CN114766304B - 一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用 - Google Patents
一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用，包括以下步骤：步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的扩繁利用魔芋在灭菌处理的刺槐腐叶土和河沙的混合物基质中扩繁丛枝菌根真菌，所述的丛枝菌根真菌为根内根生囊霉，扩繁后得到含有魔芋根段、丛枝菌根真菌孢子和菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂，所述丛枝菌根真菌根内根生囊霉菌剂产孢量为84个/cm3。本发明中的丛枝菌根真菌是能与魔芋根系共生的真菌，这与现有的用于魔芋促生防病的生防细菌、生防放线菌等菌株不同。接种丛枝菌根真菌菌种使其与魔芋根系形成共生体系，有利于提高重茬和非重茬魔芋的抗病能力及成活率，减少化学农药的使用量，提高魔芋产量和改善植株磷营养，缓解魔芋连作障碍。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用。
背景技术
魔芋是天南星科魔芋属多年生草本植物，它是目前已知唯一能大量提供葡甘聚糖的特种经济作物。魔芋的主要成分葡甘聚糖是最好的膳食纤维之一，其在食品、医疗保健、化工材料等领域用途广泛。随着魔芋作为“保健食品”和“工业味精”等巨大工业价值潜力的不断挖掘和发现，魔芋产业迅猛发展起来，成为21世纪我国的一个朝阳产业，正日益逐步发展成为陕南、四川、云南、贵州等山区乡村振兴、农业增效、农民增收、企业增利、财政增税的支柱产业和出口创汇产业。但随着魔芋种植面积的不断扩大和种植规模化，魔芋病虫害的发生也日趋严重，特别是细菌性软腐病严重影响魔芋的生长、产量及品质，正逐步成为制约魔芋产业向纵深发展的瓶颈因素。农民为了追求种植魔芋的高效益，同一田块连作种植魔芋的现象很普遍，由于生产配套技术相对落后、病害防治技术严重缺乏等因素制约，魔芋连作田的病害发生率比非连作田平均高出35％-50％，造成减产达50％-80％，甚至绝收，严重挫伤农民种植魔芋的积极性。为了预防软腐病害，芋农大量使用化学药剂，对环境和魔芋的安全性影响巨大，其农药残留严重的影响魔芋品质，从而制约了魔芋食品安全的可持续发展。因此，研究探索促进连作魔芋生长、有效控制软腐病病害的绿色防控技术具有重要意义，为魔芋绿色高产稳产提供理论依据和技术保障。
目前，现有的一些生物制剂或生物肥料不仅能够促进魔芋生长，也对魔芋有一定的抗病作用，例如：发表于《西南农业学报》(2021,34(7)：1497-1502)的《肥效微生物菌剂对魔芋及其栽培土壤的影响》公开了施用肥效微生物(固氮解磷解钾复合菌)菌剂提高了魔芋根际土壤可培养微生物数量和酶活性，促进了魔芋的生长；发表于《中国蔬菜》(2021(3)：83-93)的《魔芋软腐病致病菌Pectobacterium aroidearum的特征及贝莱斯芽孢杆菌的生防效果》公开了贝莱斯芽孢杆菌BPC16和W2-7对魔芋软腐病防效分别为43.01％和31.99％；发表于《广西农学报》(2020,35(6)：10,16-19)的《不同生物菌剂对魔芋软腐病田间防效试验》公开了枯草芽孢杆菌微囊粒剂—枯芽春和3号菌剂对魔芋软腐病的防效分别达84.84％和62.83％，且对魔芋均有增产效果。
还有一些文献和专利公开了促进魔芋在连作条件下生长的相关的研究，例如：发表于《植物医生》(2007,20(2)：14)的《魔芋连作田病害高发原因及防治对策》公开了增施有机肥可有效改善土壤结构和控制魔芋主要病害的高发；发表于《西北农业学报》(2020,29(7)：1095-1105)的《菌剂与钾肥配施对连作魔芋生长、生理代谢和发病率的影响》公开了娄彻氏链霉菌菌剂D74与钾肥配施能提高连作魔芋产量并降低植株发病率，有效缓解连作障碍；申请号为202010193489.4的中国发明专利说明书公开了一种缓解魔芋连作障碍的轮间套作栽培方法，此方法将轮间套作栽培技术整合进魔芋种植系统,魔芋与绿肥轮作、与高秆作物间作、与覆盖植物套作,利于增加土壤生物的多样性,降低病原菌侵染魔芋的机率；申请号为202121451005.8的中国实用新型专利说明书公开了一种克服魔芋连作障碍的绿色高产栽培装置，此装置有助于提升防治魔芋软腐病的菌剂与有机肥混匀效率，进而提高土壤改良效果。
丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一类能与大部分高等陆生维管植物形成互惠共生体的土壤微生物，其通过庞大的菌丝网络帮助宿主植物吸收磷等矿质元素，对植物生长、水分吸收、抗逆性及提高产量和品质具有重要作用。目前已有较多的将丛枝菌根真菌用于植物栽培的相关研究报道，例如中药材、辣椒、茄子等。
但是，目前尚未有关于魔芋根际丛枝菌根真菌多样性及利用丛枝菌根真菌促进魔芋生长、防控软腐病害、缓解连作障碍的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用，解决背景技术中所提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用，包括以下步骤：
步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的扩繁
利用宿主植物在灭菌处理的基质中扩繁丛枝菌根真菌，所述的丛枝菌根真菌为根内根生囊霉，扩繁后得到含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子和菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂，所述丛枝菌根真菌根内根生囊霉菌剂产孢量为84个/cm3；
步骤二、根内根生囊霉菌剂的施用：菌根化栽培缓解魔芋连作障碍
在多种连作土壤中接种步骤一制备的丛枝菌根真菌菌剂，并栽种魔芋，在魔芋生长过程中进行常规管理直至自然倒苗。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中扩繁丛枝菌根真菌所用的初始接种剂为含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝和被侵染根段的纯沙，接种方法采用穴施法。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，宿主植物为魔芋。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的扩繁基质为灭菌的刺槐腐叶土和河沙的混合物。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，所述基质的制备方法为：将刺槐腐叶土风干，过孔径2mm的土壤筛去除杂物，在121℃高压蒸汽的条件下灭菌2h，灭菌结束后取出冷却至室温，河沙过孔径2mm的土壤筛去除杂物，再用自来水清洗干净，160℃干热灭菌3h，灭菌结束后取出冷却至室温，然后将刺槐腐叶土和河沙1：1混合，即得基质。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，播种宿主植物时，浇水使基质含水量达到最大饱和持水量的70％；宿主播种后生长过程中，对宿主植物进行常规管理确保植株正常生长，培养3-4个月，即可得到扩繁的丛枝菌根真菌菌剂。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁后的收获方法为：去掉宿主植物地上部分，剪碎宿主根段，与基质混合均匀，得到含有被侵染的宿主根段、丛枝菌根真菌孢子及菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁过程在智能温室或人工气候室中进行。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤二中，多种连作土壤分别为未种植魔芋和种植过魔芋的土壤。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤二中丛枝菌根真菌菌剂接种方法为穴施法。
与现有技术相比，本发明提供了一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用，具备以下有益效果：
1、与现有的施用固氮解磷解钾菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、娄彻氏链霉菌菌剂等技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明中的丛枝菌根真菌是能与魔芋根系共生的真菌，这与现有的用于魔芋促生防病的非共生生防细菌、生防放线菌等菌株不同。将丛枝菌根真菌菌种接种使其与魔芋根系形成共生体系，产生良好的生理生态效应。
2、本发明与不接种对照相比，在正茬和重茬栽培条件下，接种丛枝菌根真菌各处理均能不同程度提高魔芋生长量和球茎产量，降低魔芋软腐病发病率。其中，菌根化的正茬魔芋对软腐病的防效达100.0％，菌根化的重茬魔芋对软腐病的防效达88.8％。接种丛枝菌根真菌有利于提高魔芋的抗病能力和成活率，减少化学农药的使用量，提高魔芋产量和品质。
3、本发明提供的扩繁基质来源广泛，保水性、透气好，以刺槐腐叶土和河沙混合物为基质，以魔芋为宿主，满足魔芋对水肥和氧气的需求，提高宿主根系生物量，进而有利于丛枝菌根真菌的繁殖，在短期内可获得大量丛枝菌根真菌。
4、本发明的方法简单实用、成本较低、绿色环保。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的玉米和魔芋中丛枝菌根真菌根内根生囊霉的侵染定殖状况示意图；
图2为本发明的不同宿主和基质对根内根生囊霉产孢量的影响示意图；
图3为本发明的不同宿主和基质对根内根生囊霉菌丝密度的影响示意图。
图1中：A1～A3为玉米根系，B1～B3为魔芋根系；H：菌丝，A：丛枝，V：泡囊结构；
图2中：不同字母表示差异显著，P＜0.05。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
一种丛枝菌根真菌扩繁方法及其在缓解魔芋连作障碍中的应用，包括以下步骤：
步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的扩繁
利用宿主植物在灭菌处理的基质中扩繁丛枝菌根真菌，所述的丛枝菌根真菌为根内根生囊霉，扩繁后得到含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子和菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂，所述丛枝菌根真菌根内根生囊霉菌剂产孢量为84个/cm3；
步骤二、根内根生囊霉菌剂的施用：菌根化栽培缓解魔芋连作障碍
在多种连作土壤中接种步骤一制备的丛枝菌根真菌菌剂，并栽种魔芋，在魔芋生长过程中进行常规管理直至自然倒苗。
本实施例中，所述步骤一中扩繁丛枝菌根真菌所用的初始接种剂为含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝和被侵染根段的纯沙，接种方法采用穴施法。
本实施例中，所述步骤一中，宿主植物为魔芋，且魔芋为顶芽健康露白的球茎，魔芋在播种前，用20％噻菌铜悬浮剂均匀喷雾以消除种芋带菌。
本实施例中，所述的扩繁基质为灭菌的刺槐腐叶土与河沙的混合物。
本实施例中，所述步骤一中，所述步骤一中，所述基质的制备方法为：将刺槐腐叶土风干，过孔径2mm的土壤筛去除杂物，在121℃高压蒸汽的条件下灭菌2h，灭菌结束后取出冷却至室温，河沙过孔径2mm的土壤筛去除杂物，再用自来水清洗干净，160℃干热灭菌3h，灭菌结束后取出冷却至室温，然后将刺槐腐叶土和河沙1：1混合，即得基质。
本实施例中，所述步骤一中，播种宿主植物时，浇水使基质含水量达到最大饱和持水量的70％；宿主播种后生长过程中，对宿主植物进行常规管理确保植株正常生长，培养3-4个月，即可得到扩繁的丛枝菌根真菌菌剂。
本实施例中，所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁后的收获方法为：去掉宿主植物地上部分，剪碎宿主根段，与基质混合均匀，得到含有被侵染的宿主根段、丛枝菌根真菌孢子及菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂。
本实施例中，所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁过程在智能温室或人工气候室中进行。
本实施例中，所述步骤二中，多种连作土壤分别为未种植魔芋和种植过魔芋的土壤。
本实施例中，所述步骤二中丛枝菌根真菌菌剂接种方法为穴施法。
步骤1为丛枝菌根真菌菌剂的扩繁，相较于以玉米为宿主，以及培养基质为纯沙、纯农田土壤、沙土混合和刺槐腐叶土等基质，或者宿主为魔芋，培养基质为纯沙、纯农田土壤和沙土混合等基质，以刺槐腐叶土与河沙的混合物为基质，接种根内根生囊霉的魔芋根系侵染强度、丛枝丰度、泡囊丰度、产孢量、菌丝密度最好，扩繁效果最佳，为验证上述效果，本发明设计以下试验：
在温室盆栽条件下，以根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis)作为丛枝菌根真菌菌剂，以魔芋和玉米作为扩繁宿主，以纯沙、纯农田土壤、沙土混合、刺槐腐叶土、刺槐腐叶土与纯沙混合物作为扩繁基质，评价不同宿主+基质组合扩繁效果，以期筛选适合根内根生囊霉扩繁的高效宿主和培养基质组合，为研发促进魔芋软腐病绿色防控措施和可持续安全生产提供技术基础。
温室盆栽试验采用2×5因子(宿主×基质)交叉试验设计，包括2种宿主植物，即玉米(品种：众星玉188)和魔芋(品种：花魔芋)；3种培养基质：即纯沙、纯土、沙土混合、刺槐腐叶土、刺槐腐叶土与纯沙混合物。共10个处理，测定各处理植株侵染程度、产孢量和菌丝密度等。
1材料与方法
1.1试验材料
供试玉米(Zea mays)品种‘众星玉188’和魔芋(Amorphophallus konjac)品种‘岚皋本地花魔芋’购自市场。供试AMF为根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis)为市售常用菌种。盆栽基质有5种，基质1：黄棕壤，过孔径2mm土壤筛，121℃、0.1Mpa高压蒸汽灭菌2h。基质2：河沙，过孔径2mm土壤筛，自来水清洗干净，160℃干热灭菌3h。基质3：将灭菌后的基质1纯土和基质2纯沙按体积比1:1混匀，作为沙土混合基质。基质:4：刺槐腐叶土，过孔径2mm土壤筛，121℃、0.1Mpa高压蒸汽灭菌2h。基质5：将灭菌后的基质4刺槐腐叶土和基质2纯沙按体积比1:1混匀，作为刺槐腐叶土与纯沙混合物基质。
1.2试验设计
盆栽试验采用2×5因子(宿主×基质)交叉试验设计，包括2种宿主植物，即玉米和魔芋；5种培养基质：即纯沙(PR)、纯土(PS)、沙土混合(RS)、刺槐腐叶土(LS)、刺槐腐叶土与纯沙混合物(LSR)，共10个处理，随机排列，重复5次。
1.3接种与管理
试验在安康学院植物繁育中心进行，温度23℃～35℃/14℃～18℃(白天/夜间)，相对湿度60％，自然光照12～15h/d。将玉米种子用10％H2O2消毒15min后无菌水冲洗3次，之后置于28℃恒温培养箱催芽。将顶芽露白的魔芋球茎用20％噻菌铜悬浮剂均匀喷雾以消除种芋带菌。用75％酒精给营养钵表面擦拭消毒，然后装填灭菌基质1kg，浇水使基质含水量达到最大饱和持水量的70％，接着将15g丛枝菌根真菌菌剂平铺其上。选取出芽后长势一致的玉米种子、大小一致顶芽露白的魔芋球茎分别播种到装有灭菌基质的消毒营养钵中，宿主植物播种后再覆盖0.5kg基质。每盆播种3～4粒玉米种子，出苗后观察生长状况，每盆保留2棵苗；每盆播种1株魔芋。
宿主播种后生长过程中，对宿主植物进行常规管理确保植株正常生长，每周浇1次1/10倍数的标准Hoagland营养液(50mL/盆)。培养90d后观测供试植株的生物量和菌根侵染状况。
1.4数据处理
采用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，Duncan’s test(P＜0.05)进行多重比较，采用Microsoft Excel 2010作图。图表中数据为平均值±标准差。
2根内根生囊霉的侵染和定殖状况
采集玉米和魔芋根系，用自来水冲洗干净，剪成1cm左右根段，加入5％KOH溶液，90℃水浴5min，清洗3次，2％HCl浸泡5min，加入0.05％曲利苯蓝染色1min，倾去染液水洗3次，加入乳酸甘油(1:1，v/v)于室温下脱色。制片镜检，于光学显微镜下用十字交叉法观测丛枝丰度、泡囊丰度和AMF侵染强度。
试验表明，接种根内根生囊霉的玉米和魔芋均被侵染定殖，根内可以看到清晰的泡囊、丛枝和根内菌丝等结构(图1)。不同宿主和基质对根内根生囊霉侵染程度的影响不同。无论以玉米还是魔芋作为宿主，根内根生囊霉在刺槐腐叶土与纯沙混合物中的侵染强度、丛枝丰度和泡囊丰度达到最大值，尤其是以魔芋为宿主，以刺槐腐叶土与纯沙混合物为基质的扩繁效果最好。双因素方差分析表明，宿主与培养基质存在交互作用(表1)。
表1不同宿主和基质对根内根生囊霉侵染程度的影响
注：表格中的数据为Duncan法检验的F值，NS表示不显著；*表示在5％水平差异显著；**表示在1％水平差异显著；***表示在0.1％水平差异显著。同列不同小写字母表示P＜0.05水平时差异显著。
PR＝纯沙，PS＝纯土，RS＝沙土混合，LS＝刺槐腐叶土，LSR＝刺槐腐叶土与纯沙混合物；下同。
3不同宿主和基质对根内根生囊霉的产孢量和菌丝密度的影响
分别采集玉米和魔芋的根际土壤样品，自然风干，过孔径2mm土壤筛去除杂质。用湿筛倾析法筛选孢子，在体视显微镜下观测计数，测定产孢量。采用曲利苯蓝染色-网格法测定土壤中AMF菌丝密度。
以玉米和魔芋作为宿主，根内根生囊霉在5种基质中扩繁的产孢量和菌丝密度均表现出相同趋势，即刺槐腐叶土与纯沙混合物＞刺槐腐叶土＞纯土＞纯沙＞沙土混合，其中以魔芋在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中扩繁的根内根生囊霉产孢量和菌丝密度最大(图2和图3)。
4不同扩繁处理对宿主干重的影响
分别收获玉米和魔芋地上部分和地下根系，采用烘干法测定干重。
不同扩繁处理对玉米和魔芋的生长状况影响不同。在所有扩繁处理中，以魔芋作为宿主，在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中，根内根生囊霉接种的魔芋地上干重和地下根系干重均达到最大。双因素方差分析表明，宿主与基质处理存在交互作用(表2)。
表2不同扩繁处理对宿主地上和地下干重的影响
综上，以纯沙、纯土、沙土混合物、刺槐腐叶土、刺槐腐叶土与纯沙混合物作为扩繁基质，以玉米或魔芋作为宿主，均能得到根内根生囊霉菌剂的扩繁产物。其中，以刺槐腐叶土与纯沙混合物为基质，以魔芋为宿主，根内根生囊霉菌剂的扩繁效果最好。
步骤2为根内根生囊霉菌剂的施用：菌根化栽培缓解魔芋连作障碍，通过步骤一制备的扩繁菌剂确实能够有效提高魔芋的AMF侵染率，进而可以有效避免魔芋软腐病的发生，以及提高了魔芋产量，为验证以上效果，本申请设计以下试验：
在温室盆栽条件下，以魔芋为宿主在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中扩繁的根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis)高质量菌剂作为接种剂，对正茬和重茬魔芋进行菌根化栽培，以期评价扩繁的根内根生囊霉菌剂对魔芋营养含量、产量及软腐病的影响，为研发促进连作魔芋软腐病绿色防控措施和可持续安全生产提供技术基础。
1材料与方法
1.1试验材料
魔芋(Amorphophallus konjac)品种‘岚皋本地花魔芋’购自市场。供试AMF是以魔芋为宿主在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中扩繁的根内根生囊霉(Rhizophagusirregularis)高质量菌剂。栽培基质包括2种，基质1：未种植过魔芋的正茬土，前茬作物为玉米；基质2：种植过1年魔芋的重茬土。
1.2试验设计
盆栽试验采用随机区组设计(2×2)，包括接种处理(不接种CK与接种根内根生囊霉AMF)和不同种植年限的土壤处理(正茬与重茬)，共4个处理，随机排列，重复8次。
1.3接种与管理
试验在安康学院植物繁育中心进行，温度23℃～35℃/14℃～18℃(白天/夜间)，相对湿度60％，自然光照12～15h/d。试验土壤经过晾晒、去杂，添加有机肥50g/kg和育苗基质20g/kg，混合均匀作为栽培基质。每盆装栽培基质3kg。挑选质量为20g左右顶芽露白的魔芋球茎作为供试种芋，播种前用20％噻菌铜悬浮剂均匀喷雾对种芋进行杀菌处理。播种时，先在花盆中填装栽培基质2kg，浇水至含水量达到土壤最大饱和持水量的70％，接种处理将以魔芋为宿主在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中扩繁的根内根生囊霉菌剂(带有孢子、菌丝和根段的混合物)20g平铺其上，每盆播种1株魔芋，再覆盖1kg基质。播种后盆栽魔芋置于透光率为50％遮阳网下生长，按常规管理至植株生育期结束正常倒苗为止。
1.4数据处理
采用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，Duncan’s test(P＜0.05)进行多重比较，采用Microsoft Excel 2010作图。图表中数据为平均值±标准差。
2菌根化苗AMF侵染程度分析
采收时，随机挑选4株魔芋根系样品，将根系上附着的土抖落后用自来水冲洗干净，采用实施例1相同的方法，按照菌根侵染和丛枝丰度分级标准，观测AMF侵染率和侵染强度。
侵染率＝侵染根段数/全部根段数×100％；
侵染强度＝(95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/全部根段数×100％
式中，n5、n4、n3、n2、n1分别表示5、4、3、2、1级侵染的根段数。
试验表明，未接种的正茬和重茬魔芋根系仍然测得AMF侵染率和侵染强度，说明未灭菌的栽培基质存在本土的AMF。与各自对应的对照相比，接种处理的正茬和重茬魔芋根系AMF侵染率和侵染强度均较相应的对照显著增加。由此说明，接种以魔芋作为宿主，在刺槐腐叶土与纯沙混合物基质中扩繁的根内根生囊霉菌剂能够提高正茬和重茬魔芋的AMF侵染率，实现魔芋苗的菌根化。双因素方差分析表明，土壤种植年限与接种处理存在交互作用(表3)。
表3不同处理对魔芋AMF侵染程度的影响
3魔芋软腐病发病情况调查
于魔芋软腐病发病高峰期，调查统计软腐病发病株数和病害严重程度。病害严重程度分4个等级：0级，无发病症状；1级，＜25％单株出现软腐症状；2级，25％～75％单株出现软腐症状；3级，＞75％单株出现软腐症状。按照文献“何斐,张忠良,崔鸣,王东胜,放线菌‘D74’对魔芋的防病促生作用及其鉴定,园艺学报,2015,42(2):367-376.”中的方法计算软腐病发病率、病情指数和相对防效。
发病率＝发病株数/调查总株数×100％；
相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
试验表明，菌根化的正茬魔芋无软腐病害发生，而未接种的正茬魔芋软腐病发病率为12.5％。接种根内根生囊霉的正茬和重茬魔芋软腐病相对防效分别为100.0％和88.8％(表4)。
表4不同处理魔芋AMF侵染程度和软腐病发病情况
4魔芋产量调查
采收时，将魔芋地下块茎完整挖出，去掉泥土，称量块茎鲜质量，统计根状茎个数和根系条数。
试验结果表明，正茬、重茬菌根化的魔芋单株块茎鲜质量、单株根状茎个数和单株根系条数均较各自对照显著增加，说明接种根内根生囊霉菌剂提高了连作和非连作魔芋的产量。双因素方差分析表明，种植年限和接种均显著影响魔芋单株块茎鲜质量和根系条数(P＜0.05)，但二者的交互作用对其影响不显著(表5)。
表5不同处理对魔芋产量的影响
5魔芋植株全磷含量分析
将各处理采收的魔芋植物样品用蒸馏水清洗干净，105℃杀青15min，80℃烘干至恒重，冷却后将根、茎和叶分开，样品用研磨仪研磨后过100目筛。植物样品采用浓H2SO4-H2O2消煮法制备待测液，钼锑抗比色法测定全磷含量。
试验表明，正茬、重茬栽培条件下，菌根化的魔芋根、茎和叶片中磷含量均较相应的对照显著增加，说明接种根内根生囊霉提高了连作和非连作魔芋组织中的磷含量。双因素方差分析表明，种植年限和接种均显著影响魔芋根、茎和叶片中的磷含量，但二者的交互作用对其影响不显著(表6)。
表6不同处理对魔芋植株中磷含量的影响mg/g
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的扩繁
利用宿主植物在灭菌处理的基质中扩繁丛枝菌根真菌，所述的丛枝菌根真菌为根内根生囊霉Rhizophagus irregularis，扩繁后得到含有宿主植物根段、丛枝菌根真菌孢子和菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂，所述丛枝菌根真菌根内根生囊霉菌剂产孢量为84个/cm3；此步骤中扩繁丛枝菌根真菌所用的初始接种剂为含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝和被侵染根段的纯沙，接种方法采用穴施法；
步骤二、根内根生囊霉菌剂的施用：菌根化栽培缓解魔芋连作障碍
在多种连作土壤中接种步骤一制备的丛枝菌根真菌菌剂，并栽种魔芋，在魔芋生长过程中进行常规管理直至自然倒苗；多种连作土壤分别为未种植魔芋和种植过魔芋的土壤；
所述步骤一中，宿主植物为魔芋；
所述的扩繁基质为灭菌的刺槐腐叶土与河沙的混合物；刺槐腐叶土和河沙1：1混合。
2.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于：所述步骤一中，所述基质的制备方法为：将刺槐腐叶土风干，过孔径2mm的土壤筛去除杂物，在121℃高压蒸汽的条件下灭菌2h，灭菌结束后取出冷却至室温，河沙过孔径2mm的土壤筛去除杂物，再用自来水清洗干净，160℃干热灭菌3 h，灭菌结束后取出冷却至室温，然后将刺槐腐叶土和河沙1：1混合，即得基质。
3.根据权利要求2所述的一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于：所述步骤一中，播种宿主植物时，浇水使基质含水量达到最大饱和持水量的70%；宿主播种后生长过程中，对宿主植物进行常规管理确保植株正常生长，培养3-4个月，即可得到扩繁的丛枝菌根真菌菌剂。
4.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于：所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁后的收获方法为：去掉宿主植物地上部分，剪碎宿主根段，与基质混合均匀，得到含有被侵染的宿主根段、丛枝菌根真菌孢子及菌丝的风干基质即为丛枝菌根真菌菌剂。
5.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于：所述步骤一中，丛枝菌根真菌扩繁过程在智能温室或人工气候室中进行。
6.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌扩繁方法在缓解魔芋连作障碍中的应用，其特征在于，所述步骤二中丛枝菌根真菌菌剂接种方法为穴施法。
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