CN112608852A - 一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法 - Google Patents

一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物病原真菌扩繁技术领域，具体涉及一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法。本发明提供的拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法包括固体培养基扩繁和植物籽粒扩繁的步骤，具体为将固体培养基扩繁得到的拟轮枝镰刀菌及其附着的固体培养基制备为菌液，注射接种于装有植物籽粒的培养容器中进行扩繁。本发明的扩繁方法显著提高了拟轮枝镰刀菌的产孢效率，降低了成本，具有操作简单、污染率低，接种均一、接种物不会粘附在扩繁容器上，产孢量高、生长均一、方便统一出库等优势，可在实践中用于拟轮枝镰刀菌的大批量接种和扩繁。

Description

一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法
技术领域
本发明涉及植物病原真菌扩繁技术领域，具体涉及一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法。
背景技术
近年来，作物耕作制度的变化以及气候的改变使得农业领域对于作物的抗病性的要求越来越高。拟轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)是一种常见的植物病原真菌。在自然环境条件下，拟轮枝镰刀菌往往能够引起玉米穗腐病的发生，其产生的伏马毒素(FB)会污染粮食及其制品，并对某些家畜产生急性毒性及潜在的致癌性。目前对于玉米穗腐病最为有效的和最为环保的方法就是培育和推广抗病品种，而鉴定作物是否具有对拟轮枝镰刀菌穗腐病的抗性则需要生产足量、纯度达标的拟轮枝镰刀菌。
目前，拟轮枝镰刀菌的扩繁仍然使用最为传统的方法：利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)对拟轮枝镰刀菌进行扩繁。该方法存在以下问题：(1)效率低；(2)产孢量低；(3)接种不均匀；(4)需要大量的培养皿进行扩繁；(5)需要从每个培养皿中洗脱孢子；(6)菌片容易粘在培养容器壁上；(7)容易污染；以上问题使得传统的拟轮枝镰刀菌扩繁方法不适用于大规模接种拟轮枝镰刀菌穗腐病。因此，亟需开发一种高效的拟轮枝镰刀菌接种和扩繁方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种拟轮枝镰刀菌接种和扩繁方法，该方法具有操作简单、高效、接种均匀、生长均一、扩繁时间短等优势。
为实现上述目的，本发明具体提供以下技术方案：
本发明提供一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法，该方法包括固体培养基扩繁和植物籽粒扩繁的步骤，具体地，将固体培养基扩繁得到的拟轮枝镰刀菌及其附着的固体培养基制备为菌液，注射接种于装有植物籽粒的培养容器中进行扩繁。
本发明发现，相比于传统接种扩繁方法中以PDA培养基为扩繁基质接种植物籽粒，以液体菌液的注射接种植物籽粒的方式扩繁不仅能够解决固体菌块粘度较高容易粘在培养容器壁上、开口接种易导致污染的问题，而且能够提高接种的均匀度，在培养后期不需要人工混匀，且高接种均匀度进一步减少了杂菌的生长。进一步地，在制备液体接种的菌液时，本发明发现将病原菌与其附着的固体培养基一同分散混匀制备为菌液，可使得病原菌孢子附着在植物籽粒上，为菌体生长提供丰富的营养物质，显著提高菌液接种植物籽粒时拟轮枝镰刀菌的扩繁速度。
具体地，所述菌液的制备方法为：将固体培养基扩繁得到的拟轮枝镰刀菌及其附着的固体培养基与无菌水或无菌缓冲液混合并搅拌分散，得到拟轮枝镰刀菌孢子均匀分散的菌液。
优选地，所述菌液中，拟轮枝镰刀菌孢子的浓度为1×107个/mL-5×107个/mL。本发明发现，将菌液的浓度控制在上述范围内，在接种植物籽粒后可更有效地促进产孢。
以上菌液的制备方法中，搅拌分散可采用本领域常规技术手段和设备，包括但不限于分散搅拌机、匀浆机、榨汁机等。
优选地，所述搅拌分散采用榨汁机进行，搅拌分散时间为3-5min。
以上所述的固体培养基可采用拟轮枝镰刀菌培养常用的固体培养基。在这些培养基中，本发明发现PDA培养基在接种植物籽粒后能够表现出更优的促进拟轮枝镰刀菌产孢。因此，所述固体培养基优选为PDA固体培养基。
以上所述的方法中，所述注射接种为采用连续注射器以1×108个-5×108个孢子/(450～600)g植物籽粒的比例定量接种。定量接种可很好地保证不同培养容器中拟轮枝镰刀菌生长的均一性，同时，本发明发现，采用该接种量能够在保证拟轮枝镰刀菌扩繁量的同时，节约接种病原菌用量。
本发明所述的植物籽粒可为高粱籽粒、玉米籽粒等。
优选地，所述植物籽粒为高粱籽粒。高粱籽粒具有更大的表面积，更有利于提高拟轮枝镰刀菌的扩繁量。
本发明中，植物籽粒扩繁的培养容器可为植物病原真菌常用的培养容器，包括但不限于三角瓶、双开口聚丙烯食用菌袋等。
优选地，植物籽粒扩繁的培养容器为双开口聚丙烯食用菌袋或三角瓶。
在进行大规模接种扩繁时，所述植物籽粒扩繁的培养容器更优选为双开口聚丙烯食用菌袋。采用双开口聚丙烯食用菌袋注射接种的方法，在注射接种时无需打开容器口，适用于大规模连续定量接种。
以上所述的方法中，当采用双开口聚丙烯食用菌袋培养时，在将菌液注射接种于植物籽粒后，将双开口聚丙烯食用菌袋上的注射孔密封。
以上所述的注射孔密封可采用常用的密封材料，包括但不限于胶带、粘贴纸、标签纸等。
以上所述的方法中，所述植物籽粒扩繁为在27-29℃黑暗条件下进行培养。
以上所述的方法中，固体培养基扩繁的方法为：将0.5-0.9cm的拟轮枝镰刀菌菌饼接种于固体培养基上，在27-29℃条件下培养5-7d。
本发明的有益效果在于：本发明提供的拟轮枝镰刀菌接种和扩繁方法具有如下优势：
(1)显著提高扩繁效率，降低成本：利用本发明的接种和扩繁方法，可节省固体培养基以及原始病原菌用量；接种时间从传统方法的1.5-2分钟/袋(瓶)，提高到20-24秒/袋，36-54秒/瓶；且接种仅需1人即可完成整个操作过程，不需要人工摇晃或捏，节约了人力和时间成本。
(2)操作简单，污染率低：本发明的扩繁方法，在使用双开口聚丙烯食用菌袋扩繁时，不需要将袋口打开，注射接种仅会在袋上留下一个可再次密封的小孔，避免了传统接种方法开口时间过长的问题，可将污染率控制在5％以下；即便在使用三角瓶时，由于接种均一度显著提高且产孢量更大，也可将污染率控制在5％以下。
(3)接种均一，接种物不会粘附在扩繁容器上：本发明的接种和扩繁方法中，病原菌孢子均匀分散于菌液中，通过使用连续注射器定量注射菌液，随着菌液的流淌不会出现因菌饼粘附在扩繁容器上而需要人工用镊子挑放的问题；而且在运输过程和摆放过程中，菌液可以充分与各植物籽粒接触，促进病原菌在扩繁容器的各个位置均匀生长。
(4)拟轮枝镰刀菌产孢量高，成本降低：与传统扩繁方法相比，利用本发明的接种和扩繁方法培养，拟轮枝镰刀菌的产孢效率明显提高，利用本发明的方法扩繁得到的孢子量是传统方法的约50-85倍。
(5)拟轮枝镰刀菌生长均一，方便统一出库：本发明的接种和扩繁可定量控制高粱籽粒和菌液的接种量，同一批次不同扩繁容器中的拟轮枝镰刀菌生长状态更接近，容器中的高粱发病更均一，而且纯度明显提高(传统的大批量扩繁菌种的纯度在90-95％之间，而液体接种扩繁拟轮枝镰刀菌的纯度可以达到97-100％以上)，且能够按照时间统一出库。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法，具体步骤如下：
1、PDA扩繁拟轮枝镰刀菌：将选定的目标拟轮枝镰刀菌菌株接种到PDA培养基上，每一个装有15gPDA培养基的90mm*90mm的培养皿中放入直径为0.9cm的菌饼，在28℃条件下培养7d。
2、拟轮枝镰刀菌菌液接种高粱籽粒：将500g高粱粒装入20cm*40cm双开口聚丙烯食用菌袋中，并用直径4cm的双套环将两侧封口，高压灭菌锅灭菌1h后取出，待高粱粒降至室温放入无菌操作台；将步骤1培养得到的拟轮枝镰刀菌纯度为100％的培养物(包括病原菌和培养皿中全部的固体培养基)放入榨汁杯中，加入无菌水进行榨汁，无菌水的加入量为每个培养皿35mL，榨汁3min，培养物被打成细浆，得到拟轮枝镰刀菌菌液，菌液中拟轮枝镰刀菌的孢子浓度为1×107个/mL；采用连续注射器将菌液接种于菌袋中，在接种过程中，每个食用菌袋中装入了等质量的高粱籽粒并接种等量的培养物，保证每500g高粱粒接种10mL菌液。
待注射接种结束后，使用标签纸对菌袋上的注射针孔进行密封；为了方便出入库统计，标签的内容包括病原菌类型、接种时间和接种袋数等。
3、培养室扩繁拟轮枝镰刀菌：将接种后的高粱籽粒运送到培养室进行培养，培养条件为28℃暗黑培养；从接种当天开始计时到第5d统一用无菌水洗脱孢子，每500g高粱粒用1250mL无菌水洗脱。
实施例2
本实施例提供一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法，其与实施例1的区别在于，用500mL三角瓶代替双开口聚丙烯食用菌袋，具体步骤如下：
1、PDA扩繁拟轮枝镰刀菌：将选定的目标拟轮枝镰刀菌菌株接种到PDA培养基上，每一个装有15gPDA培养基的90mm*90mm的培养皿中放入直径为0.9cm的菌饼，在28℃条件下培养7d。
2、拟轮枝镰刀菌菌液接种高粱籽粒：将200g高粱粒装入500mL三角瓶中，并用封口膜封口，高压灭菌锅灭菌1h后取出，待高粱粒降至室温放入无菌操作台，将步骤1培养得到的拟轮枝镰刀菌纯度为100％的培养物(包括病原菌和培养皿中全部的固体培养基)放入榨汁杯中，加入无菌水进行榨汁，无菌水的加入量为每个培养皿35mL，榨汁3min，培养物被打成细浆，得到拟轮枝镰刀菌菌液，菌液中拟轮枝镰刀菌的孢子浓度为1×107个/mL。采用连续注射器将菌液接种于三角瓶中，在接种过程中，需要将封口膜打开，每个三角瓶中装入了等质量的高粱籽粒并接种等量的培养物，保证每200g高粱粒接种4mL菌液。
待注射接种结束后，再次使用封口膜进行封口，同时使用标签纸粘贴在瓶身上，标签的内容包括病原菌类型、接种时间和接种袋数等。
3、培养室扩繁拟轮枝镰刀菌：将接种后的高粱籽粒运送到培养室进行培养，培养条件为28℃暗黑培养。从接种当天开始计时到第5d统一用无菌水洗脱孢子，每200g高粱粒用500mL无菌水洗脱。
对比例1
本对比例提供一种拟轮枝镰刀菌的扩繁方法，其为传统的扩繁方法，具体步骤如下：
PDA扩繁拟轮枝镰刀菌：将选定的目标拟轮枝镰刀菌菌株接种到PDA培养基上，每一个装有15gPDA培养基的90mm*90mm的培养皿中放入直径为0.9cm的菌饼，在28℃条件下培养13d，直接用无菌水洗脱孢子，40个皿用1250mL无菌水洗脱。
对比例2
本对比例提供一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法，其与实施例2的区别在于，用固体培养物代替液体菌液接种，具体步骤如下：
1、PDA扩繁拟轮枝镰刀菌：将选定的目标拟轮枝镰刀菌菌株接种到PDA培养基上，每一个装有15gPDA培养基的90mm*90mm的培养皿中放入直径为0.9cm的菌饼，在28℃条件下培养7d。
2、拟轮枝镰刀菌培养物接种高粱籽粒：将200g高粱粒装入500mL三角瓶中，并用封口膜封口，高压灭菌锅灭菌1h后取出，待高粱粒降至室温放入无菌操作台；将步骤1培养得到的拟轮枝镰刀菌纯度为100％的培养物等分10份，将每份培养物切成小块，每瓶放入1份已切碎的培养物，在接种过程中，需要将封口膜打开，每个三角瓶中装入了等质量的高粱籽粒并接种等量的培养物，保证每200g高粱粒接种1/10皿的培养物(接种量等同于500g高粱粒接种1/4皿的培养物)；
接种过程中，需注意每小块培养物都要接触到高粱粒，而非粘在瓶壁上。待接种结束后，再次使用封口膜进行封口，同时使用标签纸粘贴在瓶身上，标签的内容包括病原菌类型、接种时间和接种袋数等。
3、培养室扩繁拟轮枝镰刀菌：将接种后的高粱籽粒运送到培养室进行培养，培养条件为27～29℃暗黑培养。从接种当天开始计时到第5d统一用无菌水洗脱孢子，每200g高粱粒用500mL无菌水洗脱。
实验例1
分别测定各实施例和对比例的接种和扩繁方法得到的拟轮枝镰刀菌的孢子量和纯度，其中实施例1进行5个菌袋的扩繁试验，实施例2进行5个三角瓶液体接种的扩繁试验，对比例1进行200个皿的扩繁试验，对比例2进行5个三角瓶固体接种的扩繁试验，具体结果如下，其中产孢量和纯度的统计结果如表1所示。
实施例1的方法：从步骤2开始到接种结束，接种一袋高粱籽粒需要的时间大约在20-24秒之间；每20个培养皿榨汁得到菌液可以用连续注射器接种高粱籽粒80袋；在第5天出库时每一袋高粱粒得到的拟轮枝镰刀菌的孢子量浓度可达82.2×106-86.12×106个/mL。
实施例2的方法：接种一个装有200g高粱粒的500mL三角瓶需要的时间大约在36-54秒之间；每20个培养平板榨汁得到菌液可以用连续注射器接种高粱籽粒200瓶；在第5天出库时得到的孢子量浓度可达53.32×106-56.21×106个/mL。
选取采用实施例1的方法得到的5袋高粱粒和实施例2的方法得到的5瓶扩繁高粱粒，每一袋/每一瓶随机选取5个部位的高粱粒，每个部位取20粒，用无菌水洗脱，然后分别用显微镜进行镜检，是否存在拟轮枝镰刀菌外的其他杂菌，计算拟轮枝镰刀菌的纯度。另计算实施例1和实施例2的方扩繁方法的污染率，污染率的计算公式如下：
污染率(％)＝污染菌袋(瓶)数/扩繁总袋(瓶)数。结果显示，实施例1和实施例2的方法的污染率均低于5％。
以上结果表明，实施例1和2的接种扩繁方法能够完全满足植物接种和抗性鉴定试验对病原菌纯度的各项要求；由于每一双开口聚丙烯食用菌袋中/三角瓶中高粱籽粒的质量和菌液的接种量相同，因此出库时不同双开口聚丙烯食用菌袋/三角瓶的生长均一性高，不需要额外进行挑选，但是实施例1的接种效率和产孢量显著高于实施例2，同时实施例1的扩繁高粱粒更容易从容器中取出且便于长距离运输。
对比例1的方法获得的镰刀菌孢子浓度明显低于实施例1和2，由于其所使用的培养皿都是经过挑选后再洗脱孢子，因此该方法获得的镰刀菌纯度均为100％，但是在培养皿大量扩繁时，会出现培养皿污染的情况，污染率为2-6％。
对比例2的方法从前期准备工作到接种结束，接种一瓶高粱籽粒需要的时间大约为1.5-2分钟。在第5天出库时得到的孢子浓度为10.56×106个/mL。扩繁病原菌的纯度为90-95％；而且，不同培养瓶的拟轮枝镰刀菌生长均一性低，需要进一步挑选生物量高的培养瓶。
表1培养5d时拟轮枝镰刀菌孢子浓度和纯度
Figure BDA0002886046390000081
Figure BDA0002886046390000091
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种拟轮枝镰刀菌的接种和扩繁方法，包括固体培养基扩繁和植物籽粒扩繁的步骤，其特征在于，将固体培养基扩繁得到的拟轮枝镰刀菌及其附着的固体培养基制备为菌液，注射接种于装有植物籽粒的培养容器中进行扩繁。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌液的制备方法为：将固体培养基扩繁得到的拟轮枝镰刀菌及其附着的固体培养基与无菌水或无菌缓冲液混合并搅拌分散，得到拟轮枝镰刀菌孢子均匀分散的菌液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌液中，拟轮枝镰刀菌孢子的浓度为1×107个/mL-5×107个/mL。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述搅拌分散采用榨汁机进行，搅拌分散时间为3-5min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为PDA固体培养基。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述注射接种为采用连续注射器以1×108个-5×108个孢子/(450～600)g植物籽粒的比例定量接种。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述植物籽粒为高粱籽粒。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述植物籽粒扩繁的培养容器为双开口聚丙烯食用菌袋或三角瓶；
优选地，当采用双开口聚丙烯食用菌袋培养时，将菌液注射接种于植物籽粒后，将双开口聚丙烯食用菌袋上的注射孔密封。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物籽粒扩繁于27-29℃黑暗条件下进行培养。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基扩繁的方法为：将0.5-0.9cm的拟轮枝镰刀菌菌饼接种于PDA培养基上，在27-29℃条件下培养5-7d。
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