CN115141753B - 桦褐孔菌菌种超低温保藏技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法，属于药食两用真菌及生物工程应用领域。本发明公开了采用固液菌种转换技术超低温保藏桦褐孔菌菌种的方法，即以固体菌种作为菌种保藏的主体，将其放入装有玻璃珠的无菌水中，在混匀仪上振荡，让高速旋转的玻璃珠击碎固体菌种，使掉落的菌丝体碎片和片段悬浮在无菌水中，完成菌种的固液转换。采用本发明公开的保藏方法复活桦褐孔菌，能保证菌种活性及其生物学特性仍然保持着保藏前的初始状态。本发明为桦褐孔菌的菌种保藏提供了一种科学可靠的技术途径。

Description

桦褐孔菌菌种超低温保藏技术

技术领域

本发明属于药食两用真菌及生物工程应用领域，具体涉及一种桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法。

背景技术

桦褐孔菌[Inonotus obliquus(Pers.: Fr.) Pilat]，又名斜生纤孔菌、桦癌孔菌、白桦茸等。属担子菌亚门、层菌纲、无褶菌目、多孔菌科，是一种能促进木质素、纤维素、半纤维素降解的白腐真菌。主要分布在北半球北纬40°至50°地区，如北美、波兰、芬兰、俄罗斯、日本北海道等国家和地区。我国主要分布在吉林长白山地区、黑龙江大小兴安岭以及内蒙古自治区等地。桦褐孔菌是一种珍贵的药用真菌，东欧及俄罗斯地区民间很早就广泛利用桦褐孔菌来治疗如糖尿病、心脏病及各种癌症。随着人们对桦褐孔菌药理及生理生化研究的深入，发现桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、调节血糖、血脂、血压、胃肠道机能和提高机体免疫功能等多方面的活性，是一个不可多得的天然药食两用真菌。

桦褐孔菌突出的药理及保健活性功效引起了科研工作者的广泛关注，并对桦褐孔菌的生物学特性、栽培方法、桦褐孔菌的化学成份及其药理作用，桦褐孔菌多糖的抗肿瘤活性、桦褐孔菌深层发酵、及其菌丝体的活性成份与野生菌丝体组成变化情况都进行了广泛深入的研究，科研人员根据桦褐孔菌的多种药理作用及功效，已开发出食品、保健饮料、茶剂、桦褐孔菌精粉等产品。在俄罗斯、芬兰的民间，人们使用桦褐孔菌作为抗癌药物、滋补剂、血液清洁剂和疼痛缓解剂，直到今天，一种被称为“befungin”的褐色液体仍在使用。然而由于野生桦褐孔菌子实体稀少，人工栽培不成熟，野生的桦褐孔菌只有在活的桦树上生长10-15年才具有很好的药用价值，价格十分昂贵，因此，美国、日本、韩国已加大了对桦褐孔菌的研究力度，我国对桦褐孔菌的研究相对还比较薄弱，主要集中在三萜类化学成份的研究上。

桦褐孔菌的菌种是我们研究开发桦褐孔菌最基础也是最重要的物质条件，由于桦褐孔菌种自身的生物学特性，菌丝在生长过程中极易产生粉状孢子，并很快老化，尤其是高温培养时极易产生粉孢子，进而引起老化发黄和菌种退化，对我们研究桦褐孔菌会产生很大的困扰。为了能给桦褐孔菌的科学研究提供活性强，生长旺盛，品质及遗传特性稳定的优良原始菌种，我们不能再使用常规的如琼脂菌种保藏方法、木屑菌种保藏方法等。因为这些常规的菌种保藏方法只能在短期内保持菌种的活性，无法长时间保持菌种活性及遗传物质不发生变异。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法。所述方法为采用超低温-80℃冰箱保藏桦褐孔菌菌种，实验表明-80℃超低温冰箱保藏的桦褐孔菌菌种重新复活后菌种活性及其生物学特性仍然保持着保藏前的初始状态。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，所述方法为采用固液菌种转换技术超低温保藏桦褐孔菌菌种。

本发明提供了一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

步骤1准备固体菌种：在固体菌种培养基接上桦褐孔菌琼脂培养基的菌种，培养至长满菌丝后备用；

步骤2固液菌种转换：在超净工作台上用接种针取出步骤1中所制备的菌种中的前部1cm长段弃之不用，然后再取出1cm后面的菌种约1cm长度，放入事先灭菌的玻璃珠及纯净水的离心管中；混匀仪上振荡混合至悬浮在水中的菌丝片段是理想的菌丝状态；

步骤3冻存管内加注步骤2制备的桦褐孔菌菌种：先摇晃离心管，使沉底的菌丝片段悬浮在无菌水中，从离心管中取900μL桦褐孔菌液体菌种迅速注入含有保存液且已灭菌的冻存管内，并密封盖子后放回到冻存盒中；

步骤4步骤3中制备的冻存管混匀：步骤3中冻存管在放入超低温冰箱前需要用混匀仪振荡，摇匀里面的菌种和保护剂，使菌种和保护剂充分混匀，以使保护剂起到最佳的保护效果；

步骤5准备程序降温盒：程序降温盒在装冻存管进入超低温冰箱前，要提前从冰箱中取出，放在室温下使内部的冻存液温度下降到25℃左右；

步骤6-80℃超低温冰箱冻存：冻存管在装入程序降温盒前要先贴上标签，注明菌种名称、保护剂名称、保护剂浓度、存入日期等内容；菌种贴标后就可放入程序降温盒，然后把程序降温盒放入-80℃超低温冰箱中冷冻保存；

步骤7转入冻存盒-80℃长期保藏：经过24h的-80℃超低温冷冻，此时程序降温盒内的菌种温度已经达到-80℃；此时需要把程序降温盒中的冻存管取出插入冻存盒内，冻存盒上也要贴上标签，注明盒序号、存入菌种名称、数量、时间等信息；冻存盒放入-80℃超低温冰箱中长期保存。

进一步地，步骤1中所述固体菌种培养的组方如下：麦粒85%，桦木屑14%，石灰0.5%，石膏0.5%。

进一步地，步骤1中所述培养条件为：接种琼脂培养基上桦褐孔菌菌种至固体培养基中，20℃恒温箱培养30d备用。

进一步地，步骤2中所述玻璃珠的直径为3.5-6.5mm，所述纯净水25-28mL。

进一步地，步骤2中所述理想的菌丝状态为混合振荡至麦粒表面光滑、附着在麦粒上的木屑和菌丝掉落到无菌水中，并且由大块菌丝变成小块菌丝，甚至是菌丝片段。

进一步地，步骤3中所述冻存管中含有10%的二甲基亚砜保护剂。

本发明还提供了一种按照上述所述的保藏方法保藏的桦褐孔菌株复活方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤1快速解冻：从冰箱中取出按照所述的保藏方法保藏的桦褐孔菌株后，迅速解冻；

步骤2涂琼脂平皿：步骤1中解冻后的冻存管菌种要立刻进行涂平板，用微量取液器取出低温保藏的液体菌涂平皿；

步骤3恒温培养：平板接种完液体菌种后，要用封口膜把平皿包好，注明菌种名称及培养开始日期，倒置放入20℃生化培养箱中恒温培养。

进一步地，所述步骤1中迅速解冻的时间要在40-50s内，才能保护菌种的细胞不受低温损害。

与现有技术相比本发明的有益效果。

（1）直接使用麦粒木屑菌种作为菌种保藏的主体。通常超低温保藏菌种都是使用液体菌种作为菌种保藏的主体，这类菌种往往液体菌种比较容易得到，且液体菌种长势旺盛，活性较强。而对于另外一类菌其固体菌种活力较强，生长比较旺盛，液体菌种相对较弱，因此对于这类菌株使用固体菌种作为菌种保藏的主体就能较好地保持该菌株遗传性状的稳定。由于固体菌种无法直接进行菌种的超低温保藏，需要将其转换成液体菌种状态才能进行超低温保藏。因此本发明采用了固液菌种转换技术，将固体菌种放入装有玻璃珠的无菌水中，在混匀仪上振荡，让高速旋转的玻璃珠击碎固体菌种，使掉落的菌丝体碎片和片段悬浮在无菌水中，完成菌种的固液转换。

（2）冻存管内提前装入保护剂灭菌。常规制作冻存管时，是先把冻存管、保护剂单独灭菌，然后在超净工作台上用微量取液器先取900μL菌种放入冻存管中，再取900μL保护剂放入冻存管中。这种操作增加了冻存管开口暴露的时间，也就增加了被污染的机会。本发明是在冻存管灭菌前就提前加注保护剂，让保护剂和冻存管一起灭菌。然后在超净台内只需向冻存管中加注一次液体菌种，减少了冻存管50%开口暴露的时间，也就大大降低了被污染的风险。

（3）使用混匀仪振荡10s后再进行超低温冷冻。在把冻存管放入超低温冰箱冷冻之前，本发明使用DRAGONLAB MX-S型混匀仪对冻存管进行振荡10s是为了让保护剂和液体菌种充分混合均匀，避免分层，更好地起到保护菌种的作用。

附图说明

图1桦褐孔菌固体菌种。

图2桦褐孔菌固液菌种转换。其中，A为固体菌种接种到离心管中；B为混匀仪上振荡至麦粒表面光滑状态。

图3桦褐孔菌形成菌丝片段悬浮液。

图4冻存管制备。

图5保护剂与菌种混合液。

图6桦褐孔菌冻存。其中，A为程序降温盒；B为冻存管放入程序降温盒；C为程序降温盒中的冻存管转入冻存盒长期保存。

图7-80℃超低温冰箱保藏菌种菌种复活结果。

图8采用常规液体菌种为载体-80℃超低温保藏桦褐孔菌。其中，A为常规桦褐孔菌液体摇瓶菌种；B为常规桦褐孔菌冻存管制备。

图9采用常规液体菌种为载体-80℃超低温保藏桦褐孔菌菌种复活结果。

图10直径为3.5-6.5mm的玻璃珠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1采用本发明方法-80℃超低温保藏桦褐孔菌菌种。

步骤1：准备固体菌种（如图1）。

该固体菌种为麦粒加木屑制成培养基，接上桦褐孔菌琼脂培养基的菌种，长满菌丝后备用。这种固体菌种在麦粒及木屑上长有大量的桦褐孔菌菌丝，麦粒能为菌丝提供充足的氮源及其它微量元素及维生素等营养物质，木屑是桦褐孔菌原始生态环境中的营养物质，能给菌丝提供大量、充足的木质素和纤维素，为桦褐孔菌菌丝的生长提供均衡的营养物质。因此这种培养基中长出的菌丝洁白、粗壮、活力旺盛，适合用来作为菌种保藏。

固体菌种培养基配方：麦粒85%，桦木屑14%，石灰0.5%，石膏0.5%，接种桦褐孔菌菌种，20℃恒温箱培养30d备用。

步骤2：固液菌种转换（图2和图3）。

2.1纯固态菌种无法使用-80℃超低温冰箱保存，因此需要将固态的麦粒木屑菌种转换成液态菌种。超净工作台上用接种针取出步骤1中所制备的菌种中的前部1cm长段弃之不用，然后再取出1cm后面的菌种约1cm长度，放入事先灭菌的28粒玻璃珠及25-28mL纯净水的离心管中，本发明使用的是直径为3.5~6.5mm的玻璃珠（图10），离心管内玻璃珠占5mL体积，液体正好占20mL体积（图2A）。

2.2将上述离心管在混匀上振荡混合，振荡至麦粒表面光滑、附着在麦粒上的木屑和菌丝掉落到无菌水中，并且由大块菌丝变成小块菌丝，甚至是菌丝片段为标准（图2B）。形成菌丝片段悬浮液，完成菌种的固液转换。

步骤3：制备冻存管（图4）。

3.1配制浓度为10%的二甲基亚砜：在室温环境条件下，50mL溶量瓶中先加入5mL二甲基亚砜，再用蒸馏水定溶至50mL，配制好的保护剂放入250mL三角瓶中用聚丙烯塑料布封口保存。

3.2使用2mL规格的冻存管作为菌种保藏的容器，用微量取液器取900μL的10%二甲基亚砜注入到冻存管中，冻存管全部插入冻存盒中，用报纸包好后在121℃高压灭菌器里灭菌25min，取出冷却后备用。

步骤4：冻存管内加注步骤2制备的桦褐孔菌菌种。

4.1把事先灭菌的冻存盒、枪头盒、装有液体桦褐孔菌菌种的离心管、微量取液器架提前放入超净工作台内，打开紫外灯消毒30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台风机（高档）吹15min后开始加注液体菌种操作。

4.2先摇晃离心管，使沉底的菌丝片段悬浮在无菌水中，从离心管中取900μL桦褐孔菌液体菌种迅速注入冻存管内，并密封盖子后放回到冻存盒中。如此反复操作，一个冻存盒中可存入100个冻存管。

步骤5：冻存管混匀（图5）。

冻存管在进入超低温冰箱前需要用混匀仪振荡，摇匀里面的菌种和保护剂，使菌种和保护剂充分混匀，以使保护剂起到最佳的保护效果。

步骤6：准备程序降温盒（图6A）。

程序降温盒在装冻存管进入超低温冰箱前，要提前从冰箱中取出，放在室温下使内部的冻存液温度下降到室温。程序降温盒在使用前必须保证其冻存液在室温状态。

步骤7：-80℃超低温冰箱冻存（图6B）。

冻存管在装入程序降温盒前要先贴上标签，注明菌种名称、保护剂名称、保护剂浓度、存入日期等内容。菌种贴标后就可放入程序降温盒，然后把程序降温盒放入-80℃超低温冰箱中冷冻保存。

步骤8：转入冻存盒-80℃长期保藏（图6C）。

经过24h的-80℃超低温冷冻，此时程序降温盒内的菌种温度已经达到-80℃。此时需要把程序降温盒中的冻存管取出插入冻存盒内，冻存盒上也要贴上标签，注明盒序号、存入菌种名称、数量、时间等信息，冻存盒放入-80℃超低温冰箱中长期保存。

实施例2本发明-80℃超低温冰箱保藏菌种复活试验。

1.快速解冻。

-80℃超低温冷冻保藏菌种从冰箱中取出后要在40-50s内迅速解冻才能保护菌种的细胞不受低温损害。

2.缓慢解冻。

冻存管从-80℃冰箱取出后置室内自然解冻，融化成液体。

3.涂琼脂平皿。

两种解冻后的冻存管菌种要立刻进行涂平板，用微量取液器取出低温保藏的液体菌涂平皿，一个冻存管可接种3-4个平板，用三角爬刮均匀琼脂培养基表面的液体菌种，两种解冻方式的菌种各设置4个重复。

4.恒温培养。

平板接种完液体菌种后，要用封口膜把平皿包好，注明菌种名称及培养开始日期，倒置放入20℃生化培养箱中恒温培养。

5. 实验结果：（如图7所示）72h后快速解冻的菌种开始萌发，25d后菌种长满平板。缓慢解冻的平皿内菌种经过168h仍没有萌发，168h后转接平皿，20℃96h。

对比例：采用常规液体菌种为载体-80℃超低温保藏桦褐孔菌菌种验证试验。

1.准备液体摇瓶菌种（图8A）。

1.1液体配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨1.5克，黄豆粉1克，硫酸钙1.5克,硫酸镁1.5克，磷酸二氢钾3克。

1.2接种量：500mL三角瓶装液量200mL，每个三角瓶接种2块0.5cm²的平皿固体菌种。

1.3培养条件:设置摇床内温度为30℃，转速为170rpm，暗光振荡培养。

1.4实验结果：培养189h，菌液黄棕色澄清，菌球白色絮状，高粮米粒大小，数量极大，液体有香甜气味。PH值3.53。

2.冻存管制备（图8B）。

本实验制备过程与实施例1步骤3的3.1-3.2相同，不再赘述。加注菌种的时候本实验加注的是900μL液体摇瓶菌种。

3.使用液体菌种制备完成的冻存管经过振荡混匀后就可以装入事先准备好的程序降温盒置入-80℃超低温冰箱中冻存。

4.步骤3中液体摇瓶菌种复活试验。

4.1快速解冻

-80℃超低温冷冻保藏菌种从冰箱中取出后要在40-50s内快速解冻。

4.2涂平皿培养

解冻后的冻存管菌种要立刻进行涂平板，用微量取液器取出低温保藏的液体菌，一个冻存管可接种3-4个平皿，用三角爬刮均匀琼脂培养基表面的液体菌种，设置4个重复，置入20℃恒温箱中培养。

4.3恒温培养。

平板接种完液体菌种后，要用封口膜把平皿包好，注明菌种名称及培养开始日期，倒置放入20℃生化培养箱中恒温培养。

5. 实验结果：20℃培养168h后观察，未见菌种萌发（图9）。

综上，通过本实验以液体摇瓶菌种作为超低温保藏菌种的主体进行-80℃超低温保藏桦褐孔菌，经过快速解冻复活，在20℃恒温箱里培养168h后仍未见萌发，证明此方法是不可行的。因此只有按照本发明的方法，使用固液转换技术把固体麦粒木屑菌种转换成菌种悬浮液后再进行超低温保存，复活后的菌种在20℃恒温培养72h萌发，转接一次后菌种萌发十分强壮，经过18d培养即可长满90mm平皿。

Claims (5)

1.一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

步骤1，准备固体菌种：接种琼脂培养基上桦褐孔菌菌种至固体培养基中，培养至长满菌丝后备用；所述的固体培养基包括麦粒和桦木屑；

步骤2，固液菌种转换：在超净工作台上用接种针取出步骤1中所制备的菌种中的前部1cm长段弃之不用，然后再取出1cm后面的菌种约1cm长度，放入事先灭菌的玻璃珠及纯净水的离心管中；混匀仪上振荡混合至悬浮在水中的菌丝片段是理想的菌丝状态；所述理想的菌丝状态为混合振荡至麦粒表面光滑、附着在麦粒上的木屑和菌丝掉落到无菌水中，并且由大块菌丝变成小块菌丝，甚至是菌丝片段；

步骤3，冻存管内加注步骤2制备的桦褐孔菌菌种：先摇晃离心管，使沉底的菌丝片段悬浮在无菌水中，从离心管中取900μL桦褐孔菌液体菌种迅速注入含有保存液且已灭菌的冻存管内，并密封盖子后放回到冻存盒中；

步骤4，步骤3中制备的冻存管混匀：步骤3中冻存管在放入超低温冰箱前需要用混匀仪振荡，摇匀里面的菌种和保护剂，使菌种和保护剂充分混匀，以使保护剂起到最佳的保护效果；

步骤5，准备程序降温盒：程序降温盒在装冻存管进入超低温冰箱前，要提前从冰箱中取出，放在室温下使内部的冻存液温度下降到25℃左右；

步骤6，-80℃超低温冰箱冻存：冻存管在装入程序降温盒前要先贴上标签，注明菌种名称、保护剂名称、保护剂浓度、存入日期等内容；菌种贴标后就可放入程序降温盒，然后把程序降温盒放入-80℃超低温冰箱中冷冻保存；

步骤7，转入冻存盒-80℃长期保藏：经过24h的-80℃超低温冷冻，此时程序降温盒内的菌种温度已经达到-80℃；此时需要把程序降温盒中的冻存管取出插入冻存盒内，冻存盒上也要贴上标签，注明盒序号、存入菌种名称、数量、时间等信息；冻存盒放入-80℃超低温冰箱中长期保存。

2.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，步骤1中所述固体菌种培养基的组成如下：麦粒85%，桦木屑14%，石灰0.5%，石膏0.5%。

3.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，步骤1中所述培养条件为：接种琼脂培养基上桦褐孔菌菌种至固体培养基中，20℃恒温箱培养30d备用。

4.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，步骤2中所述玻璃珠的直径为3.5~6.5mm，所述纯净水25~28mL。

5.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，步骤3中所述冻存管中含有10%的二甲基亚砜保护剂。