CN110367057B - 一种纯化向日葵列当生理小种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种纯化向日葵列当生理小种的方法，该方法简单易行、操作方便、准确性高。可用于收集不同生理小种的列当种子，有助于提高抗列当基因转育效率，进一步研究各个生理小种毒性的衍变规律，对国内学术界与国际的接轨起到连接作用，因此列当各个级别生理小种的纯化就显得至关重要。

Description

一种纯化向日葵列当生理小种的方法

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种纯化向日葵列当生理小种的方法。

背景技术

向日葵列当(Orobanche cumana Wallr)是列当科(Orobanchaceae)列当属(Orobanche)的全寄生草本植物，寄主专化性很强，扩展蔓延速度很快。列当在我国的新疆、甘肃、内蒙古、陕西、东三省均有分布，被列为入境植物检疫对象。由于列当种内变异使抗列当品种很快失去抗性，必需不断加强向日葵列当生理小种的鉴定与抗性育种。因此，收集不同生理小种的纯样具有重要意义。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种纯化向日葵列当生理小种的方法，以收集不同生理小种的纯样，以便于了解向日葵列当的分布及衍变规律。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种纯化向日葵列当生理小种的方法，包括以下步骤：

步骤一、收集成熟单株向日葵列当植株，干燥后压碎过筛，收集筛余物，并记录筛余物中列当种子的质量比；

步骤二、将步骤一收集的列当种子分单株存放于容器中，之后向日葵种子进行浸种催芽；

步骤三、将浸种催芽后的向日葵种子移栽到基质中，当向日葵幼苗长至4片真叶时，移栽至培养土中；

步骤四、将明确生理小种的列当种子扩繁，待列当种子成熟后，单株套袋收种；

步骤五、将收集的明确生理小种的列当种子重新接种到低一级别的鉴定品系上，此时收到的列当种子即为纯化的列当生理小种。

进一步地，步骤一中用孔径为0.25mm的筛网过滤。

进一步地，步骤二中存放于容器后，保存在温度为4℃、湿度30％的环境中。

进一步地，步骤二中的浸种催芽包括将种子置于并覆盖潮湿的纸巾于托盘上，并在托盘上覆盖一层黑色塑料袋存放于培养箱中。

进一步地，将托盘存储于25℃下，每天检查生长情况并添加水分。

进一步地，托盘存储于25℃下48-72h后，将葵花壳以及种子上的种皮分离以利移栽后生长。

进一步地，所述基质的制备方法包括将要接种的列当种子与土壤搅拌均匀，之后压实即可。

进一步地，所述培养土的原料包括营养土、蛭石和沙子，且三者的质量比为2:1:1。

进一步地，移栽到培养土后的环境条件为温度20-28℃、相对湿度约40％、光照强度1000Lux，光照长度14h/d。

本发明实施例具有如下优点：本发明实施例提供一种纯化向日葵列当生理小种的方法，该方法简单易行、操作方便、准确性高。可用于收集不同生理小种的列当种子，有助于提高抗列当基因转育效率，进一步研究各个生理小种毒性的衍变规律，对国内学术界与国际的接轨启到连接作用，因此列当各个级别生理小种的纯化就显得至关重要。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例1提供的一种纯化向日葵列当生理小种的方法中接种时的照片；

图2为本发明实施例1提供的浸种催芽照片；

图3为本发明实施例1提供的移栽到生长培养土中照片之一；

图4为本发明实施例1提供的移栽到生长培养土中照片之二；

图5为本发明实施例1提供的不同鉴定系中收集的各生理小种的列当种子。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种纯化向日葵列当生理小种的方法，包括以下步骤：

步骤一、收集成熟单株向日葵列当植株，干燥后压碎过筛，收集筛余物，并记录筛余物中列当种子的质量比；

步骤二、将步骤一收集的列当种子分单株存放于容器中，之后向日葵种子进行浸种催芽；

步骤三、将浸种催芽后的向日葵种子移栽到基质中，当向日葵幼苗长至4片真叶时，移栽至培养土中；

步骤四、将明确生理小种的列当种子扩繁，待列当种子成熟后，单株套袋收种；

步骤五、将收集的明确生理小种的列当种子重新接种到低一级别的鉴定品系上，此时收到的列当种子即为纯化的列当生理小种。

优选的，步骤一中用孔径为0.25mm的筛网过滤。

优选的，步骤二中存放于容器后，保存在温度为4℃、湿度30％的环境中。

优选的，步骤二中的浸种催芽包括将种子置于并覆盖潮湿的纸巾于托盘上，并在托盘上覆盖一层黑色塑料袋存放于培养箱中。

优选的，将托盘存储于25℃下，每天检查生长情况并添加水分。

优选的，托盘存储于25℃下48-72h后，将葵花壳以及种子上的种皮分离以利移栽后生长。

优选的，所述基质的制备方法包括将要接种的列当种子与土壤搅拌均匀，之后压实即可。

优选的，所述培养土的原料包括营养土、蛭石和沙子，且三者的质量比为2:1:1。

优选的，移栽到培养土后的环境条件为温度20-28℃、相对湿度约40％、光照强度1000Lux，光照长度14h/d。

以下结合具体案例对本发明进行详细说明：

一种纯化向日葵列当生理小种的方法，包括以下步骤：

(1)全国向日葵主产区列当种子的采集。

(2)列当种子的筛选，以小型筛网(约0.25mm)将干燥后的列当花压碎，将种子及剩余物过筛。过筛后的种子和剩余物比例需做纪录。每更换一株植株操作时必须更换筛网，并将使用过的筛网以酒精清洗及高温消毒。

(3)将列当种子样本以植株为单位标注并储存于小试管中，存放于温度(4℃)湿度(30％左右)控制的环境。

(4)于一周前先做好准备鉴定系种子的发芽。将种子置于并覆盖潮湿的纸巾于托盘上，并在托盘上覆盖一层黑色塑料袋存放于培养箱中。

(5)将托盘存储于正常温度(25℃)下，每天检查生长情况并视情况添加水分。

(6)48-72h后，将葵花壳以及种子上的种皮小心分离以利移栽后生长，注意不要伤害到生长点。

(7)准备花盆和植物生长所需培养土。

(8)使用小勺子接种列当种子并将土壤及种子轻轻搅匀。(每个鉴定系各5盆)。

(9)将盆中土壤及种子倒入消毒的塑料袋中，封紧后均匀摇晃约五秒钟。

(10)将混合均匀后的土壤小心的倒回盆中并且将其适当压实。

(11)每次更换列当植株时使用酒精将勺子以及桌面消毒。

(12)将预先准备好的种子移栽至盆中，每盆一粒，每个品系种植5盆。播种时用手指于盆中轻压一洞，将葵花种子根部朝下并将周围土壤在覆盖于两侧，露出子叶顶部。

(13)营养土∶蛭石∶沙子按2:1:1的比例配制成培养土；当葵花植株成长至4片真叶时，准备移栽至消毒过的花盆中，每日浇水并观察植株长势。当葵花植株到达R-6生长阶段，开始记录列当发育状况。做好标签，按顺序摆放在光照温室培养(温度20-28℃、相对湿度约40％、光照强度为1000Lux，光照时长14h/d)。植株生长期间适时适量浇水，保持花盆内土壤湿度不要太大。

(14)记录列当生长情况。

(15)依据抗性标准，对结果明确的列当植株进行单株套袋，成熟后收取种子。

(16)因在鉴定系上收取的列当种子量少，需对其进行扩繁，将明确生理小种的列当种子接种到无抗性品系B1117上。

(17)待列当种子成熟后，单株套袋，收取种子。

(18)将收集的明确生理小种的列当种子重新利用完备的鉴定系进行二次鉴定，此时收到的列当种子为纯化后的列当生理小种。

(19)列当生理小种D的纯化：列当种子在S1358未长，在1532长列当。

列当生理小种E的纯化：列当种子在NR5不长列当，在S1358长列当。

列当生理小种F的纯化：列当种子在P96不长列当，在NR5长列当。

列当生理小种G的纯化:列当种子在P96生长。

本发明收集的全国向日葵主产区的列当对获取不同级别的列当生理小种提供了可能。

本发明提供的纯化向日葵列当生理小种的方法，能将收集到的国内列当生理小种用于列当基因图谱的构建以及生物学性状的研究。

表1是发明实例提供的全国向日葵主产区列当采集地区数量(从2012年到2018年)

表2是发明实例提供的向日葵列当鉴定系材料

注：R表示抗列当，S表示感列当；B-G为向日葵列当生理小种级别。

图1展示了本发明接种向日葵列当的方法，该方法具体步骤如下:

(1)将一小勺列当种子与土壤基质轻轻搅匀(每个鉴定系各5盆)。

(2)将盆中土壤基质及种子倒入新塑料袋中，封紧后均匀摇晃约五秒钟。

(3)将混合均匀后的土壤基质小心的倒回盆中并且将其适当压实。

(4)每次更换列当植株时使用酒精将勺子以及桌面消毒。

图2展示了鉴定系材料发芽方法，该方法具体步骤如下述:(参考前面)

(1)于一周前先做好准备鉴定系种子的发芽。将种子置于并覆盖潮湿的纸巾于托盘上，并在托盘上覆盖一层黑色塑料袋存放于培养箱中。

(2)将托盘存储于正常温度(25℃)下，每天检查生长情况并视情况添加水分。

(3)48-72h后，将葵花壳以及种子上的种皮小心分离以利移栽后生长，注意不要伤害到生长点。

(4)准备花盆和植物生长所需培养土。

图3展示了鉴定系材料种植在大花盆的生长情况，该方法具体步骤如下:

(1)营养土∶蛭石∶沙子按2:1:1的比例配制成培养土；当葵花植株成长至4片真叶时，准备移栽至消毒过的花盆中，每日浇水并观察植株长势。当葵花植株到达R-6生长阶段，开始记录列当发育状况。做好标签，按顺序摆放在光照温室培养(温度20-28℃、相对湿度约40％、光照强度为1000Lux，光照时长14h/d)。植株生长期间适时适量浇水，保持花盆内土壤湿度不要太大。

(2)记录列当生长情况。

(3)依据抗性标准，对结果明确的列当植株进行单株套袋，成熟后收取种子。

图4展示了在鉴定系上收集的不同生理小种的列当种子，该方法具体步骤如下:

(1)在鉴定系上收取的列当种子量少，需对其进行扩繁，将明确生理小种的列当种子接种到无抗性品系B1117上。

(2)待列当种子成熟后，单株套袋，收取种子。

(3)将收集的明确生理小种的列当种子利用鉴定系进行二次鉴定核实，此时收到的列当种子为纯化的列当生理小种。

(4)列当生理小种D的纯化：向日葵列当在S1358未长，在1532长列当。

列当生理小种E的纯化：向日葵列当在NR5不长列当，在S1358长列当。

列当生理小种F的纯化：向日葵列当在P96不长列当，在NR5长列当。

列当生理小种G的纯化:向日葵列当在P96长列当。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种纯化向日葵列当生理小种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、收集成熟单株向日葵列当植株，干燥后压碎过筛，收集筛余物，并记录筛余物中列当种子的质量比；

步骤二、将步骤一收集的列当种子分单株存放于容器中，之后向日葵种子进行浸种催芽；

步骤三、将浸种催芽后的向日葵种子移栽到基质中，当向日葵幼苗长至4片真叶时，移栽至培养土中；

步骤四、将明确生理小种的列当种子扩繁，待列当种子成熟后，单株套袋收种；

步骤五、将收集的明确生理小种的列当种子重新接种到低一级别的鉴定品系上，此时收到的列当种子即为纯化的列当生理小种；

步骤一中用孔径为0.25mm的筛网过滤；

步骤二中存放于容器后，保存在温度为4℃、湿度30％的环境中；

步骤二中的浸种催芽包括将种子置于并覆盖潮湿的纸巾于托盘上，并在托盘上覆盖一层黑色塑料袋存放于培养箱中；

将托盘存储于25℃下，每天检查生长情况并添加水分；

托盘存储于25℃下48-72h后，将葵花壳以及种子上的种皮分离以利移栽后生长。

2.根据权利要求1所述纯化向日葵列当生理小种的方法，其特征在于：所述基质的制备方法包括将要接种的列当种子与土壤搅拌均匀，之后压实即可。

3.根据权利要求1所述纯化向日葵列当生理小种的方法，其特征在于：所述培养土的原料包括营养土、蛭石和沙子，且三者的质量比为2:1:1。

4.根据权利要求1所述纯化向日葵列当生理小种的方法，其特征在于：移栽到培养土后的环境条件为温度20-28℃、相对湿度约40％、光照强度1000Lux，光照长度14h/d。

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