受其它病菌的影响。
本发明播种后盖土即代表接菌，与大田播种相似，无需再进行后续的接菌处理，省却了单独接菌处理的时间。
附图说明
图1是室内枯萎病抗性鉴定过程；
图中，A：液体土豆培养基培养7天后的枯萎病菌孢子液；B：敲散，揉碎的品氏托普栽培基质；C：枯萎病菌菌液与基质充分混匀；D：将病菌和基质混匀后装入72孔穴盘；E：将多个装好基质的穴盘摞在一起，F：从上面施压，在穴盘的每个孔中形成播种穴。
图2是两种室内苗期接菌方法比较；
图中，A：纸杯撕底蘸根接菌方法接菌后42天发病表型；B：利用本发明介绍的枯萎病抗性鉴定方法，播种42天后不同材料的发病情况；c：两种室内枯萎病抗性鉴定方法鉴定不同品种的病指。
图3是不同浓度枯萎病菌孢子对发病的影响；
图中，A：不同品种播种在包含不同浓度枯萎病菌孢子液的基质中35天后表型；B：不同品种播种在包含不同浓度枯萎病菌孢子液的基质中35天后病指。
图4是室内和大田枯萎病抗性鉴定结果比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
1.材料
本发明所用的材料为海岛棉长彩抗1号，长彩感1号和新海35号，陆地棉新彩5号。另外还包括28个已经审定的海岛棉品种，分别为吐海1号，吐海2号，新海3号，新海5号，新海6号，新海8号，新海9号，新海13号，新海14号，新海17号，新海18号，新海19号，新海20号，新海21号，新海23号，新海25号，新海26号，新海27号，新海28号，新海35号，新海36号，新海41号，新海47号，新海48号，新海49号，新海52号，新海53号，新海58号。所有品种都来源于新疆农业科学院经济作物研究所，引入的品种严格自交繁殖保纯。
本发明所用的枯萎病菌株为7号菌株，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。
2.试验方法
(1)病菌准备：
本研究所用枯萎病菌株为7号菌株。将枯萎病7号菌株滴在固体土豆培养基(马铃薯200g、琼脂17g、蔗糖20g、蒸馏水1000m1)表面，菌斑约为0.5cm；晾干封口放置在避光25℃恒温培养箱中培养；5天后将枯萎病菌菌块转移到液体土豆培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)中培养，7天后使用纱布过滤菌液，使用血球计数板在显微镜下计数枯萎病菌的孢子浓度。
(2)接种方法
本发明涉及的接种方法如下：将枯萎病菌菌块放入液体土豆培养基中培养，7天后使用纱布过滤菌液(图1A)；将品氏托普栽培基质敲散，揉碎，达到基质没有成团，颗粒大小均匀为标准(图1B)；将浓度为5×107孢子/ml枯萎病菌菌液倒入揉碎的基质中，多次搓揉，将病菌与基质充分混匀(图1C)；将接菌的基质装入72孔穴盘中(图1D)，将多个装好基质的穴盘摞在一起(图1E)，从上面施压，在穴盘的每个孔中形成播种穴(图1F)。种子浓硫酸处理后晾干，播种，每穴3粒，盖土，放在28℃的环境中，浇水，覆膜。出苗后，及时去除薄膜，间苗，每穴保留2株。
撕底蘸根接种方法如下：将试验种子浓硫酸脱绒后晾干，播于容积为460ml纸杯中，一杯3粒，出苗后间苗，每一杯保留2株。待棉株长到两叶一心时，进行纸杯撕底，以达到伤根目的。对各材料分别用枯萎病菌的分生孢子悬浮液进行接种，浓度为5×107个孢子/ml，每营养钵20ml。接种后，关闭门窗，早上、中午、晚上温室定期喷水，保持室温28℃，以利于发病。在接种一周后把死苗全部清除。
(3)鉴定方法
实时监测感病对照的发病情况，根据发病情况调查枯萎病发病病级。棉花枯萎病发病分级标准为：0级，棉株健康，生长正常，无病叶；1级，棉株四分之一以下叶片表现病状；2级，棉株四分之一以上，二分之一以下叶片表现病状；3级，棉株二分之一以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。对于本发明所介绍的鉴定方法，在幼苗长至两叶一心时，感病对照即表现明显病症，即可进行调查。对于撕底蘸根法，在接菌后28天开始调查发病情况。整个苗期至少调查3次，每次间隔7-10天，根据单株病级，计算不同品种的抗病指数和死亡率，评估棉花的枯萎病抗性水平。抗病指数＝[∑(Ni×i)/(N×4)]×100；i＝0～4，Ni＝每级植株个数。死亡率＝死亡单株×100％/调查的所有株数。
3.试验结果
(1)本发明所述方法与撕底蘸根接种法鉴定方法的比较
首先对撕底蘸根接种法和本发明介绍的接种法进行比较，所用的材料为新海35号，新彩5号，长彩抗1号和长彩感1号(感病)。结果表明，2种方法都能真实反应4个材料对枯萎病的抗性水平(图2A，2B，2C)。但是，在进行抗病鉴定过程中，2中方法占用空间，基质使用量，整个鉴定所用时间都存在显著差异。以鉴定4个品种，每个品种鉴定36株为例(每杯2株，每个品种需要18个纸杯)，使用撕底蘸根接种法，如果使用容积为220ml纸杯，占地面积至少为4050cm2，使用基质总重量为2865.6g；如果使用容积为460ml纸杯，占地面积为4896cm2，使用基质总重量为4852.8g。使用本发明介绍的鉴定方法，4个品种可以在1个72孔穴盘中完成，占地面积只有1510.5cm2，使用基质重量只有295.2g(表1)。
表1. 4个品种枯萎病抗性鉴定占地面积及所需基质数量
对整个接菌过程所需时间进行比较发现，如果调查时间间隔7天，使用撕底蘸根接种法，整个枯萎病抗性鉴定过程需要70天，而本发明所述鉴定方法只需要42天；如果调查时间间隔10天，使用撕底蘸根接种法，整个枯萎病抗性鉴定过程需要76天，而本发明所述鉴定方法只需要48天(表2)。
利用本发明介绍的室内枯萎病抗性鉴定方法，比较了不同浓度的枯萎病菌孢子对枯萎病抗性的鉴定效果，结果表明，与枯萎病菌孢子浓度为1×107个孢子/ml相比，使用枯萎病菌孢子浓度为5×107个孢子/ml时，达到一定发病程度所需时间较短，且发病较重(图3A，3B)。因此，在本发明介绍的室内枯萎病抗性鉴定方法中，可以使用的枯萎病菌孢子浓度并非完全确定，使用不同浓度的枯萎病菌菌液与发病时间和发病严重程度相关。
以上结果表明，本发明所述室内枯萎病抗性鉴定方法，不需要再进行单独接菌处理，将播种和接菌两个步骤合二为一，具有方便、省工、快捷、发病快的特点，而且具有省空间和省时间的特点，适合进行大规模操作。
表2整个枯萎病抗性鉴定过程所需时间
(2)本发明所述鉴定方法的评估
为评估本发明所述方法进行枯萎病抗性鉴定的准确性，选择28个已经审定的海岛棉品种进行枯萎病抗性鉴定，28个品种分别是吐海1号，吐海2号，新海3号，新海5号，新海6号，新海8号，新海9号，新海13号，新海14号，新海17号，新海18号，新海19号，新海20号，新海21号，新海23号，新海25号，新海26号，新海27号，新海28号，新海35号，新海36号，新海41号，新海47号，新海48号，新海49号，新海52号，新海53号，新海58号。通过与大田自然病圃抗性鉴定结果相比较，本发明所述方法能够准确地反应28个品种的枯萎病抗性水平，在一定程度上反应了28个品种在生产中的枯萎病抗性水平。该结果表明，本发明所述枯萎病抗性鉴定方法在一定程度上模拟了棉花种植过程，可以真实反应棉花在生产过程中对枯萎病的抗性。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (6)
1.一种室内枯萎病抗性鉴定方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将保存的枯萎病菌液滴在固体马铃薯培养基上，菌斑为0.5-1.0cm；晾干，封口放置在避光25℃恒温培养箱中培养；
(2)5天后将枯萎病菌菌块放入液体马铃薯培养基中培养，7天后使用脱脂纱布过滤菌液，使用血球计数板在显微镜下计数枯萎病菌的孢子浓度；
(3)将品氏托普基质敲散，反复揉碎，达到基质没有成团，颗粒大小均匀为标准；
(4)将浓度为1×107-5×107孢子/ml枯萎病菌菌液倒入揉碎的基质中，多次搓揉，将病菌与基质充分混匀；
(5)将接菌的基质装入72孔穴盘中，将多个装好基质的穴盘摞在一起，从上面施压，在穴盘的每个孔中形成播种穴；
(6)将棉花种子播种在穴盘播种穴中，穴盘上盖土，放在28℃的环境中，浇水，覆膜；
(7)出苗后，及时去除薄膜，实时监测感病对照的发病情况，根据发病情况调查枯萎病发病病级情况；
(8)整个苗期至少调查3次，每次间隔7-10天，根据单株病级，计算不同品种的抗病指数和死亡率，评估棉花的枯萎病抗性水平。
2.根据权利要求1所述的室内枯萎病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述品氏拓扑基质颗粒均匀较细，内容物单一，吸水性能好，容易与病菌充分混匀；基质充分揉碎，不能成团。
3.根据权利要求1所述的室内枯萎病抗性鉴定方法，其特征在于，在步骤(5)中将接菌的基质装入穴盘，基质填装不需按压，穴盘中的基质与穴盘齐平即可。
4.根据权利要求1所述的室内枯萎病抗性鉴定的方法，其特征在于，在步骤(7)中的感病对照，棉花幼苗出现2片真叶，感病棉花品种即开始显著出现病症，即可进行第一次调查。
5.根据权利要求1所述的室内枯萎病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(7)棉花枯萎病发病病级的分级标准为：0级，棉株健康，生长正常，无病叶；1级，棉株四分之一以下叶片表现病状；2级，棉株四分之一以上，二分之一以下叶片表现病状；3级，棉株二分之一以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。
6.根据权利要求1所述的室内枯萎病抗性鉴定的方法，其特征在于，所述枯萎病菌菌液孢子浓度为5×107个孢子/ml。
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