CN110042144A - 一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，属于玉米病害防治技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将拟轮枝镰孢菌室内培养，得到拟轮枝镰孢菌单菌落；2)沿步骤1)所述拟轮枝镰孢菌单菌落外缘切下带菌培养基块，得到菌饼；3)取新鲜玉米花丝平行帖放于步骤2)所述菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况，确定拟轮枝镰孢菌致病力。本发明的方法在室内操作，操作过程简单，工作量小，能够节省人力资源；并且在实施过程中，温度和湿度容易控制，不易受外界环境影响，实验结果准确，稳定，可靠，误差低。经过验证，本发明的鉴定结果与大田致病力鉴定结果一致。

Description

一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法

技术领域

本发明涉及玉米病害防治技术领域，尤其涉及一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法。

背景技术

玉米穗腐病是世界各玉米产区严重威胁玉米生产的一种真菌性病害。在我国各地均有发生且日趋严重，直接影响玉米的产量和品质，常造成严重的经济损失。

目前，已报道的玉米穗腐病病原菌类群主要包括镰孢菌(Fusarium spp.)、青霉菌(Penicillium spp.)、木霉菌(Trichoderma spp.)、蠕孢菌 (Helminthosporium spp.)和曲霉菌(Aspergillus spp.)等，其中镰孢菌为主要致病菌，而拟轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioides)是引起玉米穗腐病的主要病原菌。通过农杆菌介导转化产生弱致病力的拟轮枝镰孢菌菌株，该菌株对由拟轮枝镰孢菌引起的玉米穗腐病具有免疫保护力，可用于玉米穗腐病的生物防治，降低化学农药的使用量，具有广阔的应用前景。

传统的菌株致病力筛选鉴定方法有田间接菌和室内植物离体接菌等方式。玉米穗腐病菌株致病力鉴定多用田间接菌鉴定，即在乳熟期用苞叶内注射法接种，但此方法前期需要培养大量的病原菌，接种后需要对玉米进行日常管理，后期对接种玉米表现症状情况随时观察，且突变率低，需筛选的植株基数至少要几千以上，工作量大，试验周期长，试验效率低下。加之添加接菌受外界环境影响较大，无法满足大量菌株筛选的需求。利用植物离体接菌进行菌株室内致病力鉴定具有快速、准确、不易受外界环境影响、不受季节限制，以及适应筛选大批量菌株等优越性。但目前还没有成熟的室内鉴定针对玉米穗腐病致病菌—拟轮枝镰孢菌致病力的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，该方法具有操作简便、鉴定结果准确的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，包括以下步骤：

1)将拟轮枝镰孢菌室内培养，得到拟轮枝镰孢菌单菌落；

2)沿步骤1)所述拟轮枝镰孢菌单菌落外缘切下带菌培养基块，得到菌饼；

3)取新鲜玉米花丝平行帖放于步骤2)所述菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况，确定拟轮枝镰孢菌致病力；

若玉米花丝有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为强致病力菌株；

若玉米花丝没有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为弱致病力菌株。

优选的，步骤1)中所述拟轮枝镰孢菌包括野生型拟轮枝镰孢菌和农杆菌介导转化的拟轮枝镰孢菌。

优选的，所述农杆菌介导转化的拟轮枝镰孢菌表现出对潮霉素B的抗性。

优选的，步骤1)中培养所述拟轮枝镰孢菌的培养基为PDA平板培养基。

优选的，步骤1)中所述培养的温度为25～30℃。

优选的，步骤2)中所述菌饼的直径为0.5～1.2cm。

优选的，步骤3)中所述玉米花丝取自于玉米果穗中部。

优选的，所述玉米果穗为吐丝期的玉米果穗。

优选的，步骤3)中所述玉米花丝的长度为1～6cm。

优选的，步骤3)中所述静置的环境为黑暗环境；所述静置的温度为 25～30℃。

本发明的有益效果：

拟轮枝镰孢菌侵染玉米导致穗腐病的其中一种途径是通过气传，其分生孢子通过气流落到花丝上，进而侵染籽粒。玉米花丝发挥了重要的作用，因此本发明利用花丝侵染法进行室内拟轮枝镰孢菌致病力鉴定。本发明室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，仅需将新鲜玉米花丝平行帖放于含有拟轮枝镰孢菌的菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况；若玉米花丝没有明显的发病症状，则拟轮枝镰孢菌为弱致病力菌株；若玉米花丝有明显的发病症状，则拟轮枝镰孢菌为强致病力菌株；上述操作均需在无菌条件下进行。本发明的方法在室内操作，操作过程简单，工作量小，能够节省人力资源；并且在实施过程中，温度和湿度容易控制，不易受外界环境影响，实验结果准确，稳定，可靠，误差低。经过验证，本发明的鉴定结果与大田致病力鉴定结果一致，本发明的方法可以用于拟轮枝镰孢菌致病力的室内鉴定。

附图说明

图1为玉米花丝与菌饼的摆放情况；

图2为轮枝镰孢菌生长4d后菌落形态；

图3为拟轮枝镰孢菌在玉米花丝上的发病情况，其中a为弱致病力菌株 110号在玉米花丝上的发病情况；b为强致病力菌株38号在玉米花丝上的发病情况；ck为野生型菌株在玉米花丝上的发病情况。

图4为拟轮枝镰孢菌在玉米籽粒上的发病情况，其中a为110号菌株在玉米籽粒上的发病情况；b为38号菌株在玉米籽粒上的发病情况；ck为野生型菌株在玉米籽粒上的发病情况。

图5为拟轮枝镰孢菌在玉米果穗上的发病情况，其中WT表示野生型菌株在玉米果穗上的发病情况；110表示弱致病力菌株110号在玉米果穗上的发病情况。

具体实施方式

本发明提供了一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，包括以下步骤：

1)将拟轮枝镰孢菌室内培养，得到拟轮枝镰孢菌单菌落；

2)沿步骤1)所述拟轮枝镰孢菌单菌落外缘切下带菌培养基块，得到菌饼；

3)取新鲜玉米花丝平行帖放于步骤2)所述菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况，确定拟轮枝镰孢菌致病力；

若玉米花丝有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为强致病力菌株；

若玉米花丝没有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为弱致病力菌株；

上述操作均在无菌条件下完成。

本发明首先将拟轮枝镰孢菌室内培养，得到拟轮枝镰孢菌单菌落。

本发明对拟轮枝镰孢菌的来源没有特殊限制。本发明具体实施过程中，所述拟轮枝镰孢菌菌株优选的采用以下方法制备获得：拟轮枝镰孢菌原始菌株经农杆菌转化，获得转化子，转化子连续转接5代后，经潮霉素B抗性筛选，获得具有不同致病力的拟轮枝镰孢菌菌株。

本发明对所述农杆菌转化的方法和连续转接的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员的常规操作即可；所述连续转接过程采用的培养基优选为 PDA平板培养基。在本发明具体实施例中所采用的拟轮枝镰孢菌原始菌株优选为河北省农林科学院植物保护研究保存的对玉米果穗具有致病力的菌株，但并非是对本发明的限定。

本发明对所述PDA平板培养基的组成原料及制备方法没有特殊限定，采用本领域常规PDA平板培养基即可；本发明具体实施过程中，所述PDA 平板培养基优选的由包括以下原料制备获得：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g和蒸馏水1000mL。

本发明对所述拟轮枝镰孢菌的接种量没有特殊限制；所述培养的环境优选为黑暗环境；所述培养的时间优选为3～5d，更优选为4d；所述培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃。

得到拟轮枝镰孢菌单菌落后，本发明沿拟轮枝镰孢菌单菌落外缘切下带菌培养基块，得到菌饼；本发明对菌饼大小没有特殊限制，所述菌饼的直径优选为0.5～1.2cm，更优选为0.8～1cm；所述切下带菌培养基块的设备优选为打孔器；所述菌饼优选的放置于无菌培养皿中。

得到菌饼后，本发明取玉米花丝平行帖放于菌饼上，优选玉米花丝根数为1～3根。密封静置5～9d后，观察玉米花丝的发病情况，确定不同拟轮枝镰孢菌菌株的致病力；

若玉米花丝没有明显的发病症状(如图3中图a所示)，则拟轮枝镰孢菌为弱致病力菌株；

若玉米花丝有明显的发病症状(如图3中图b所示)，则拟轮枝镰孢菌为强致病力菌株。

本发明所述明显的发病症状，是指花丝表面布满菌丝，花丝侵染部位变褐萎蔫。

本发明选择花丝作为接菌材料的原因是拟轮枝镰孢菌侵染玉米导致穗腐病的其中一种途径是通过气传，其分生孢子通过气流落到花丝上，进而侵染籽粒，玉米花丝发挥了重要的作用，因此可以利用花丝侵染法进行室内拟轮枝镰孢菌致病力鉴定。

本发明所述玉米花丝的长度优选为1～6cm，更优选为3～4cm；所述玉米花丝优选的取自于玉米果穗中部，整根花丝中间无弯曲且长势好的部位，取玉米花丝的过程优选的在超净工作台中进行；所述玉米果穗优选为吐丝期的新鲜玉米果穗；取玉米花丝前，所述玉米果穗优选的经过灭菌处理。所述灭菌的方法优选为采用乙醇水溶液喷雾消毒；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为75％。

本发明对玉米品种没有特殊限定，现有技术中的任意玉米品种所生长的花丝均能用于本发明中。本发明具体实施过程中，所述玉米花丝与菌饼尽量贴合且花丝无交叉，玉米花丝与菌饼的摆放情况参见图1。

本发明中，所述静置的环境优选为黑暗环境；所述静置的温度优选为 25～30℃，更优选为28℃；所述静置的时间优选为7d。

本发明对于密封的方式没有特殊限定。在本发明具体实施例中，优选采用封口膜将培养皿封闭，得到具有一定稳定温湿度环境的密封状态，且能够避免杂菌的污染。

本发明仅需将新鲜玉米花丝平行帖放于含有拟轮枝镰孢菌的菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况，即可鉴定出拟轮枝镰孢菌的致病力，操作过程简单，工作量小，并且室内操作温度和湿度容易控制，不易受外界环境影响，实验结果准确，稳定，可靠，误差低，可以用于室内鉴定不同拟轮枝镰孢菌的致病力。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所用玉米品种郑58为现有市售品种，以该品种花丝作为本发明实施例中的材料，但不能理解为对本发明技术方案的限定。本领域技术人员可以根据材料来源选择任意的玉米品种材料。

下述实施例中所用拟轮枝镰孢菌是河北省农林科学院植物保护研究所保存的现有具有致病力菌株，但不能理解为对本发明技术方案的限定。本发明技术方案可以测定任意来源的拟轮枝镰孢菌菌株致病力。

实施例1一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法(接菌部位：玉米花丝)

1、材料：品种郑58新鲜花丝，待鉴定致病力的拟轮枝镰孢菌突变体菌株(216株)。

2、待鉴定致病力的拟轮枝镰孢菌突变体菌株的获得方法

拟轮枝镰孢菌突变体菌株的培养

a.拟轮枝镰孢菌是河北省农林科学院植物保护研究所保存的对玉米果穗具有致病力的菌株(此菌株为野生型菌株CK)。

b.用保存的菌株建立并优化拟轮枝镰孢菌突变体的转化体系，转化方法如下：

①农杆菌的转化：市场上购买已构建好的根癌农杆菌AGL-1(带有双价载体质粒，该质粒将pCAMBIA1300骨架中的pCaMV35S-hph置换为 pTrpc-hph，同时含有pGpd-GFP，含有潮霉素B抗性，含有GFP标记基因)，质粒采用冻融法转化到AGL1农杆菌中，挑单斑接种于5mLLB液体培养基 (含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL利福平)中，于250r/min、28℃过夜培养，然后吸取适量培养物离心，用诱导培养基(IM)洗两遍，于28℃、250r/min 震荡培养6h，调OD₆₀₀为0.30～0.35，备用。

②镰孢菌的转化：用5mL步骤①中调试好的IM培养基从培养4d的PDA平板上洗下镰孢菌的孢子，离心收集，冲洗并稀释至孢子浓度为10⁶个/mL，取 200μL孢子液涂布在置于共培养基IM(含200μmol/mLAS和40mM MES)平板上的玻璃纸上，28℃共培养48h，将玻璃纸连同生长的菌转到含有150μg/mL 潮霉素B、200μg/mL氨苄青霉素钠和200μg/mL头孢噻肟钠的CYA培养基上，长出菌落后连续转接到含150μg/mL潮霉素B的PDA平板上，保存性状稳定的转化子。

③转化子的稳定性测定：将步骤②中的转化子菌丝于普通PDA培养基上培养一周后，挑取边缘菌丝重复转接5代，再接种到含潮霉素B的培养基上，以不加潮霉素B的为对照，观察菌落生长，保存性状稳定的转化子。

c.采用PDA平板培养拟轮枝镰孢菌，将保存的拟轮枝镰孢菌突变体菌株取出小块，并接种在含有潮霉素B的PDA培养基的中央，温度28℃黑暗培养 4d，待用，轮枝镰孢菌生长4d后菌落形态参见图2。

3、鉴定方法

1)将马铃薯200g去皮后切成小块，放入800mL蒸馏水中煮沸20min， 4层纱布过滤后，加入葡萄糖20g和琼脂20g，煮沸后定容至1000mL，121℃灭菌20min，倒平板，冷却后得到PDA平板培养基，接种拟轮枝镰孢菌进行培养，28℃黑暗培养3d，长出单菌落。

2)用直径为1cm的打孔器在轮枝镰孢菌菌株的菌落边缘打孔，用接种针将菌饼放置在无菌的一次性皿上，每个皿放置3个菌饼备用(3个菌饼为 3次重复)。

3)在田间采集处于吐丝期的新鲜玉米果穗(玉米品种：郑58)，采回后用75％酒精喷雾杀菌后放入超净工作台中，用无菌的镊子剥开玉米果穗苞叶，选取果穗中新鲜的玉米花丝(果穗中部，整根花丝中间无弯曲且长势较强的部位)，用无菌的剪刀将花丝剪成3cm，备用。

4)用镊子将两根花丝平行置于菌饼上，完成后用封口膜将一次性皿封口，于28℃黑暗培养7d后观察花丝的发病情况。

5)发病情况统计

致病力评价：花丝被侵染7d后，根据花丝发病症状分为强/弱致病力菌株2个级别。

1)弱致病力菌株：接菌花丝没有明显的发病症状，花丝未被菌株侵染；

2)强致病力菌株：接菌花丝有明显的发病症状，花丝表面布满菌丝；

结果见图3，结果显示216个菌株中只有1个菌株的花丝未发病(图a)，花丝表面无菌丝侵染，菌株侵染部位未变褐萎缩，为弱致病力菌株，菌号为 110，检出率为0.46％。剩余215个菌株的花丝全部发病(随机挑选1株，菌号为38号，发病情况如图b所示)，为强致病力菌株，发病花丝表面布满菌丝，菌株侵染部位变褐萎缩，检出率为99.54％。野生型菌株(ck)侵染的花丝表面布满菌丝，对花丝具有较强的致病力。实验表明弱致病力菌株检出率相对较低，需要增大转化子菌株基数才能筛选出更多弱致病力转化子菌株。

对照例1一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法(接菌部位：玉米籽粒)

1、材料：品种郑58玉米籽粒，待鉴定致病力的拟轮枝镰孢菌突变体菌株(216个)，菌株与实施例1中菌株相同。

2、鉴定方法：

1)将马铃薯200g去皮后切成小块，放入800mL蒸馏水中煮沸20min， 4层纱布过滤后，加入葡萄糖20g和琼脂20g，煮沸后定容至1000mL，121℃灭菌20min，倒平板，冷却后得到PDA平板培养基，接种拟轮枝镰孢菌进行培养，28℃黑暗培养3d，长出单菌落。

2)用直径为1cm的打孔器在轮枝镰孢菌菌株的菌落边缘打孔，用接种针将菌饼放置在无菌的一次性皿上，每个皿放置3个菌饼备用(3个菌饼为 3次重复)。

3)在田间采集处于吐丝期的新鲜玉米果穗，采回后用75％酒精喷雾杀菌后放入超净工作台中，用无菌的镊子剥开玉米果穗苞叶，用刀子将籽粒取下，将籽粒放入15mL离心管中，向离心管中加入75％的酒精处理3min，在 1.5％的NaClO(V/V)水溶液中浸泡表面消毒3min，再用无菌水仔细冲洗3 次，消毒完成后用无菌滤纸将籽粒表面多余的水分吸干备用。

4)用镊子将酒精消毒后的籽粒放在菌饼上，完成后用封口膜将一次性皿封口，于28℃黑暗培养7d后观察籽粒的发病情况。

5)发病情况统计

致病力评价：籽粒被侵染7d后，根据籽粒发病症状分为强/弱致病力菌株2个级别。

1)弱致病力菌株：接菌籽粒没有明显的发病症状，籽粒未被菌株侵染；

2)强致病力菌株：接菌籽粒有明显的发病症状，籽粒表面布满菌丝；

结果见图4，结果显示，突变体库中的216株拟轮枝镰孢菌菌株经过筛选后发现籽粒接种菌株的全部发病(弱致病菌110号发病情况如图a所示；随机挑选出1株强致病菌，菌号为38号，发病情况如图b所示)，籽粒表面附着大量菌丝，腐烂严重。野生型菌株发病同样较为严重(图ck)。由图 3和图4的结果可知，室内筛选弱致病力轮枝镰孢菌菌株的最佳接种材料为花丝接种。

实施例2田间回接实施例1筛选出的拟轮枝镰孢菌弱致病力菌株。

(1)试验目的：田间回接筛选轮枝镰孢菌转化子中弱致病力的菌株。

(2)试验材料：自交系品种郑58。

(3)回接菌株：实施例1鉴定的弱致病力菌株110号，强致病力菌株 38号(从215株强致病力菌株中随机挑选一个菌株)，野生型菌株WT(河北省农林科学院植物保护研究所保存的对玉米果穗具有致病力的菌株)。

(4)回接方法：用花丝涂抹法，将突出苞叶部分的1～2cm的花丝保留。其余剪除，将培养皿中培养好的菌株直接涂抹在剪齐的花丝上，套上授粉袋和网袋，防止其它病虫的侵入。

(5)结果：如表1可以看出，本发明筛选出的强致病力菌株38号和野生型菌株WT接种后发病率分别为85％和90％(受环境等因素影响，发病率未到100％)，但弱致病力菌株110的发病率为0(图5)，试验结果与室内致病力鉴定中的结果一致，说明本发明方法准确、可靠，可用于室内拟轮枝镰孢菌突变体的快速筛选。

表1田间回接拟轮枝镰孢菌强/弱致病力菌株

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法，包括以下步骤：

1)将拟轮枝镰孢菌室内培养，得到拟轮枝镰孢菌单菌落；

2)沿步骤1)所述拟轮枝镰孢菌单菌落外缘切下带菌培养基块，得到菌饼；

3)取新鲜玉米花丝平行帖放于步骤2)所述菌饼上，密封静置5～9d，观察玉米花丝的发病情况，确定拟轮枝镰孢菌致病力；

若玉米花丝有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为强致病力菌株；

若玉米花丝没有发病症状，则拟轮枝镰孢菌为弱致病力菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述拟轮枝镰孢菌包括野生型拟轮枝镰孢菌和农杆菌介导转化的拟轮枝镰孢菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导转化的拟轮枝镰孢菌表现出对潮霉素B的抗性。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中培养所述拟轮枝镰孢菌的培养基为PDA平板培养基。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25～30℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述菌饼的直径为0.5～1.2cm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述玉米花丝取自于玉米果穗中部。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述玉米果穗为吐丝期的玉米果穗。

9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述玉米花丝的长度为1～6cm。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述静置的环境为黑暗环境；所述静置的温度为25～30℃。