CN102511368A

CN102511368A - 一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法

Info

Publication number: CN102511368A
Application number: CN2011104587266A
Authority: CN
Inventors: 和江明; 胡靖锋; 汪骞; 钟利; 杨红丽; 田志梅
Original assignee: HORTICULTURAL RESEARCH INSTITUTE YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: HORTICULTURAL RESEARCH INSTITUTE YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明公开了一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法，属于芸薹属作物抗病性鉴定技术领域。该方法用酸性水浸泡后的珍珠岩与打碎的芸薹根肿菌菌根按1升：10～15克比例混合成培养基质，培养基质填充在冷冻盒格内，待鉴定品种的种子和感根肿病的感病品种种子播于冷冻盒的格内，每一格播1粒种子，冷冻盒置于瓷盘内，用1/2MS培养基作和打碎的芸薹根肿菌菌根制成pH为5.5，病菌孢子含量为1×10⁸个/毫升以上的接种菌液；接种菌液注入瓷盘内，置入人工气候箱内培养，根据调查的病情指数鉴定待鉴定品种对根肿病的抗性。该方法可规模化鉴定根肿病的抗性，节省大量土地，保证鉴定条件一致，省时省工，鉴定结果准确可靠，操作简便。

Description

一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法

技术领域

本发明属芸薹属作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及对根肿病抗性的鉴定方法。

背景技术

根肿病（club root）是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）侵染植物引起的一种世界性病害。芸薹根肿菌属真菌界鞭毛菌亚门根肿菌纲根肿菌属（Plasmodiophora），是专一侵染芸薹属植物的致病性病原菌，该病原菌侵入植物根毛、皮层、形成层，产生含有植物生长激素的病菌分泌物，刺激薄壁细胞的异常分裂增大，在增生部位膨大形成瘤状的肿根。肿根的出现一方面降低了根系吸收和供给水份及养份的能力，造成地上部分失水、枯黄和死亡；另一方面使植物根系失去了外层的保护作用，易被其它杂菌入侵而引起腐烂。芸薹属植物（Brassica）是根肿菌的专一性寄主，在高温、高湿和酸性的环境条件下，有利于病害发生，可导致作物产量严重下降，甚至绝收。云南是典型的高原红壤，酸性较重，夏天的时候气温高、湿度大，根肿病发生严重。虽然经过了诸多年药剂防治的研究，但根肿病有“植物的癌症”之称，药剂防治效果不突出。

应用抗病品种预防根肿病的发生是最安全而又十分经济的一种方法。但应用抗病品种，首先需要建立品种抗病能力的检测方法。芸薹根肿菌是寄生性真菌，目前尚不能人工培养，所以无法进行人工接种鉴定。传统的方法是将品种种植在根肿病严重的地块进行检测，或将根肿病病根、菌土带回单位，搭建小拱棚种植品种，进行鉴定。这两种方法都难以保证鉴定条件的一致性，而且费工、费时，难以完成规模化的品种鉴定需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术对根肿病的抗性鉴定存在难以保证鉴定条件的一致性，费工、费时，难以完成规模化的品种鉴定的缺陷和不足，其目的是提供一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法，其步骤如下：

（1）培养基质的制备

用珍珠岩和打碎的芸薹根肿菌菌根混合而成的混合物作为培养基质，珍珠岩在使用前用pH为5.0～5.5的酸性水浸泡72～96小时以上，珍珠岩与打碎的芸薹根肿菌菌根混合的比例为1升：10～15克；

（2）培养基质的填充

用冷冻盒作为培养器皿，将冷冻盒的每一格底部打一个孔，将培养基质填充在冷冻盒的格内，培养基质的高度低于格子高度2mm～3mm；

（3）播种

将待鉴定品种的种子播于冷冻盒的格内，每一格播1粒种子，播种后再覆盖一层培养基质，使培养基质的高度与冷冻盒的格子高度一致，盖上盒盖，将冷冻盒置于瓷盘内或不锈钢盘内；

（4）接种菌液的制备

用1/2MS培养基作为培养液，将打碎的芸薹根肿菌菌根和所述的培养液混合，制成病菌孢子含量为1×10⁸个/毫升以上的溶液，用1mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH为5.5即制成接种菌液；

（5）将接种菌液注入所述的瓷盘内或不锈钢盘内，使接种液的高度为0.5~1.0cm；

（6）每一鉴定批次用感根肿病的感病品种作为对照；

（7）将注入了接种菌液的瓷盘或不锈钢盘及其盘内的冷冻盒一起置入人工气候箱内，30℃暗培养3天，保持空气湿度在48～52%，3天后，打开盒盖和气候箱光源，转入光照生长，光照时间12 h/d，光照强度5300～5500lx，调节空气湿度在75%～80%，调节人工气候箱的温度为24℃～26℃；

（8）病情指数的调查统计

对照材料在培养基质以上的叶片萎蔫和根部肿大时，按单株病症分级标准进行调查统计，计算病情指数，根据调查的病情指数，按群体抗性分级标准鉴定出待鉴定品种对根肿病的抗性；

所述的单株病症分级标准是：

病级病症

0 级：根不膨大，

1 级：根膨大，根直径＜0.3厘米，

2 级：根膨大，0.3厘米≤根直径≤0.6厘米，

3 级：根膨大，根直径＞0.6厘米；

病情指数的计算公式是：

所述的群体抗性分级标准是：

群体抗性分级病情指数

免疫(I)： 0.00—0.10；

高抗(HR)： 0.11—5.55；

抗病(R)： 5.56—11.11；

耐病(T)： 11.12—33.33；

感病(S)： 33.34—55.55；

高感(HS)： 55.56—100.00。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、采用本发明方法，在一个1000升的人工气候箱一次可完成100个品种的鉴定（以一个冷冻盒鉴定一个品种，以及冷冻盒的体积和人工气候箱的体积计算得出），可以大批量鉴定，节省大量土地，解决了现有技术鉴定根肿病抗性难以保证鉴定条件的一致性，费工、费时，难以完成规模化的品种鉴定的缺陷和不足。

2、本发明方法鉴定结果准确可靠，操作简便，实用性强。

附图说明

图1是冷冻盒的结构示意图，图中标记表示：1-冷冻盒；2-冷冻盒的格。

图2是冷冻盒的盒盖的结构示意图，图中标记表示：3-盒盖。

具体实施方式

实施例1

试验材料：

待鉴定品种为：大白菜C09-35、大白菜C09-36、大白菜C09-37、大白菜C09-38、

对照为：已知为感根肿病的高感品种大白菜83-1；

试验步骤如下：

（一）芸薹根肿菌菌根的鉴别，按如下常规方法：

根肿病菌感染引起的根部肿大只发生在十字花科作物，主要是与根结线虫引起的根部肿大进行区别，芸薹属根肿病菌从根毛侵入细胞内，经演变和扩展，再从根部表皮进入形成层，刺激薄壁细胞分裂、膨大，最终使根部形成瘤状物。根肿病引起的根部肿大在作物主、侧根均能发生，主根上的瘤多靠近上部，圆形或椭圆形，表面凹凸不平、粗糙，后期开裂或不开裂；侧根上的瘤多呈圆筒形手指状；而根结线虫病引起的根部肿大是由于在植物组织内寄生的线虫，分泌的唾液能刺激根部组织形成巨型细胞，使细胞过度分裂引起根部虫瘿。根结线虫引起的根部肿大有的只发生在主根，有的只发生在侧根上。取根部组织进行显微镜镜检后，发现根肿病菌引起的根肿病植物根部细胞内有一个个圆形小病菌，小病菌聚集后形成近椭圆形的病菌孢子囊，根内无任何东西；而根结线虫引起的根部肿大，根部解剖镜检后发现，有细长蠕虫状雄虫和梨形雌成虫。因此，本实施例采集的大白菜根部肿大的菌根用显微镜镜检，其根部细胞内有一个个圆形小病菌，小病菌聚集后形成近椭圆形的病菌孢子囊，根内无任何东西即为芸薹根肿菌菌根；

(二) 实验室内冷冻盒芸薹根肿菌菌根接种法

（1）培养基质制备

用珍珠岩和打碎的芸薹根肿菌菌根混合而成的混合物作为培养基质，珍珠岩在使用前用pH为5.5的酸性水浸泡72小时，培养基质按珍珠岩与打碎的芸薹根肿菌菌根的配比比例为1升：10克的比例进行混合；

（2）培养基质的填充

用冷冻盒1作为培养器皿，将冷冻盒的每一格底部都打一个孔，将培养基质填充在冷冻盒的格2内，培养基质的高度低于格子高度2mm～3mm；

（3）播种

冷冻盒1如图1所示，该冷冻盒1共有100个格2，每一个品种用一个冷冻盒1，5个品种各用1个冷冻盒1，将待鉴定品种：大白菜C09-35、大白菜C09-36、大白菜C09-37、大白菜C09-38、及对照：大白菜83-1的种子分别播于各冷冻盒1的格2内，每一格1内播1粒种子，每个材料播种100粒，播种后再覆盖一层培养基质，使培养基质的高度与冷冻盒格子高度一致，盖上盒盖3，将冷冻盒1置于瓷盘内；

（4）接种菌液的制备

（5）将接种菌液注入所述的瓷盘内，使接种液的高度为0.5~1.0cm；

（6）将注入了接种菌液的瓷盘及其盘内的冷冻盒（即播好种的冷冻盒）一起置入人工气候箱内，30℃暗培养3天，保持空气湿度在48%，3天后，打开盒盖和气候箱光源，转入光照生长，光照时间12 h/d，光照强度5300lx，调节空气湿度在75%，调节人工气候箱的温度为24℃；每天观察接种液的高度、接种液的pH值，人工气候箱的温度、空气湿度，如有变化，及时进行修正；

（7）病情指数的调查统计

种子的生长期达到40～45天，对照材料在培养基质以上的叶片萎蔫和根部肿大时，按单株病症分级标准进行发病率和病情指数的调查统计，根据调查计算的病情指数，按如下所述的群体抗性分级标准鉴定出待鉴定品种对根肿病的抗性。

所述的单株病症分级标准是：

病级病症

0 级：根不膨大，

1 级：根膨大，根直径＜0.3厘米，

2 级：根膨大，0.3厘米≤根直径≤0.6厘米，

3 级：根膨大，根直径＞0.6厘米；

计算方法：

发病率=（发病株数/调查株数）×100%

(三)田间鉴定（品种鉴定对照）

将待鉴定品种：大白菜C09-35、大白菜C09-36、大白菜C09-37、大白菜C09-38、和对照大白菜83-1播种于根肿病发病较严重的大白菜田地，该大白菜田地的芸薹根肿菌菌根的鉴别方法与上述（一）芸薹根肿菌菌根的鉴别相同，每个品种播种100株，60天后，按上述步骤（7）病情指数的调查统计进行调查鉴定品种对根肿病的抗性。

(四)结果及分析：

由表1可以看出，本发明方法与田间鉴定用相同的材料，它们的病情指数相差不大，感病对照均感病，大白菜C09-35、大白菜C09-36、大白菜C09-38为高抗品种，大白菜C09-37为抗病品种，对照83-1感病率是100%，本发明方法的鉴定结果与田间鉴定结果基本相符，本发明方法结果可靠，并且本发明方法可以大批量鉴定，节省大量土地，省工省时，解决了现有技术鉴定根肿病抗性难以保证实验条件的一致性，费工、费时，难以完成规模化的品种鉴定的缺陷和不足，操作简便，实用性强。

实施例2

试验材料：大白菜C10053、大白菜C10054、大白菜C10055、大白菜C10056；

对照为：已知为感根肿病的高感品种大白菜83-1；

试验步骤除以下操作措施不同外，其余操作措施与实施例1相同：

(二) 实验室内冷冻盒芸薹根肿菌菌根接种法

（1）培养基质的制备

珍珠岩在使用前用pH为5.0的酸性水浸泡96小时，培养基质按珍珠岩与打碎的芸薹根肿菌菌根的配比比例为1升：15克的比例进行混合；

（3）播种

将冷冻盒1置于不锈钢盘内；

（6）将注入了接种菌液的不锈钢盘及其盘内的冷冻盒（即播好种的冷冻盒）一起置入人工气候箱内，30℃暗培养3天，保持空气湿度在52%，3天后，打开盒盖和气候箱光源，转入光照生长，光照时间12 h/d，光照强度5500lx，调节空气湿度在80%，调节人工气候箱的温度为26℃；

(三) 室外菌土接种法（（品种鉴定对照）

将采集的芸薹根肿菌菌根用DG180型中药材粉碎机打成粉末，播种前在土中加入该菌根粉末，并充分混合,使菌土中病菌孢子含量达到1×10⁸个/g土以上，用0.1mol/L稀盐酸溶液调节PH值至5.5。将待鉴定品种大白菜C10053、大白菜C10054、大白菜C10055、大白菜C10056、及对照品种大白菜83-1播于装有该菌土的育苗盘中，每个品种播种100粒。将育苗盘放于小型人工塑料拱棚中，覆盖上塑料薄膜。控制土壤湿度在74％～76％，白天温度在24-26℃之间，夜晚温度在20-23℃之间。出苗后45天（大约8片真叶）进行统计。统计方法和品种群体抗性分级标准鉴定与实施例1相同。

（四）结果及分析：

由表2可以看出，本发明方法与室外菌土接种法相比较，结果得出品种大白菜C10053、大白菜C10054、大白菜C10055是高抗品种，大白菜C10056是抗病品种，对照83-1感病率是100%，两种方法鉴定的结果没有较大的出入，说明本发明方法的鉴定结果准确可靠。

上述实施例是一个品种播种在1个冷冻盒内，也可以每一个冷冻盒内一次播种多个品种，每一格播1粒种子，每一个品种设3次重复，对照品种也播种在同一个冷冻盒的不同的格内，每一格播1粒种子，设3次重复。

Claims

1.一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法，其特征在于步骤如下：

（1）培养基质的制备

用珍珠岩和打碎的芸薹根肿菌菌根混合而成的混合物作为培养基质，珍珠岩在使用前用pH为5.0～5.5的酸性水浸泡72～96小时，珍珠岩与打碎的芸薹根肿菌菌根混合的比例为1升：10～15克；

（2）培养基质的填充

（3）播种

（4）接种菌液的制备

（6）每一鉴定批次用感根肿病的感病品种作为对照；

（8）病情指数的调查统计

所述的单株病症分级标准是：

病级病症

0 级：根不膨大，

1 级：根膨大，根直径＜0.3厘米，

2 级：根膨大，0.3厘米≤根直径≤0.6厘米，

3 级：根膨大，根直径＞0.6厘米；

病情指数的计算公式是：

所述的群体抗性分级标准是：

群体抗性分级病情指数

免疫： 0.00—0.10；

高抗： 0.11—5.55；

抗病： 5.56—11.11；

耐病： 11.12—33.33；

感病： 33.34—55.55；

高感： 55.56—100.00。