CN112300978A - 一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于稻瘟病菌孢子的分离技术领域，公开了一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法，进行病圃的设置、病菌采样和保存；将稻瘟病标本放置含有抗生素利福平2ml的无菌水中，浸泡10h～24h，取出后放置在灭菌标本支架上；于标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h；将经保湿培养的标本利用震落法将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中；将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h；并进行接种体准备；进行鉴别寄主培育；并将接种体接种于培育好的寄主上。本发明解决了现有技术中稻瘟病病菌孢子分离和保存智能效果差，缺乏实用性的问题。

Description

一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法
技术领域
本发明属于稻瘟病菌孢子的分离技术领域，尤其涉及一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法。
背景技术
目前，稻瘟病由稻梨孢真菌引起的一种水稻病害，又称稻热病、火烧瘟、叩头瘟。病菌侵染叶片、茎秆、穗颈、小穗梗和谷粒。根据受害时期和侵染部位不同，可分别引起苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和粒瘟。水稻稻瘟病是一种重要真菌病害,是影响水稻高产、稳产的重要病害之一。近年来，随着抗病品种的推广，病害得到了有效的控制，但随着抗病品种种植年限的延长,其抗性就被克服，造成病害流行，主要是由于稻瘟病菌群体内小种或致病性的变化所致。一个抗病新品种的抗性的逐渐丧失与该地区稻瘟病菌小种的组成和变异有关,小种的生存和占优势取决于可作用的寄主品种。近年来我区培育了一批优质、高产水稻品种，实现了品种的六次更新换代，每一次品种更新都使水稻产量和品质大幅度提升，但随着品种大面积推广种，新的优势小种产生而导致其抗病性逐年丧失，影响了新品种应用年限。2010-2012年对全区采集的稻瘟病样进行了分离、培养，筛选出17个宁夏稻瘟病菌代表菌系，对宁夏主栽品种、高代稳定材料和预审品系进行抗性鉴定，通过对育种资源和育成品种抗性研究，获得了一批抗源材料和抗性品种，部分材料已作为杂交亲本使用。但对宁夏水稻品种的抗瘟性和抗谱的分析还未深入进行研究。
本项目拟通过对宁夏水稻主栽地区的稻瘟病采集标样进行分离，从中获取有效单孢菌株，分离鉴定出不同地区的生理小种的种类、毒力，筛选出本区主要致病生理小种，探明我区稻瘟病菌生理小种组成及其分布,同时将宁夏水稻稻瘟病病菌的不同类型不同小种进行提纯分类并保存，以便应对随着不同年份生理小种的变异。筛选广谱性稻瘟病抗源，为抗性基因的科学利用、抗病品种的合理布局及病害的可持续控制提供理论依据。
稻瘟病孢子，稻瘟病菌丝产生的生殖细胞,它不需和其他细胞结合即可发育成新的个体。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有技术中，稻瘟病病菌孢子分离和保存智能效果差，缺乏实用性。
(2)宁夏在稻瘟病方面先后开展了许多研究。1984年宁夏农学院穆永顺教授对宁夏灌区稻瘟病流行趋势作了分析研究。1995年，由于稻瘟病大发生，宁夏多个主栽品种先后因稻瘟病的大发生而遭受淘汰，其中以新育成高产品种“宁粳9号”也在其中。为此，1994-1995年开展了本区主栽水稻品种稻瘟病发生情况的普查工作，并从采集标样中获取有效单孢菌株104个，分离鉴定出本区生理小种有47个，主要致病生理小种有7个，对宁夏稻瘟病致病性变异进行了分析研究，取得了可喜的成绩，但对宁夏水稻品种的抗瘟性和抗谱的分析未能深入系统研究。稻瘟病生理小种的监测对制定抗病育种策略，病害预测预防以及水稻品种的合理布局具有重大的意义。目前利用全国统一的鉴别寄主，按照统一方法对病菌生理小种进行监测是切实可行的，可是由于水稻品种的更换，稻瘟病致病性的变异，仅靠我国的70年代筛选的7个鉴别寄主远不能辨别潜在的致病小种的上升动态，所以必须在利用7个鉴别寄主的同时增加新推广的品种作为辅助鉴别品种，这样对潜在的致病小种的检测结果会更准确。
近年来我区培育了一批优质、高产水稻品种，实现了品种的七次更新换代，每一次品种更新都使水稻产量和品质大幅度提升，但随着品种大面积推广种，新的优势小种产生而导致其抗病性逐年丧失，影响了新品种应用年限。2010-2012年对全区采集的稻瘟病样进行了分离、培养，筛选出17个宁夏稻瘟病菌代表菌系，对宁夏主栽品种、高代稳定材料和预审品系进行抗性鉴定，通过对育种资源和育成品种抗性研究，获得了一批抗源材料和抗性品种，部分材料已作为杂交亲本使用。但对宁夏水稻品种的抗瘟性和抗谱的分析还未深入进行研究。
解决以上问题及缺陷的难度为：稻瘟病病菌单孢提取、分离、纯化、保存是生理小种构成、病菌群体的构建、优势小种的鉴定和致病性变异研究的技术关键。稻瘟病病菌孢子的产生扩繁成熟时间一定要和鉴别寄主的成长时期把握一致，以明确鉴别生理小种。通过连续五年水稻病害高峰期不间断的取样，初步构建了宁夏稻瘟病菌库，为宁夏优势生理小种鉴别和抗病育种提供了物质基础，为加速抗稻瘟病育种工作进程、提高工作成效奠定了重要基础。
解决以上问题及缺陷的意义为：水稻田间稻瘟病菌群体复杂多样，小种遗传变异速度快，抗病水稻品种的种植年限和适宜区域受限。因此，采集稻瘟病菌样本，构建宁夏稻瘟病菌库，对于保持稻瘟病研究的可持续性和研究结果的稳定性与可靠性具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法。
本发明是这样实现的，一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法包括：
步骤一，进行病圃的设置、病菌采样和保存；所述病菌采样和保存包括：在发病植株上采集获取发病部位的标本，统一编号，晾干，4℃冰箱内保存、备用；将稻瘟病标本放置含有抗生素利福平2ml的无菌水中，浸泡10h～24h，取出后放置在灭菌标本支架上；于标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h；
步骤二，将经保湿培养的标本利用震落法将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中；将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h；挑取水琼脂培养基上培养好的稻瘟病单孢，接种到PDA培养基上；并在培养皿上标明编号；
步骤三，于26℃恒温培养箱中培养3d-5d；当PDA培养基上的单孢菌株的菌落直径达到2cm时，切取一部分转入到灭菌稻谷粉培养基中，每皿倒2/3培养基，每皿接种一株单孢菌株；待菌落长满培养皿直至自然干燥，在无菌条件下切碎装入冻存管，于-20℃环境下进行低温保存；将保存的单孢菌株取出一小块，放在PDA培养基中在26℃的恒温培养箱中进行菌株活化3d～5d；将PDA培养基中活化的菌株在超净工作台中转入产孢培养基中，在26℃的恒温培养箱中全培养5d～7d；
步骤四，将产孢培养皿黑暗和光照交替12h培养4d～7d，令菌株产生孢子；再次放入在黑光灯下培养，再次培养的菌落；利用无菌水洗下产孢培养基表面的孢子，并利用灭菌纱布过滤，加入0.02％的tween_20配制成5×105个/mL的用于接种的孢子悬浮液；过筛稻田土一立方米和5kg/m3复合肥并按照3:1的比例加入育秧基质，均匀混合后装入育秧盘中，压平、压紧备用、装土量为育秧盘的2/3；
步骤五，育秧时浇灌好水的盘秧土表面均匀喷洒2‰移栽灵溶液200mL；稻谷种子用0.5％双氧水浸种24h，换水再浸泡24h；将消毒种子滤去水分,30℃催芽24h-48h；将催芽种子播于育秧盘消毒土中，每个育秧盘播21份稻种，7个鉴别寄主每个设置3个重复；覆细土0.5cm,覆盖薄膜；并进行施肥管理；所述施肥管理包括：当苗高1.5cm～2cm时，喷施2‰移栽灵溶液；当气温超过30℃时，开窗通风；于两叶一心时追施尿素1g/盘，接种前3d同剂量追施一次尿素；80％幼苗三叶一心时进行接种；
步骤六，将含有0.02％的tween-20孢子溶液雾化，喷施在保湿培养箱内的鉴别寄主叶片表面，叶片布满不聚合的细雾滴，40ml～60ml孢子液；在恒温25℃培养箱中保湿培养24h；保湿培养24h后,置于弱光照、26℃温室中，用时控开关控制喷雾时间，每隔2h喷雾3min，培养7d～10d；
步骤七，接种7d-10d后，将病斑分按9级分类；当对照品种发病率低于50％时，判定菌株接种无效；对某小种有效的抗病基因作分子，无效的抗病基因作分母写成公式鉴别寄主。
进一步，所述进行病圃设置包括：将病圃田设在稻瘟病常发病区或常年稻区，选择平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域。
进一步，所述标本包括病穗颈和病穗节。
进一步，所述水琼脂培养基由琼脂粉20g，抗生素2ml，水1000ml组成。
进一步，所述挑取水琼脂培养基上的稻瘟病单孢包括：一个标本上挑取3个及以上抖落的单孢。
进一步，所述接种到PDA培养基包括：每个PDA培养基上接种3-5个单孢；
所述PDA培养基有成品PDA培养基粉40g与水1000ml组成。
进一步，所述稻谷粉培养基由稻谷粉20g，琼脂粉20g，酵母粉2g，抗生素2ml以及水1000ml组成。
进一步，所述产孢培养基由玉米粉40g，稻谷粉50g，琼脂粉20g以及水1000ml组成。
进一步，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法还包括：整个育苗过程保持盘内泥土湿润但不积水。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统包括：
病圃选取系统，用于选择稻瘟病常发病区或常年稻区、平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域作为病圃田；
病菌采样和保存系统，用于于发病植株上进行发病部位的标本采样，并进行标本保存；
保湿培养系统，用于将采集的病菌样本浸泡后于含有抗生素灭菌水的培养皿上进行保湿培养；
孢子分离系统，用于将保湿培养后的孢子利用震落法从无菌培养皿中分离至灭菌水琼脂培养基中并进行培养；
提纯系统，用于提纯水轻质培养基上的单孢并利用PDA培养基对提纯的单孢进行培养；
单孢保存系统，用于对培养的单孢进行冷冻保存；
病菌活化系统，用于将冷冻保存的单孢进行活化；
病菌扩繁培养系统，用于将活化的单孢进行扩繁培养；
孢子培养系统，用于对扩繁后的孢子黑暗和光照交替培养，并利用无菌水处理孢子；
育秧盘制备系统，用于进行育秧盘的制备；
种子处理系统，用于对种子进行消毒、催芽以及播种；
管理监测系统，用于实时对播种的后的种子的苗期进行管理，并实时监测生长状况；
接种系统，用于将培养处理的后的孢子溶液进行雾化，并采用喷雾接种的方式寄生于叶片表面；
培养管理系统，用于进行接种后的叶片的培养管理以及发病分析。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明解决了现有技术中稻瘟病病菌孢子分离和保存智能效果差，缺乏实用性的问题。本发明能够对病菌孢子分离保存的全过程进行实时监测以及智能化控制，有效提高了病菌孢子的分离成功率以及保存有效性，同时本发明提高了孢子接种的成功率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法流程图。
图2是本发明实施例提供的将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h的方法示意图。
图3是本发明实施例提供的接种体准备的方法示意图。
图4是本发明实施例提供的进行鉴别寄主培育的方法示意图。
图5是本发明实施例提供的将接种体接种于培育好的寄主上的方法示意图。
图6是本发明实施例提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统结构示意图；
图中：1、病圃选取系统；2、病菌采样和保存系统；3、保湿培养系统；4、孢子分离系统；5、提纯系统；6、单孢保存系统；7、病菌活化系统；8、病菌扩繁培养系统；9、孢子培养系统；10、育秧盘制备系统；11、种子处理系统；12、管理监测系统；13、接种系统；14、培养管理系统。
图7是本发明实施例提供的从5月-10月分3批次检测51份2013年的稻瘟病菌生理小种，通过对检测结果抗性频率的分析图。
图8是本发明实施例提供的从5月-10月共检测4批次稻瘟病菌生理小种，共检测2014年的稻瘟病单孢菌株103份图。
图9是本发明实施例提供的从5月-10月共检测6批次稻瘟病菌生理小种，其中个广东省农科院植保所合作异地鉴定菌株93份，宁夏农科院作物所鉴定98份，共检测2015年的稻瘟病单孢菌株191份图。
图10是本发明实施例提供的根据单基因鉴别寄主对菌株的抗性频率来看，抗性基因Pikh、Piz、Piz5 Pizt、Pi1、Pi5、Pi9、Pita2、pi25对2015年的稻瘟病菌株抗性频率较高，大于60％图。
图11是本发明实施例提供的从5月-10月共检测5批次稻瘟病菌生理小种，共检测2016年单孢菌株120份图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统及方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法包括以下步骤：
S101，进行病圃的设置、病菌采样和保存；所述病菌采样和保存包括：在发病植株上采集获取发病部位的标本，统一编号，晾干，4℃冰箱内保存、备用；
S102，将稻瘟病标本放置含有抗生素利福平2ml的无菌水中，浸泡10h～24h，取出后放置在灭菌标本支架上；
S103，于标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h；将经保湿培养的标本利用震落法将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中；
S104，将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h；并进行接种体准备；进行鉴别寄主培育；并将接种体接种于培育好的寄主上。
本发明实施例提供的进行病圃设置包括：将病圃田设在稻瘟病常发病区或常年稻区，选择平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域。
本发明实施例提供的标本包括病穗颈和病穗节。
如图2所示，步骤S103中，本发明实施例提供的将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h包括：
S201，挑取水琼脂培养基上培养好的稻瘟病单孢，一个标本上挑取3个及以上抖落的单孢；将挑取的稻瘟病单孢接种到PDA培养基上；并在培养皿上标明编号；于26℃恒温培养箱中培养3d-5d；
S202，当PDA培养基上的单孢菌株的菌落直径达到2cm时，切取一部分转入到灭菌稻谷粉培养基中，每皿倒2/3培养基，每皿接种一株单孢菌株；待菌落长满培养皿直至自然干燥，在无菌条件下切碎装入冻存管，于-20℃环境下进行低温保存。
步骤S201中，本发明实施例提供的水琼脂培养基由琼脂粉20g，抗生素2ml，水1000ml组成。
步骤S201中，本发明实施例提供的接种到PDA培养基包括：每个PDA培养基上接种3-5个单孢；所述PDA培养基有成品PDA培养基粉40g与水1000ml组成。
如图3所示，步骤S104中，本发明实施例提供的接种体准备包括：
S301，将保存的单孢菌株取出一小块，放在PDA培养基中在26℃的恒温培养箱中进行菌株活化3d～5d；
S302，将PDA培养基中活化的菌株在超净工作台中转入产孢培养基中，在26℃的恒温培养箱中全培养5d～7d；
S303，将产孢培养皿黑暗和光照交替12h培养4d～7d，令菌株产生孢子；再次放入在黑光灯下培养，再次培养的菌落；
S304，利用无菌水洗下产孢培养基表面的孢子，并利用灭菌纱布过滤，加入0.02％的tween_20配制成5×105个/mL的用于接种的孢子悬浮液。
如图4所示，步骤S104中，本发明实施例提供的进行鉴别寄主培育包括：
S401，过筛稻田土一立方米和5kg/m3复合肥并按照3:1的比例加入育秧基质，均匀混合后装入育秧盘中，压平、压紧备用、装土量为育秧盘的2/3；育秧时浇灌好水的盘秧土表面均匀喷洒2‰移栽灵溶液200mL；
S402，稻谷种子用0.5％双氧水浸种24h，换水再浸泡24h；将消毒种子滤去水分,30℃催芽24h-48h；将催芽种子播于育秧盘消毒土中，每个育秧盘播21份稻种，7个鉴别寄主每个设置3个重复；
S403，覆细土0.5cm,覆盖薄膜；并进行施肥管理；所述施肥管理包括：当苗高1.5cm～2cm时，喷施2‰移栽灵溶液；
S404，当气温超过30℃时，开窗通风；于两叶一心时追施尿素1g/盘，接种前3d同剂量追施一次尿素；80％幼苗三叶一心时进行接种。
如图5所示，步骤S104中，本发明实施例提供的将接种体接种于培育好的寄主上包括：
S501，将含有0.02％的tween-20孢子溶液雾化，喷施在保湿培养箱内的鉴别寄主叶片表面，叶片布满不聚合的细雾滴，40ml～60ml孢子液；
S502，在恒温25℃培养箱中保湿培养24h；保湿培养24h后,置于弱光照、26℃温室中，用时控开关控制喷雾时间，每隔2h喷雾3min，培养7d～10d；
S503，接种7d-10d后，将病斑分按9级分类；当对照品种发病率低于50％时，判定菌株接种无效；对某小种有效的抗病基因作分子，无效的抗病基因作分母写成公式鉴别寄主。
本发明实施例提供的稻谷粉培养基由稻谷粉20g，琼脂粉20g，酵母粉2g，抗生素2ml以及水1000ml组成。
本发明实施例提供的产孢培养基由玉米粉40g，稻谷粉50g，琼脂粉20g以及水1000ml组成。
本发明实施例提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法还包括：整个育苗过程保持盘内泥土湿润但不积水。
如图6所示，本发明实施例提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统包括：
病圃选取系统1，用于选择稻瘟病常发病区或常年稻区、平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域作为病圃田；
病菌采样和保存系统2，用于于发病植株上进行发病部位的标本采样，并进行标本保存；
保湿培养系统3，用于将采集的病菌样本浸泡后于含有抗生素灭菌水的培养皿上进行保湿培养；
孢子分离系统4，用于将保湿培养后的孢子利用震落法从无菌培养皿中分离至灭菌水琼脂培养基中并进行培养；
提纯系统5，用于提纯水轻质培养基上的单孢并利用PDA培养基对提纯的单孢进行培养；
单孢保存系统6，用于对培养的单孢进行冷冻保存；
病菌活化系统7，用于将冷冻保存的单孢进行活化；
病菌扩繁培养系统8，用于将活化的单孢进行扩繁培养；
孢子培养系统9，用于对扩繁后的孢子黑暗和光照交替培养，并利用无菌水处理孢子；
育秧盘制备系统10，用于进行育秧盘的制备；
种子处理系统11，用于对种子进行消毒、催芽以及播种；
管理监测系统12，用于实时对播种的后的种子的苗期进行管理，并实时监测生长状况；
接种系统13，用于将培养处理的后的孢子溶液进行雾化，并采用喷雾接种的方式寄生于叶片表面；
培养管理系统14，用于进行接种后的叶片的培养管理以及发病分析。
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
实施例1：
本发明提供的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法包括：
1)病菌采样和保存
在发病植株上采集获取发病部位的标本。标本包括病穗颈和病穗节，统一编号，晾干，置于密闭容器，4℃冰箱内保存、备用。
2)保湿培养
将稻瘟病标本放置含有抗生素利福平2ml(25mg/ml酒精稀释配液)的无菌水中，浸泡10h～24h,取出后放置在灭菌标本支架上，标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h。
3)稻瘟病孢子分离
经保湿培养的标本用震落法，将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中,水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h。水琼脂培养基：琼脂粉20g，利福平2ml(25mg/ml酒精稀释配液),水1000ml。
下面结合鉴定方法和材料对本发明作进一步描述。
1、样品采集
1.1病圃设置
病圃田设在稻瘟病常发病区或常年稻区，平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便，利于稻瘟病发生。
1.2标样采集和保存
9月上旬在水稻种植区的田块采集叶瘟、节瘟和穗颈瘟标本。采集的标本要标明采样的时间、地点并统一编号。标本完全晾干水分后装入自封袋干燥保存。
1.3病菌分离保存
1.3.1标本保湿培养
将标本放置含有抗生素利福平2ml(25mg/ml酒精稀释配液)的无菌水中，浸泡10h～24h,取出后放置在灭菌标本支架上，在标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h。
1.3.2单孢分离
经保湿培养的标本用震落法，将孢子震落到灭菌的水琼脂培养基中,水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h。水琼脂培养基：琼脂粉20g，利福平2ml(25mg/ml酒精稀释配液),水1000ml。
1.3.3单孢提纯
在超净工作台内显微镜下用手术刀挑取水琼脂培养基上的稻瘟病单孢，接种到PDA培养基上，一个标本上抖落的单孢至少要挑取3个，并在培养皿上标明编号，在26℃恒温培养箱中培养3d-5d，观察菌落生长情况，每个PDA培养基上可以接种3-5个单孢。马铃薯琼脂培养基(简称PDA)：成品PDA培养基粉40g,水1000ml。
1.3.4单孢保存
当单孢菌株的菌落直径达到2cm时，用灭菌手术刀切取一部分转入到灭菌稻谷粉培养基中，每皿倒2/3培养基，每皿接种一株单孢菌株。待菌落长满培养皿直至自然干燥，在无菌条件下切碎装入冻存管，-20℃低温保存。稻谷粉培养基：稻谷粉20g，琼脂粉20g，酵母粉2g,利福平2ml(25mg/ml酒精稀释配液),水1000ml。
1.4接种体准备
1.4.1病菌活化
将保存的单孢菌株取出一小块，放在PDA培养基中在26℃的恒温培养箱中进行菌株活化，需3d～5d。
1.4.2病菌扩繁培养
将PDA培养基中活化的菌株在超净工作台中转入产孢培养基中，在26℃的恒温培养箱中全培养5d～7d。期间要观察是否污染，如有污染及时将污染菌落取出。产孢培养基：玉米粉40g，稻谷粉50g，琼脂粉20g，水1000ml。
1.4.3孢子产生
将产孢培养皿置于黑光灯下(荧光灯与培养皿距离38cm)、黑暗和光照交替12h，4d～7d，促进菌株产生孢子。期间取少量菌落显微镜下观察，如产孢量低可将菌丝用无菌水洗刷，然后再次放入在黑光灯下培养，再次培养的菌落产孢量会增加。
1.4.4孢子悬浮液制备
用无菌水洗下产孢培养基表面的孢子，用灭菌纱布过滤，加入0.02％的tween_20配制成5×105个/mL的孢子悬浮液用于接种。
1.5鉴别寄主培育
1.5.1土壤消毒和装土
过筛稻田土一立方米和5kg/m3复合肥并按照3:1的比例加入育秧基质，均匀混合后装入育秧盘中，压平,压紧备用,装土量为育秧盘的2/3为宜。育秧时浇灌好水的盘秧土表面均匀喷洒2‰移栽灵溶液200mL。
1.5.2种子消毒
稻谷种子用0.5％双氧水浸种24h，换水再浸泡24h。
1.5.3催芽
消毒种子滤去水分,30℃催芽24h-48h。
1.5.4播种
消毒种子播于育秧盘消毒土中，每个育秧盘播21份稻种，7个鉴别寄主每个设置3个重复。覆细土0.5cm,覆盖薄膜。
1.5.5苗期管理
苗高1.5cm～2cm时，喷施2‰移栽灵溶液。当气温超过30℃时,需要开窗通风。两叶一心,追施尿素1g/盘，接种前3d同剂量追施一次尿素。整个育苗过程需保持盘内泥土湿润但不积水。80％幼苗三叶一心,即可接种。
1.6接种和保湿
1.6.1喷雾接种
用高压气泵将含有0.02％的tween-20孢子溶液雾化，喷施在保湿培养箱内的鉴别寄主叶片表面，叶片布满不聚合的细雾滴，需要40ml～60ml孢子液。
1.6.2恒温保湿培养
在恒温25℃培养箱中保湿培养24h。
1.6.3潜育期管理
保湿培养24h后,置于弱光照、26℃温室中，用时控开关控制喷雾时间，每隔2h喷雾3min，培养7d～10d。
1.6.4发病调查
1.6.4.1调查方法
接种7d-10d后调查，病斑分9级，见表1分级标准调查记载。
表1水稻苗叶瘟调查分级标准
Figure BDA0002759739730000141
Figure BDA0002759739730000151
1.6.4.2无效数据
当对照品种发病率低于50％时，该菌株接种无效。
1.6.4.3生理小种命名(毒性公式命名法)
毒性公式命名法：所用的7个单基因鉴别寄主分别为RBL1_CL(含Pi-1)、IRBLI_F5(含Pi-i)、IRBL19_A(含Pi-19)、RBL5_M(含Pi-5)、IRBLZT_T(含Pi-zt)、IRBL9-w(含Pi-1)和丽江新团黑谷，命名时，将对某小种有效的抗病基因作分子，无效的抗病基因作分母写成的公式，即无毒性(R)/有毒性(S)，作为小种名称，见表2.
表2鉴定稻瘟病生理小种鉴别寄主的抗谱和编码
Figure BDA0002759739730000152
Figure BDA0002759739730000161
下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
表3 2013-2017年采集标本一览表
Figure BDA0002759739730000162
Figure BDA0002759739730000171
在稻瘟病发生的季节(7月初至10月初)，采集宁夏水稻种植区的稻瘟病标本，采集标本一般包括叶瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和节瘟，统一编号，标本一式两份分别保存，一份用于提取单胞，一份放入冰箱内低温保存。五年来在宁夏灌区四市不同水稻种植区域的145个地点采集了稻瘟病病害标本1693份。详见表3。
2.稻瘟病病菌分离和保存：
2.1试验材料：
材料为便于挑取稻瘟病单孢的稻瘟病标本，2013年在全区各稻区48个采集地点采集穗颈瘟和节瘟标本480份。2014年在全区各稻区20个采集地点采集穗颈瘟和节瘟标本254份。2015年在全区各稻区22个采集地点采集穗颈瘟和节瘟标本331份。2016年在全区各稻区25个采集地点采集穗颈瘟和节瘟标本255份。2017年在全区各稻区30个采集地点采集穗颈瘟和节瘟标本373份并分类保存。五年共采集标本1693份详见表4。
表4:2013年-2017年采集标本一览表
Figure BDA0002759739730000172
2.2试验方法：
稻瘟病标本将在实验室内进行组织分离、纯化，扩繁得到单孢菌株。将稻瘟病标本消毒，在加入抗生素的无菌水中浸泡24时，在25℃恒温箱中保湿培养24-48小时，并在超净环境下镜检观察是否有稻瘟病，待其病斑上产生大量孢子时，将孢子抖落在水琼脂平板培养基上，在25℃恒温箱中保湿培养16小时，在超净环境显微镜下用手术刀挑取单个孢子，接种到PDA培养基上，25℃保湿培养3-5天左右，期间注意污染菌株并将其及时剔除，培养至长至直径2厘米，再次转入稻谷粉培养基中25℃保湿培养3-5天左右，同样剔除掉污染菌株，将单孢菌株放入4度冰箱暂时保存备用。每个标本只分离3个单孢菌株。将分离获得的单孢菌株接种到产孢培养基上，放入恒温培养箱直至干燥，装入灭菌的冻存管中，将冻存管按编号装入密封容器中，在–20℃的条件下储存。
2.3试验结果
将头年采集的标本进行分离纯化，五年共分离单孢3474份，剔除污染和产孢率低的单孢菌株，共保存菌株1529份，保存率达到44％。详见表5、6。
表5：2014年-2017年保存单孢数量
Figure BDA0002759739730000181
Figure BDA0002759739730000191
表6：2014年-2017年保存单孢数量
Figure BDA0002759739730000192
2.3.1 2014年分离和保存的菌株
用2013年采集的标本提取单孢，共提取单孢678份，保存有效单孢250份，保存率达到36.9％。
2.3.2 2015年分离和保存的菌株
2015年利用2014年采集的标本提取单孢，共提取单孢808份，保存有效单孢306份，保存率达到37.9％，保存单孢的地点和品种信息详见附表1-2。
2.3.3 2016年分离和保存的菌株
2016年利用2015年采集的标本提取单孢，共提取单孢1283份，保存有效单孢638份，保存率达到49.7％，保存单孢的地点和品种信息详见附表1-3。
2.3.4 2017年分离和保存的菌株
2017年利用2016年采集的标本，共分离提纯菌株705份，保存有效菌株335份，保存率达到47.5％，保存单孢的地点和品种信息详见附表1-4。
2.3结果
2.3.1 2014年稻瘟病单孢鉴定结果：
从5月-10月分3批次检测51份2013年的稻瘟病菌生理小种，通过对检测结果抗性频率的分析(如图7)，根据单基因鉴别寄主对菌株的抗性频率来看，抗性基因Piz、Pizt、Pi9、PiB对菌株抗性频率较高，大于40％，详见表7。得出以上抗性基因对我区要水稻品种的抗病性贡献率较大，应加强利用。
表7：稻瘟病主要抗性基因对2013年宁夏稻瘟病菌株的抗性频率
Figure BDA0002759739730000201
2.3.2 2015年稻瘟病单孢鉴定结果：
从5月-10月共检测4批次稻瘟病菌生理小种，共检测2014年的稻瘟病单孢菌株103份(如图8)，根据单基因鉴别寄主对菌株的抗性频率来看，抗性基因Pikh、Piz、Piz5 Pizt、Pi9、Pita2、对菌株抗性频率较高，大于44％；详见表8。表明以上抗性基因对我区要水稻品种的抗病性贡献率相对较大，应加强利用。
表8：稻瘟病主要抗性基因对2014年宁夏稻瘟病菌株的抗性频率
Figure BDA0002759739730000202
2.3.3 2016年稻瘟病单孢鉴定结果：
从5月-10月共检测6批次稻瘟病菌生理小种，其中个广东省农科院植保所合作异地鉴定菌株93份，宁夏农科院作物所鉴定98份，共检测2015年的稻瘟病单孢菌株191份(如图9)，根据单基因鉴别寄主对菌株的抗性频率来看，抗性基因Pikh、Piz、Piz5 Pizt、Pi1、Pi5、Pi9、Pita2、pi25对2015年的稻瘟病菌株抗性频率较高，大于60％(图10)，详见表9、10。得出以上抗性基因对我区要水稻品种的抗病性贡献率较大，应加强利用；尤其抗病基因pi25抗性频率高达90.82，应该加强引进利用。
表9稻瘟病主要抗性基因对2015年宁夏稻瘟病菌株的抗性频率
Figure BDA0002759739730000211
表10：抗性基因对2015年病菌株的宁夏和广东鉴定抗性频率对比表
Figure BDA0002759739730000212
2.3.4 2017年稻瘟病单孢鉴定结果：
从5月-10月共检测5批次稻瘟病菌生理小种，共检测2016年单孢菌株120份(图11)，通过对检测结果抗性频率的分析，Pizt、Pikh、Piz、Pib、Pi9、Pi20、Pita2、基因对菌株表现了高抗性，而Pia Piks Pish Pit Pi3 Pi19几个抗性基因作用对宁夏稻瘟病作用则不大，其中Pi5抗性频率由2016年的67.02％下降到21.67％，抗性频率大幅降低，有待今后继续鉴定观察此基因对宁夏稻瘟病的作用。抗性频率见表11。
表11：抗性基因对2016年宁夏稻瘟病菌株的抗性频率
Figure BDA0002759739730000221
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法包括：
步骤一，进行病圃的设置、病菌采样和保存；所述病菌采样和保存包括：在发病植株上采集获取发病部位的标本，统一编号，晾干，4℃冰箱内保存、备用；将稻瘟病标本放置含有抗生素利福平2ml的无菌水中，浸泡10h～24h，取出后放置在灭菌标本支架上；于标本支架下放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h；
步骤二，将经保湿培养的标本利用震落法将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中；将含有孢子的水琼脂培养皿放入26℃恒温培养箱，培养16h～20h；挑取水琼脂培养基上培养好的稻瘟病单孢，接种到PDA培养基上；并在培养皿上标明编号；
步骤三，于26℃恒温培养箱中培养3d-5d；当PDA培养基上的单孢菌株的菌落直径达到2cm时，切取一部分转入到灭菌稻谷粉培养基中，每皿倒2/3培养基，每皿接种一株单孢菌株；待菌落长满培养皿直至自然干燥，在无菌条件下切碎装入冻存管，于-20℃环境下进行低温保存；将保存的单孢菌株取出一小块，放在PDA培养基中在26℃的恒温培养箱中进行菌株活化3d～5d；将PDA培养基中活化的菌株在超净工作台中转入产孢培养基中，在26℃的恒温培养箱中全培养5d～7d；
步骤四，将产孢培养皿黑暗和光照交替12h培养4d～7d，令菌株产生孢子；再次放入在黑光灯下培养，再次培养的菌落；利用无菌水洗下产孢培养基表面的孢子，并利用灭菌纱布过滤，加入0.02％的tween_20配制成5×105个/mL的用于接种的孢子悬浮液；过筛稻田土一立方米和5kg/m3复合肥并按照3:1的比例加入育秧基质，均匀混合后装入育秧盘中，压平、压紧备用、装土量为育秧盘的2/3；
步骤五，育秧时浇灌好水的盘秧土表面均匀喷洒2‰移栽灵溶液200mL；稻谷种子用0.5％双氧水浸种24h，换水再浸泡24h；将消毒种子滤去水分,30℃催芽24h-48h；将催芽种子播于育秧盘消毒土中，每个育秧盘播21份稻种，7个鉴别寄主每个设置3个重复；覆细土0.5cm,覆盖薄膜；并进行施肥管理；所述施肥管理包括：当苗高1.5cm～2cm时，喷施2‰移栽灵溶液；当气温超过30℃时，开窗通风；于两叶一心时追施尿素1g/盘，接种前3d同剂量追施一次尿素；80％幼苗三叶一心时进行接种；
步骤六，将含有0.02％的tween-20孢子溶液雾化，喷施在保湿培养箱内的鉴别寄主叶片表面，叶片布满不聚合的细雾滴，40ml～60ml孢子液；在恒温25℃培养箱中保湿培养24h；保湿培养24h后,置于弱光照、26℃温室中，用时控开关控制喷雾时间，每隔2h喷雾3min，培养7d～10d；
步骤七，接种7d-10d后，将病斑分按9级分类；当对照品种发病率低于50％时，判定菌株接种无效；对某小种有效的抗病基因作分子，无效的抗病基因作分母写成公式鉴别寄主。
2.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述进行病圃设置包括：将病圃田设在稻瘟病常发病区或常年稻区，选择平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域。
3.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述标本包括病穗颈和病穗节。
4.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述水琼脂培养基由琼脂粉20g，抗生素2ml，水1000ml组成。
5.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述挑取水琼脂培养基上的稻瘟病单孢包括：一个标本上挑取3个及以上抖落的单孢。
6.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述接种到PDA培养基包括：每个PDA培养基上接种3-5个单孢；
所述PDA培养基有成品PDA培养基粉40g与水1000ml组成。
7.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述稻谷粉培养基由稻谷粉20g，琼脂粉20g，酵母粉2g，抗生素2ml以及水1000ml组成。
8.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述产孢培养基由玉米粉40g，稻谷粉50g，琼脂粉20g以及水1000ml组成。
9.如权利要求1所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法，其特征在于，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法还包括：整个育苗过程保持盘内泥土湿润但不积水。
10.一种实施如权利要求1-9所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能方法的稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统，其特征在于，所述稻瘟病病菌孢子分离和保存智能系统包括：
病圃选取系统，用于选择稻瘟病常发病区或常年稻区、平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便的区域作为病圃田；
病菌采样和保存系统，用于于发病植株上进行发病部位的标本采样，并进行标本保存；
保湿培养系统，用于将采集的病菌样本浸泡后于含有抗生素灭菌水的培养皿上进行保湿培养；
孢子分离系统，用于将保湿培养后的孢子利用震落法从无菌培养皿中分离至灭菌水琼脂培养基中并进行培养；
提纯系统，用于提纯水轻质培养基上的单孢并利用PDA培养基对提纯的单孢进行培养；
单孢保存系统，用于对培养的单孢进行冷冻保存；
病菌活化系统，用于将冷冻保存的单孢进行活化；
病菌扩繁培养系统，用于将活化的单孢进行扩繁培养；
孢子培养系统，用于对扩繁后的孢子黑暗和光照交替培养，并利用无菌水处理孢子；
育秧盘制备系统，用于进行育秧盘的制备；
种子处理系统，用于对种子进行消毒、催芽以及播种；
管理监测系统，用于实时对播种的后的种子的苗期进行管理，并实时监测生长状况；
接种系统，用于将培养处理的后的孢子溶液进行雾化，并采用喷雾接种的方式寄生于叶片表面；
培养管理系统，用于进行接种后的叶片的培养管理以及发病分析。
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