CN103834684B - 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法 - Google Patents

一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103834684B
CN103834684B CN201410116096.8A CN201410116096A CN103834684B CN 103834684 B CN103834684 B CN 103834684B CN 201410116096 A CN201410116096 A CN 201410116096A CN 103834684 B CN103834684 B CN 103834684B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
seed
gene
paddy
female sterile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410116096.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103834684A (zh
Inventor
曹孟良
夏玉梅
沈春修
方真
蔡立湘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HUNAN TAOHUAYUAN SEED CO., LTD.
Original Assignee
HUNAN TAOHUAYUAN SEED Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUNAN TAOHUAYUAN SEED Co Ltd filed Critical HUNAN TAOHUAYUAN SEED Co Ltd
Priority to CN201410116096.8A priority Critical patent/CN103834684B/zh
Publication of CN103834684A publication Critical patent/CN103834684A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103834684B publication Critical patent/CN103834684B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/024—Female sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/829—Female sterility

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。本方法中，3个紧密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。这3个表达盒是：1）水稻雌性可育基因表达盒；2）花粉致死基因表达盒；3）荧光筛选标记基因表达盒。杂合转基因水稻在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒败育而不能参与受精；而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实。通过光电分选，获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。这一技术解决了雌性不育水稻繁殖难题，实现了杂交稻机械化制种，特别是混播混收方式的机械化制种。

Description

一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。
背景技术
我国杂交水稻的年种植面积约1600万hm2，种子生产面积约需15万hm2，每年需商品杂交种2.4亿kg左右。我国现行杂交水稻制种技术，自播种至收获主要依靠人工操作。父母本分期播种，多为先播父本，后播母本；父母本箱式分开栽插，母本多行，父本双行；收获时父母本分开收割，或者授粉后成熟前割掉父本。整个制种过程工序繁杂，难以实现机械化，需要足够的劳动力做保证，只适宜在劳动密集型的农村推广应用，大型农场因缺少足够的劳动力而不能制种。而且，由于父本的因素，减少了制种产量。随着城镇化、工业化、农业产业化和农村土地流转政策的逐步实施，农村人口将进一步减少，现行劳动密集型、精耕细作型的制种技术已阻碍了杂交水稻种子生产的发展。因此，杂交水稻机械化制种技术研究迫在眉睫。
已有不少研究者作了各种尝试开展杂交稻机械化制种。有研究者提出用谷壳颜色区别水稻不育系和恢复系种子，具体做法是将正常谷壳色的水稻不育系种子与非正常谷壳色的水稻恢复系种子机械混播，成熟后经机械混收，再用色选机分选，获得杂交种;有研究者提出用飞机将花粉喷施在母本田块里进行制种;也有研究者提出利用父、母本粒型的较大悬殊，用粒选机分选;还有研究者提出用半机械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和收割父本，最后机械收割母本等方法；还有研究者利用水稻对除草剂苯达松的敏感特性进行杂交水稻机械化制种。然而上述多种方法均存在诸多缺陷而不能从根本上实现杂交水稻机械化制种，目前在生产上也未见大规模商业化应用。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法，包括如下步骤：
（1）将水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体；
（2）将步骤（1）所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻，得到杂合的转基因水稻；
（3）将步骤（2）所获得的杂合的转基因水稻或者利用步骤（2）所获得的转基因水稻进行转育而成的杂合转基因，进行自交，通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选，筛选出不具有红色荧光的种子，即为纯合的雌性不育水稻种子，将该纯合的雌性不育水稻种子用于杂交稻机械化制种；筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种子，将该转基因种子继续用于雌性不育水稻的繁殖，即，继续进行杂合不育系自交，然后按前述步骤进行光电分选，选出纯合的雌性不育水稻种子，如此循环。
其中，步骤（1）所述水稻雌性可育基因为野生型PTB1基因或雌性不育水稻sfs1的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfs1的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID NO.1；所示野生型PTB1基因序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤（2）所述雌性不育水稻包括雌性不育水稻sfs1（该不育系已被申请号为201210096970.7的发明专利公开），携带雌性不育基因PTB1（野生型PTB1基因已被申请号为201010194553.7的发明专利公开，所述雌性不育基因PTB1即为野生型PTB1基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的不育基因）的雌性不育水稻；所述雌性不育水稻sfs1的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述野生型PTB1基因序列如SEQ IDNO.2所示。
所述花粉致死基因为ZM-AA1，其序列如SEQ ID NO.5所示；所述花粉致死基因由花粉发育后期特异性启动子PG47驱动，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述荧光筛选标记基因为RP，其序列如SEQ ID NO.8所示；所述荧光筛选标记基由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动，其序列如SEQ ID NO.7所示。所述水稻表达载体为pCAMBIA1300。
雌性不育水稻的繁殖和杂交稻机械化制种中利用了包含3个表达盒的转基因水稻进行转育所获得的水稻材料。
下面结合原理，对本发明作进一步说明：
本发明首先构建了携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒的水稻表达载体。利用水稻转基因技术，将上述表达载体转入雌性不育水稻。
本发明实质上提供了一种雌性不育水稻繁殖技术，以及利用这一技术机械化生产非转基因杂交稻种子的方法。将水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。携带转基因的杂合单株在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒败育而不能参与受精；而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实。通过光电分选，获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种，因为父本（恢复系）为雌性不育系，因此制种时可以混播混收。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等，大大简化栽插工序。成熟后进行机械化收割；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明方法解决了雌性不育水稻繁殖技术难题，实现了杂交稻种子生产的混播混收；这一方法利用了转基因技术，但生产的是非转基因杂交稻种子。繁殖时，雌性不育水稻虽为转基因水稻，但面积不大，易于隔离。制种时，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有转基因成分，不会造成转基因的扩散漂移，有利于生物安全；收获时，可以混收，杂交种子也不含有转基因成分。这一混播混收的杂交水稻种子生产技术，可以减少制种操作程序，便于进行机械化操作，减轻劳动强度，降低种子生产成本，整体提高水稻种业的效益。
附图说明
图1是实施例1中携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体图谱；
图2是实施例2中经农杆菌转化后表达红色荧光蛋白的水稻愈伤图；
图3是实施例2中经农杆菌转化后获得水稻转基因植株图；
图4是实施例3中部分转基因植株的PCR检测图（M：DNA分子量标准；+：正/阳性对照；—：负/阴性对照）；
图5是实施例3中部分转基因植株的Southern blot检测图（—：阴性对照；+：以质粒作为阳性对照）；
图6是实施例4中I2-KI转基因植株花粉粒图；
图7是实施例4中转基因植株穗部性状图；
图8是实施例5中小规模制种现场图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。
实施例1：携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体构建
在表达载体pCAMBIA1300上，插入3个表达盒：野生型PTB1表达盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AA1表达盒、荧光筛选标记基因RP表达盒。野生型PTB1携带有自身的启动子和终止子（其核苷酸序列见SEQ ID NO.2）；淀粉酶基因ZM-AA1表达盒元件包括：玉米的花粉发育后期特异性启动子PG47（其核苷酸序列见SEQ ID NO.3）、玉米的转运肽ZM-BT1（其核苷酸序列见SEQ ID NO.4）、玉米的淀粉酶基因编码序列ZM-AA1（其核苷酸序列见SEQ ID NO.5）、玉米的终止子IN2-1（其核苷酸序列见SEQ ID NO.6）；红色荧光蛋白基因RP表达盒元件包括：玉米的种子特异性启动子END2（其核苷酸序列见SEQ ID NO.7）、载体pLJ02上的RP编码序列（其核苷酸序列见SEQ ID NO.8）、马铃薯的终止子PINⅡ（其核苷酸序列见SEQ ID NO.9）。完整的构建载体图谱见附图1。
所构建载体质导入农杆菌菌株EHA105用于水稻遗传转化。导入方法采用电击转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：
（1）将储存于-80℃的DH10B感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电激杯放在冰上预冷，把冻存的SOC放置在37℃解冻。
（2）将干净的EP离心管插在冰上预冷，一般EP离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照（没有加入DNA）、另一个做阳性对照（加入1μl的10ng/μlpUC19）。
（3）分别吸取1-2μl要转化的DNA样品放入预冷的EP离心管中，然后将融化的DH10B感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的EP离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。
（4）设置转化参数，1800v，25μF，200Ω，1mm，BioRad电激仪一般有推荐的使用参数。
（5）轻轻吸取感受态和DNA混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底，改上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后（一般会仪器会发出完成提示音），将在37℃预热好的SOC放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于37℃恒温摇床，225rpm，1hr。
实施例2：转基因水稻获得
2.1植物材料选择
用于遗传转化的水稻（Oryza sativa L.）品种选择为对应的携带PTB1基因（SEQ IDNO.1）的水稻雌性不育系。
2.2水稻胚性愈伤组织的诱导
取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min，再于0.1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次。
成熟胚去壳，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。28℃暗培养至长出愈伤组织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。
2.3愈伤组织的预培养
取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3～4天。生长旺盛的愈伤用于转化。
2.4农杆菌介导的水稻转化
农杆菌的培养。挑农杆菌单菌落接种于含50mg/L YM培养基上，260C暗培养2～3天后，用一金属匙收集农杆菌菌体，将其悬浮于AAM液体悬浮培养基中。调整菌落浓度至O.D.600为0.8～1.0，即可用于转化。
愈伤组织与农杆菌的共培养。用于转化的愈伤组织在被农杆菌污染前均应先在新鲜的继代培养基IM上预培养3～4天。转化时将经过预培养的愈伤组织转移到一无菌的三角瓶中，然后倒入适量的农杆菌悬浮液（至少保证有足够的菌液与材料接触），室温下放置10～20分钟，并不时晃动。取出愈伤组织，在无菌纸上吸去多余的菌液，随即将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基CM上于260C暗培养2～3天。
2.5抗性愈伤的筛选
将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
2.6抗性愈伤的分化培养
经抗生素筛选长出的抗性愈伤，转入分化培养基中继续培养，26℃～28℃，12h光照，12h黑暗条件下培养。
2.7转基因植株的再生及幼苗移栽
转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7～10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5～7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。注意保湿，以提高移栽成活率。
实施例3：转基因植株的分子检测
3.1DNA大规模抽提
T0代转基因水稻DNA抽提采用CTAB法（Murry and Thompson,1980）。称取新鲜叶片2－4克，剪碎后放入－20℃预冷的研钵中，用液氮磨成粉末，转入预冷的磨样瓶中于－20℃保存备用。提取时加入预热至100℃的10ml1.5X CTAB，迅速搅匀，于56℃水浴保温摇床振荡20分钟，然后用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提。离心后，上清液再用1/10体积预热至56℃的10％CTAB缓冲液及等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提一次，然后上清加入1％CTAB沉淀DNA，离心后加入添加有RNase A的1mol/L NaCl溶解DNA，于56℃过夜完全溶解酒精沉淀后，溶于适量TE中，用DNA微量测定仪（DNA Fluorometer）测定DNA浓度，平衡DNA浓度至250ng/ul，存于4℃备用。
3.2PCR分析
对T0代转基因水稻DNA进行PCR检测。以ZM-AA1基因作为模板设计引物。正向引物为：5’-AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT-3’（SEQ ID NO.11），反向引物为：5’-TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC-3’（SEQ ID NO.12）。扩增产物片段为1043bp。PCR反应体系：DNA30－90ng,10x Buffer2.0ul,1mM dNTP1.8ul,25mM MgCl21.5ul,10uM primer两种各0.5ul,Tag酶1.5U，然后加dd h2O至20ul反应体积。PCR循环条件：94℃，变性3分钟；94℃，1分钟，55℃，1.5分钟，72℃，1.5分钟，40个循环；72℃，延伸5分钟。电泳检测：用1.4％琼脂糖凝胶电泳，照相记录电泳结果。
附图4为部分转基因植株PCR扩增结果，表明目的基因已整合进入水稻基因组中。
3.3Southern印迹分析
取水稻总DNA2.5ug，用限制性内切酶XbaI37℃酶解20hr左右，经电泳检测酶切完全后，用0.6～0.8%琼脂糖（Sigma公司生产）凝胶电泳，经12－16hr电泳后，凝胶用0.2N HCl变性10分钟，用0.4N NaOH溶液将凝胶上的DNA片段转移至尼龙膜Hybond-N+上。转移20小时，将尼龙膜用2X SSC漂洗2次，各5分钟，膜晾干后于80－100℃真空烘烤3hr，取出冷却后置于4℃冰箱中保存备用。
预杂交：先将尼龙膜用2X SSC漂洗，凉干后装入杂交袋中，加入10－18ml（依膜的张数1－6张）预热至65℃的杂交缓冲液。赶气泡后，于65℃空气摇床中预杂交6hr左右。
探针标记：用随机引物法按下列步骤进行标记。探针DNA100ng，加入dd H2O至10ul，100℃变性10分钟，冰浴5分钟冷却后，加入dNTP(A+G+T)3ul，随机引物缓冲液5.0ul,Klenow Fragment酶2U，最后加入a－32P－dCTP10-40uCi（按杂交膜数量），混匀后于25℃保温3小时以上。
杂交：加600ul杂交液到标记好的探针溶液中，打开管盖，100℃变性10分钟后，倒入杂交袋中，65℃杂交6hr。
洗膜、压片：杂交完毕后，将膜从杂交袋中取出，用洗膜液1X SSC、0.2%SDS室温漂洗1次，然后再用预热至65℃的洗膜液于65℃保温摇床中热洗1－2次，每次15分钟。凉干后用保鲜膜包膜，压片后于－20℃放射自显影约4－7天。
探针DNA制备。探针DNA选自3.2中的PCR扩增产物，扩增产物的序列见SEQ ID NO.10。
附图5为部分转基因植株的Southern印迹分析。结果表明，目的基因已整合进入水稻基因组中。
实施例4：转基因水稻植株的育性考察
对经过分子鉴定的转基因植株考察了花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的I2-KI染色后，观察到部分花粉粒为黑染的可育花粉粒（见附图6）；与雌性不育对照比较，转基因植株能正常结实（见附图7）。
实施例5：水稻雌性不育系用于繁殖制种试验
水稻雌性不育系的繁殖。将携带杂合转基因的水稻雌性不育系自交。自交种子通过对红色荧光的光电分选，可以筛选出具有红色荧光的种子，获得纯合的雌性不育水稻用于混播混收的杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。
水稻雌性不育系应用于杂交稻制种。因为父本（恢复系）为雌性不育系，因此制种时可以箱式栽插，也可以混播混收。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等。待成熟后进行机械化收割，收获的均为杂交水稻种子。附图7展示了小规模的制种现场。

Claims (7)

1.一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体；
（2）将步骤（1）所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻，得到杂合的转基因水稻；
（3）将杂合的转基因水稻自交，通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选，筛选出不具有红色荧光的种子，即为纯合的雌性不育水稻种子，将该纯合的雌性不育水稻种子用于箱式播插或者混播混收的杂交稻机械化制种；筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种子，将该转基因种子继续用于雌性不育水稻的繁殖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻雌性可育基因为野生型PTB1基因或雌性不育水稻sfs1的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfs1的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID NO.1所示；所示野生型PTB1基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因为ZM-AA1，其序列如SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因由花粉发育后期特异性启动子PG47驱动，PG47序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光筛选标记基因包括红色荧光蛋白基因RP，其序列如SEQ ID NO.8所示。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光筛选标记基由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动，END2序列如SEQ ID NO.7所示。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻表达载体为pCAMBIA1300。
CN201410116096.8A 2013-03-29 2014-03-26 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法 Active CN103834684B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410116096.8A CN103834684B (zh) 2013-03-29 2014-03-26 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310108325.7 2013-03-29
CN201310108325 2013-03-29
CN201410116096.8A CN103834684B (zh) 2013-03-29 2014-03-26 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103834684A CN103834684A (zh) 2014-06-04
CN103834684B true CN103834684B (zh) 2015-02-18

Family

ID=50798579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410116096.8A Active CN103834684B (zh) 2013-03-29 2014-03-26 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN103834684B (zh)
WO (1) WO2014154141A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015101243A1 (zh) * 2014-01-02 2015-07-09 北京思创达科技有限公司 雌性不育系的繁殖及杂交制种技术
CN108148855A (zh) * 2017-12-31 2018-06-12 青岛袁策生物科技有限公司 一种水稻遗传工程不育系选育方法
CN108239653A (zh) * 2017-12-31 2018-07-03 青岛袁策生物科技有限公司 水稻遗传工程不育系的制备方法
CN109112158B (zh) * 2018-08-17 2022-08-09 湖南杂交水稻研究中心 一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法
CN109486853A (zh) * 2018-11-21 2019-03-19 湖南杂交水稻研究中心 一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法
CN109392694A (zh) * 2018-11-30 2019-03-01 湖南杂交水稻研究中心 除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用
CN110029126B (zh) * 2019-04-17 2023-05-02 湖南杂交水稻研究中心 一种固定植物杂种优势的方法
CN110093354B (zh) * 2019-04-17 2020-06-05 湖南杂交水稻研究中心 一种固定植物杂种优势的种子分选方法
CN114072512A (zh) * 2019-07-05 2022-02-18 未名生物农业集团有限公司 不育基因及其相关构建体和应用
CN112195188B (zh) * 2020-11-17 2022-05-31 中国水稻研究所 水稻基因OsDES1的应用
CN114317599A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 云南农业大学 一种水稻雌性核不育基因工程表达载体及其应用
CN115094085B (zh) * 2022-06-08 2024-04-12 湖南杂交水稻研究中心 水稻工程繁殖系的快速创制方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101658129B (zh) * 2009-09-18 2012-02-01 云南农业大学 雌性不育基因fst用于杂交水稻育种的方法
CN102477443A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法
CN101697706B (zh) * 2009-11-02 2012-06-06 湖南杂交水稻研究中心 高频隐性雌不育水稻恢复系的应用及培育方法
CN102731635A (zh) * 2011-04-08 2012-10-17 北京大学 水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9121028B2 (en) * 2005-09-09 2015-09-01 Monsanto Technology Llc Selective gene expression in plants
CN101828516A (zh) * 2009-03-09 2010-09-15 高克君 用荧光蛋白基因标记实现农作物杂交种子机械化生产的方法
CN101863969B (zh) * 2010-06-04 2012-06-13 四川农业大学 分离的水稻雌性育性相关蛋白、其编码基因及其应用
CN102965391B (zh) * 2012-10-23 2014-09-24 中国农业大学 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法
CN102876711B (zh) * 2012-10-31 2014-03-05 湖南杂交水稻研究中心 水稻工程保持系的培育方法及其在水稻普通核不育系繁殖中的应用
CN102870670B (zh) * 2012-10-31 2013-09-11 湖南杂交水稻研究中心 一种通用型水稻工程保持系的培育方法及其在水稻普通核不育系繁殖中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101658129B (zh) * 2009-09-18 2012-02-01 云南农业大学 雌性不育基因fst用于杂交水稻育种的方法
CN101697706B (zh) * 2009-11-02 2012-06-06 湖南杂交水稻研究中心 高频隐性雌不育水稻恢复系的应用及培育方法
CN102477443A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一种有效降低转基因植物通过花粉介导基因漂移的方法
CN102731635A (zh) * 2011-04-08 2012-10-17 北京大学 水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一份水稻雌性全不育隐形突变体的基本特性;高荣村;《浙江农业科学》;20071231;全文 *
水稻雌性不育突变体研究进展及应用展望;高荣村;《浙江农业科学》;20091231;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103834684A (zh) 2014-06-04
WO2014154141A1 (zh) 2014-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103834684B (zh) 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
CN101810140B (zh) 一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法
CN104004781A (zh) 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
CN107460133B (zh) 深色有隔内生真菌hs40及其在铁皮石斛生产上的应用
CN108849528A (zh) 一种获得假俭草突变体的方法
CN109486853A (zh) 一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法
CN106047924A (zh) 苦荞麦毛状根的诱导和快速扩繁方法
CN1763207A (zh) 一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系及其建立方法
CN108546670A (zh) 一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法
CN101928724A (zh) 一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法
CN100557015C (zh) 一种根瘤固氮菌株系bxbl9及其应用
CN111019835A (zh) 一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法
CN117004649B (zh) 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法
EP3247787A1 (en) New hybrid agaricus bisporus mushrooms strains
CN110305894B (zh) 一种快速高效的楸遗传转化方法
CN105309299A (zh) 一种利用诱导型雌性不育的杂交稻机械化制种方法
CN101948868B (zh) 一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法
CN116925923A (zh) 一种促进天麻种子萌发的真菌ph30w及其应用
CN115261405B (zh) 一种通过基因编辑延缓番茄果实成熟的方法
CN101748073B (zh) 一种蛹虫草菌种分离保藏方法
CN114507618B (zh) 一株具有促进石斛新叶生长能力的瘤菌根菌菌株tp-11及其应用
CN114946524A (zh) 一种用于羊肚菌的高效栽培方法
CN104946644A (zh) 玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记及其应用
CN112961787B (zh) 一种杨柳田头菇菌株及其栽培方法
CN114258858A (zh) 一种诱导糖用甜菜胚性愈伤组织的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: HUNAN TAOHUAYUAN SEED INDUSTRY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: HUNAN RESEARCH CENTRE FOR HYBRID RICE

Effective date: 20140618

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 410125 CHANGSHA, HUNAN PROVINCE TO: 415001 CHANGDE, HUNAN PROVINCE

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140618

Address after: 415001 Changde province Hunan City Zonta Changde economic and Technological Development Zone Road

Applicant after: HUNAN TAOHUAYUAN SEED CO., LTD.

Address before: 410125 Hunan province Changsha Furong district Mapoling two Yuanda Road No. 736

Applicant before: Hunan Research Centre for Hybrid Rice

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant