CN111909936B

CN111909936B - Gt1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用

Info

Publication number: CN111909936B
Application number: CN202010653774.XA
Authority: CN
Inventors: 王海洋; 郭芳燕; 魏洪彬; 孔德鑫; 李春连; 薛伟聪; 杨娟; 景艺峰; 苟亚军
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN111909936A

Abstract

本发明公开了GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用，本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的GT1基因进行了基因编辑，使GT1基因产生大片段的删除；结果显示，GT1突变体植株的分蘖数增加，玉米主轴和分蘖的雄穗小花的心皮不退化，形成花丝，并且观察到gt1突变体大量的腋生分生组织脱抑制发育成雌穗，雌穗的穗柄伸长，柄上长出新的雌穗，形成多果穗。此外，雌花序小穗的下位花不退化。表明敲除GT1基因后，可使玉米突变体植株的雄穗产生雌花特征，并产生果穗表型，促使玉米产生更多的果穗数。多分蘖多穗型玉米可作为青贮玉米的优良品种。因此，可通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑GT1基因改良青贮玉米的产量和品质。

Description

GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用

技术领域

本发明涉及玉米发育生物学和玉米遗传育种技术领域，更具体地，涉及Grassytillers 1(GT1)基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用。

背景技术

玉米(拉丁学名：Zea mays L.)是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，玉米是一年生雌雄同株异花授粉植物，植株高大，茎强壮，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。玉米是雌雄同株异花植物，是研究植物花序性别决定的一个优良遗传系统。玉米的开花过程由顶端分生组织(shootapical meristem，SAM)诱导形成花序分生组织(inflorescence meristem，IM)开始，继而发育为穗对分生组织(spikelet pair meristem，SPM)和小穗分生组织(spikeletmeristem，SM)。SM产生小穗原基，形成2个小花包片或颖片，随后又发端形成2个小花原基(floral primordium)，每个小花原基先后有外稃、内稃、2个浆片(雄穗中具有浆片)、3个雄蕊和一个中心雌蕊发端。随后，在顶端花序中，雌蕊发生了选择性退化，雄蕊发育至成熟，形成具有雄性小花的花序。在腋芽花序中，每个小穗的第1小花雄蕊和第2小花整个花原基退化，雌蕊发育至性成熟，最终发育成具有雌穗小花的花序。可见，玉米的花序经历了无性期、双性期和单性期的发育过程，在穗分化早期，雌雄花序的小穗和小花分化基本是一致的，性别决定发生在双性期，单性花的形成在于花序中不适宜性器官选择性退化。

玉米Grassy tillers 1(GT1)基因编码1个I类同源域亮氨酸拉链(HD-ZIP)转录因子。GT1突变后产生大量分蘖(Whipple et al.,2011)。分蘖是单子叶植物的一种特殊的分枝现象，是禾谷类作物最重要的农艺性状之一，直接决定穗数多少，并进而影响单位面积产量。少分蘖玉米是由多分蘖的祖先进化而来，墨西哥类蜀黍(Zea mays ssp.parviglumis，俗称大刍草、玉米草)就是在驯化过程中的一个很大程度改变植物茎分枝结构的最好例子。从水稻的分蘖、玉米茎的分枝进化研究中确定了分枝基因Teosinte branched 1(TB1)，其作用是抑制侧芽的生长而非侧芽的发生。TB1编码的蛋白属于转录因子TCP家族，以创始成员命名为Teosinte branched 1、CYCLOIDEA和增殖细胞因子1和2。单子叶和双子叶植物中的TB1是保守的，其在高粱、水稻、小麦、豌豆、番茄和拟南芥中的同源性较高。野生墨西哥类蜀黍中TB1的表达很弱或沉默，激活腋芽的进一步发育表现多枝形态；在玉米中TB1的表达升高则抑制腋芽的发育；而玉米仅有一个单轴生长，几乎没有分枝。GT1的功能与TB1类似，突变后促进玉米腋芽(分蘖)生长，并且GT1作用于TB1下游(Whipple et al.,2011)。此外，研究表明GT1基因调控玉米多穗性。在GT1基因上游2.7kb处存在一个控制果穗数的数量性状位点(QTL)prolificacy1.1(pro1.1)。该QTL可使GT1等位基因的表达量增加，从而抑制二级分枝腋芽的生长，减少果穗数目(Wills et al.,2013)。最新研究发现TB1蛋白可结合到GT1启动子的prol.1区域，进而直接调控GT1的表达(Dong et al.2019)。虽然已有研究表明GT1在调控玉米植株分蘖和多果穗发育方面具有重要作用，但是GT1在调控玉米雄花序性别决定方面的功能尚不清楚，而且现有公开的gt1突变体(Whipple et al.,2011)为通过转座体突变获得，表现的多果穗仅为3～4个。青贮玉米是在适宜收获期收获包括果穗在内的地上全部植株，并经切碎、加工，制作青贮饲料的一种玉米。青贮玉米是牛羊优质饲料，特别是奶牛不可或缺的饲料。玉米植株的分蘖可显著提高生物量，并且果穗含有较高的营养物质。因此培育多分蘖多穗型玉米优良品种，提高青贮玉米的产量和质量，具有重要意义。

参考文献：

Dong Z,Xiao Y,Govindarajulu R,Feil R,Siddoway ML,Nielsen T,Lunn JE,Hawkins J,Whipple C,Chuck G.2019.The regulatory landscape of a core maizedomestication module controlling bud dormancy and growth repression.NatureCommunications 10:3810.

Whipple CJ,Kebrom TH,Weber AL,Yang F,Hall D,Meeley R,Schmidt R,Doebley J,Brutnell TP,Jackson DP.2011.Grassy Tillers1 promotes apicaldominance in maize and responds to shade signals in the grasses.Proceedingsof the National Academy of Sciences 108:506–512.

Wills DM,Whipple CJ,Takuno S,Kursel LE,Shannon LM,Ross-Ibarra J,Doebley JF.2013.From many,one:Genetic control of prolificacy during maizedomestication.PLoS Genetics 9:e1003604.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供玉米GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术敲除GT1基因后，在玉米突变体植株中观察到雄花序雌化和多果穗的表型，且多果穗数量有显著提升，该研究结果对玉米花序性别决定和多穗性的遗传改良提供了理论依据。另外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑GT1基因可为青贮玉米的改良提供重要思路。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中GT1基因的两个靶点进行了基因编辑，使GT1基因在分别在两个靶点位置有32个碱基删除及1个碱基删除，得到的GT1基因编辑后序列如SEQ ID NO:2所示。结果显示，gt1突变体植株的分蘖增加，gt1突变体植株的腋生分生组织也脱抑制发育为雌穗，雌穗的穗柄伸长并长出新的雌穗，表现为多穗性表型(果穗数>10)，该表型与文献中报道的Mutator转座子插入gt1突变体的表型一致，但其果穗数仅有3～4个(Whipple et al.,2011)，因此本发明方法获得的多果穗数量与其相比有显著提升。此外，我们首次发现gt1突变体玉米主轴和每个分蘖顶端的雄花序小花中的雌蕊不退化，发育出花丝。并且雄花雌化在较小的分蘖中更加明显。此外，雌花序小穗的下位花不退花。

因此，本发明提供GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用。

具体地，所述GT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体地，为GT1基因的突变在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用。

具体地，为GT1基因的敲除突变在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用。

本发明还提供GT1基因的定点敲除突变基因，所述定点敲除突变基因的序列如SEQID NO:2所示。

还提供SEQ ID NO:2所述GT1敲除突变基因在促进玉米雄花序雌化和/或多果穗发育中的应用。

同时，本发明还提供一种促进玉米雄穗产生雌花特征和/或提高玉米多果穗性状的方法，定点敲除突变玉米中的GT1基因，获得含有SEQ ID NO:2所述的GT1敲除突变基因的突变体。

优选地，所述敲除突变为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行。

进一步优选地，GT1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和或和/或多果穗发育中的应用。利用CRISPR/Cas9转基因技术对玉米中的GT1两个靶点进行了基因编辑，使GT1基因的靶位点有大片段的删除；结果显示，gt1突变体植株的分蘖增加，每个分蘖顶端的雄花序的小花中雌蕊不退化，具有花丝的发育。并且雄花雌化的特征在较小的分蘖中更加明显。此外，gt1突变体植株的腋生分生组织也脱抑制发育为雌穗，雌穗的穗柄伸长并长出新的雌穗，表现为多穗性表型，且与现有gt1突变体相比，多果穗数量有显著提升。本发明表明敲除GT1基因后，可使玉米突变体植株产生大量分蘖，多果穗，并表型出植株雌花的表型，例如雄花小花的心皮不退化以及雌花小穗的下位花不退化。分蘖和多果穗的特征对于提高青贮玉米的产量和质量具有较大的应用前景。

附图说明

图1为GT1转基因植株的基因型鉴定，PCR产物测序后与野生型的序列进行比对。

图2为玉米野生型和gt1突变体植株的分蘖、雌穗多穗性、株高等表型的差异。(A)gt1突变体与野生型相比分蘖数增加；(B)gt1突变体与野生型相比果穗数增加

图3为玉米野生型和gt1突变体雌花序小穗的两个小花的差异。(A)野生型玉米(WT)雌花序小穗的上位花发育健全,而下位花退化消失，成熟时只产生一个籽粒；(B)玉米gt1突变体雌花序小穗的下位花不退化。

图4为玉米野生型和gt1突变体雄花序的差异。野生型玉米(WT)雄穗发育过程中，小花的心皮退化。而gt1突变体中，雄穗小花的心皮不退化，形成花丝(即雌穗的柱头)。分蘖越小，雌化越严重，从第五个分蘖开始，雄穗已经转变为雌穗。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1玉米GT1基因的CRISPR/Cas9转基因植株的构建

1、方法

玉米GT1基因的CRISPR/Cas9敲除载体的构建过程为：首先，利用SnapGene Viewer软件及同源序列比对设计和筛选GT1基因特异的靶标序列(设计sgRNA)，为了保证基因编辑效率，得到两个最优的靶标序列；

靶标序列1(sgRNA)：5’-GACGCCCCGCAAGGTGCAGCTGG-3’(SEQ ID NO:3)；

靶标序列2(sgRNA)：5’-GCTGAAGATGAAGGACAGGCTGG-3’(SEQ ID NO:4)。

之后将这些靶标序列引入到sgRNA表达盒中。同时，将人类中的hSpCas9序列用商业化的

PCR Cloning Kit试剂盒克隆到pCPB载体中，构建成为pCPB-ZmUbi:hSpCas9载体。接着，将两个sgRNA表达盒通过

HD Cloning Kit试剂盒插入到pCPB-ZmUbi:hSpCas9的HindIII酶切位点间。最终构建成的CRISPR/Cas9基因编辑载体经过PCR测序验证无误后用于后续的遗传转化。所构建的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系ZC01材料的愈伤组织，由此获得T0代转基因玉米材料。

2、结果

(1)基因型鉴定

结果如图1所示，显示GT1基因的靶位点有碱基的缺失，导致移码突变，不能转录翻译出有功能的GT1蛋白。具体表现为，GT1基因在靶点1位置有32个碱基删除，在靶点2位置有1个碱基删除，得到了GT1基因编辑后序列如SEQ ID NO:2所述。

(2)转基因植株表型观察

转基因植株表型结果如图2～4所示，玉米gt1突变体植株产生大量分蘖和多果穗表型，与Whipple et al.(2011)报道的突变体植株表型一致，但是利用本发明CRISPR/Cas9编辑技术获得的gt1突变体产生的多果穗数量较现有转座体突变方法显著提升。此外，我们首次观察到gt1突变体主轴和每个分蘖顶端的雄花序小花的雌蕊不退化，具有花丝的发育。并且雄花雌化的特征在较小的分蘖中更加明显。此外，gt1突变体雌花序小穗的下位花不退化，形成一对小花(2个花丝)。以上结果表明敲除GT1基因后，可使玉米突变体植株表现出雄花序雌化和多果穗表型。果穗中含有丰富的糖和蛋白质等养分，可提高青贮饲料的品质。并且分蘖还可以促进生物量积累。因此通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑GT1基因对于提高青贮玉米的产量和品质具有较大的应用前景。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> GT1基因在调控玉米雄花序性别决定和/或多果穗发育中的应用

<141> 2020-07-07

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 925

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

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Claims

1.GT1基因在促进玉米雄花序雌化和提高玉米多果穗性状中的应用，其特征在于，所述GT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述应用为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除突变玉米中的GT1基因，获得GT1基因敲除突变体，GT1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为SEQ ID NO:2所示GT1敲除突变基因在促进玉米雄花序雌化和多果穗发育中的应用。

3.一种促进玉米雄花序雌化和提高玉米多果穗性状中的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除突变玉米中的GT1基因，获得GT1基因敲除突变体；所述GT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，GT1基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3～4所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，定点敲除突变玉米中的GT1基因，获得含有SEQ ID NO:2所述的GT1敲除突变基因的突变体。