JP2023164339A - イネの葉の角度の調節におけるイネOsCKX3遺伝子の使用 - Google Patents
イネの葉の角度の調節におけるイネOsCKX3遺伝子の使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】イネの葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼOsCKX3遺伝子の使用を提供する。【解決手段】本発明は、イネ作物の改良におけるイネ遺伝子OsCKX3またはそれにコードされるタンパク質の応用を開示し、イネの葉枕の発達および葉の角度を調節することにより、イネの株型を改善し、イネの収量を増加させる。【選択図】図1
Description
本発明は、植物遺伝子工学の技術分野に属し、特に、イネの葉の角度の調整におけるイネOsCKX3遺伝子の使用に関する。
現在、中国の年間穀物の総生産量は6.6億トンを超え、そのうち米の生産量は約32%を占めている。しかし、中国の人口増加と生活水準の向上に伴い、穀物生産に対する人々の需要はますます増加している。耕地面積が変わらない現状では、穀物生産、特に米生産を大幅に増加させるには、科学者が高収量で高品質の新品種を開発する必要がある。葉の角度とは、葉と茎との傾斜角のことで、イネの受光面積に大きく影響し、理想的な株型を形成する重要な要素であり、作物栽培において重要な役割を果たしている。直立した葉は密植に適しており、植物間の相互の陰影を減らし、光合成効率を高め、作物収量を増やすことができる(Tong and Chu, 2018)。葉の角度の大きさは主に葉枕によって制御され、葉枕の発達過程で細胞分裂と伸長により、葉の傾斜角度が変化する(Feng et al., 2016)。
植物ホルモンは、葉の角度の調節に重要な役割を果たしている。ブラシノステロイド(brassinosteroid、BR)、ジベレリン酸(gibberellic acid、GA)、およびオーキシン(IAA)はすべて、葉の角度の形成に関与していることがわかっている(Tong and Chu, 2018; Duan et al., 2019)。サイトカイニン(cytokinin、CK)は、作物の形態、生理機能、収量を調節する重要なホルモンの1種であり、幹細胞の分裂、穂の発達、株型、窒素肥料の使用、環境ストレスなどに密接に関連している(Hwang et al., 2012; Wang et al., 2018; Yang et al., 2021)。しかし、葉の角度を調節するCKの分子メカニズムはまだ報告されていない。CKレベルを調節する重要な酵素として、サイトカイニンオキシダーゼ/サイトカイニンデヒドロゲナーゼ(cytokinin dehydrogenase、CKX)はCKの酸化分解を触媒してアデニンと側鎖を生成し、CKを完全に不活性化する(Ashikari et al., 2005)。CKXは、CK活性レベルの調節において重要な役割を果たしている。CKX遺伝子発現量の低下は、CK含有量を大幅に増加させ、頂端分裂組織の形成を促進することができる。シロイヌナズナCKX3CKX5二重変異体の花、さや、および種子の数は大幅に増加し、種子の数は50%以上増加した(Bartrina et al. al., 2011)。イネCKX2およびDST(OsCKX2正の調節遺伝子)変異体では、CK含有量が大幅に増加し、一穂籾数が20%以上増加した(Ashikari, 2005; Li et al., 2013)。イネのOsCKX9は、D53を介してストリゴラクトン(strigolactone, SL)シグナル伝達経路に関与し、イネの分げつ芽の発育を制御する(Duan et al., 2019)。イネのCKX11は、ABA代謝経路に関与し、葉の老化を制御する(Zhang et al., 2021)。イネのOsCKX4は、Znの取り込みの制御にも関与している(Gao et al., 2019)。CKおよびCKX遺伝子は、イネの頂端分裂組織の発達、根の発達、葉の老化および分げつ芽の発達に関与することが確認されている。しかし、葉の角度の形成を調節するCKXのメカニズムおよびその応用はまだ研究されていない。
本発明が解決しようとする技術的課題は、イネの葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼOsCKX3遺伝子の使用を提供することである。
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、イネ遺伝子OsCKX3またはそれにコードされるタンパク質のイネ作物改良における使用、すなわちイネの葉の角度の調節を提供する。
本発明の使用の改良としては、イネの葉枕の発達と葉の角度を調節し、イネの品種を改良し、イネの収量を増加させる。
本発明の使用のさらなる改良としては、イネ遺伝子OsCKX3のヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 1に示されるとおりである。また、それに相補的なヌクレオチド配列、同種のヌクレオチド配列、あるいは、配列中のいくつかのヌクレオチドを挿入または突然変異させることによって形成される、同じ機能を有するヌクレオチド配列も含まれる。
本発明の使用のさらなる改良としては、遺伝子OsCKX3によってコードされるアミノ酸配列がSEQ ID NO: 2に示されるとおりである。
本発明の使用のさらなる改良としては、OsCKX3遺伝子をノックアウトすることにより、葉の角度が小さくなり、稲粒が大きくなる。
本発明の使用のさらなる改良としては、OsCKX3が過剰発現することにより、イネの葉の角度を増加させる。
本発明の使用のさらなる改良としては、OsCKX3変異体のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 4~ SEQ ID NO: 5のいずれかに示されるとおりである。
本発明はまた、植物の葉の角度を調節する際にイネOsCKX3遺伝子を編集するためのgRNA標的配列の使用を提供する。前記gRNAの標的配列は、イネOsCKX3遺伝子のCDSセンス鎖の332番目から351番目の位置にあり、そのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 3に示されるとおりである。
本発明は、イネの葉の角度を調節する正の調節因子とその使用を提案するもので、リバースジェネティクスアプローチを用いて、イネの葉枕組織の細胞分裂と成長に関与することで、葉の角度の大きさを調節するOsCKX3遺伝子をスクリーニングした。本発明は、イネの葉の角度を調節する遺伝子の分子生物学的機能および使用を研究し、密に植えられた高収量の新しいイネ品種を育種するための潜在的な新しい遺伝子資源を提供する。
本発明は、イネの葉の角度を調節する正の調節因子を取得し、その正の調節因子は遺伝子OsCKX3であり、塩基配列はSEQ ID NO: 1に示されるとおりであり、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 2に示されるとおりである。植物の葉の角度の調節におけるイネOsCKX3遺伝子の使用は、具体的には次のとおりである。OsCKX3遺伝子は、イネの葉の角度の形成を調節するために、葉枕の細胞の非対称成長を調節することにより、葉枕の発達を調節する。
本発明の技術的な解決手段は、以下のように実現される。
本発明において、11個のOsCKX遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、OsCKX3変異体は葉の角度が著しく小さいことが見出され、異なる発育段階においてのイネの葉の角度が表れた形はすべて、OsCKX3が葉の角度の大きさを調節することを証明した。
本発明において、11個のOsCKX遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、OsCKX3変異体は葉の角度が著しく小さいことが見出され、異なる発育段階においてのイネの葉の角度が表れた形はすべて、OsCKX3が葉の角度の大きさを調節することを証明した。
使用の際、OsCKX3のCRISPR/CAS9ベクターを構築し、アグロバクテリウムを介した方法で日本晴に導入し、OsCKX3遺伝子をノックアウトしたところ、得られたノックアウト変異体の葉の角度が著しく小さくなる。したがって、この方法は、葉枕組織のサイトカイニン含有量を増やし、葉枕細胞層の数を増やし、葉の角度を減らし、イネの株型と植え付け密度を改善し、収量を増やすことができる。
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を奏する。
1. OsCKX3遺伝子は、他の収量特性を弱めることなく作物の葉の角度を変化させ、コンパクトな植物サイズと小さな葉の角度を持つイネ育種材料を作成できる。これは、イネ育種にとって重要な実用的意義を持っている。
1. OsCKX3遺伝子は、他の収量特性を弱めることなく作物の葉の角度を変化させ、コンパクトな植物サイズと小さな葉の角度を持つイネ育種材料を作成できる。これは、イネ育種にとって重要な実用的意義を持っている。
2. OsCKX3遺伝子は、葉の角度の大きさを変えるのに有効な遺伝子で、葉枕の細胞層の数と維管束の数を変えることによって、イネの葉の角度を変えることができる。
3. 現在、サイトカイニンによる葉の角度を調節する遺伝子についての報告はなく、本発明の遺伝子は、葉枕のサイトカイニンの含有量を制御することにより、葉の角度の調節に関与していることが明らかになった。
葉の角度を調節するための本発明におけるOsCKX3の発見およびその使用は、葉の角度を調節するCKに関する技術の空白を埋め、イネの密植を改善し、イネの収量を増加させるための潜在的な応用価値を有する遺伝子を提供する。
サイトカイニン含有量の増加を促進することと、イネの葉の角度を調節することとの間には必ずしも関係がないことに注意する必要がある。例えば、現在知られているOsCKX2遺伝子やOsCKX11遺伝子はいずれもサイトカイニン量の増加を促進する機能を持っているが、イネの葉の角度との相関についての報告がなされていない。
以上の説明を要約すると、本発明は、植物遺伝子工学の分野に関し、特に、植物の葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼOsCKX3遺伝子の使用に関する。本発明は、CRISPR/CAS9技術を使用して日本晴イネ遺伝子OsCKX3をノックアウトし、トランスジェニック技術を使用して、OsCKX3過剰発現材料を得る。野生型と比較して、突然変異体の葉の角度は大幅に減少し、株型はより直立になるが、一方、過剰発現材料の葉の角度は大幅に増加する。ホルモン分析により、突然変異体のサイトカイニン含有量が著しく増加したことが示された。また、葉枕の細胞学的な構造観察により、突然変異体の葉枕の向軸端と背軸端の細胞層と維管束の数が著しく増加したことが観察された。そのサイトカイニンは細胞数を増やし、葉の角度の形成を変化させることを示した。農業形質の分析は、突然変異体の米粒サイズが有意に増加し、過剰発現材料の粒サイズが著しく小さいことを示した。そのため、遺伝子組換え技術によりOsCKX3遺伝子をノックアウトすることで、イネの葉の形成角度や稲粒の大きさを変化させ、植物の形状や植栽密度を改善し、収量を増やすことができる。
以下、図面を参照しながら、本発明に係る実施形態について、さらに具体的に説明する。
本発明の目的、技術的解決手段および利点をより明確にするために、本発明は、実施形態を介して以下でさらに詳細に説明される。ここに記載された特定の実施形態は、本発明を限定するものではなく、本発明を説明するためにのみ使用されることを理解されたい。
本発明の目的、技術的解決手段および利点をより明確にするために、本発明は、実施形態を介して以下でさらに詳細に説明される。ここに記載された特定の実施形態は、本発明を限定するものではなく、本発明を説明するためにのみ使用されることを理解されたい。
本発明の実施形態に係るイネの葉の角度を調節する遺伝子は、イネOsCKX3変異体を同定することによって得られる。
本発明の実施形態において、OsCKX3のCDS配列は、SEQ ID No: 1に示されるとおり、または、SEQ ID No: 1に示されるCDS配列と少なくとも70%の相同性を有するDNA配列であり、または、それらのいくつか置換、挿入、または欠失によって得られる機能的類似体である。
本発明の実施形態において、OsCKX3によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID No: 2である。
本発明に係る野生型イネは日本晴である。
本発明に係る従来の大腸菌DH5α株、アグロバクテリウムGV3101株、EHA105株はいずれも市場から購入することができる。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。
(実施形態1)
イネサイトカイニンオキシダーゼOsCKX3変異体を得る。
1. OsCKX3遺伝子CRISPR/Cas9ベクター導入遺伝子
イネゲノムアノテーションプロジェクトにおけるイネOsCKX3の遺伝子番号はLOC_Os10g34230であり、SEQ ID No: 1はOsCKX3の完全な読み取り枠配列であり、そのアミノ酸配列は配列表のSEQ ID No: 2である。
イネサイトカイニンオキシダーゼOsCKX3変異体を得る。
1. OsCKX3遺伝子CRISPR/Cas9ベクター導入遺伝子
イネゲノムアノテーションプロジェクトにおけるイネOsCKX3の遺伝子番号はLOC_Os10g34230であり、SEQ ID No: 1はOsCKX3の完全な読み取り枠配列であり、そのアミノ酸配列は配列表のSEQ ID No: 2である。
CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトベクターpGEB31-OsCKX3の構築と転換を行う。具体的には、遺伝子OsCKX3のCDS配列の332~351bp配列を標的部位(GAATTCAATCTCAGAAGGCA)として選択し、それをノックアウトベクターpRGEB31に接続し、pRGEB31- OsCKX3ベクターを構築する。そのあと、通常の方法(武漢伯遠生物科技有限公司に委託)に従って形質転換を行い、OsCKX3遺伝子のノックアウト株系を取得する。
2. イネゲノムDNAの抽出
OsCKX3変異体(ステップ1で得られたOsCKX3遺伝子ノックアウト株系)のイネ葉約0.05gを2mL遠沈管に入れ、スチールビーズと500μL CTAB溶液(100mM Tris-HCl (pH8.0)(1M母液を予め配合する)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2% CTAB)を加え、組織粉砕機で40Hz、60秒間粉砕し、65℃の水浴に20分間入れ、10,000rpmで5分間遠心分離する。400μLの上清を取り、新しい1.5mLの遠沈管に加え、同じ体積のクロロホルムを加え、よく混ぜて、室温で5分間放置する。その後、12,000rpmで10分間遠心分離し、上清300μLを注意深く吸引し、そして、2倍積の無水エタノールを加えて、上下反転して均一に混合し、-20℃で30分間放置する。それを12000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、残液を吸引除去し、室温で5~10分間静置すると、小さな白い斑点が透明になり、すぐに30~50μLの水またはTEを加えて溶解し、やさしく混ぜて均一に混合し、遠心分離して、将来の使用のために-20℃で保存する。
OsCKX3変異体(ステップ1で得られたOsCKX3遺伝子ノックアウト株系)のイネ葉約0.05gを2mL遠沈管に入れ、スチールビーズと500μL CTAB溶液(100mM Tris-HCl (pH8.0)(1M母液を予め配合する)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2% CTAB)を加え、組織粉砕機で40Hz、60秒間粉砕し、65℃の水浴に20分間入れ、10,000rpmで5分間遠心分離する。400μLの上清を取り、新しい1.5mLの遠沈管に加え、同じ体積のクロロホルムを加え、よく混ぜて、室温で5分間放置する。その後、12,000rpmで10分間遠心分離し、上清300μLを注意深く吸引し、そして、2倍積の無水エタノールを加えて、上下反転して均一に混合し、-20℃で30分間放置する。それを12000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、残液を吸引除去し、室温で5~10分間静置すると、小さな白い斑点が透明になり、すぐに30~50μLの水またはTEを加えて溶解し、やさしく混ぜて均一に混合し、遠心分離して、将来の使用のために-20℃で保存する。
3. ノックアウト材料の標的配列遺伝子型の検出
上記ステップ2で得られたイネ遺伝子OsCKX3ノックアウトT0世代材料のゲノムDNAを鋳型として、プライマーペアOsCKX3 crispr-F(5’-CCTGCTCATCCTCATCCTTTT -3’)およびOsCKX3 crispr-R(5’-GGGCAAATATAGACCTTAT-3)’)を用いて、PCR増幅を行う。
上記ステップ2で得られたイネ遺伝子OsCKX3ノックアウトT0世代材料のゲノムDNAを鋳型として、プライマーペアOsCKX3 crispr-F(5’-CCTGCTCATCCTCATCCTTTT -3’)およびOsCKX3 crispr-R(5’-GGGCAAATATAGACCTTAT-3)’)を用いて、PCR増幅を行う。
PCR増幅システムの総量は50μLであり、テンプレートは1μLのゲノムDNA(約 50ng)、25μLの2×KOD酵素反応バッファー、10μLの2mM dNTP、4μLの10Mプライマー(各プライマー2μL)、KOD酵素1μL、ddH2O(滅菌脱イオン水)を50μLに加える。
PCRプログラムは、95℃で5分間の予備変性し、続いてPCRサイクルに入り、パラメーターは、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長でPCRサイクルを実施し、合計35サイクルを行う。スクリーニングにより、T0世代の陽性トランスジェニック植物を得る(陽性植物のPCR増幅産物のサイズは597bpであった)。結果を図1に示し、2つの独立したOsCKX3変異体が取得され、それぞれ1塩基Cが挿入された変異株と25bpが削除された変異株であって、その表現型の観察を行う。
OsCKX3-1の配列はSEQ ID NO: 4に示されている。
OsCKX3-3の配列はSEQ ID NO: 5に示されている。
OsCKX3-3の配列はSEQ ID NO: 5に示されている。
(実施形態2)
OsCKX3過剰発現材料の取得
1. 融合タンパク質OsCKX3-GFPベクターの構築
(1) イネの総RNAの抽出
野生型イネ日本晴の葉をとり、素早く粉末状にすりつぶし、その粉末(約0.1g)をRNaseフリーの1.5mL遠沈管に素早く移す(予めTrizol 1mLを入れておく)。10秒間ボルテックスし、室温で5分間静置した後、4℃、12,000gで10分間遠心分離し、上清を新しい1.5mL遠沈管に移す。遠沈管に200μLのクロロホルムを加え、上下反転させてよく混ぜ、室温で5分間放置し、4℃、12,000gで15分間遠心分離する。上層の水相300μLを新しい1.5mL遠沈管に移し、イソプロパノール300μLを加えてよく混ぜ、室温で10分間放置し、4℃、12,000gで10分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を保持し、1mLの70%(DEPCで調製)アルコールを加えて沈殿物を洗浄し、沈殿物を吸引して再懸濁し、4℃、7500gで、5分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を残し、軽く遠心し、ピペットチップで余分なアルコールを吸い取り、室温で5分間放置し、RNAを乾燥させる。50μLのDEPC水を加えて沈殿物を溶解し、溶解後氷上に置き、cDNA合成用RNAの濃度を測定し、-80℃の冷蔵庫に保存する。
OsCKX3過剰発現材料の取得
1. 融合タンパク質OsCKX3-GFPベクターの構築
(1) イネの総RNAの抽出
野生型イネ日本晴の葉をとり、素早く粉末状にすりつぶし、その粉末(約0.1g)をRNaseフリーの1.5mL遠沈管に素早く移す(予めTrizol 1mLを入れておく)。10秒間ボルテックスし、室温で5分間静置した後、4℃、12,000gで10分間遠心分離し、上清を新しい1.5mL遠沈管に移す。遠沈管に200μLのクロロホルムを加え、上下反転させてよく混ぜ、室温で5分間放置し、4℃、12,000gで15分間遠心分離する。上層の水相300μLを新しい1.5mL遠沈管に移し、イソプロパノール300μLを加えてよく混ぜ、室温で10分間放置し、4℃、12,000gで10分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を保持し、1mLの70%(DEPCで調製)アルコールを加えて沈殿物を洗浄し、沈殿物を吸引して再懸濁し、4℃、7500gで、5分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を残し、軽く遠心し、ピペットチップで余分なアルコールを吸い取り、室温で5分間放置し、RNAを乾燥させる。50μLのDEPC水を加えて沈殿物を溶解し、溶解後氷上に置き、cDNA合成用RNAの濃度を測定し、-80℃の冷蔵庫に保存する。
(2) 第一鎖cDNAの逆転写
抽出した全RNAは、TAKARAのPrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kitの説明書に従って逆転写し、第1鎖cDNA産物を得て、-20℃で保存する。
抽出した全RNAは、TAKARAのPrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kitの説明書に従って逆転写し、第1鎖cDNA産物を得て、-20℃で保存する。
(3) プラスミドOsCKX3-GFPの構築
OsCKX3遺伝子配列(SEQ ID NO: 1)によって、下記のプライマー対を設計する。
OsCKX3-GFP-F (5’- GCAGGCTCCGAATTCATGGAGGTTGCCATGGTCTG -3’) および OsCKX3-GFP-R(5’- GAAAGCTGGGTCGAATTCTCAGCTATAGCTTGCAAA -3’)。
OsCKX3遺伝子配列(SEQ ID NO: 1)によって、下記のプライマー対を設計する。
OsCKX3-GFP-F (5’- GCAGGCTCCGAATTCATGGAGGTTGCCATGGTCTG -3’) および OsCKX3-GFP-R(5’- GAAAGCTGGGTCGAATTCTCAGCTATAGCTTGCAAA -3’)。
日本晴のcDNAを鋳型として、ハイフィデリティ酵素を用いてPCR増幅を行った。PCR増幅系は50 μLであって、テンプレートcDNA 1μL(約50ng)、2×KOD酵素反応バッファー25μL、2mM dNTP 10μL、10uM プライマー 4μL(各プライマーは 2μL)、KOD酵素 1μL、ddH2O(滅菌脱イオン水)を50μLに加える。
PCR増幅条件は、94℃で5分間、30サイクル(98℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で2分間、30秒間)、68℃で10分間であって、OsCKX3 CDSフラグメントを得る(増幅産物のサイズは1584bp、配列SEQ ID NO: 1)。増幅産物をアガロースゲル回収キットで回収し、ワンステップクローニング法でPCR8ベクターに連結し、構築したベクターをLR反応によりpMDC43ベクターに構築し、OsCKX3-GFPベクターを得る。
2. OsCKX3過剰発現材料の取得
(1) OsCKX3過剰発現材料の構築
OsCKX3-GFPベクターを取得した後、武漢伯遠生物科学技術有限公司によって、日本晴材料の形質転換を行い、OsCKX3過剰発現材料を得る。
(1) OsCKX3過剰発現材料の構築
OsCKX3-GFPベクターを取得した後、武漢伯遠生物科学技術有限公司によって、日本晴材料の形質転換を行い、OsCKX3過剰発現材料を得る。
(2) OsCKX3過剰発現材料におけるOsCKX3発現量の解析
OsCKX3過剰発現材料のRNAを抽出し、リバースし、以下のプライマーを用いてOsCKX3の発現量を検出したところ、図1Cの結果となり、過剰発現材料にOsCKX3が高発現していることを示している。
OsCKX3過剰発現材料のRNAを抽出し、リバースし、以下のプライマーを用いてOsCKX3の発現量を検出したところ、図1Cの結果となり、過剰発現材料にOsCKX3が高発現していることを示している。
以下のプライマーを使用して、OsCKX3遺伝子の発現を分析する。
プライマーF: 5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’
プライマーR: 5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’
プライマーF: 5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’
プライマーR: 5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’
また、使用した内部参照遺伝子Ubiquitin5のプライマーは次のとおりである。
プライマーF: 5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’
プライマーR: 5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。
プライマーF: 5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’
プライマーR: 5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。
図1Cでは、NIPは日本晴野生型を表し、OE1~OE2はOsCKX3過剰発現材料の2つの系統を表す。
(実施形態3)
イネ変異体および過剰発現材料の表現型同定
野生型日本晴、OsCKX3ノックアウト変異体、OsCKX3過剰発現材料の葉の角度をそれぞれ観察する。播種後10日間正常に成長し、葉3枚、茎1本の段階まで成長した後、第1葉の葉枕部を撮影し、ソフトウェアimage Jを使用して不完全葉に対して、葉の角度を測定する。葉枕を交点とし、葉面を一辺の線、葉鞘をもう一辺の線とする。その発生表現型を図2に示す。OsCKX3変異体は、野生型と比較して葉の角度の表現型が大幅に減少し、過剰発現材料は葉の角度の表現型が大幅に増加していることが分かる。これは、OsCKX3がイネの葉の角度を変化させることができることを示している。
イネ変異体および過剰発現材料の表現型同定
野生型日本晴、OsCKX3ノックアウト変異体、OsCKX3過剰発現材料の葉の角度をそれぞれ観察する。播種後10日間正常に成長し、葉3枚、茎1本の段階まで成長した後、第1葉の葉枕部を撮影し、ソフトウェアimage Jを使用して不完全葉に対して、葉の角度を測定する。葉枕を交点とし、葉面を一辺の線、葉鞘をもう一辺の線とする。その発生表現型を図2に示す。OsCKX3変異体は、野生型と比較して葉の角度の表現型が大幅に減少し、過剰発現材料は葉の角度の表現型が大幅に増加していることが分かる。これは、OsCKX3がイネの葉の角度を変化させることができることを示している。
葉枕組織切片の観察(図3A~I)により、変異体の葉枕部の向軸端から維管束までの距離(d1)がわずかに短く、葉枕部の背軸端から維管束までの距離(d2)が著しく長くなる。一方、過剰発現材料のd1とd2は両方とも短くなる(図2D~J)。変異体は、背軸端の細胞層数と維管束の数が顕著に増加した(図2K~L)。結果として、OsCKX3が葉枕の長さと背軸端の長さを調節することによって葉の角度を調節することを示している。
120日の正常な成長から成熟までの日本晴、OsCKX3変異体、およびOsCKX3過剰発現材料を観察し、農業形質の統計結果を図6に示す。OsCKX3変異体は、より大きな稲粒になるが、他の形質に有意差はない。OsCKX3変異体には、葉の角度を小さくして稲粒を大きくする有益な形質があるが、他の形質には影響しないことを示している。これは、葉の角度を小さくすることが可能な他の多くの変異体と異なり、それらの変異体は、収量特性にも影響を与える。OsCKX3は、イネ収量を改善するための潜在的な新しい遺伝子資源として使用できることを示している。
(実施形態4)
OsCKX3遺伝子発現解析
1. ProOsCKX3::GUSベクターの構築
日本晴のイネゲノムDNAを鋳型とし、以下のプライマーペア:
OsCKX3 pro-F(5’-GCAGGCTCCGAATTCGTCCATTAGCACCACCAAAAT-3’)、およびOsCKX3 pro-R (5’-AAGCTGGGTCGAATTCGGTGTTGGAGTAGTGATTCT-3’)を用いてPCRで増幅した。PCR増幅システムの総量は50μLで、テンプレートは1μLのゲノムDNA(約50ng)、25μLの2×KOD酵素反応バッファー、10μLの2mM dNTP、4μLの10uM プライマー(各プライマー2μL)、1μLのKOD酵素、およびddH2O(滅菌脱イオン水)を50μLに添加する。
OsCKX3遺伝子発現解析
1. ProOsCKX3::GUSベクターの構築
日本晴のイネゲノムDNAを鋳型とし、以下のプライマーペア:
OsCKX3 pro-F(5’-GCAGGCTCCGAATTCGTCCATTAGCACCACCAAAAT-3’)、およびOsCKX3 pro-R (5’-AAGCTGGGTCGAATTCGGTGTTGGAGTAGTGATTCT-3’)を用いてPCRで増幅した。PCR増幅システムの総量は50μLで、テンプレートは1μLのゲノムDNA(約50ng)、25μLの2×KOD酵素反応バッファー、10μLの2mM dNTP、4μLの10uM プライマー(各プライマー2μL)、1μLのKOD酵素、およびddH2O(滅菌脱イオン水)を50μLに添加する。
PCRプログラムは、95℃で5分間の予備変性し、続いてPCTのサイクルに入り、パラメーターとして95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長でPCRサイクルを実施し、合計35サイクルを行う。OsCKX3プロモーター配列(配列は配列表のSEQ ID NO: 6)を取得する。増幅産物をアガロースゲル回収キットで回収し、ワンステップクローニング法でPCR8ベクターに結合し、構築したベクターをLR反応に使用pMDC163ベクターに構築し、ProOsCKX3::GUSベクターを取得する。その後、常法(武漢伯遠生物科学技術有限公司に委託)に従って形質転換を行い、ProOsCKX3::GUS形質転換植物を得る。
ProOsCKX3の配列は、SEQ ID NO: 6に示されている。
2. OsCKX3遺伝子発現解析
ステップ1で得られたProOsCKX3::GUS形質転換植物の実生、成葉、節、葉枕を採取し、GUS染色法により目的遺伝子の発現状況を解析する。トランスジェニック植物のサンプルを90%アセトンで満たされた予冷ガラス瓶に入れ、室温で30分間放置する。氷水で2回洗浄した後、サンプルをGUS染色液に移し、37℃で4~20時間染色する。染色したサンプルをエタノール:酢酸=3:1の脱色液に2~12時間入れ脱色する。脱色が完了したら、デジタルカメラまたは顕微鏡を使用して写真を撮り、染色結果を記録する。葉枕部切片観察用サンプルはFAA固定液で固定する必要があり、具体的に固定液の成分は1mL 38%ホルムアルデヒド(最終濃度2%)、1mL 氷酢酸、18mL 50%アルコールであり、さらに樹脂に埋め込む。半薄切りスライサーを使用して厚さ7μmの切片を得て、葉枕部組織の観察に用いる。OsCKX3の発現解析は、TaKaRa社のSYBR Greenの操作説明書に従って行い、異なる組織をテンプレートとして使用し、OsCKX3の定量的プライマーと内部参照遺伝子Ubiquitin5を使用して標的遺伝子を増幅し、OsCKX3の発現を検出する。図4A~Eの結果は、OsCKX3が葉枕部で高度に発現していることを示している。図4Fの結果は、OsCKX3遺伝子がBL、tZおよびiPホルモンによって誘導されることを示している。
ステップ1で得られたProOsCKX3::GUS形質転換植物の実生、成葉、節、葉枕を採取し、GUS染色法により目的遺伝子の発現状況を解析する。トランスジェニック植物のサンプルを90%アセトンで満たされた予冷ガラス瓶に入れ、室温で30分間放置する。氷水で2回洗浄した後、サンプルをGUS染色液に移し、37℃で4~20時間染色する。染色したサンプルをエタノール:酢酸=3:1の脱色液に2~12時間入れ脱色する。脱色が完了したら、デジタルカメラまたは顕微鏡を使用して写真を撮り、染色結果を記録する。葉枕部切片観察用サンプルはFAA固定液で固定する必要があり、具体的に固定液の成分は1mL 38%ホルムアルデヒド(最終濃度2%)、1mL 氷酢酸、18mL 50%アルコールであり、さらに樹脂に埋め込む。半薄切りスライサーを使用して厚さ7μmの切片を得て、葉枕部組織の観察に用いる。OsCKX3の発現解析は、TaKaRa社のSYBR Greenの操作説明書に従って行い、異なる組織をテンプレートとして使用し、OsCKX3の定量的プライマーと内部参照遺伝子Ubiquitin5を使用して標的遺伝子を増幅し、OsCKX3の発現を検出する。図4A~Eの結果は、OsCKX3が葉枕部で高度に発現していることを示している。図4Fの結果は、OsCKX3遺伝子がBL、tZおよびiPホルモンによって誘導されることを示している。
以下のプライマーを使用して、OsCKX3遺伝子の発現を分析する。
プライマー F: 5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’
プライマー R: 5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’
プライマー F: 5’-AGGCCCTTGATGGCATTGTAG-3’
プライマー R: 5’-CCACCACCCACATCAGCATAA-3’
使用した内部参照遺伝子Ubiquitin5プライマーは次のとおりである。
プライマー F: 5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’
プライマー R: 5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。
プライマー F: 5’-GCACAAGCACAAGAAGGTGA-3’
プライマー R: 5’-CCAAAGAACAGGAGCCTACG-3’。
(実施形態5)
OsCKX3の細胞内局在
実施例2で得られたOsCKX3-GFPベクターをアグロバクテリウムGV3101に形質転換し、LB固形培地に画線し、1~2日間培養した後、実験用のシングルコロニーを選択する。5mLの対応する抗生物質を含むLB液体培養液の中から単一のクローンを選び、28℃、200~220rpmで1日間振盪しながら培養する。アグロバクテリウムを、OD600が約0.3になるようにカナ抗生物質を含むLB液体培地20mLに移し(培地20mLに対して1.5mL)、28℃で振とうしながら培養する。菌液のOD600値を検査し、1.5程度の値になれば十分である。事前に再懸濁液を準備し(滅菌 ddH2O、0.01M MgCl2、0.01M MESおよび100μM AS)、6000rpmで5分間細菌を収集する。最初に2mLの再懸濁液を使用し、次に6~8mLの再懸濁液を加え、6000rpmで5分間遠心分離する。上清を捨て、再懸濁溶液に2mLの再懸濁溶液を加え、最後に15mLの再懸濁溶液を加える。28℃で2~3時間の暗培養後にタバコを注入する。異なる菌液を含む侵入液を5mLの遠沈管で1:1:1の割合で混合し、よく振った後、1mLの注射器に充填し、親指で注射器を押しながら、葉の下表皮からタバコ葉(子葉は使用せず)に注入する。注入後、タバコの葉は湿潤現象が発生するため、注入穴の数をなるべく少なくする。タバコは培養3日後に観察し、結果を図4Gに示す。OsCKX3-GFP(左から1番目)と小胞体メーカー蛍光(左から2番目)が融合し(左から4番目)、明視野は左から3番目であり、OsCKX3が小胞体に局在することを示している。
OsCKX3の細胞内局在
実施例2で得られたOsCKX3-GFPベクターをアグロバクテリウムGV3101に形質転換し、LB固形培地に画線し、1~2日間培養した後、実験用のシングルコロニーを選択する。5mLの対応する抗生物質を含むLB液体培養液の中から単一のクローンを選び、28℃、200~220rpmで1日間振盪しながら培養する。アグロバクテリウムを、OD600が約0.3になるようにカナ抗生物質を含むLB液体培地20mLに移し(培地20mLに対して1.5mL)、28℃で振とうしながら培養する。菌液のOD600値を検査し、1.5程度の値になれば十分である。事前に再懸濁液を準備し(滅菌 ddH2O、0.01M MgCl2、0.01M MESおよび100μM AS)、6000rpmで5分間細菌を収集する。最初に2mLの再懸濁液を使用し、次に6~8mLの再懸濁液を加え、6000rpmで5分間遠心分離する。上清を捨て、再懸濁溶液に2mLの再懸濁溶液を加え、最後に15mLの再懸濁溶液を加える。28℃で2~3時間の暗培養後にタバコを注入する。異なる菌液を含む侵入液を5mLの遠沈管で1:1:1の割合で混合し、よく振った後、1mLの注射器に充填し、親指で注射器を押しながら、葉の下表皮からタバコ葉(子葉は使用せず)に注入する。注入後、タバコの葉は湿潤現象が発生するため、注入穴の数をなるべく少なくする。タバコは培養3日後に観察し、結果を図4Gに示す。OsCKX3-GFP(左から1番目)と小胞体メーカー蛍光(左から2番目)が融合し(左から4番目)、明視野は左から3番目であり、OsCKX3が小胞体に局在することを示している。
(実施形態6)
OsCKX3の生化学的活性の検出
1. in vitroでのOsCKX3活性検出
(1) OsCKX3-MBPベクター構築
次のプライマーを使用してOsCKX3を増幅し、pMALベクターに接続し、大腸菌BL21(DE3 Invitrogen)に形質転換し、0.5mM IPTGを加えて発現を誘導し、Amylose Resin(New England Biolabs Inc.)を使用して目的のタンパク質を精製し、MBP-OsCKX3融合タンパク質を取得する。
OsCKX3の生化学的活性の検出
1. in vitroでのOsCKX3活性検出
(1) OsCKX3-MBPベクター構築
次のプライマーを使用してOsCKX3を増幅し、pMALベクターに接続し、大腸菌BL21(DE3 Invitrogen)に形質転換し、0.5mM IPTGを加えて発現を誘導し、Amylose Resin(New England Biolabs Inc.)を使用して目的のタンパク質を精製し、MBP-OsCKX3融合タンパク質を取得する。
pMAL-c2XベクターのOsCKX3増幅プライマーを構築する。
OsCKX3-pMAL F: GAAGGATTTCAGAATTCATGGAGGTTGCCATGGTCTG
OsCKX3-pMAL R: CTAGAGGATCCGAATTCTCAGCTATAGCTTGCAAATG
OsCKX3-pMAL F: GAAGGATTTCAGAATTCATGGAGGTTGCCATGGTCTG
OsCKX3-pMAL R: CTAGAGGATCCGAATTCTCAGCTATAGCTTGCAAATG
(2) 活性の検出
各反応液(100μL)に14μg MBP-OsCKX3融合タンパク質、0.1mMサイトカイニン基質(iPとtZ)、0.5mM 2,6-dichlorophenol indophenol(DCIP)、75mM Tris/HCL buffer (pH 8.5)を加え、37℃の水浴で30分間反応させる。その後、直ちにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。4°C、12,000gで10分間遠心分離する。上清をろ過し、HPLCを使用して基質の減少量を定量的に検出する。図5Aと5Bの結果は、OsCKX3がtZとiPを触媒できることを示している。
各反応液(100μL)に14μg MBP-OsCKX3融合タンパク質、0.1mMサイトカイニン基質(iPとtZ)、0.5mM 2,6-dichlorophenol indophenol(DCIP)、75mM Tris/HCL buffer (pH 8.5)を加え、37℃の水浴で30分間反応させる。その後、直ちにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。4°C、12,000gで10分間遠心分離する。上清をろ過し、HPLCを使用して基質の減少量を定量的に検出する。図5Aと5Bの結果は、OsCKX3がtZとiPを触媒できることを示している。
2. in vivo活性の検出
(1)CKの抽出
サンプル50mgを2mL遠沈管(Eppendorf)に入れ、スチールボールを加え、すばやく液体窒素に入れ、ミル(Tissuelyser-48、Shanghai Jingxin Experimental Technology Co.、Ltd.)を使用してサンプルを粉砕する。粉末にした後、1.6mLの80%メタノールと対応する内部標準として、50pgの[2H5]tZ,[2H5]tZR,[2H6]iP,[2H6]iPRを添加する。混合物の入った遠沈管を回転機で4℃、2時間回転混合し、4℃、15,000gで10分間遠心分離する。上清を新しい遠沈管に注意深く吸引し、窒素下でブロードライする。残りの沈殿物に80%メタノール溶液0.6mLを加えて再度混合し、上記の操作を繰り返す。最後に、上清を2mLの遠沈管に加え、窒素下で乾燥させ、300μLの30%メタノールに再溶解させる。この溶液を0.22μmの水性フィルター膜を用いてろ過して使用に備える。
(1)CKの抽出
サンプル50mgを2mL遠沈管(Eppendorf)に入れ、スチールボールを加え、すばやく液体窒素に入れ、ミル(Tissuelyser-48、Shanghai Jingxin Experimental Technology Co.、Ltd.)を使用してサンプルを粉砕する。粉末にした後、1.6mLの80%メタノールと対応する内部標準として、50pgの[2H5]tZ,[2H5]tZR,[2H6]iP,[2H6]iPRを添加する。混合物の入った遠沈管を回転機で4℃、2時間回転混合し、4℃、15,000gで10分間遠心分離する。上清を新しい遠沈管に注意深く吸引し、窒素下でブロードライする。残りの沈殿物に80%メタノール溶液0.6mLを加えて再度混合し、上記の操作を繰り返す。最後に、上清を2mLの遠沈管に加え、窒素下で乾燥させ、300μLの30%メタノールに再溶解させる。この溶液を0.22μmの水性フィルター膜を用いてろ過して使用に備える。
(2) GC-MSシステムを用いたCK含有量の測定
CK抽出物は、Acquity UPLC BEH C18型分離カラムアセンブリを備えたExionLC(AB SCIEX)液体クロマトグラフィーシステムを使用して分離する。カラムは、まず40℃で平衡化させ、その後30μLのサンプルを加えて分析を行う。CKの分析において、移動相成分Aは水、Bはメタノールであり、多段階の直線勾配溶出法によって溶出される。具体的なステップは、0~2.5min:5%A;2.5~3min:5~20%B;3~12.5min:20~50%B;12.5~13min:50~100%B;13~15min:100%B;15~15.2min:100~5%B;15.2~18min:5%Bである。流量は0.3mL/minに設定する。
CK抽出物は、Acquity UPLC BEH C18型分離カラムアセンブリを備えたExionLC(AB SCIEX)液体クロマトグラフィーシステムを使用して分離する。カラムは、まず40℃で平衡化させ、その後30μLのサンプルを加えて分析を行う。CKの分析において、移動相成分Aは水、Bはメタノールであり、多段階の直線勾配溶出法によって溶出される。具体的なステップは、0~2.5min:5%A;2.5~3min:5~20%B;3~12.5min:20~50%B;12.5~13min:50~100%B;13~15min:100%B;15~15.2min:100~5%B;15.2~18min:5%Bである。流量は0.3mL/minに設定する。
CKの分析は、QTRAP 5500型三重四重極型質量分析計システム(AB SCIEX)のマルチプル反応検出スキャンモード(MRM mode)で行われる。関連情報の参照に基づき、ホルモン含有量の定量分析に適したイオンを選択する。MRMの最適条件は次のとおりである。エアカーテンガス圧:40psi、イオンスプレー電圧:陽イオンモード 5000V、陰イオンモード -4500V、ターボヒーター温度:600℃、霧化ガス圧(Gas 1):60psi;加熱ガス圧(Gas 2):60psi。Analyst(バージョン 1.6.3 AB SCOEX)ソフトウェアを使用して、関連機器を制御し、結果のデータを取得する。得られた生データは、さらなる分析と処理のためにMultiQuantソフトウェア(バージョン3.0.2 AB SCIEX)にインポートし、CKの結果は内部標準参照によって正確に定量化される。図5Cは、OsCKX3がin vivoでtZとiPを触媒できることを示している。変異後にイネのtZとiPの含有量が増加し、イネの葉の角度が小さくなり、一方、過剰発現後にイネのtZとiPの含有量が減少し、イネの葉の角度が大きくなることを示している。
(実施形態7)
農業形質の分析
日本晴野生型、OsCKX3遺伝子変異体、過剰発現材料種を圃場に植え、生育120日後の農業的形質を写真撮影し、統計分析を行う。草丈、一穂籾数、分げつ数、千粒重、粒長、粒幅を含むすべての農業的形質を、SPSSソフトウェアを用いて単一植物データに基づき統計的な分析を行う。得られた結果を図6に示す。
農業形質の分析
日本晴野生型、OsCKX3遺伝子変異体、過剰発現材料種を圃場に植え、生育120日後の農業的形質を写真撮影し、統計分析を行う。草丈、一穂籾数、分げつ数、千粒重、粒長、粒幅を含むすべての農業的形質を、SPSSソフトウェアを用いて単一植物データに基づき統計的な分析を行う。得られた結果を図6に示す。
図6によれば、以下の要約した結論が得られる。
OsCKX3遺伝子変異後、イネの葉の角度が小さくなり、千粒重が増加し、結実率がわずかに低下するが、他の農業形質に有意差はない。OsCKX3遺伝子の過剰発現後、葉の角度が大きくなり、千粒重が減少し、結実率がわずかに減少し、また、草丈が低くなり、一穂籾数が減少するが、その他の農業形質に有意差はない。それは、OsCKX3遺伝子が育種改良可能な遺伝子資源として使用できることを示す。
OsCKX3遺伝子変異後、イネの葉の角度が小さくなり、千粒重が増加し、結実率がわずかに低下するが、他の農業形質に有意差はない。OsCKX3遺伝子の過剰発現後、葉の角度が大きくなり、千粒重が減少し、結実率がわずかに減少し、また、草丈が低くなり、一穂籾数が減少するが、その他の農業形質に有意差はない。それは、OsCKX3遺伝子が育種改良可能な遺伝子資源として使用できることを示す。
最後に、上記の例は、本発明のいくつかの特定の実施形態に過ぎないことに留意されたい。もちろん、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、多くの変形が可能である。当業者が本発明に開示された内容から直接導出または関連付けることができるすべての変形は、本発明の保護範囲と見なされるべきである。
Claims (8)
- イネの葉の角度を調節することを特徴とする、イネ作物の改良におけるイネ遺伝子OsCKX3またはそれがコードするタンパク質の使用。
- イネの葉枕の発達および葉の角度を調節し、イネの株型を改善し、イネの収量を増加させることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 前記イネ遺伝子OsCKX3のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 1に示されるものであり、また、それと相補的なヌクレオチド配列、それと同種のヌクレオチド配列、あるいは、数個のヌクレオチドを挿入または突然変異させることによって形成される、同じ機能を有するヌクレオチド配列も含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
- 前記イネ遺伝子OsCKX3がコードするアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2に示されるものであることを特徴とする、請求項3に記載の使用。
- 前記イネ遺伝子OsCKX3をノックアウトすることにより、イネの葉の角度を小さくさせ、稲粒を大きくすることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 前記イネ遺伝子OsCKX3を過剰発現させることにより、イネの葉の角度を増加させることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- OsCKX3変異体のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO: 4~SEQ ID NO: 5のいずれかに示されるものであることを特徴とする、請求項5に記載の使用。
- gRNA標的配列であって、前記gRNA標的配列は、イネOsCKX3遺伝子のCDSセンス鎖の332~351番目の位置であり、そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 3に示されるものであることを特徴とする、植物の葉の角度の調節におけるイネOsCKX3遺伝子を編集するためのgRNA標的配列の使用。
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---|---|---|---|
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