CN114456966B - 用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。所述的芽孢杆菌菌剂包括枯草芽孢杆菌ZR‑2，其保藏编号为CGMCC NO.21124；和，解淀粉芽孢杆菌ZR‑3，其保藏编号为CGMCC NO.21123。本发明中的芽孢杆菌菌剂可用于防治黄瓜枯萎病，能够防治黄瓜病害，同时，还可以促进黄瓜种子萌发和幼苗生长，有利于黄瓜增产增收。

Description

用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
黄瓜枯萎病是黄瓜生产上的重要病害之一，是典型的土传病害，全国各地均有发生，吉林、辽宁、山东、湖北、北京等省市发生尤为严重，发病率一般在10％～30％，严重时可达80％～90％，是制约黄瓜产量和品质的重要因素。近年来，随着张家口地区大棚蔬菜的迅速发展，复种指数增加，黄瓜枯萎病发生越发严重，给黄瓜生产造成极大的损失。黄瓜枯萎病菌从植株根部的伤口或根尖侵入，在维管束内生长发育，堵塞导管，阻碍水分和无机盐的运输，分泌毒素引起植株萎蔫死亡，病情发展迅速，而且呈逐年加重趋势，化学防治会形成二次污染，会对人身体健康造成不良影响，因此筛选生防菌剂对有效防控黄瓜枯萎病具有重要意义。
CN 104560837A中提到了一种解淀粉芽孢杆菌，并提到其可与其他具有抑菌作用的芽孢杆菌、霉菌等组合成复合微生物制剂，对白粉病、灰霉病、褐斑病、果腐病等植物病害的防治效率达到85％-90％。但其并未提供对黄瓜枯萎病的防治试验及效果数据，而黄瓜枯萎病与其所验证的植物病害的致病机理存在实质差异。而CN 101531971A中提到了一种枯草芽孢杆菌M-2菌株，其是分离于海洋红树植物的根际促生菌，能够抑制黄瓜枯萎病病菌、番茄根腐病病菌、大豆根腐病病菌等多种有害真菌的生长。但其并未提到对黄瓜种子萌发和幼苗生长的作用，尤其是并未提到对黄瓜种子萌发所具有的作用。
发明内容
针对上述不足，本发明从305个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种，最终筛选出的菌种为枯草芽孢杆菌ZR-2(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌ZR-3(Bacillus amyloliquefaciens)。并基于上述发现，提供了用于防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。
具体而言，本发明首先提供枯草芽孢杆菌ZR-2，其保藏编号为CGMCC NO.21124，分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏时间是2020年11月06日。同时提供解淀粉芽孢杆菌ZR-3，其保藏编号为CGMCC NO.21123，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏时间是2020年11月06日。两株菌株的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编为100101。
本发明进一步提供一种芽孢杆菌菌剂，包括：
枯草芽孢杆菌ZR-2，其保藏编号为CGMCC NO.21124；和，
解淀粉芽孢杆菌ZR-3，其保藏编号为CGMCC NO.21123。
为了更有利于二者的协同效果，作为优选，所述芽孢杆菌菌剂包括：
枯草芽孢杆菌ZR-2 1.5×108-2.0×1010cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 3.5×108-2.0×1010cfu/mL；
总菌数为2×1010-4×1010cfu/mL。
更优选地，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：
枯草芽孢杆菌ZR-2 7.5×109-1.0×1010cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 2.5×109-0.5×1010cfu/mL；
总菌数为1.0×1010-1.5×1010cfu/mL。
进一步优选地，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：
枯草芽孢杆菌ZR-2 8.0×109～9.0×109cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 2.6×109～3.0×109cfu/mL；
总菌数为1.0×1010～1.2×1010cfu/mL。
本发明进一步提供所述的芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括：
将枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3进行高密度混合发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。
本发明发现，通过上述的制备方法，进一步有利于发挥枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3的协同效果。
作为优选，在所述高密度混合发酵培养中所使用的液体培养基为如下质量百分比的组分：
玉米糖浆粉10-20％、豆饼粉4-8％、蛋白胨1-5％、磷酸氢二钾0.8-1.2‰，余量为水。
作为优选，所述的高密度混合发酵培养可以采用补料分批培养(FBC)方式，其中补料碳源为：葡萄糖、糖蜜、玉米糖浆粉中的一种或两种以上；氮源为：豆饼粉和/或蛋白胨。
作为优选，所述高密度混合发酵培养的过程中需要分阶段调控溶解氧、搅拌转速和温度。具体地说，混合发酵培养为有氧培养：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件下发酵，通气量1：0.8～1.5，调控发酵溶解氧10％～20％。搅拌转速100～200r/min，搅拌间隔时间1～2小时，搅拌1-3分钟，更优选为2分钟。温度为25℃～35℃。
作为优选，在进行所述高密度混合发酵培养前，先将枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3分别进行如下培养：
1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，25℃-35℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，25℃-35℃条件下，摇床培养1-2天，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-10％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，25℃-35℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2.0，培养1-2天，制得二级种子；
优选在进行高密度混合发酵培养时，按液体培养基的体积比为5-10％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中。
作为优选，在步骤2)中，摇床培养的转速为100-200r/min，在OD600值为3.0-4.0时停止培养。
作为优选，在步骤1)中所述固体培养基为LB培养基；在步骤2)、步骤3)中所用的液体培养基LB培养基。
作为优选，在步骤3)中，通气量为1：1.0～1.5。
本领域人员可对上述优选方案进行组合，得到本发明的较佳实施例。
作为本发明的优选方案，所述芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，25℃～35℃条件下，培养1～3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，25℃～35℃条件下，100-200r/min摇床培养1～2天，单菌种液体培养OD600值3.0～4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-10％的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，25℃～35℃条件下，搅拌速度为100～200r/min，通气量为1：0.8～2.0，培养2～3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5％～10％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。
本发明进一步提供所述的枯草芽孢杆菌ZR-2、或所述的解淀粉芽孢杆菌ZR-3、或所述的芽孢杆菌菌剂在以下任一方面的应用：
(1)防治黄瓜枯萎病；
(2)促进黄瓜种子萌发；
(3)促进黄瓜幼苗生长。
基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明中的芽孢杆菌菌剂可用于防治黄瓜枯萎病，能够防治黄瓜病害，同时，还可以促进黄瓜种子萌发和幼苗生长，有利于黄瓜增产增收。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
芽孢杆菌菌剂的构成：
总菌数为 1.06×1010cfu/mL；
枯草芽孢杆菌ZR-2 8.0×109cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 2.6×109cfu/mL。
上述芽孢杆菌菌剂的制备方法如下：
1).斜面培养：枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，35℃条件下培养1天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3在35℃条件下150r/min摇床培养24h，待各菌悬液光密度OD600值均达到3.0时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到300L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为180L，35℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1：1，培养36h天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为600L，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。
其中，步骤1)中所用的固体培养基为LB培养基：具体培养基配方为：10g L-1蛋白胨，5g L-1酵母浸出汁，10g L-1NaCl，15g L-1琼脂粉。
步骤2)、步骤3)中所用的液体培养基为LB培养基：具体培养基配方为：10g L-1蛋白胨，5g L-1酵母浸出汁，10g L-1NaCl。
其中，步骤4)所用的液体培养基的配方按质量百分比为：玉米糖浆粉15％、豆饼粉4.0％、蛋白胨2％、磷酸氢二钾1.0‰，余量为水；
步骤4)中，高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、糖蜜、玉米糖浆粉；氮源为：豆饼粉、蛋白胨。
步骤4)中，混合发酵培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.5，调控发酵溶解氧20％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。
实施例2
芽孢杆菌菌剂的构成：
总菌数为 1.2×1010cfu/mL；
枯草芽孢杆菌ZR-2 9.0×109cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 3.0×109cfu/mL；
上述芽孢杆菌菌剂的制备方法如下：
1).斜面培养：枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，35℃条件下培养1天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3在35℃条件下200r/min摇床培养1天，待各菌悬液光密度OD600值均达到4.0时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到300L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为180L，35℃条件下，搅拌速度为100r/min，通气量为1：1.5，培养2天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为600L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基均与实施例1中相应的培养基配方相同。
其中，步骤4)所用的液体培养基的配方按质量百分比为：玉米糖浆粉10％、豆饼粉5.0％、蛋白胨2.5％、磷酸氢二钾1.2‰，余量为水；
高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、糖蜜、玉米糖浆粉；氮源为：豆饼粉、蛋白胨。
发酵培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。
实施例3对黄瓜种子萌发的影响
供试黄瓜品种：津艺1号
方法：选取籽粒饱满的供试作物种子，用浓度15％的H2O2溶液进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次。分别取一定数量的黄瓜种子放入实施例1得到的稀释107cfu mL-1芽孢杆菌菌剂中浸种6h，取灭菌的培养皿，在底部铺一层脱脂棉，在上面均匀放置20粒作物种子，再覆盖一层脱脂棉，向其中滴加清水将脱脂棉全部浸湿，置于25℃条件下暗培养，以在清水中浸种的作物种子为对照，待对照中作物种子露白后48h分别统计各处理中种子的发芽率并测定胚根长。每个处理设3个重复。结果见表1。
表1芽孢杆菌菌剂对黄瓜种子萌发的影响效果
结果显示，芽孢杆菌菌剂对津艺1号黄瓜种子的萌发具有一定的促进作用，效果明显好于对照例。
实施例4对黄瓜幼苗的生长影响
选取籽粒饱满的黄瓜种子，用浓度为15％的H2O2溶液进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，置于25℃条件下催芽。用浅盘(长×宽×高＝33cm×24cm×4.5cm)装好事先灭菌的营养土，加入稀释浓度为107cfu mL-1的实施例1芽孢杆菌菌剂并混匀，以加清水为对照，加入的细菌发酵液或清水的量以按压营养土可结块但无多余水分为准，将已发芽的供试黄瓜种子分别播种，30粒，分为3组，待对照出苗后统计出苗率并移栽至营养钵中，待作物生长至3叶期测量作物幼苗的根长、地上株高。结果见表2。
表2芽孢杆菌菌剂对黄瓜幼苗的生长情况
结果显示，芽孢杆菌菌剂对黄瓜幼苗具有较为明显的促生作用。
实施例5
自然土壤灭菌备用，按1∶60的质量比向土壤中加入稀释浓度为107cfu mL-1的实施例1芽孢杆菌菌剂，以加清水为对照，混合均匀后分装于塑料盒(长×宽×高＝20cm×15cm×10cm)中并保持适宜的湿度，每个菌剂处理播种5盒并分为两组。将经过催芽的黄瓜种子播种15粒。将黄瓜枯萎病的致病菌在PDA培养液中扩大培养96h，制成浓度为106cfu mL-1的孢子悬浮液，待作物幼苗生长至3叶期，采用浸根法：将经消毒催芽后的种子播于装有灭菌珍珠岩50孔穴盘中，子叶展平期拔出幼苗，用水洗净根部，在1×106孢子/mL的接种液中浸5s，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(6.5cm×6.5cm)中，在25℃中培养，再接种病原菌。待对照发病且病情稳定后，观察并记录各处理中作物的发病情况，依照病害严重度分级标准，根据公式1和公式2计算病情指数和防病效果(周红梅，2010)。
黄瓜枯萎病严重度分级标准(武玉环，2014)：
0级：植株健康，无症状；
1级：茎叶出现轻微症状；
2级：植株轻度枯萎，茎出现坏死斑，叶片黄化；
3级：植株焦中度枯萎，叶片下垂黄瓜；
4级：植株严重枯萎，倒伏枯死。
公式1为：病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(调查总叶数×4)×100％。
公式2为：防治效果(％)＝(对照平均病情指数－处理平均病情指数)/对照平均病情指数×100％。
结果见表3。
表3芽孢杆菌菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果
结果显示，芽孢杆菌菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果明显优于对照例。
此外，本发明还对实施例2的使用效果进行了检测，其与实施例1的使用效果相当。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (14)

1.一种防治黄瓜枯萎病的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，包括：
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZR-2，其保藏编号为CGMCC NO. 21124；和，
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZR-3，其保藏编号为CGMCC NO.21123。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，包括：
枯草芽孢杆菌ZR-2 1.5×108-2.0×1010cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 3.5×108-2.0×1010cfu/mL；
总菌数为2×1010-4×1010cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，由如下组分组成：
枯草芽孢杆菌ZR-2 7.5×109-1.0×1010cfu/mL；
解淀粉芽孢杆菌ZR-3 2.5×109-0.5×1010cfu/mL；
总菌数为1.0×1010-1.5×1010cfu/mL。
4.权利要求1~3中任一项所述的芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
将枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3进行高密度混合发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述高密度混合发酵培养中所使用的液体培养基为如下质量百分比的组分：
玉米糖浆粉10-20%、豆饼粉4-8%、蛋白胨1-5%、磷酸氢二钾0.8-1.2‰，余量为水。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述高密度混合发酵培养中，在起始0-24小时内，进行间隔通气，保持在有氧条件下发酵，通气量1：0.8-1.5，控制发酵溶解氧为10-20%；搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间1-2小时，搅拌1-3分钟；温度为25-35℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述高密度混合发酵培养中，在起始0-24小时内，进行间隔通气，保持在有氧条件下发酵，通气量1：0.8-1.5，控制发酵溶解氧为10-20%；搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间1-2小时，搅拌1-3分钟；温度为25-35℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在进行所述高密度混合发酵培养前，先将枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3分别进行如下培养：
1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，25℃-35℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，25℃-35℃条件下，摇床培养1-2天，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-10%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，25℃-35℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2.0，培养1-2天，制得二级种子。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，在进行所述高密度混合发酵培养前，先将枯草芽孢杆菌ZR-2和解淀粉芽孢杆菌ZR-3分别进行如下培养：
1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌ZR-2、解淀粉芽孢杆菌ZR-3两种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，25℃-35℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，25℃-35℃条件下，摇床培养1-2天，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-10%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，25℃-35℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2.0，培养1-2天，制得二级种子。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在进行高密度混合发酵培养时，按液体培养基的体积比为5-10%的接种量，将二级种子接种于发酵罐中。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在进行高密度混合发酵培养时，按液体培养基的体积比为5-10%的接种量，将二级种子接种于发酵罐中。
12.根据权利要求8、10或11所述的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，摇床培养的转速为100-200 r/min，在OD600值为3.0-4.0时停止培养；
和/或，在步骤1)中所述固体培养基为LB培养基；在步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为LB培养基。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，摇床培养的转速为100-200 r/min，在OD600值为3.0-4.0时停止培养；
和/或，在步骤1)中所述固体培养基为LB培养基；在步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为LB培养基。
14.权利要求1~3中任一项所述的芽孢杆菌菌剂在以下任一方面的应用：
（1）防治黄瓜枯萎病；
（2）促进黄瓜种子萌发；
（3）促进黄瓜幼苗生长。
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