CN111411143A - 一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，涉及作物抗病育种技术领域。该方法包括以下步骤：培育玉米苗；病原菌扩繁；病原菌接种；抗性鉴定。本发明接种利用注射器的针头沿着玉米叶片的叶脉划线，制造伤口，协助病原菌入侵，并模拟发病的环境，使菠萝泛菌在玉米叶片成功发病。本发明的鉴定方法操作简单，可在室内完成，重复性好，效率高；且不受季节、外部环境的影响，不但保证了病原菌的数量与生长状态，做到了精准接种、鉴定，而且可在短时间内对玉米材料进行抗性鉴定，大大缩短了鉴定时间，有助于玉米自交系对细菌性条纹病的快速鉴定，应用价值大。

Description

一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法
技术领域
本发明涉及作物抗病育种技术领域，特别涉及一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法。
背景技术
甜玉米起源美洲，是玉米种属中的一个亚种，受一个或多个胚乳淀粉合成途径中的天然隐性突变基因控制。甜玉米兼具粮、果、蔬特性，不仅风味独特、适口性好，同时含有较高蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质，具有很高的的营养价值(张英,李时群,穆楠等.鲜食型玉米的研发现状及发展前景[J].杂粮作物,2007,27(5):373～375.)。随着国民经济的增长和消费者膳食结构的调整，我国甜玉米种植面积和需求量也不断增加。但因其品种特性和较高的含糖量，甜玉米在田间受到多种微生物的危害。
细菌性条纹病于1960年首次在美国发现，多发生于美国中部和东部，温暖潮湿的气候有利于病害的发生。植株发病初期叶片上出现狭长的平行的退绿病斑，后期病斑变褐并枯死，严重影响植株的光合作用。2016年以前，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)引起的细菌性条纹病在广东甜玉米种植区偶有发生。由于甜玉米常年连作使得土壤中的病原菌逐年积累，2016年开始，细菌性条纹病的发病率逐年上升，且发病程度越来越严重，严重影响了甜玉米的品质和产量。因此，建立一套成功的、高效的细菌性条纹病的病害鉴定系统，对现有的种植资源进行抗性鉴定，筛选出抗病的甜玉米材料具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法。该方法可以高效的、稳定的对细菌性条纹病进行鉴定。
传统的玉米叶部病害多采用叶面喷雾法。但因菠萝泛菌属于细菌型致病菌，不能形成如附着胞、附着枝等侵染结构，突破细胞壁，进入细胞内部，因此需人为制造伤口，帮助病原菌侵入。因此，本发明接种利用注射器的针头沿着玉米叶片的叶脉划线，制造伤口，协助病原菌入侵，并模拟发病的环境，使菠萝泛菌在玉米叶片成功发病。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)培育玉米苗：将玉米种子消毒，播种；培育至三叶一心期，获得玉米苗；
(2)病原菌扩繁：将玉米细菌性条纹病致病菌菠萝泛菌(Pantoea ananatis)于LB培养基中扩繁，清水洗脱，离心收集，将病原菌的浓度调至107数量级，并按照总体积加入0.2～0.5％(优选0.2％)的吐温20，制备菠萝泛菌悬浮液；
(3)病原菌接种：用无菌注射器吸取菠萝泛菌悬浮液，推动注射器，使针头处有菌液流出，并用针头在心叶上划线，将在伤口处均匀涂抹菠萝泛菌悬浮液；
(4)抗性鉴定：将接种后的玉米植株培育72h后，根据叶片病斑扩展情况对玉米材料的抗性进行鉴定；若伤口处发生坏死，坏死斑无扩散现象为高抗，记为HR；若伤口处坏死斑有少量扩散现象为抗病，记为R；若坏死斑扩散范围较大，叶片皱缩为感病，记为S；若坏死斑扩散至整个叶片，叶片萎蔫甚至枯死为高感，记为HS。
步骤(1)中所述的玉米优选为甜玉米；进一步优选为甜玉米品种粤甜28号、甜玉米自交系群1-1或甜玉米自交系GQ-1，但不限于此。
步骤(1)中所述的消毒是依次经酒精和NaClO消毒；具体消毒步骤如下：
将玉米种子于28～30℃(优选28℃)浸泡12～16h，使种子充分吸胀；将吸胀后的种子用70～75％的酒精浸泡5～10min(优选5min)，进行表面消毒；将种子用灭菌后的ddH2O清洗三次；清洗后将种子浸泡在10％的NaClO中20～30min(优选30min)，进行再次消毒；倒掉NaClO溶液用灭菌后的ddH2O清洗三次。
步骤(1)中所述的培育的环境设置为：28～30℃，湿度60±5％，光照时间16小时，光照强度20000～30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
进一步的，步骤(1)中所述的培育的环境设置为：28℃，湿度60±5％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
步骤(2)中所述的病原菌扩繁的具体包括如下步骤：
a、将玉米细菌性条纹病致病菌菠萝泛菌(Pantoea ananatis)在LB固体培养基上划线，培养；
b、在划线的LB固体培养基上挑取菠萝泛菌单菌落于LB液体培养基中，初次培养，进行初次扩繁；按照1～500：1000(优选1：1000)的体积比吸取初次扩繁的菌液于LB液体培养基中第二次培养，获得第二次扩繁的菌液；将第二次扩繁的菌液离心，收集病原菌；用灭菌后的ddH2O，清洗两次，再次离心，获得病原菌；用ddH2O重悬病原菌，将病原菌的浓度调至107数量级，并按照总体积加入0.2～0.5％(优选0.2％)的吐温20，以此为接种液，即菠萝泛菌悬浮液。
步骤a中所述的培养的条件为28～30℃培养12～16h；进一步为30℃培养16h；
步骤b中所述的初次培养的条件为28～30℃，150～200rpm培养10～12h；进一步为30℃，200rpm培养12h；
步骤b中所述的第二次培养的条件为28～30℃，150～200rpm培养10～12h；进一步为30℃，200rpm培养12h；
步骤b中所述的离心、再次离心的条件均为8000～10000rpm离心5～10min；进一步为8000rpm离心10min；
LB液体培养基的配方为：10g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH为7.4；
LB固体培养基的配方为：10g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15～20g/L琼脂，pH为7.4。
步骤(3)中所述的注射器为1mL注射器；
步骤(3)中所述的在心叶上划线是沿着心叶的叶脉划线；
进一步的，步骤(3)中所述的在心叶上划线是沿着心叶的叶脉划1～5处伤口；更进一步是沿着心叶的叶脉划3～5处伤口；
步骤(3)中所述的划线的伤口长度为1～1.5cm；进一步为1cm；
步骤(4)中所述的培育的环境设置为：35～38℃，湿度90±5％，光照时间16小时，光照强度20000～30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。其中，温度设置为35～38℃，湿度为90±5％，模拟细菌性条纹病高温高湿的发病条件。
进一步的，步骤(4)中所述的培育的环境设置为：35℃，湿度90±5％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。其中，温度设置为35℃，湿度为90±5％，模拟细菌性条纹病高温高湿的发病条件。
上述菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法在玉米抗细菌性条纹病育种中的应用，也是本发明的保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的鉴定方法，具体包括以下步骤：(1)培育玉米苗；(2)病原菌扩繁；(3)病原菌接种；(4)抗性鉴定。本发明通过光照培养箱模拟出细菌性条纹病发病的最适环境(高温、高湿)，用注射器针头对叶片造成伤口，在伤口处涂抹菌液使得病原菌侵入，使玉米叶片在适宜的环境下成功发病。本发明不受季节、外部环境的影响，不但保证了病原菌的数量与生长状态，做到了精准接种、鉴定，而且可在短时间内对玉米材料进行抗性鉴定，大大缩短了鉴定时间。
(2)本发明的鉴定方法操作简单，可在室内完成，重复性好，效率高，鉴定准确，有效的缩短了接种到发病的时间，有助于玉米自交系对细菌性条纹病的快速鉴定，应用价值大。
附图说明
图1是细菌性条纹病的田间发病株。
图2是本发明中LB固体培养基培养的菠萝泛菌。
图3是实施例3中细菌性条纹病菌室内接种后72h的发病图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
LB液体培养基的制备方法为：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeastextract)，5g NaCl，NaOH调pH至7.4用去离子水定容至1L。高压下蒸汽灭菌20min。
LB固体培养基的制备方法为：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeastextract)，5g NaCl，15g琼脂，NaOH调pH至7.4用去离子水定容至1L。高压下蒸汽灭菌20min，倒入10cm培养皿。
细菌性条纹病的田间发病株，如图1所示。
实施例中涉及如下生物材料：
菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC：1.15633。菠萝泛菌在LB固体培养基上培养的结果图，如图2所示。
粤甜28号，审定编号：粤审玉20170004，也可从广东省农业科学院作物研究所获得；
甜玉米自交系群1-1作为粤甜28号(粤审玉20170004)的亲本公开，公开网址：http://dara.gd.gov.cn/zzglc/content/post_1567881.html，也可从广东省农业科学院作物研究所获得。
甜玉米自交系GQ-1，在专利“201811050252.X、一种分子标记辅助选育抗南方锈病甜玉米自交系的方法”中公开，也可从广东省农业科学院作物研究所获得。
实施例1：甜玉米品种粤甜28号细菌性条纹病的抗性鉴定
1.甜玉米接种苗的培育
(1)取40粒粤甜28号的种子于ddH2O中，28℃浸泡16h。将吸胀后的种子用75％的酒精浸泡5min，进行表面消毒，然后将种子用灭菌后的ddH2O清洗三次；将清洗后将种子浸泡在10％的NaClO中30min，再次进行消毒，然后用灭菌后的ddH2O清洗三次。
(2)将种子播种于营养土中，采用直径为10cm的小花盆，每个花盆播种4颗种子。将播种好的花盆放置于光照培养箱。将培养箱的环境设置为28℃，湿度60％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。将玉米苗培养至三叶一心期。
2.病原菌扩繁
(1)将在超低温保存的菠萝泛菌菌株取出，解冻后用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上划线。30℃培养箱放置16h，固体培养基上长出单菌落。
(2)用枪头挑取单菌落于3mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养16h，对病原菌进行初次扩繁。
(3)吸取500μL菌液于500mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养12h，获得第二次扩繁的菌液。
(4)8000rpm离心10min，收集病原菌，并用灭菌的ddH2O清洗两次。用100mL ddH2O重悬病原菌。
(5)用血球计数板对病原菌进行计数，计算浓度，将病原菌最终浓度稀释为1×107。
(6)按比例0.2％的浓度加入一定量的吐温20，为接种液，即菠萝泛菌悬浮液。
3.病原菌接种
(1)用1mL无菌注射器吸取病菠萝泛菌悬浮液，插上枪头。缓慢推动注射器，使针头处有液滴流出；
(2)用针头沿着心叶的叶脉划3-5处约1cm伤口，并涂抹菠萝泛菌悬浮液，使伤口处有均匀沾满菌液；
(3)用菌液接种20株，ddH2O接种20株为对照。
4.抗性鉴定
(1)将接种后的玉米幼苗移回至光照培养箱中，将培养条件改为将培养箱的环境设置为35℃，湿度90％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
(2)72h后观察叶片病斑扩展情况。伤口周围有大面积病斑，叶片皱缩，抗性评价为感病(S)。
实施例2：甜玉米自交系群1-1的细菌性条纹病的抗性鉴定
1.甜玉米接种苗的培育
(1)取40粒群1-1的种子于ddH2O中，28℃浸泡16h。将吸胀后的种子用75％的酒精浸泡5min，进行表面消毒，然后将种子用灭菌后的ddH2O清洗三次；将清洗后将种子浸泡在10％的NaClO中30min，再次进行消毒，然后用灭菌后的ddH2O清洗三次。
(2)将种子播种于营养土中，采用直径为10cm的小花盆，每个花盆播种4颗种子。将播种好的花盆放置于光照培养箱。将培养箱的环境设置为28℃，湿度60％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。将玉米苗培养至三叶一心期。
2.病原菌扩繁
(1)将在超低温保存的菠萝泛菌菌株取出，解冻后用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上划线。30℃培养箱放置16h，固体培养基上长出单菌落。
(2)用枪头挑取单菌落于3mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养16h，对病原菌进行初次扩繁。
(3)吸取500μL菌液于500mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养12h，获得第二次扩繁的菌液。
(4)8000rpm离心10min，收集病原菌，并用灭菌的ddH2O清洗两次。用100mL ddH2O重悬病原菌。
(5)用血球计数板对病原菌进行计数，计算浓度，将病原菌最终浓度稀释为1×107。
(6)按比例0.2％的浓度加入一定量的吐温20，为接种液，即菠萝泛菌悬浮液。
3.病原菌接种
(1)用1mL无菌注射器吸取菠萝泛菌悬浮液，插上枪头。缓慢推动注射器，使针头处有液滴流出；
(2)用针头沿着心叶的叶脉划3-5处约1cm伤口，并涂抹菠萝泛菌悬浮液，使伤口处有均匀沾满菌液；
(3)用菌液接种20株，ddH2O接种20株为对照。
4.抗性鉴定
(1)将接种后的玉米幼苗移回至光照培养箱中，将培养条件改为将培养箱的环境设置为35℃，湿度90％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
(2)72h后观察叶片病斑扩展情况。伤口周围有大面积病斑并扩散至整个叶片，叶片萎蔫甚至枯死，抗性评价为高感(HS)。
实施例3：甜玉米自交系GQ-1的细菌性条纹病的抗性鉴定
1.甜玉米接种苗的培育
(1)取40粒GQ-1的种子于ddH2O中，28℃浸泡16h。将吸胀后的种子用75％的酒精浸泡5min，进行表面消毒，然后将种子用灭菌后的ddH2O清洗三次；将清洗后将种子浸泡在10％的NaClO中30min，再次进行消毒，然后用灭菌后的ddH2O清洗三次。
(2)将种子播种于营养土中，采用直径为10cm的小花盆，每个花盆播种4颗种子。将播种好的花盆放置于光照培养箱。将培养箱的环境设置为28℃，湿度60％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。将玉米苗培养至三叶一心期。
2.病原菌扩繁
(1)将在超低温保存的菠萝泛菌菌株取出，解冻后用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上划线。30℃培养箱放置16h，固体培养基上长出单菌落。
(2)用枪头挑取单菌落于3mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养16h，对病原菌进行初次扩繁。
(3)吸取500μL菌液于500mL LB液体培养基，30℃，200rpm，培养12h，获得第二次扩繁的菌液。
(4)8000rpm离心10min，收集病原菌，并用灭菌的ddH2O清洗两次。用100mL ddH2O重悬病原菌。
(5)用血球计数板对病原菌进行计数，计算浓度，将病原菌最终浓度稀释为1×107。
(6)按比例0.2％的浓度加入一定量的吐温20，为接种液，即菠萝泛菌悬浮液。
3.病原菌接种
(1)用1mL无菌注射器吸取菠萝泛菌悬浮液，插上枪头。缓慢推动注射器，使针头处有液滴流出；
(2)用针头沿着心叶的叶脉划3-5处约1cm伤口，并涂抹菠萝泛菌悬浮液，使伤口处有均匀沾满菌液；
(3)用菌液接种20株，ddH2O接种20株为对照。
4.抗性鉴定
(1)将接种后的玉米幼苗移回至光照培养箱中，将培养条件改为将培养箱的环境设置为35℃，湿度90％，光照时间16小时，光照强度30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
(2)72h后观察叶片病斑扩展情况(图3)。伤口周围有大面积病斑，叶片皱缩，抗性评价为感(S)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)培育玉米苗：将玉米种子消毒，播种；培育至三叶一心期，获得玉米苗；
(2)病原菌扩繁：将玉米细菌性条纹病致病菌菠萝泛菌于LB培养基中扩繁，清水洗脱，离心收集，将病原菌的浓度调至107数量级，并按照总体积加入0.2～0.5％的吐温20，制备菠萝泛菌悬浮液；
(3)病原菌接种：用无菌注射器吸取菠萝泛菌悬浮液，推动注射器，使针头处有菌液流出，并用针头在心叶上划线，将在伤口处均匀涂抹菠萝泛菌悬浮液；
(4)抗性鉴定：将接种后的玉米植株培育72h后，根据叶片病斑扩展情况对玉米材料的抗性进行鉴定；若伤口处发生坏死，坏死斑无扩散现象为高抗，记为HR；若伤口处坏死斑有少量扩散现象为抗病，记为R；若坏死斑扩散范围较大，叶片皱缩为感病，记为S；若坏死斑扩散至整个叶片，叶片萎蔫甚至枯死为高感，记为HS。
2.根据权利要求1所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的玉米为甜玉米。
3.根据权利要求1或2所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的培育的环境设置为：28～30℃，湿度60±5％，光照时间16小时，光照强度20000～30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
4.根据权利要求1或2所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的病原菌扩繁的具体包括如下步骤：
a、将玉米细菌性条纹病致病菌菠萝泛菌在LB固体培养基上划线，培养；
b、在划线的LB固体培养基上挑取菠萝泛菌单菌落于LB液体培养基中，初次培养，进行初次扩繁；按照1～500：1000的体积比吸取初次扩繁的菌液于LB液体培养基中第二次培养，获得第二次扩繁的菌液；将第二次扩繁的菌液离心，收集病原菌；用灭菌后的ddH2O，清洗两次，再次离心，获得病原菌；用ddH2O重悬病原菌，将病原菌的浓度调至107数量级，并按照总体积加入0.2～0.5％的吐温20，以此为接种液，即菠萝泛菌悬浮液。
5.根据权利要求4所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤a中所述的培养的条件为28～30℃培养12～16h；
步骤b中所述的初次培养的条件为28～30℃，150～200rpm培养10～12h；
步骤b中所述的第二次培养的条件为28～30℃，150～200rpm培养10～12h；
步骤b中所述的离心、再次离心的条件均为8000～10000rpm离心5～10min。
6.根据权利要求1或2所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的注射器为1mL注射器；
步骤(3)中所述的在心叶上划线是沿着心叶的叶脉划线。
7.根据权利要求6所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的在心叶上划线是沿着心叶的叶脉划1～5处伤口；
步骤(3)中所述的划线的伤口长度为1～1.5cm。
8.根据权利要求7所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的在心叶上划线是沿着心叶的叶脉划3～5处伤口；
步骤(3)中所述的划线的伤口长度为1cm。
9.根据权利要求1或2所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的培育的环境设置为：35～38℃，湿度90±5％，光照时间16小时，光照强度20000～30000Lx，黑暗时间8h，光照强度0Lx。
10.权利要求1～9任一项所述的菠萝泛菌引起的玉米细菌性条纹病的鉴定方法在玉米抗细菌性条纹病育种中的应用。
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