CN112195188B

CN112195188B - 水稻基因OsDES1的应用

Info

Publication number: CN112195188B
Application number: CN202011283325.7A
Authority: CN
Inventors: 张迎信; 程式华; 胡霞; 曹立勇; 于萍; 孙廉平
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112195188A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsDES1的应用，本发明首次揭示了水稻基因OsDES1具有调控植物育性的生物学功能。基于基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了该基因的功能，通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体转化水稻日本晴，转基因植株雌配子发育异常、育性降低；用pCUBi1390‑OSDES1过表达载体转化突变体des1后，转基因植株雌配子育性恢复，即OSDES1基因功能丧失型突变导致雌性部分败育而过表达该基因育性恢复正常。本发明水稻OSDES1基因功能丧失后未完全败育，可收获部分种子，可与其他雌性不育基因形成有利补充，为水稻智能恢复系育种提供了新的基因资源。

Description

水稻基因OsDES1的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及水稻基因OsDES1的应用。

背景技术

水稻作为最重要的粮食作物，提供了人类近50％的食物和营养来源。我国有一半以上的人口将稻米作为主要食物。杂交水稻的推广为世界的粮食安全做出了巨大的贡献，70年代具有里程碑式的野败雄性不育基因的发现，使杂交水稻三系育种得到推广，选育出了大量具有较强杂种优势的杂交组合。杂种优势的利用划分为以核质互作花粉不育为代表的“三系法”杂交水稻和光温敏核不育为代表的“两系法”杂交水稻。但是“三系法”受严格的恢保关系的制约，种质资源一直处于较低的利用水平。“两系法”容易受到环境条件的影响，导致杂交稻种子纯度经常发生变化。智能不育分子育种是将分子生物学技术和传统杂交育种工作结合在一起，利用隐性细胞核不育实现杂种优势利用的新途径，由于智能不育育种方法能够克服“三系法”与“两系法”的技术缺陷，使得杂交水稻的研究和应用进入一个崭新时代。通过利用无融合生殖技术固定杂种优势被誉为是杂交水稻育种技术的最高目标，最近在对水稻无融合生殖研究上已经获得了重大发现，为杂种优势的利用开拓了一条崭新的途径(KHANDAY et al.，2019；WANG et al.，2019)。

植株的生长发育是一个复杂而完善的过程，在生长发育过程中，会受到多重因素的影响。因此导致植物发生雌性不育的原因有很多。例如植物近远缘杂交、植物体内生理因素或者遗传因素发生改变以及植物体外部营养供给和生长环境发生改变，以上因素均会影响到雌性器官中孢子体和配子体的发育过程进而导致雌性不育。雌性不育广泛存在于拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆和白菜等植物中，雌性不育现象的产生主要是因为雌性器官发育出现异常而引起的，包括胚珠的发育、胚囊的形成和发育(YOKOO et al.，1984；凌定厚等，1991；ILARSLAN et al.，1997，2003；PALMER et al.，2000；LI et al.，2006；LI.et al.，2019；LIU et al.，2019)。

水稻育性是由雌性生殖器官和雄性生殖器官共同发育所决定的，水稻的生殖发育过程涉及许多环节，复杂却十分完善。水稻生殖生长过程划分为生殖器官(幼穗)发育和生殖细胞(雌雄配子)发育，这两个发育阶段并没有明确的界定，彼此间存在着交叉和协调发育。雄配子体和雌配子体的正常发育和成功的传粉受精过程是水稻进行生殖生长过程的必要前提和重要事件，这两个重要事件中的任何一个出现问题，都有可能引起不育。

水稻雌配子的发育过程：按照水稻发育胚囊的发育特点，刘向东(1997)通过进行GMA半薄切片观察水稻胚囊发育过程，将水稻胚囊发育进程分为8个阶段：(1)孢原细胞形成期：细胞体积发生膨大，类似等径发育，细胞质变得更加致密，细胞核增大位于珠心表皮下，与其它珠心细胞差异明显。(2)大孢子母细胞形成期：孢原细胞进一步伸长，为进行随后的减数分裂做准备。(3)大孢子母细胞减数分裂期：在大孢子母细胞减数分裂I和II过程中，依次形成二分体和四分体细胞。(4)功能大孢子形成期：四个单倍体的大孢子中的3个逐步发生降解，只留下位于靠近合点处的大孢子进行发育成功能大孢子。(5)单核胚囊形成期：功能大孢子进一步发育生长，能够清楚的观察到细胞液泡化，单核胚囊位于中央。(6)胚囊有丝分裂期：细胞进行三次有丝分裂过程发育成二核、四核和八核胚囊。二核胚囊中的2个核分别分布于胚囊的珠孔和合点处，然后这两个核继续发生分裂形成四核胚囊，之后这四个核同步分裂发育成八核胚囊。(7)八核胚囊发育期：在八核胚囊形成初期，胚囊两侧各有1个临近胚囊中央的核开始进一步生长，这两个核被誉为原极核。位于合点处的三个核形成反足细胞。位于珠孔处较近的两个核发育形成两个助细胞，而另外一个核发育形成卵细胞。位于中央的两个原极核一起向卵器迁移，并排移至卵器上方。(8)胚囊成熟期：从除卵细胞以外的区域的淀粉粒开始消失至胚囊体积增长至最大发育成成熟胚囊过程。

胚囊的正常发育是双受精过程能否能够正常进行的必要前提，许多相关基因组成了调控网络，参与或者影响胚囊发育的各个阶段：

大孢子母细胞相关调控基因。正常的大孢子母细胞发育是关系到功能大孢子能否形成的前提。SPOROCYTELESS(SPL)基因编码一个与MADS box转录因子相关的核蛋白，SPL和NZZ是同一基因，能够在大孢子发生阶段表达，细胞学研究发现在拟南芥中阻碍了大孢子母细胞的形成，因此在雌配子体发育过程中未发现胚囊结构(YANG et al.，1999)。其他克隆地与大孢子母细胞发育相关的基因如MULTIPLE ARCHESPORIAL CELLS1(MAC1)和MSP1(MULTIPLE SPOROCYTE)。

大孢子母细胞减数分裂过程相关调控基因。有报道研究发现，水稻中的PAIR1、PAIR2和PAIR3基因参与减数分裂过程中同源染色体发生配对和联会过程；ZMM是一种细胞在减数分裂期间同源染色体间进行交换产生的蛋白，以复合体的形式参与染色体的交换和联会过程(SHINOHARA et al.，2008；官文祥等，2017)。ZIP4，MER3和ZEP1同属ZMM基因；此外水稻中的还有Replication protein A(RPA)蛋白OsRPA1a在水稻DNA复制和同源染色体的重组过程发挥重要的作用(CHANG et al.，2009)；RAD51C是水稻RecA/RAD51家族成员，基因丧失功能后花粉母细胞在减数分裂粗线期染色体联会失败，导致从减数分裂双线期至末期II染色体出现异常，引起雌雄均不育(KOU et al.，2012)；此外，在osmsh4突变体中，由于减数分裂过程同源染色体的配对功能发生缺失，造成功能大孢子和成熟胚囊无法形成，雌雄性配子均呈现不育(WANG et al.，2016)。

功能大孢子有丝分裂过程相关调控基因。有丝分裂过程也是生物进行有性生殖的关键性环节。近年来，有多个参与雌配子发生过程的相关调控基因被报道，例如HDD(MOOREet al 1997)、FEM3、GFA4和GFA5(CHRISTENSEN et al.，1998)、PROLIFERA(SPRINGER et al2000)、NOMEGA(KWEE et al.，2003)、SWA1(SHI et al.，2003)、AGP18(ACOSTA-GARCIA etal.，2004)、APC/C(KWEE and SUNDARESAN，2003)、AGL23(COLOMBO et al.，2008)、RHF1a、RHF2a(LIU et al.，2008)、SWA3(LIU et al.，2010)、AtRH36(HUANG et al.，2010)、AtHDA7(CIGLIANO et al.，2013)、YUC8、TAA1(PANOLI et al.，2015)和AOG1(CUI et al.，2015)。OsDEES1(WANG et al.，2012)和OsAPC6(KUMER et al.，2010；AWASTHI et al.，2012)是近年来被报道的参与调控水稻有丝分裂过程的雌配子发育基因。例如KUMAR等(2010)研究发现OsAPC6突变体中部分雌性不育，40-45％的种子产生不育现象。

参与成熟胚囊中细胞核位置分布的相关调控基因。在植物中参与细胞核位置分布的基因有很多报道，例如：AGAMOUS-LIKE80(AGL80)(PORTEREIKO et al.，2006)、indeterminate gametophyte1(ig1)(EVANS，2007)、BEL1-like homeodomain 1(BLH1)(PAGNUSSAT et al.，2007)、Lachesis(LIS)(GROSS-HARDT et al.，2007)、DIANA(BEMER etal.，2008)和MAA3(SHIMIZU et al.，2008)等。YANG等(2010)认为中央细胞的正常发育以及正确的分布是双受精成功进行的重要前提。卵细胞和极核的位置的异常也是造成籼粳杂种不育的重要原因之一(ZENG et al.，2009)。

水稻籼粳杂种不育相关调控基因。水稻雌性不育最早出现在籼粳亚种间或亚洲栽培稻和野生稻的杂交种中(IKEHASHI andARAKI，1984；LIU et al.，1996)。水稻籼粳间杂种不育现象大部分是由S5控制的，因此研究人员对S5进行了大量的报道研究。S5位点有三个等位基因：籼稻等位基因(S5-i)，粳稻等位基因(S5-j)以及广亲和基因(S5-n)。基因型S5-n/S5-i和S5-n/S5-j是可育的，基因型S5-i/S5-j是高度雌性不育(DAVIES，1990；RAWLINGSand BARRETT，1995；YANAGIHARA et al.，1995；LIU et al.，1997；QIU et al.，2005；JI etal.，2005)。此外，还有一系列杂种不育基因，如S7(YU et al.，2016)，S8(WAN et al.，1993)，S9(ZHAO et al.，2006)，S10(ZHU et al.，2005a)，S15(WAN et al.，1996)，S16(WANand IKEHASHI，1995)，S17(WAN et al.，1998)，S29(ZHU et al.，2005a)，S30(ZHU et al.，2005b)，S31(ZHAO et al.，2007)和S32(LI et al.，2007)。

水稻雌性不育的育种应用：首先，雌性不育在水稻杂种优势的利用与固定上有着巨大潜力。利用常规杂交或者分子生物学技术将含有强优势组合特点的无融合生殖基因转移至雌性不育水稻中，通过无融合生殖产生具有强优势特性的不定胚，由于这种不定胚不经历减数分裂过程，因此能够固定杂种优势，而胚囊中的极核是正常的，因此能够发育成胚乳，进而能够形成正常的且固定了杂种优势的种子(凌定厚等，1991)。其次，有些雌性不育材料虽然雌性器官不育，但是具备花粉育性正常以及恢复高的特点，可以用作雄性不育系的恢复系。利用雌性不育材料做父本，将其和恢复系进行杂交，通过轮回杂交、高代表现纯合，筛选出雌性完全不育的新型恢复系，和雄性不育系混合播制种，不仅能够提高制、繁种产量以及纯度，并且很大程度上减轻了田间的工作量和人力负担，便于实现机械化生产。但智能恢复系目前还只是一种设想，并未出现成功应用的实例。因此挖掘更多的雌性不育基因可以为实现这一设想提供可利用的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供水稻基因OsDES1的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供水稻基因OsDES1的以下任一应用：

1)用于调控植物雌配子发育；

2)用于调控植物育性；

3)用于调控植物结实率；

3)用于植物品种改良；

4)用于制备转基因植物。

其中，基因OsDES1为编码如下蛋白质A或B的基因：

A、由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

B、SEQ ID NO：3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由A衍生的蛋白质。

基因OsDES1(登录号LOC_Os03g31570或Os03g0430000)为：

i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

基因OSDES1的eDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中，所述植物为禾本科植物，优选水稻。

第二方面，本发明提供一种降低水稻育性或结实率或使水稻雌配子发育异常的方法，包括：利用基因工程手段，敲除或降低水稻中的基因OsDES1。

可选地，以基因OsDES1为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体(如BGK03)中，转化水稻，获得该基因功能缺失的转基因水稻。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-AGCAGAGAACGAGGCGGCGGTGG-3’。

第三方面，本发明提供由水稻基因OsDES1突变导致的水稻育性或结实率下降的植株育性或结实率恢复方法，包括：通过质粒将基因OsDES1导入育性或结实率下降的水稻植株中或通过基因工程手段整合到水稻染色体上。

可选地，将基因OsDES1构建到植物双元表达载体(如pCUBi1390)上，转化水稻，获得该基因过表达的转基因水稻。

本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

第四方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了基因OsDES1的功能，通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体转化水稻日本晴，转基因植株雌配子发育异常、育性降低；用pCUBi1390-OSDES1过表达载体转化突变体des1后，转基因植株雌配子育性恢复，即OSDES1基因功能丧失型突变导致雌性部分败育而过表达该基因育性恢复正常。本发明首次揭示了水稻基因OsDES1的生物学功能，为水稻智能恢复系育种提供了新的基因资源。

本发明水稻OSDES1基因功能丧失后未完全败育，可收获部分种子，可与其他雌性不育基因形成有利补充，或者可同时对多个雌性不育基因进行编辑，保证雌性败育更加彻底，可用于创制智能恢复系。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中野生型(WT)和des1突变体表型对比结果。其中，(a)成熟期野生型和突变体des1植株表型对比。比例尺＝20cm。(b)成熟期野生型和突变体des1穗部性状对比。比例尺＝5cm。(c)开花前野生型和突变体des1雌蕊对比。比例尺＝0.125cm。(d)野生型和突变体des1结实率统计，样本量重复数n＝8，采用t检验进行差异显著性分析，**p＜0.01表示极显著。(e)成熟期野生型胚囊观察。(f)成熟期突变体des1败育胚囊观察。A，反足细胞；P，极核；E，卵细胞；S，助细胞。(e，f)比例尺＝50μm。

图2为本发明较佳实施例中野生型和des1突变体花药和花粉表型对比结果。其中，(a)抽穗后野生型和突变体des1植株表型对比。比例尺＝20cm。(b)野生型和突变体des1穗部开花比较。比例尺＝2cm。(c)开花前野生型与des1去除颖壳花器官的形态对比。比例尺＝0.25cm。(d)开花前野生型和突变体des1花药对比。比例尺＝0.125cm。(e，f)野生型和突变体des1成熟花粉粒镜检观察。比例尺＝25μm。(g)野生型和突变体花粉镜检统计，样本量重复数n＝3。

图3为本发明较佳实施例中野生型和des1突变体胚囊发育过程。其中，(a-h)野生型不同发育进程胚囊观察。(i-n)des1突变体不同发育进程胚囊观察。(o)野生型和des1突变体中正常发育成熟胚囊统计。样本量重复数n＝3。(p-r)野生型和突变体授粉后24小时胚囊观察。(p)野生型含有多细胞球形胚和胚乳核。(q，r)des1突变体含有降解的胚囊(q)和未受精的胚囊(r)。(s)授粉后24小时野生型和突变体胚囊形态统计。大孢子发生过程和雌配子发育过程中的核用箭头符号表示，图中所有比例尺＝50μm。

图4为本发明较佳实施例中野生型和des1成熟雌蕊和花药扫描电镜分析结果。其中，(a-f)成熟野生型雌蕊、花药和花粉粒的扫描电镜图像。(g-1)成熟des1雌蕊、花药和花粉粒的扫描电镜图像。(a，g)成熟野生型和des1胚囊的扫描电镜图像。(b，h)成熟野生型和des1花药的扫描电镜图像。(c)野生型花药表皮的扫描电镜图像。(d)图(c)中的花药表皮高倍放大。(i)des1花药表皮的扫描电镜图像。(j)图(i)中的花药表皮高倍放大。(e)野生型花药内壁的扫描电镜图像。(f)图(e)中的花药内壁高倍放大。(k)des1花药内壁的扫描电镜图像。(l)图(k)中的花药内壁高倍放大。比例尺＝1mm(a，g)；1mm(b，h)；10μm(c，i)；100μm(d，j)；5μm(e，k)；1μm(f，1)。

图5为本发明较佳实施例中OsDES1基因定位于3号染色体。(a)OsDES1基因初定位于3-24和3-31两个分子标记之间。(b)OsDES1精细定位于H35和H58标记之间的329.5kb。精细定位区间内有24个开放阅读框。(c)ORF12的基因结构图。(d)des1的序列在第七外显子存在一个单碱基替换。ATG和TAA分别代表起始密码子和终止密码子，黑框表示外显子，黑框中间的线表示内含子。

图6为本发明较佳实施例中野生型和敲除突变体成熟期表型对比结果。其中，(a)敲除株系靶位点上三种类型突变。红色碱基序列代表插入，红色虚线代表碱基发生缺失。(b)成熟期野生型(NIP)和敲除突变体ko-3植株表型。比例尺＝20cm。(c)成熟期NIP和敲除突变体ko-3穗部表型。比例尺＝5cm。(d)NIP和敲除突变体ko-3结实率统计。样本量重复数n＝10。(e)成熟期NIP胚囊观察。(f)成熟期ko-3败育胚囊观察。(g)NIP和敲除突变体ko-3正常发育成熟胚囊统计。样本量重复数n＝3。(e，f)比例尺＝50μm。

图7为本发明较佳实施例中野生型和敲除突变体抽穗期表型对比结果。其中，(a)抽穗期野生型(NIP)和ko-3植株表型。比例尺＝20cm。(b)开花前NIP和ko-3颖花表型。比例尺＝0.25cm。(c)开花前NIP和ko-3花药表型。比例尺＝0.125cm。(d)开花前NIP和ko-3雌蕊表型。比例尺＝0.125cm。(e)，(f)NIP和ko-3花粉镜检观察。比例尺＝25μm。(g)NIP和ko-3花粉镜检统计，样本量重复数n＝3。

图8为本发明较佳实施例中des1突变体过表达成熟期表型分析结果。其中，(a)野生型、des1和过表达株系OE-1成熟期植株表型。比例尺＝20cm。(b)野生型、des1和过表达株系OE-1成熟期穗部表型。比例尺＝5cm。(c)-(e)野生型、des1和过表达株系OE-1成熟期胚囊观察。比例尺＝50μm。(f)野生型、des1和过表达株系OE-1相对表达量检测。在抽穗期选取剑叶进行RNA提取。三次重复求平均值。(g)野生型、des1和过表达株系OE-1成熟期胚囊统计。A，反足细胞；P，极核；E，卵细胞；S，助细胞。样本量重复数n＝3。(h)野生型、des1和过表达株系OE-1结实率统计。样本量重复数n＝8。

图9为本发明较佳实施例中des1突变体过表达花药和花粉对比结果。其中，(a)开花前野生型(左)、突变体des1(中)和过表达OE-1株系(右)颖花形态对比。比例尺＝0.25cm。(b)开花前野生型、突变体des1和过表达OE-1株系花药对比。比例尺＝0.125cm。(c)-(e)野生型、突变体des1和过表达OE-1株系成熟花粉粒镜检观察。(f)野生型、突变体和过表达OE-1花粉统计。样本重复数n＝3。比例尺＝25μm。

图10为本发明较佳实施例中OsDES1的表达模式。其中，(a-f)：幼根(a)，叶片(b)，茎节(c)，叶鞘(d)，不同发育时期的颖花(e)和(f)雌蕊。(a-d)比例尺＝1cm，(e)比例尺＝2mm，(f)比例尺＝200μm。(b，c)颖花长度从左到右依次为2.5-3.0mm，3.0-3.4mm，3.4-4.5mm，4.5-5.6mm和5.6-6.2mm。

具体实施方式

育性(体现为稻谷的结实率)是水稻重要的农艺性状，直接关系到水稻产量高低。本发明提供的控制水稻育性的基因OsDES1(defective embryo sac 1)，相比野生型，水稻突变体des1结实率相对于野生型降低约60％，主要是由雌配子(胚囊)发生部分败育引起。遗传分析表明，des1雌性不育受一对隐性核基因控制，将des1不育基因精细定位在水稻3号染色体H35和H58两个分子标记之间，物理距离为329.5kb，该区域包含24个开放阅读框。对候选基因测序发现突变体在ORP12(LOC_Os03g31570)基因组第2731位(cDNA第825位)碱基G突变为A，导致蛋白翻译第275位提前终止。通过过表达转基因实验、CRISPR/Cas9敲除和表达模式分析等实验证明了OsDES1是控制des1突变体雌性不育的基因。其中通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体后转化日本晴后转基因植株出现雌配子发育异常、育性下降的类似突变体表型；利用pCUBi1390-OSDES1过表达载体转化突变体des1后转基因植株育性基本恢复。OsDES1(LOC_Os03g31570)编码一个含484个氨基酸残基，在Uniprot和RGAP网站中均收录为预测的富含脯氨酸家族蛋白(proline-rich family protein，putative，expressed)，确切生物学功能未知。

本发明采用如下技术方案：

(1)克隆一个水稻新的控制雌配子发育的基因：克隆一个水稻中新育性基因OSDES1，突变体功能丧失型突变导致雌配子发育异常、育性降低。

(2)利用过表达验证基因功能：pCUBi1390-OSDES1过表达载体转化突变体des1后，转基因植株雌配子育性恢复。

(3)利用基因敲除验证基因功能：通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体后转化日本晴后转基因植株雌配子发育异常、育性降低。

(4)有望利用OSDES1在智能恢复系育种中与其他雌性不育基因配合使用，创制雌性不育更加彻底的恢复系。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的引物及序列如下：

实施例1水稻育性基因OsDES1的功能

1、des1突变体表型分析

从中恢8015经辐射诱变获得的突变体库中鉴定分离出一个低结实率突变体des1。该突变体结实率降低性状稳定，在浙江富阳和海南陵水均呈现结实率下降。在营养生长时期，该突变体与野生型相比，株型、分蘖无明显差异，株高略微降低(图1a)。在生殖生长时期，相对于野生型，突变体的抽穗期早于野生型，部分包颈(图2a)，穗子略带褐色，穗长变短(图1b)。突变体雌蕊外观形态与野生型相比无明显差异(图1c)。与野生型中恢8015结实率83.5±4.1％相比，突变体的小穗结实率约16.0±5.0％(图1d)。经细胞学观察发现，野生型成熟胚囊内部能够形成正常的“七细胞八核”结构，即含有三个反足细胞，两个极核和助细胞以及一个卵细胞。而在突变体中，成熟期胚囊不能发育形成“七细胞八核”结构，胚囊发生败育(图1e和f)。以上结果表明该突变体结实率下降主要原因可能是雌配子(胚囊)发生败育。正反交实验表明：以des1为母本，各组合的结实率处于较低的水平；以中恢8015为母本，各组合结实率相对处于较高的水平，其中，以野生型做母本，des1做父本，比野生型自交的结实率低(表1)。除了对雌蕊进行了观察外，还对des1花药以及花粉进行了观察。在开花期，突变体和野生型开花无差异，突变体中的花药能够正常开裂进行传粉过程(图2b)。与野生型颖花中的6枚花药相比，突变体中花药数目发生变化(颖花中存在0-6个数目不等的花药)并且长度变短，其它花器官形态观察无异常(图2c和d)。花粉碘化钾染色分析，野生型中可育的花粉粒98.0±1.2％，突变体的可育花粉粒64.0±7.1％(图2e、f和g)，均达到可育标准。

表1正反交结实率统计

2、des1突变体胚囊和花粉发育过程观察分析：

观察发现在des1突变体的大孢子母细胞形成期之前，des1和野生型相比无明显差异(图3a-j)。但是，在突变体中部分位于合点处的大孢子却没有像正常大孢子一样变大进一步发育形成功能大孢子(图3k)，而是伴随着珠孔处的3个大孢子逐步发生退化，由于不能形成功能大孢子，在成熟期des1突变体部分胚珠中没有任何胚囊结构的形成，导致有丝分裂不能进行，发育形成未分化的胚囊(图3l-n)，进一步证明了雌配子发育异常。与野生型中恢8015正常可育胚囊96.7±0.6％相比，突变体正常可育胚囊仅为50.3±5.7％(图3o)。对野生型和突变体进行授粉后24小时胚囊观察实验。在野生型中观察到多细胞的球形胚和胚乳核。但是在突变体中观察到未分化的胚囊和未受精的胚囊(图3p-r)。在野生型中有77％的胚囊进行了受精，但是在突变体中仅有20％胚囊进行了受精(图3s)。为了观察des1与野生型花药的差异，利用扫描电镜对野生型和des1成熟期雌蕊和花药进行详细的观察和分析。从外观上看野生型和des1雌蕊无差异(图4a和g)。成熟期与野生型相比，des1花药短小，明显呈异常的形态特征(图4b和h)。des1和野生型花药表皮有泡面状的角质层，与野生型花药表皮相比，des1角质脊结构更加紧密(图4c、d、i和j)，野生型花药内壁绒毡层完全降解为充满乌氏体的细胞碎片，而des1绒毡层降解不够彻底，乌氏体相对于野生型数量更多(图4e、f、k和1)。

3、OsDES1基因定位和候选基因分析

以des1突变体为母本，中恢8015为父本进行杂交，其F₁代全部正常可育。将收获的F₁种子继续种植，F₂代群体遗传分析显示育性性状呈近似3∶1的分离比(其中不育株28株，可育株108株，卡方检测χ²＝0.235＜χ²0.05＝3.84)，结果表明des1雌性不育性状受单隐性核基因控制。为了克隆OsDES1基因，利用粳稻02428为母本，des1突变体为父本配制杂交组合和构建定位群体，在F₂群体里面选取具有突变体表型的叶片提取DNA进行定位。首先利用均匀分布在水稻12条染色体同时在02428和ZH8015之间具有多态性的标记进行连锁分析，将其初步定位与第3号染色体上的3-24和3-31标记之间(图5a)。随后通过开发新的InDel标记，利用393个不育植株将目标基因精细定位在H35和H58两个标记之间，物理距离为329.5kb，通过RAP-DB网站(https：//rapdb.dna.affrc.go.jp)发现精细定位区间里面分布24个开放阅读框(图5b)。设计引物，分别以ZH8015和des1突变体的DNA为模板，对该区间内的开放阅读框基因组序列进行PCR扩增并进行测序。通过对序列进行比对，发现在ORF12(LOC_Os03g31570)的第七个外显子中(cDNA第825碱基)存在单碱基替换(图5c和d)，促使蛋白翻译第275位提前终止。因此我们将LOC_Os03g31570作为候选基因，进行功能验证。

4、利用基因敲除验证OsDES1的功能

为了证实LOC_Os03g31570基因突变引起des1结实率降低的表型，利用CRISPR/Cas9技术对LOC_Os03g31570进行编辑。以OsDES1基因LOC_Os03g31570为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列(5’-AGCAGAGAACGAGGCGGCGGTGG-3’)(图6a)，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中(商业化CRISPR/Cas载体BGK03购自百格基因科技(江苏)有限公司)。利用农杆菌介导法进行水稻品种日本晴的转化。在靶位点临近区域进行引物设计，对阳性转基因植株进行鉴定。获得了三个独立的转基因敲除阳性植株，分别命名为ko-1，ko-2和ko-3。ko-1和ko-2分别在第一个外显子处插入了1个碱基A和T，ko-3在第一个外显子处缺失了2个碱基CC(图6a)。在成熟期通过田间表型观察发现，与NIP植株结实率87.4±5.2％相比，ko-3植株的结实率8.2±3.5％(图6b-d)。通过对NIP和敲除突变体成熟期胚囊观察发现，与NIP植株正常胚囊91.5±0.7％相比，ko-3植株的正常胚囊26.4±7.9％(图6e-g)，敲除突变体成熟期的这些表型与des1表型一致。这些结果更加肯定了OsDES1(LOC_Os03g31570)基因突变造成雌性不育进而导致了des1结实率下降。

在抽穗期对NIP和ko-3植株也进行了表型调查。ko-3与NIP相比，抽穗期提前并且花药长度变短，雌蕊外观同野生型相比无明显差异(图7a-d)。我们还对NIP和ko-3植株花粉粒进行花粉粒碘化钾染色观察，与NIP正常可育花粉95.0±1.0％相比，ko-3正常可育花粉68.0±6.0％(图7e-g)，达到可育水平。此外，敲除突变体的抽穗期表型与des1突变体表型一致。

5、利用过表达验证OsDES1基因的功能

将LOC_Os03g31570基因的CDS连接到过表达载体(pCUBi1390，购自CAMBIA公司)上，然后利用农杆菌介导的转基因，转化des1突变体愈伤组织。在开花期和成熟期对转基因阳性植株进行育性调查和表型观察。对过表达转基因阳性植株结实率进行统计，与野生型结实率83.5±4.1％相比，des1结实率16±5％，过表达转基因阳性植株结实率74.1±3.4％(图8a、b和h)。对过表达转基因阳性植株成熟期胚囊进行观察，与野生型正常可育胚囊96.7±0.6％相比，des1正常可育胚囊50.3±5.7％，过表达正常可育胚囊79.7±5.8％(图8c-e和g)。与野生型和des1相比，过表达植株的表达量呈显著上升(图8f)。如图3-5所示，过表达转基因植株中在成熟期可育胚囊和结实率接近野生型表型。在过表达转基因阳性植株中，花药长度和花粉镜检统计接近野生型表型(图9a-f)。这一结果表明在突变体中表达正常的LOC_Os03g31570能够恢复des1低结实率表型。

6、OsDES1时空表达模式

将OsDES1起始密码子ATG的上游2444bp的启动子区与GUS基因融合构建proOsDES1：GUS表达株系，对OsDES1表达谱进行分析。选取发育不同时期的颖花进行GUS染色。结果表明，在水稻的幼根、叶、茎和叶鞘中都能检测到信号(图10a-d)，说明OsDES1在营养生长组织有表达。从减数分裂期、单核花粉粒形成期、二核花粉粒形成期和花粉粒成熟期的颖花发育不同阶段，花药(图10e)的信号处于较强的水平。说明从减数分裂至花粉粒成熟期，在生殖生长组织花药中表达量处于较高的水平。从大孢子母细胞形成期、减数分裂期、功能大孢子时期和胚囊成熟期的颖花发育不同阶段，雌蕊(图10f)的信号同样处于较强的水平。说明从减数分裂至胚囊成熟期，在生殖生长组织雌蕊中表达量处于较高的水平，进一步验证了目的基因的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 水稻基因OsDES1的应用

<130> PI202010667

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4158

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgccaccac tccaccgccg cctcgttctc tgcttcctca tcctcgccgc cgccgccgcc 60

gctaccaccg ctgcctccat ctccaccccc gccgagctcg cgggtaagta tttactttct 120

cccctcccaa accccaccaa accctaaccc taactgtttt ttaacatcct tctcctcgca 180

gtcgcgtcgc accctctgtc ccccctccgt ctcccgccgg ccgcgccctt cgccggcggc 240

ggggagggcg gcggcggtgg cggtggcccc ttctgcacac gcgtgcatat ccgcggtcgc 300

ccgtcccgcc tccgcgaccc gtcgcgcttc ttccacgccc tcagggtccg cgccaacgcc 360

acccgcccca gcggacttga gctctgcttt caccggtaag tgggaatgcg gacataaacc 420

ctagcgcttc cttgctatgt ctgcacgttt cgcctgattt ttcttttggt tggcccggct 480

ggtgtttgta ggaatgccac agtgggtcca tgcaagtgcg cggcgtcaca gtgccataag 540

atggccaaga gcggcctatg ggtgcaagcc atctccccgt acgacacccg ggtcctcgat 600

ttccggatgc catcggaccc ttcgaggtct atcatagtgt cgacggagga aggtactgtt 660

ttctttctcc ttgtttcagt agttgtgttc tgtttgctgg catcgtttgc gtgtatattg 720

atatgggagt gctttggggg ctttctgtgg ttgtgtttgc agagttcttg cttcacaggg 780

tggtgttctt gttgctggga atggtgctga tggcagtggc gcacactctt agcgagtctg 840

tggtattcta ctatggcgga gcaatgacga ttggaatttt ccttgtaatt ctgattatac 900

tcttccaggt gagtttaccc atcttcacta agttctatat atatggcaat tgatattgtt 960

tgaagttttg tatggtgggt gttgccatca ttgtaatagt ttgggaagtt atatttacat 1020

catgcttagc attgacagtt agaagaatta ttggcatagg cgggtggcat atatggaatt 1080

accaaagtta ttttctcatc tggacaacat aatttaaact gtaaactttc tttactagag 1140

ggttttctct gttacctttg tttcaattag taatatcacg ttttgttatc atgtttaaac 1200

tgtaaactcc acgcaacgac attccactat tcctatttca tcttatcatg tttatcaaag 1260

taatctgcat tcccacgttt tctattctgg tgtataattt aaaaatatta ttctgttaca 1320

tttgtttcca gttaccaaca ctgcattggt gattaataaa gctctaactg attagatacc 1380

tgttatcatg cttagcaagt catattctgt aaaaaggaat caagaattga gaatttaggt 1440

gtttgttatg ttttgctggc aattttgtct tgtatgtaaa acatgccatt tcattcagtg 1500

cttcagctta atggacactc tccctccttt tctgatgtgc ttataataaa atgtgtgttt 1560

ccattttttt ccctcgtgtt ctgttaggcg agaaagtctc ctgcttctat attggaaccc 1620

ttttccaaat tcactttggt gatcctaagc ttttaccatg gaaaggaagg gtcgtgggat 1680

gtaaacaaag aaatggggca aaacactaac ataataagaa agaaaatgat cgagacaaat 1740

aacctcatag tgtttgcatt tttaacagtt ttttattgat gacttatcct tctccttttt 1800

atcaatgagc ataagttgat tcttatgaac caatctgtct agcttattga attttcagta 1860

ccaaatgctt aaactgaggt acgattgtct gtagtccctc caagtatttt atgtgacaac 1920

cagttacctt aggagtgttt ttttagttct tttcttagct tactgtctga ttttttctat 1980

ttttatcttc tttttcaggg aatgaagctt ttacccactg gtagaaagag ttctcttgca 2040

atttttgtgt actcttcact tgtgagtatt catacaattt gacttgtttc tgctttgatt 2100

gcaatgccat atccttggaa cactgattca tgacgttttc tcaaaacagg ttggcatgac 2160

cacatatttt ttgcactatt tgtcgggact tttacgttct gtgcttgtgg aaattgggat 2220

tgccgaagac atgcataatc ctgtatgtaa gttctccttg taggttactt atggttcatt 2280

tgctacttct gtttccacct tcaattacat gtgccatatg gaagaaagag ctttaccttt 2340

tatggaggta caagtgtata atattttcaa ctttgcagtt tgctgcttgt gttttgtaag 2400

ttcgttttca tagattactg tgatgtataa atttgataat atctcatatt ctcttcaaat 2460

atttacttat gcttgtctct gccagttctt gttgataaat agtctggtta taatagtccc 2520

ataaagagat agtccatgat ttatcattag tattcccttc aagtttatat gctgctgtca 2580

aattatccca taaatatatt gctaatgctt tcaaaagcat cattcgttca aggtccattt 2640

tctcttttcc ctgtgacata ccaacatcca atatatgtta ttgcagctag gtgtattcct 2700

tctcgtaagt gtgatcttag ctggagcctg gtttggttac tggggtgtcc gtaagcttgt 2760

gctaacagaa gaaggatctg ttgatgctgg tgtggcttat tttgttgagt gggctatctt 2820

gattatttct gcagttatga tcctgcaggt aagttgttat agtgacctgt tatttactga 2880

caatcctaat aatttgctta tctgttaact gacatacaag cttttgcttg ttcttttttt 2940

ccgtgtagag ttctttggac tatctctttg cattttcagc attattattt tgcacagcca 3000

tcaaagcagt ttctaggatt gagggaaagt caagagttct acggtgccta tcaaggtaag 3060

atgcaatata ttcgtatatc ttatatcagg gaagtcacct catactttcg cattgatcat 3120

aacccttgtc aattttcatc aaggagaatt tgacttgatt gtaactatgt aagagcaggg 3180

ttcctcatat tctattgttt atggttgggt tcctaacttt tatagattta gccagtgcac 3240

tttgttattt gtatctgctg attattcttg gccaatgcac acacagctaa gtccaataga 3300

tgttttctcc tatgtgtgta gtatgttgtg caacatcaga gtaattactt tagatgtgaa 3360

tagaaagtgg aacactgaca ggaattgggt atgctgggaa ataattcatg tcttagtcct 3420

tgtatctttc taaatgtatt atcttgtaga tgtgatggtg aatgtatgca actttgtcaa 3480

aaaccttttg gttacattta taacactatg tttcgtagag atgacgctga ataatgtctt 3540

tgtggataat agtttctcca aatgaatgga tccctttgcc ttaagaatgc atttcatttt 3600

gttaccacca aatcttttga taacatggtt aacacatcaa tgacctgatt gtatctcttg 3660

gcagggcatt ttcgaacatt gttcccaccg gctatgaagg ttttggtgag gagtactcca 3720

gcatgaatgg atctcaccaa gatggattta gcaagcttca tggtgaatac atgaggagta 3780

caccaaaaag aaattcactt cgtacgggtt tgtcatttct tttacctgta tgatgtcata 3840

gttcggtatt attgtttggt gaatgaccta aaatcttttg cttttacagg gtcaaggaag 3900

acattgtctc aagaccttgc tacggatagc tactattcta ccttccacac taaccctgag 3960

cggaaaaagt tttcagagga ggaatatgca gcattcacta gagaagagac acataaagct 4020

atgaaacaac tggtctcatc gcctgatttc aacaggtggg cactagcaaa cgtggacagg 4080

atatctgtga ctcctccaca aagaacaccc caaaatagca tgagccagca gcggaaacgt 4140

ttgttcggac tgttttaa 4158

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgccaccac tccaccgccg cctcgttctc tgcttcctca tcctcgccgc cgccgccgcc 60

gctaccaccg ctgcctccat ctccaccccc gccgagctcg cggtcgcgtc gcaccctctg 120

tcccccctcc gtctcccgcc ggccgcgccc ttcgccggcg gcggggaggg cggcggcggt 180

ggcggtggcc ccttctgcac acgcgtgcat atccgcggtc gcccgtcccg cctccgcgac 240

ccgtcgcgct tcttccacgc cctcagggtc cgcgccaacg ccacccgccc cagcggactt 300

gagctctgct ttcaccggaa tgccacagtg ggtccatgca agtgcgcggc gtcacagtgc 360

cataagatgg ccaagagcgg cctatgggtg caagccatct ccccgtacga cacccgggtc 420

ctcgatttcc ggatgccatc ggacccttcg aggtctatca tagtgtcgac ggaggaagag 480

ttcttgcttc acagggtggt gttcttgttg ctgggaatgg tgctgatggc agtggcgcac 540

actcttagcg agtctgtggt attctactat ggcggagcaa tgacgattgg aattttcctt 600

gtaattctga ttatactctt ccagggaatg aagcttttac ccactggtag aaagagttct 660

cttgcaattt ttgtgtactc ttcacttgtt ggcatgacca catatttttt gcactatttg 720

tcgggacttt tacgttctgt gcttgtggaa attgggattg ccgaagacat gcataatcct 780

ctaggtgtat tccttctcgt aagtgtgatc ttagctggag cctggtttgg ttactggggt 840

gtccgtaagc ttgtgctaac agaagaagga tctgttgatg ctggtgtggc ttattttgtt 900

gagtgggcta tcttgattat ttctgcagtt atgatcctgc agagttcttt ggactatctc 960

tttgcatttt cagcattatt attttgcaca gccatcaaag cagtttctag gattgaggga 1020

aagtcaagag ttctacggtg cctatcaagg gcattttcga acattgttcc caccggctat 1080

gaaggttttg gtgaggagta ctccagcatg aatggatctc accaagatgg atttagcaag 1140

cttcatggtg aatacatgag gagtacacca aaaagaaatt cacttcggtc aaggaagaca 1200

ttgtctcaag accttgctac ggatagctac tattctacct tccacactaa ccctgagcgg 1260

aaaaagtttt cagaggagga atatgcagca ttcactagag aagagacaca taaagctatg 1320

aaacaactgg tctcatcgcc tgatttcaac aggtgggcac tagcaaacgt ggacaggata 1380

tctgtgactc ctccacaaag aacaccccaa aatagcatga gccagcagcg gaaacgtttg 1440

ttcggactgt tttaa 1455

<210> 3

<211> 484

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Pro Pro Leu His Arg Arg Leu Val Leu Cys Phe Leu Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ser Ile Ser Thr Pro Ala Glu

20 25 30

Leu Ala Val Ala Ser His Pro Leu Ser Pro Leu Arg Leu Pro Pro Ala

35 40 45

Ala Pro Phe Ala Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro

50 55 60

Phe Cys Thr Arg Val His Ile Arg Gly Arg Pro Ser Arg Leu Arg Asp

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Phe His Ala Leu Arg Val Arg Ala Asn Ala Thr Arg

85 90 95

Pro Ser Gly Leu Glu Leu Cys Phe His Arg Asn Ala Thr Val Gly Pro

100 105 110

Cys Lys Cys Ala Ala Ser Gln Cys His Lys Met Ala Lys Ser Gly Leu

115 120 125

Trp Val Gln Ala Ile Ser Pro Tyr Asp Thr Arg Val Leu Asp Phe Arg

130 135 140

Met Pro Ser Asp Pro Ser Arg Ser Ile Ile Val Ser Thr Glu Glu Glu

145 150 155 160

Phe Leu Leu His Arg Val Val Phe Leu Leu Leu Gly Met Val Leu Met

165 170 175

Ala Val Ala His Thr Leu Ser Glu Ser Val Val Phe Tyr Tyr Gly Gly

180 185 190

Ala Met Thr Ile Gly Ile Phe Leu Val Ile Leu Ile Ile Leu Phe Gln

195 200 205

Gly Met Lys Leu Leu Pro Thr Gly Arg Lys Ser Ser Leu Ala Ile Phe

210 215 220

Val Tyr Ser Ser Leu Val Gly Met Thr Thr Tyr Phe Leu His Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Gly Leu Leu Arg Ser Val Leu Val Glu Ile Gly Ile Ala Glu Asp

245 250 255

Met His Asn Pro Leu Gly Val Phe Leu Leu Val Ser Val Ile Leu Ala

260 265 270

Gly Ala Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Val Arg Lys Leu Val Leu Thr Glu

275 280 285

Glu Gly Ser Val Asp Ala Gly Val Ala Tyr Phe Val Glu Trp Ala Ile

290 295 300

Leu Ile Ile Ser Ala Val Met Ile Leu Gln Ser Ser Leu Asp Tyr Leu

305 310 315 320

Phe Ala Phe Ser Ala Leu Leu Phe Cys Thr Ala Ile Lys Ala Val Ser

325 330 335

Arg Ile Glu Gly Lys Ser Arg Val Leu Arg Cys Leu Ser Arg Ala Phe

340 345 350

Ser Asn Ile Val Pro Thr Gly Tyr Glu Gly Phe Gly Glu Glu Tyr Ser

355 360 365

Ser Met Asn Gly Ser His Gln Asp Gly Phe Ser Lys Leu His Gly Glu

370 375 380

Tyr Met Arg Ser Thr Pro Lys Arg Asn Ser Leu Arg Ser Arg Lys Thr

385 390 395 400

Leu Ser Gln Asp Leu Ala Thr Asp Ser Tyr Tyr Ser Thr Phe His Thr

405 410 415

Asn Pro Glu Arg Lys Lys Phe Ser Glu Glu Glu Tyr Ala Ala Phe Thr

420 425 430

Arg Glu Glu Thr His Lys Ala Met Lys Gln Leu Val Ser Ser Pro Asp

435 440 445

Phe Asn Arg Trp Ala Leu Ala Asn Val Asp Arg Ile Ser Val Thr Pro

450 455 460

Pro Gln Arg Thr Pro Gln Asn Ser Met Ser Gln Gln Arg Lys Arg Leu

465 470 475 480

Phe Gly Leu Phe

Claims

1.水稻基因OsDES1的以下任一应用：

1）用于调控植物雌配子发育；

2）用于调控植物育性；

3）用于调控植物结实率；

其中，基因OsDES1为编码如下蛋白质A的基因：

A、由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为水稻。

2.降低水稻育性或结实率或使水稻雌配子发育异常的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，敲除水稻中的基因OsDES1；其中，基因OsDES1的定义同权利要求1中所述。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以基因OsDES1为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化水稻，获得该基因功能缺失的转基因水稻。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-AGCAGAGAACGAGGCGGCGGTGG-3’。

5.由水稻基因OsDES1突变导致的水稻育性或结实率下降的植株育性或结实率恢复方法，其特征在于，包括：通过质粒将基因OsDES1导入育性或结实率下降的水稻植株中或通过基因工程手段整合到水稻染色体上；其中，基因OsDES1的定义同权利要求1中所述。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将基因OsDES1构建到植物双元表达载体上，转化水稻，获得该基因过表达的转基因水稻。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物双元表达载体为pCUBi1390。

8.根据权利要求2-4任一项所述方法获得的水稻在植物育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。