CN104770175A

CN104770175A - 一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法

Info

Publication number: CN104770175A
Application number: CN201510178384.0A
Authority: CN
Inventors: 李余良; 韩福光; 刘建华; 李春艳; 夏磊
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN104770175B

Abstract

本发明公开一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法。本发明的方法包括如下步骤：分离获得病原轮枝镰孢菌的菌株；轮枝镰孢菌的扩繁；待接种玉米品种准备；轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种；播种；玉米植株抗病性鉴定。本发明的方法不依赖大田自然条件，接种菌量少、受环境影响小、效果较好、可控性较强，可结合田间接种试验，辅助验证品种对玉米茎腐病的抗性。本发明的方法提供有效的轮枝镰孢菌接种玉米技术，并可解决玉米对茎腐病抗性的早期鉴定问题。

Description

一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法

技术领域

本发明涉及植物病害接种鉴定技术，具体涉及一种茎腐病菌致病轮枝镰孢菌早期室内接种鲜食玉米的方法。

背景技术

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，然而它能被许多土传病原菌所侵染，导致产量损失和品质下降。玉米茎腐病常见的有两种，细菌性茎腐病和真菌性茎腐病。细菌性茎腐病是由细菌侵染发育中期的玉米植株引起茎秆腐烂。真菌性茎腐病是由镰孢菌或腐霉菌引起的为害玉米根和茎基部的一类重要土传真菌病害。病菌在整个生育期都可侵染根系造成根腐，初生根和不定根腐烂变短，髓部中空，须根少而黑，整个根系容易拔除。在茎基节间开始出现茎部症状，形成纵向扩展的不规则状褐色病斑，茎基1～3节变褐发软，植株极易倒伏。叶片症状主要有青枯型、黄枯型等。玉米乳熟末期至蜡熟期为发病高峰期。由轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)等引起的玉米茎腐病是世界上分布最为广泛的土传病害。自20世纪80年代以来，我国主要玉米产区这种病害的发生一直相当普遍，一些地区发生相当严重，对玉米安全生产造成了很大的影响。不仅如此，由于轮枝镰孢菌可产多种大量毒素，如伏马毒素(FB_l、FB₂和FB₃)、镰孢酸(Fusarie acid)等污染农产品，引起人类的食用安全和畜禽疾病，如食管癌、肝癌、胃癌、猪肺水肿及白脑质病等。

随着华南鲜食甜糯玉米种植面积不断增长，一些抗性差的品种在生产中应用，茎腐病已经成为华南鲜食玉米主产区主要病害，据相关统计，茎腐病每年造成玉米产量损失10％～30％，制约甜糯玉米在生产中的应用。轮枝镰孢菌是造成玉米茎腐病的病原菌之一，对甜糯玉米种质资源、品种抗茎腐病接种鉴定是遗传育种的重要研究领域，也是准确掌握与利用育种材料及品种对茎腐病抗性的要求。因此，探索简便、有效的鲜食甜糯玉米茎腐病接种鉴定方法显得十分重要。

近年来，我们对广州地区感病鲜食玉米调查与鉴定后发现，茎腐病主要是由轮枝镰孢菌造成的。目前，镰孢菌接种方法有埋根法、茎秆针刺法等，埋根接种法是用玉米粒培养基扩繁病原菌后，将玉米根系一侧土壤扒开，将扩繁的带菌玉米粒埋于玉米露出的根系处，一定时间后调查根部发病情况。类似的还有土埋伤根法，即在玉米抽丝后一周前后，将一定量的菌剂接种在断根处。还有采用玉米播种时土壤埋菌接种和成株期伤茎根埋法接种相结合的方法，总的来说，此法接种病菌量大，费工，费时，鉴定大量玉米材料受到限制。在田间条件下，将带菌玉米粒埋在植株根系土壤2～3厘米处，受环境影响大，效果及可控性不强。茎秆针刺法是在玉米生长期用针管刺穿茎秆基部将病原菌注射到组织，也存在费工、费时、注射菌量少、效果不明显等缺点。

因此，需要寻找一种可以在室内方便接种鉴定由轮枝镰孢菌引起的玉米茎腐病的方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法。该方法不依赖大田自然条件，接种菌量少、周期短、效率高、可结合田间接种试验，辅助验证品种对玉米茎腐病的抗性。该方法提供有效的轮枝镰孢菌接种玉米技术，并可解决玉米对茎腐病抗性的早期鉴定问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法，包括如下步骤：

(1)分离获得病原轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)的菌株；

(2)轮枝镰孢菌的扩繁：将预先准备好的玉米粒用水泡涨，然后高压灭菌，冷却后做为扩繁培养基，即玉米粒扩繁培养基；挑取若干菌丝置于玉米粒扩繁培养基上进行扩繁；

(3)待接种玉米品种准备：挑选无损、无霉烂、无虫口、无病斑的健康玉米品种种子，消毒后备用；

(4)轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种：取步骤(2)中扩繁的轮枝镰孢菌玉米粒与步骤(3)的待接种玉米混合后，放在垫有灭菌滤纸的器皿中，恒温光照培养；同时设置未接种玉米品种作为对照；

(5)将步骤(4)经培养萌发后带有幼芽的玉米种子进行播种；

(6)玉米植株抗病性鉴定：步骤(5)播种后定期浇适量水保湿，置于室温经过15～20天后考察玉米植株的抗病性；

玉米苗期茎腐病调查分级标准：

0级，整株生长正常，无病；

1级，地上地下部生长基本正常，根部可见少量病斑，病斑面积占根表总面积1/4以下，根群颜色白中有褐；

2级，地上地下生长明显受阻，叶色变淡，株高仅及对照的3/4，侧根少、细而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4～1/2，根群颜色白、褐相当；

3级，地上地下部生长极不正常，地上部可见青枯—黄枯状，株高仅及对照的1/2，侧根极小，病斑面积占根总面积的l/2～3/4，根群颜色褐中带白；

4级，种子发芽，但不出苗，几乎窒息而死，病斑面积占根表总面积的3/4以上，根为棕褐色。

其中，0级代表高抗，1级代表抗病，2级代表中抗，3级代表中感，4级代表高感。

步骤(1)中所述的分离获得病原轮枝镰孢菌，包括如下具体步骤：

①感病材料处理：从大田自然条件下发生茎腐病的玉米植株上采取病害茎秆，剖开，取被害部位茎髓组织，切成0.3～0.5cm小块，无菌条件下用0.1％升汞溶液浸泡1～2min，无菌水漂洗1～2次，取出组织块用75％(v/v)酒精消毒5～10mins，无菌水漂洗3～4次，取出材料，接种于固体PDA培养基上，26～28℃恒温暗培养分离病原菌；

②病原镰孢菌株的分离：上述感病组织在培养基上培养2～3d，在生长有菌丝的培养皿里挑取单个菌丝转接于新的固体PDA培养基上置于恒温中26～28℃进行培养，直到白色菌丝布满整个培养基；

③致病轮枝镰孢菌的纯化鉴定：挑取步骤②中单个菌丝置于10×光学显微镜下观察病原菌孢子形态，确认为近年广州地区发生玉米茎腐病的致病轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)；

步骤①和②中所述的固体PDA培养基，组成为：马铃薯淀粉200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15～20g/L，蒸馏水定容1000mL，121℃高压灭菌15min后倒平板。

所述的鲜食玉米包括玉米的自交系、种质材料或杂交种；

所述的玉米为甜玉米或糯玉米。

步骤(2)中所述的玉米粒为一般玉米粒，仅作为病原菌培养用基质。

步骤(2)中所述的高压灭菌的条件优选为121℃高压灭菌15mins；

步骤(2)中所述的扩繁的条件为26～28℃恒温暗培养3～5d，以明显看到白色菌丝布满玉米粒为宜。

步骤(3)中所述的待接种玉米品种优选为鲜食玉米；

所述的鲜食玉米包括玉米的自交系、种质材料或杂交种；所述的玉米为甜玉米或糯玉米；以上玉米均可，不限定；

步骤(3)中所述的消毒的条件优选为用75％(v/v)酒精消毒5～10mins后，再用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理15～20mins，用无菌水冲洗2～3次；

步骤(4)中所述的混合为步骤(2)中扩繁的轮枝镰孢菌玉米粒与步骤(3)的待接种玉米按种子量1:(1～1.5)进行混合；

步骤(4)中所述的器皿优选为培养皿；

步骤(4)中所述的恒温光照培养的条件优选26～28℃恒温光照培养5～7天，直到发芽后可见幼芽2.5～3.5cm；

步骤(5)中的播种是挑出步骤(4)中带有幼芽的玉米种子播种在含有土壤或基质的普通花盆中，视种子量多少选择不同规格花盆或苗盘，播种30株以上；

步骤(6)中所述的室温优选为26～28℃。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明的方法不依赖大田自然条件，接种菌量少、受环境影响小、效果较好、可控性较强，可结合田间接种试验，辅助验证品种对玉米茎腐病的抗性。

(2)本发明的方法提供有效的轮枝镰孢菌接种玉米技术，并可解决玉米对茎腐病抗性的早期鉴定问题。

附图说明

图1是实施例3中轮枝镰孢菌与待接种玉米品种种子共培养5～7天图；其中，图1A：混合共培养，图1B：CK为无镰孢菌。

图2是实施例3中带有玉米幼芽的种子在小花盆中生长15天的状况图；其中，图2A：接种后的糯玉米种质材料kj61的生长状况图；图2B：未接种的糯玉米种质材料kj61(对照)的生长状况图。

图3是实施例3中带有玉米幼芽的种子播种后生长20天后考察植株抗病性的情况图；其中，图3左是接种后的植株；图3右是对照CK的植株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明提供一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法，能够对品种和种质材料进行抗性鉴定。本发明包括茎腐病病原轮枝镰孢菌的分离与扩繁、致病轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种和玉米植株抗性鉴定。

鲜食甜玉米自交系茎腐病的接种方法详细过程如下：

(1)感病材料处理：从大田自然条件下发生茎腐病的玉米植株上采取病害茎秆，剖开，取被害部位茎髓组织，切成0.3～0.5cm小块，无菌条件下用0.1％升汞溶液浸泡1min左右，无菌水漂洗1次，取出组织块用75％(v/v)酒精消毒5mins，无菌水漂洗3次，取出材料，接种于固体PDA培养基上，26～28℃恒温箱暗培养分离病原菌；

(2)病原轮枝镰孢菌株的分离：上述感病组织在培养基上培养2～3d，在生长有菌丝的培养皿里挑取单个菌丝转接于新的固体PDA培养基上置于恒温箱中26～28℃进行培养，直到白色菌丝布满整个培养基；

(3)致病轮枝镰孢菌的纯化鉴定：挑取步骤(2)中单个菌丝置于载玻片上滴1滴蒸馏水置于10×光学显微镜下观察病原菌孢子形态，确认为近年广州地区发生玉米茎腐病的致病轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)；

(4)轮枝镰孢菌的扩繁：将预先准备好的玉米粒(一般玉米粒，仅作为病原菌培养用基质)用自来水泡涨，装入瓶中封口后121℃高压灭菌15mins，冷却后做为扩繁培养基，即玉米粒扩繁培养基。挑取若干轮枝镰孢菌菌丝置于玉米粒扩繁培养基上进行扩繁，26～28℃恒温箱暗培养3～5d，以明显看到白色菌丝布满玉米粒为宜；

(5)待接种玉米品种准备：挑选无损、无霉烂、无虫口、无病斑的健康甜玉米自交系XWY种子(购自广东省农业科学院作物研究所)，用75％(v/v)酒精消毒5mins后，再用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理20mins，用无菌水冲洗3次，备用；

(6)轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种：取步骤(4)中扩繁的镰孢菌玉米粒与步骤(5)待接种玉米按种子量1:1混合后，放在垫有灭菌滤纸的培养皿中，置于26～28℃恒温光照培养箱共培养5～7天，直到发芽后可见幼芽3cm左右，得到接种后带有幼芽的玉米种子。同时设置未接种的甜玉米自交系XWY种子作为对照；

(7)将步骤(6)获得的带有幼芽的玉米种子播种在小花盆：挑出带有幼芽的玉米种子播种在含有土壤或基质的普通花盆中，视种子量多少选择不同规格花盆或苗盘，播种30株以上；

(8)玉米植株抗病性鉴定：步骤(7)播种后定期浇适量水保湿，置于室温(26～28℃)，经过20天后考察玉米植株的抗病性。

玉米苗期茎腐病调查分级标准：

0级(高抗)，整株生长正常，无病。

1级(抗病)，地上地下部生长基本正常，根部可见少量病斑，病斑面积占根表总面积1/4以下，根群颜色白中有褐。

2级(中抗)，地上地下生长明显受阻，叶色变淡，株高仅及对照的3/4，侧根少、细而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4～1/2，根群颜色白、褐相当。

3级(中感)，地上地下部生长极不正常，地上部可见青枯—黄枯状，株高仅及对照的1/2，侧根极小，病斑面积占根总面积的l/2～3/4，根群颜色褐中带白。

4级(高感)，种子发芽，但不出苗，几乎窒息而死，病斑面积占根表总面积的3/4以上，根为棕褐色。

步骤(1)和(2)中所述的固体PDA培养基，组成为：马铃薯淀粉200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容1000mL，121℃高压灭菌15min后倒平板。

依据上述玉米苗期茎腐病调查分级标准，甜玉米自交系XWY苗期对茎腐病抗性鉴定结果为3级，中感。

实施例2

鲜食甜玉米品种茎腐病的接种方法详细过程如下：

(5)待接种玉米品种准备：挑选无损、无霉烂、无虫口、无病斑的健康甜玉米品种粤甜13号种子(购自广东省农业科学院作物研究所)，用75％(v/v)酒精消毒5mins后，再用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理20mins，用无菌水冲洗3次，备用；

(6)轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种：取步骤(4)中扩繁的镰孢菌玉米粒与步骤(5)待接种玉米按种子量1:1混合后，放在垫有灭菌滤纸的培养皿中，置于26～28℃恒温光照培养箱共培养5～7天，直到发芽后可见幼芽3cm左右，得到接种后带有幼芽的玉米种子。同时设置未接种的甜玉米品种粤甜13号种子作为对照；

玉米苗期茎腐病调查分级标准：

0级(高抗)，整株生长正常，无病。

依据上述玉米苗期茎腐病调查分级标准，甜玉米品种粤甜13号苗期对茎腐病抗性鉴定结果为3级，中感。

实施例3

鲜食糯玉米种质材料茎腐病的接种方法详细过程如下：

(5)待接种玉米品种准备：挑选无损、无霉烂、无虫口、无病斑的健康糯玉米种质材料kj61(购自广东省农业科学院作物研究所)，用75％(v/v)酒精消毒5mins后，再用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理20mins，用无菌水冲洗3次，备用；

(6)轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种：取步骤(4)中扩繁的镰孢菌玉米粒与步骤(5)待接种玉米按种子量1:1混合后，放在垫有灭菌滤纸的培养皿中，置于26～28℃恒温光照培养箱共培养5～7天，直到发芽后可见幼芽3cm左右，得到接种后带有幼芽的玉米种子。同时设置未接种的糯玉米种质材料kj61作为对照；结果见图1所示，其中，图1A可见种子表面附有病菌，叶鞘处变褐色；图1B(对照)中干净、色泽鲜亮。

(8)玉米植株抗病性鉴定：步骤(7)播种后定期浇适量水保湿，置于室温(26～28℃)，经过15天～20天后考察玉米植株的抗病性。植株生长状况，见图2和图3。

玉米苗期茎腐病调查分级标准：

0级(高抗)，整株生长正常，无病。

依据上述玉米苗期茎腐病调查分级标准，糯玉米种质材料kj61苗期对茎腐病抗性鉴定结果为2级，中抗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种致病轮枝镰孢菌室内接种鲜食玉米的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)分离获得病原轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)的菌株；

(4)轮枝镰孢菌与玉米种子共培养接种：取步骤(2)中扩繁的轮枝镰孢菌玉米粒与步骤(3)的待接种玉米混合后，放在垫有灭菌滤纸的器皿中，恒温光照培养；同时设置未接种玉米品种作为对照。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括如下步骤：

(5)将步骤(4)经培养萌发后带有幼芽的玉米种子进行播种；

(6)玉米植株抗病性鉴定：步骤(5)播种后定期浇适量水保湿，置于室温经过15～20天后考察玉米植株的抗病性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

①感病材料处理：从大田自然条件下发生茎腐病的玉米植株上采取病害茎秆，剖开，取被害部位茎髓组织，切成0.3～0.5cm小块，无菌条件下用0.1％升汞溶液浸泡1～2min，无菌水漂洗1～2次，取出组织块用75％酒精消毒5～10mins，无菌水漂洗3～4次，取出材料，接种于固体PDA培养基上，26～28℃恒温暗培养分离病原菌；

③致病轮枝镰孢菌的纯化鉴定：挑取步骤②中单个菌丝置于10×光学显微镜下观察病原菌孢子形态，确认为近年广州地区发生玉米茎腐病的致病轮枝镰孢菌。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述的鲜食玉米包括玉米的自交系、种质材料或杂交种；所述的玉米为甜玉米或糯玉米。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的扩繁的条件为26～28℃恒温暗培养3～5d。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的待接种玉米品种为鲜食玉米；

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的消毒的条件为用75％酒精消毒5～10mins后，再用5％次氯酸钠溶液处理15～20mins，用无菌水冲洗2～3次。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的混合为步骤(2)中扩繁的轮枝镰孢菌玉米粒与步骤(3)的待接种玉米按种子量1:(1～1.5)进行混合。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的恒温光照培养的条件26～28℃恒温光照培养5～7天。