CN114303516B - 一种芸薹根肿菌的接菌方法及其在筛选抗根肿病育种材料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芸薹根肿菌的接菌方法及其在筛选抗根肿病育种材料中的应用，属于十字花科抗病育种领域。所述接菌方法包括：催芽、催芽期管理、定植、定植后管理、发病调查、抗病性调查以及依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级；催芽是用根肿菌悬浮液感染种子，每个培养皿中1‑300粒所述种子添加所述根肿菌悬浮液2‑5mL，25℃恒温条件催芽。该接菌方法可以保证每一个植株的根系都能充分的与菌液接触，接菌成功率达到100％；还能明显缩短抗病性调查所需要的时间，在能保证接菌稳定性的前提下极大提高了抗病性材料筛选的效率，还为抗病抗病性材料筛选提供了新的接菌方法，缩短了抗病性材料筛选的时间，利于加快抗病育种的进程。
Description
技术领域
本发明涉及十字花科抗病育种领域，特别是涉及一种芸薹根肿菌的接菌方法及其在筛选抗根肿病育种材料中的应用。
背景技术
根肿病是威胁十字花科植物的一种世界性土传病害，该病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染十字花科根部，引起薄壁组织细胞大量分裂增殖且增大，进而根部逐渐形成肿瘤。根肿病专性寄生十字花科，国内主要种植的十字花科作物为大白菜，小白菜，结球甘蓝，萝卜，菜心等，根肿病的发生对十字花科作物造成非常严重的危害。目前，国内外对根肿病的研究越来越多，无论是抗病育种，还是根肿菌接菌方法及抗病性的鉴定。国内外已报道的接菌方法包括菌土法、灌根法、插入法、浸根法、蘸根法等，但到目前为止尚未形成一个统一、高效的十字花科作物根肿菌接菌方法。
经过前人多次的试验验证，以上接菌方法均有效，但是接菌效果不稳定，重复性不高，不具可比性，从而导致试验结果及植物抗性评价等差异显著。菌土法、注射法发病慢，浪费菌液，但发病较均匀，发病指数高；浸根法、虽操作简单，但发病指数低。柴阿丽在十字花科根肿病接菌技术及发病条件研究使用了浸根法，发现该方法方便快捷，节省菌液用时短，效果好，发病快，但容易造成死苗。在相同的条件下用同一浓度的菌液发病率和发病指数随处理时间的增长而加大。此外，根肿菌的接菌浓度是制约接菌成功与否的关键因素，浓度过低则选择压力达不到，侵染根部的根肿菌数达不到发病要求，而浓度过高选择压力过大，侵染根部的孢子数量过多，繁殖过快，使植株根部很快变成肿瘤使根部腐烂，而影响鉴定结果。发病率在一定范围内随接菌孢子浓度的增大而增大，但孢子浓度达到一定时发病率反而下降。
根肿病的大面积流行对国内大白菜的安全生产构成了严重威胁。面对国内大白菜根肿病发病区域日益扩大的严峻形势，现有的生物防治、化学防治、农业防治措施，虽然可以在一定程度上减轻根肿病的危害，但同时存在土壤、环境污染，生产成本高等诸多问题，仍不能从根本上解决大白菜栽培所面临的严重问题。抗病育种是防控根肿病危害最经济且安全有效的途径，这就需要建立一种芸薹根肿菌稳定、高效的接菌方法及其在抗病育种材料筛技术，服务于大白菜抗病新品种的选育。加速抗病新品种的培育，减少根肿病危害地区的经济损失，提高经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种芸薹根肿菌的接菌方法及其在筛选抗根肿病育种材料中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法可以达到接菌成功率100％，并且还缩短了材料筛选的时间，加速了抗病育种的进程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种芸薹根肿菌的接菌方法，包括：催芽、催芽期管理、定植、定植后管理、发病调查、抗病性调查以及依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级；
其中，所述催芽是用根肿菌悬浮液感染种子，每1-300粒所述种子添加所述根肿菌悬浮液2-5mL，25℃恒温条件催芽。
优选的是，所述催芽的具体操作步骤包括：培养皿中放置双层滤纸，所述滤纸用所述根肿菌悬浮液湿润，然后在所述滤纸上放上所述种子进行催芽。
优选的是，所述种子为十字花科种子。
优选的是，所述根肿菌悬浮液浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL。
优选的是，所述催芽管理包括：每隔24h向所述滤纸上添加所述根肿菌悬浮液，维持滤纸湿润。
优选的是，所述定植包括：用催芽72-96h的幼芽定植。
优选的是，所述定植后管理包括：定植后保持温度23-26℃，湿度70％-90％，光照时间保持每天不低于8h光照，正常给予水分管理。
优选的是，定植后4周进行抗病性调查；抗病性调查分4个等级：0级，即抗病免疫；1级，须根有小瘤，主根无肉眼可见瘤；2级，主根略有膨大，须根有瘤、有肉眼可见小瘤或者大瘤；3级，主根明显膨大，须根有明显瘤，严重感病。
本发明还提供所述的接菌方法在筛选抗根肿病育种材料中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的芸薹根肿菌的接菌方法较现有常用方法(菌土法、灌根法、插入法、浸根法、蘸根法等)更加稳定、高效，可以保证每一个植株的根系都能充分的与菌液接触，接菌成功率达到100％。另外，传统接菌方法是在育苗2周后接种根肿菌，接种后6-7周进行抗病性鉴定，共计需8-9周左右时间，本发明的接菌方法可在接菌后4周进行抗病性调查，相比已有的接菌方法所需时间缩短了50％左右，可见，本发明能够保证了接菌稳定性的前提下极大提高了抗病性材料筛选的效率，为抗病性材料筛选提供了新的接菌方法，并缩短了材料筛选的时间，加速了抗病育种的进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为催芽接菌第一天的状态；
图2为催芽接菌后28天发病调查的植株；
图3为大白菜根肿病抗病性调查分级标准；
图4为供试品种对pb1生理小种抗病性病情指数调查结果；
图5为供试品种对pb1生理小种发病率的调查结果；
图6为供试品种对pb1生理小种发病指数的调查结果；
图7为供试品种对pb6生理小种抗病性病情指数调查结果；
图8为供试品种对pb6生理小种发病率的调查结果；
图9为供试品种对pb6生理小种发病指数的调查结果；
图10为供试品种对pb1和pb6生理小种抗性表现。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
芸薹根肿菌稳定、高效的接菌方法，包括以下步骤：
(1)催芽：培养皿中放置双层滤纸，滤纸用根肿菌悬浮液(浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL)将滤纸湿润，在滤纸上放入种子1-300粒，置于25℃培养箱进行催芽72-96h。
(2)催芽期管理：每隔24h向培养皿滤纸上添加适量根肿菌悬浮液(浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL)使滤纸湿润，保证种子正常发芽所需水分和湿度。
(3)定植：72孔穴盘中装入商用蔬菜育苗基质(包含草炭，珍珠岩，蛭石等)并浇适量水，使基质充分湿润，将催芽72-96h后幼芽定植到72孔穴盘中，穴盘置于温室大棚中；
(4)定植后管理：定植后保持温度23-26℃范围内，湿度70％-90％，光照时间为保持每天不低于8h光照，正常给予水分管理；
(5)发病调查：定植后4周进行抗病性调查，从育苗穴盘取出完整植株及根系，用清水洗净植株根部，最大可能性的保留根系的完整。
(6)抗病性调查分4个等级，0级，即抗病免疫；1级，须根有小瘤，主根无肉眼可见瘤；2级，主根略有膨大(小瘤)，须根有瘤有肉眼可见小瘤或者大瘤；3级，主根明显膨大，须根有明显瘤，严重感病。
(7)依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级。计算发病率和发病指数。
发病率(％)＝(感病株数/调查总株数)×100％；
植株病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数)/调查总株数×最高级别值]×100％
实施例2
以大白菜种子为例，用实施例1的方法进行抗病性的筛选
1、试验材料
1.1供试菌样来自四川德阳采集的大白菜根肿病根SCDY-57和辽宁新民采集的大白菜根肿病根LNXM-1。SCDY-57生理小种为pb1，LNXM-1生理小种为pb6。两种病根经清洗晾干，置于-20℃冰箱，留待制备接种液。
1.2植物材料
供试57种大白菜品种为国内市场上现有的部分抗根肿病大白菜品种(见表1)，其中抗根肿病大白菜品种55个，不含有抗根肿病基因的旺庆春和91-12两个品种作为感病对照(CK)。
表1试验中用的大白菜抗根肿病品种及来源
2、试验方法
2.1大白菜抗病品种的根肿菌接种
试验于2019年3月开始在沈阳农业大学天柱山基地温室内进行。2019年3月12日催芽，(1)培养皿中放置双层滤纸，滤纸用根肿菌悬浮液(浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL)将滤纸湿润，在滤纸上放入每个品种大白菜种子36粒(前期为了验证试验的准确性，采用大量的种子并用相同方法进行了试验，见图1)，置于25℃培养箱进行催芽。
(2)催芽期管理：每隔24h向培养皿滤纸上添加适量根肿菌悬浮液(浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL)使滤纸湿润，保证种子正常发芽所需水分和湿度。结果发现：定植之前，36粒种子液仅用了2mL根肿菌悬浮液。
(3)定植：72孔穴盘中装入商用蔬菜育苗基质(包含草炭，珍珠岩，蛭石等)并浇适量水，使基质充分湿润，将催芽4天后幼芽定植到72孔穴盘中，穴盘置于温室大棚中。
(4)定植后管理：定植后保持温度23℃-26℃范围内(优选25℃)，湿度80％，光照时间为保持每天不低于8小时光照，正常给予水分管理。
2.2抗病品种的抗病性鉴定
供试55个品种随机区组分布。出苗后正常水肥管理，尽量避免土壤含水量较高或较低影响根肿菌发病情况。
发病调查：定植后4周进行抗病性调查，从育苗穴盘取出完整植株及根系，用清水洗净植株根部，最大可能性的保留根系的完整，见图2。抗病性调查分4个等级，0级，即抗病免疫；1级，须根有小瘤，主根无肉眼可见瘤；2级，主根略有膨大(小瘤)，须根有瘤有肉眼可见小瘤或者大瘤；3级，主根明显膨大，须根有明显瘤，严重感病。依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级(图3)。计算发病率和发病指数。
3、结果与分析
3.1对四川德阳根肿菌生理小种的抗性鉴定
不含有抗根肿病基因的旺庆春和91-12两个感病对照品种均发病，发病率为100％，发表指数为100。供试55个品种共有20个表现出免疫(图4)，这些品种分别是：胜根1号、战神K5、CR秋丽、宝根王、滇赢白菜王、CR春福5号、CR春泰、胜根3号、千腾65F1、CR天白15、彩云CR007、强根118、似锦、维多星、CR秀金2号、CR宏图8号、亚久-旺春、秋状元、凯莱CR春白菜、CR寒春。此外，还有一些品种只少量发病，抗性较强。还有10个品种抗性较差，这10个品种是：德高CR63、金春秋、精英.夏、普威春锦、CR炎黄、亚妃、韩国迷你、春秋黄、吉锦、CR金顶11号。
由图5可以看出，其发病率整体趋势与其病情指数趋势基本相似。表现为免疫的品种发病率为0。表现为感病或高感的品种，其对应的发病率也较高。从图片整体趋势来看，发病率与病情指数出入不大。
由图6可以看出，供试品种发病指数表现为40-80区间内品种个数为0，说明供试品种要么对pb1生理小种表现为抗病，要么表现为感病，没有处于中间地带的品种，说明品种纯度较高，表现为抗病的品种抗性良好，表现为感病的品种可能由于育种上的原因，导致其有针对性只抗某个其他生理小种，对pb1生理小种抗性表现较差。且发病指数处于0-10之间的品种个数达到了36个，占供试55个品种的65.45％。发病指数占80以上的有8个品种，占供试55个品种的14.55％。
3.2对辽宁新民根肿菌生理小种的抗性鉴定
不含有抗根肿病基因的旺庆春和91-12两个感病对照品种均发病，发病率为100％，发表指数为100。供试品种整体对pb6抗病性较差(图7)，只有10个品种表现为免疫，这10个品种是：胜根1号、战神K5、CR秋丽、宝根王、滇赢白菜王、CR春福5号、CR春泰、今锦、春美味、胜根3号。除部分品种抗性较良好之外，有33个品种表现为高感。
从图8可知，除千腾65F1与其病情指数有些许出入外，其余品种发病率均与病情指数差异不明显，供试品种的发病率和病情指数整体数据趋势基本相似。
由图9可知，供试品种发病指数表现为30-70区间内品种个数为0，说明供试品种对pb6生理小种只表现为抗病或感病，品种纯度较高。但发病指数在30以下的品种有22个，占供试55个品种的40.00％，发病指数在70以上的有33个，占供试55个品种的60.00％，说明供试品种对pb6抗性表现整体较差，发病指数多数偏高。
结合供试品种对pb1和pb6综合表现，制作表2。根据表2可看出，这17个品种的发病率和病情指数总体上基本在10％以下，均属抗性较强品种。德高CR69对pb1和pb6生理小种表现为抗病，发病很轻微，除此之外，其余的16个品种均至少对pb1或pb6两个生理小种其中的一个表现为免疫。千腾65F1针对pb6生理小种表现出的发病率和病情指数较之其他品种有些差异，但其总体上表现为高抗甚至免疫根肿病。总体来看，这些抗性较强品种对pb1表现为免疫的个数比对pb6表现为免疫的个数要多。
供试55个品种针对pb1和pb6都表现为完全免疫的有8个，占供试55个品种的14.55％，这8个品种分别为：胜根1号、战神K5、CR秋丽、宝根王、滇赢白菜王、CR春福5号、CR春泰，胜根3号，这8个品种均对pb1和pb6生理小种表现为完全免疫，发病率和病情指数均为0。有2个品种对pb1表现为少量发病而对pb6表现为完全免疫，包括今锦、春美味。还有5个品种对pb6表现为部分发病，对pb1表现为免疫，分别是千腾65F1、CR天白15、彩云CR007、强根118、似锦。总体来说，除完全免疫的8个品种外，这5个品种对pb1和pb6两种生理小种抗性表现均属优良。此外，德超CR金胜和德高CR69对pb1和pb6均表现为抗病，病情指数小于11.11。虽然不是完全免疫，但其发病轻微，品种抗性较强。
表2抗性较强品种及其发病率和发病指数
由图10可见，供试品种中完全感病的品种只有9种，说明这批从市场购买的种子大部分还是具有一定抗性的。部分表现为仅抗pb1品种较仅抗pb6的品种多，可能是由于育种者在育种过程中有针对性的选育只抗pb1生理小种的品种，导致其小种专化性明显。或pb6生理小种致病力强，抗性资源少。
结合图4、图7中的pb1和pb6病情指数可以发现，部分对pb1表现出抗性，对pb6表现抗性较弱的品种为：维多星、寒冬CR、CR秀金2号、CR金春12号、CR宏图8号、亚久旺春、CR金丽、胜根2号、CR67、秋状元、亚久CR-金达、凯莱CR春白菜、亚久CR春辉、春光、CR寒春、靓根CR1、极品白菜、CR真金3号、CR黄龙10号、玲珑黄、亚久惠春、CR仙龙黄、CR顺美、CR1239大白菜，共24种，占供试55个品种的43.64％。对pb6表现为抗性良好、对pb1表现为感病的品种主要是德高CR63，针对pb1和pb6两种生理小种抗性表现差异较大。对pb1和pb6抗性表现均较差的品种为：金春秋、精英.夏、普威春锦、CR炎黄、亚妃、韩国迷你、春秋黄、吉锦、CR金顶11号，共9种，占供试55个品种的16.36％。剩下的21个品种均对pb1和pb6表现出病情指数在33.34以下，即对两种生理小种均有抗病性。
另外，在根据实施例2对本发明的方法进行验证的同时，还根据现有技术的接菌法进行了对照试验，其中，菌土法参考“结球甘蓝对根肿病的抗性鉴定与评价”；蘸根法参考“Clubroot in Brassica:a standard inoculation technique and the specificationof races”；注射法参考“十字花科蔬菜根肿病菌生理小种及接种方法”；插入法参考“大白菜根肿病室内人工接种方法和条件比较及不同品种抗性鉴定”；浸根法参考“培养用于观察根肿菌侵染十字花科植株的方法”。对不同试验结果进行统计，如表3所示。
表3不同方式接种根肿菌的结果统计
由表3的结果可见，本发明公开的芸薹根肿菌的接菌方法相对现有技术的常规接菌方法，明显的，用菌量大大减少(200-300粒大白菜种子用3-5mL，而比如蘸根法或浸根法虽见其他方法用量少，但是每个植株对于菌量需求也在2-3mL，那么200-300粒种子发育成植株后需要的菌量也在400-900mL，其他方法的用菌量比蘸根法更多)。同时，还发现本发明能够明显的降低筛选抗病材料的时间，缩短育种进程，并且稳定好，利于提高了抗病材料筛选效率的提高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种芸薹根肿菌的接菌方法，其特征在于，包括：催芽、催芽期管理、定植、定植后管理、发病调查、抗病性调查以及依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级；
其中，所述催芽是用根肿菌悬浮液感染种子，每1-300粒所述种子添加所述根肿菌悬浮液2-5mL，25℃恒温条件催芽72-96h；
所述催芽的具体操作步骤包括：培养皿中放置双层滤纸，所述滤纸用所述根肿菌悬浮液湿润，然后在所述滤纸上放上所述种子进行催芽；
所述根肿菌悬浮液浓度为1×106个根肿菌休眠孢子/mL；
所述催芽管理包括：每隔24h向所述滤纸上添加所述根肿菌悬浮液，维持滤纸湿润。
2.如权利要求1所述的芸薹根肿菌的接菌方法，其特征在于，所述种子为十字花科种子。
3.如权利要求1所述的芸薹根肿菌的接菌方法，其特征在于，所述定植包括：用催芽72-96h的幼芽定植。
4.如权利要求1所述的芸薹根肿菌的接菌方法，其特征在于，所述定植后管理包括：定植后保持温度23-26℃，湿度70％-90％，光照时间保持每天不低于8h光照，正常给予水分管理。
5.如权利要求1所述的芸薹根肿菌的接菌方法，其特征在于，定植后4周进行抗病性调查；抗病性调查分4个等级：0级，即抗病免疫；1级，须根有小瘤，主根无肉眼可见瘤；2级，主根略有膨大，须根有瘤、有肉眼可见小瘤或者大瘤；3级，主根明显膨大，须根有明显瘤，严重感病。
6.如权利要求1-5任一项所述的接菌方法在筛选抗根肿病育种材料中的应用。
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