CN114292862A - OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用，属于植物分子生物学和植物育种领域。所述OsCEN2基因为如SEQ ID NO：1所示的全基因序列，或如SEQ ID NO：2所示的基因片段。通过构建OsCEN2基因过表达植株、干涉植株、敲除植株，发现OsCEN2基因过表达使水稻种子萌发速率变慢；OsCEN2基因降低表达或者敲除突变后，使水稻种子萌发速度加快；说明该基因调控水稻种子萌发速率，可为作物育种提供基因资源，将水稻OsCEN2基因应用于水稻育种中，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。

Description

OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物育种领域，特别是涉及OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用。

背景技术

种子萌发是指具有活力的种子在合适的环境条件下，吸收水份，体积膨大，解除休眠至胚芽突破种皮的过程，这是所有通过种子繁殖的开花植物生命周期中的关键。农作物种子萌发速度差异影响出苗一致性和幼苗整齐度，进而影响作物产量。在种子萌发过程中，环境因素起了至关重要的作用。除此之外，种子发育情况、激素水平以及种子结构等内源影响因素也很重要。研究指出，赤霉素(GA)与脱落酸(ABA)在种子休眠以及萌发过程中作用是相互拮抗的，ABA可以抑制种子萌发，GA则具有促进种子萌发的作用。种子在发育过程中通过积累脱落酸(ABA)使种子保持休眠水平，防止出现收获前萌发的现象。在种子萌发过程中，ABA含量会逐渐降低，并且外源施加ABA会一定程度地抑制种子萌发。

OsCEN2属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族中FLOWERING LOCUS T(FT)/TERMINAL FLOWER 1(TFL1)基因家族。FT/TFL1除了在开花时间和植物结构中发挥作用外，还与植物种子萌发相关。目前，已发现PopCEN1、PcFT2、AtMFT、TaMFT、和OsMFT2与种子萌发有关。虽然已报道了多个FT/TFL基因的功能，但其中的分子机理仍未被完全阐明。因此进一步挖掘与水稻种子萌发相关基因对育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建OsCEN2基因的过表达植株、干涉植株和敲除植株，发现该基因可以调控水稻种子萌发速率，这为作物育种提供了基因资源，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用。

优选的是，所述OsCEN2基因为如SEQ ID NO：1所示的全基因序列，或如SEQ ID NO：2所示的基因片段。

优选的是，所述OsCEN2基因过表达使水稻种子萌发速率变慢；所述OsCEN2基因降低表达或者突变后，使水稻种子萌发速度加快。

本发明还提供OsCEN2蛋白在调控水稻种子萌发速率中的应用，所述OsCEN2蛋白的编码区为SEQ ID NO：2所示序列编码。

本发明还提供重组载体在调控水稻种子萌发速率中的应用，所述重组载体包括如下任意一种：

a：含有编码OsCEN2基因的cDNA全长的重组载体；

b：可以降低OsCEN2基因表达量的重组载体；

c：可以靶向敲除OsCEN2基因的重组载体。

优选的是，所述重组载体过表达OsCEN2基因时，使水稻种子萌发速率变慢；所述重组载体降低或缺失OsCEN2基因降低表达时，使水稻种子萌发速度加快。

本发明还提供一种利用OsCEN2基因调控水稻种子萌发速率的方法，包括以下步骤：

(1)构建重组载体，并将所述重组载体转入宿主菌，再利用根瘤农杆菌介导的遗传转化法，获取基因转化植株；

其中，所述重组载体包括如下任意一种：

a：含有编码OsCEN2基因的cDNA全长的重组载体；

b：可以降低OsCEN2基因表达量的重组载体；

c：可以靶向敲除OsCEN2基因的重组载体；

(2)从基因转化植株中筛选OsCEN2基因不同表达情况的转基因植株。

优选的是，所述OsCEN2基因不同表达情况包括：

S1：OsCEN2基因过表达，使水稻种子萌发率变慢；

S2：OsCEN2基因降低表达，使水稻种子萌发速度加快；

S3：OsCEN2基因缺失，使水稻种子萌发速度加快。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一个调控水稻种子萌发速率的基因OsCEN2，该基因位于11号染色体上，其在水稻中的基因位点编号是LOC_Os11g05470(Os11g0152500)。实验验证，通过构建基因OsCEN2过表达植株、干涉植株以及敲除植株，发现基因OsCEN2过表达后种子萌发速率变慢；将该基因降低表达或敲除突变后可以使种子萌发速率加快，说明该基因调控水稻种子萌发速率。本发明为作物育种提供了基因资源，可将水稻OsCEN2基因应用于水稻育种中，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为过表达载体图；

图2为pYLRNAi.5载体图；

图3为CRISPR/gRNA载体图；

图4为pYLCRISPR/Cas9-Mtmono双元载体图；

图5为OsCEN2转基因植株中OsCEN2的表达量分析；UBQ基因用于内对照基因(n＝3)，误差线代表标准误差，SPSS用于显著性差异分析，**代表P＜0.01；

图6为野生型植株和OsCEN2转基因植株的萌发速率曲线图(n＝3)；

图7为野生型植株和OsCEN2转基因植株萌发48h的表型图，比例尺为1cm。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、含目的基因过表达载体的构建及遗传转化

(1)克隆OsCEN2基因

根据NCBI提供的关于OsCEN2基因(该基因位于11号染色体上，其在水稻中的基因位点编号是LOC_Os11g05470(Os11g0152500))的cDNA序列设计引物：

F(SEQ ID NO:4)：ttacttctgcagggtaccatgtctaggtctgtggagcc；

R(SEQ ID NO:5)：acgcgtactagtaagctttcagcgcctcctggctgcag。

用常规PCR方法从水稻品种中花11号cDNA中克隆得到OsCEN2基因。

PCR扩增体系为：

PCR扩增程序为：(1)预变性95℃3min；(2)95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共35个循环；(3)72℃延伸5min。

经过扩增后得到OsCEN2基因的序列如SEQ ID NO：1所示，OsCEN2基因的编码区序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO：3所示，该基因位于11号染色体上，其在水稻中的基因位点编号为LOC_Os11g05470(Os11g0152500)。

(2)农杆菌转化

在载体上选取Kpn I和Hind III酶切位点，将Pox载体进行酶切(见图1)。把克隆得到OsCEN2基因运用同源重组的方法与Pox载体进行连接(具体操作步骤参考诺唯赞同源重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit)。随后将连接产物通过热激法转化至DH5α感受态中并用kan抗性培养基筛选阳性菌落。从平板上挑取适量的单菌落进行培养，用碱裂解法抽提质粒，用双酶切法进行检测是否有目的大小片段插入，选取酶切检测阳性的菌液送入测序公司进行测序检测，从而获得阳性重组子载体。采用电击方法将阳性质粒转化至农杆菌感受态细胞中，得到阳性农杆菌。并通过同样的检测方法对农杆菌进行检测，确保用于转化的农杆菌包含目的基因。

(3)培育转化植株

利用根瘤农杆菌介导的遗传转化法，将前面获得的阳性农杆菌对水稻愈伤组织进行侵染，通过筛选培养基进行筛选两次后转接到预分化培养基上，将愈伤置于组培间中；待茎叶分化完全后，转移到生根培养基中，使苗更壮；当转化苗长到瓶口高时便可移栽出来，从而获得多个从不同愈伤组织转化而来的植株。

上述培养过程所涉及到的培养基配方：

筛选培养基为：N6+40mg/L潮霉素+200mg/L头孢霉素+200mg/L淀粉，pH 5.8。

预分化培养基：N6+15g/L山梨醇+5mg/L ABA+2.5mg/L CuSO4+5mg/L 6-BA+1mg/LNAA+40mg/L潮霉素+100mg/L头孢霉素+100mg/L淀粉，pH 5.8。

分化培养基：MS无机大量元素母液+MS无机微量元素母液+MS有机母液+30g/L蔗糖+300mg/L水解酪蛋白+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA+40mg/L潮霉素+3.0g/L琼脂，pH 5.8。

生根培养基：1/2MS+15g/L蔗糖+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+3.0g/L琼脂，pH 5.8。

(4)转基因植株筛选

通过潮霉素溶液浸泡叶片，筛选抗潮霉素的阳性植株，并运用检测引物：

F(SEQ ID NO:6)：ctatgagagtccaaagccga；

R(SEQ ID NO:7)：aggccaagatcattctcctc。

通过qRT-PCR方法(两步法)，检测转基因植株中OsCEN2基因表达量。选取两个不同的过量表达株系OE1和OE2，这两个株系中OsCEN2的表达量显著升高(见图5)。

qRT-PCR体系：

qRT-PCR反应程序：95.0℃2min；95.0℃10s，60.0℃30s，44个循环；65.0℃-95.0℃读取熔解曲线，温度每增长0.5℃，保持5s，读取一次信号。END。

2、OsCEN2干涉载体的构建及遗传转化

(1)克隆OsCEN2基因片段

根据NCBI提供的关于OsCEN2的cDNA序列设计特异片段引物：

F(SEQ ID NO:8)：atgtctaggtctgtggagcctc；

R(SEQ ID NO:9)：gatcacttggtcctggcacatc；

用常规PCR方法扩增该基因片段，其中：

PCR扩增体系：

PCR扩增程序：(1)预变性95℃3min；(2)95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共35个循环；(3)72℃延伸5min。

从水稻品种中花11中克隆得到该基因片段1。

(2)筛选阳性重组子载体

选取Bam HI和Hind III酶切位点，将pYLRNAi.5载体中的MCS1区域进行酶切(见图2)。把克隆得到OsCEN2基因片段1运用T4连接酶与酶切好的载体进行连接。随后将连接产物通过热激法转化至Top10感受态中并用kan抗性培养基筛选阳性菌落。从平板上挑取适量的单菌落进行培养，用碱裂解法抽提质粒，用双酶切法进行检测是否有目的大小片段插入，选取酶切检测阳性的菌液送入测序公司进行测序检测，从而获得阳性重组子载体。

(3)把上述获得的重组质粒作为模板，利用通用引物扩增，得到基因片段2。

通用引物如下：

RNAi-Mlu-F(SEQ ID NO:10)：caccctgacgcgtggtgttacttctgaagagg；

RNAi-Pst-R(SEQ ID NO:11)：actagaactgcagcctcagatctaccatggtcg；

扩增体系：

扩增程序：(1)预变性95℃3min；(2)95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共35个循环；(3)72℃延伸5min。

(4)选取Mlu I和Pst I酶切位点，将pYLRNAi.5载体中的MCS2区域进行酶切(见图2)。把克隆得到的基因片段2运用T4连接酶与酶切好的载体进行连接。随后将连接产物通过热激法转化至DH5α感受态中并用kan抗性培养基筛选阳性菌落。从平板上挑取适量的单菌落进行培养，用碱裂解法抽提质粒，用双酶切法进行检测是否有目的大小片段插入，选取酶切检测阳性的菌液送入测序公司进行测序检测，从而获得阳性重组子载体。

(5)采用电击方法将阳性质粒转化至农杆菌感受态细胞中，得到阳性农杆菌；并通过同样的检测方法对阳性农杆菌进行检测，确保用于转化的农杆菌包含目的基因。

(6)利用根瘤农杆菌介导的遗传转化法，将前面获得的阳性农杆菌对水稻愈伤组织进行侵染，通过培养基进行筛选两次后转接到预分化培养基上，将愈伤置于组培间中；待茎叶分化完全后，转移到生根培养基中，使苗更壮；当转化苗长到瓶口高时便可移栽出来，从而获得多个从不同愈伤组织转化而来的植株。

(7)通过潮霉素溶液浸泡叶片，筛选抗潮霉素的阳性植株，并运用检测引物(F(SEQID NO:12)：ctatgagagtccaaagccga；R(SEQ ID NO:13)：aggccaagatcattctcctc)，通过qRT-PCR方法(两步法)，检测转基因植株中OsCEN2基因表达量。

qRT-PCR体系：

qRT-PCR反应程序：95.0℃2min；95.0℃10s，60.0℃30s，44个循环；65.0℃-95.0℃读取熔解曲线，温度每增长0.5℃，保持5s，读取一次信号。END。

通过qRT-PCR检测结果表明，选取两个不同的干涉株系RNAi 12和RNAi 2，这两个株系中OsCEN2的表达量显著降低，而过表达植株中OsCEN2的表达量比野生型显著升高，RNAi株系的表达量显著降低(图5)。

3、OsCEN2基因敲除载体的构建及遗传转化

(1)通过NCBI获得OsCEN2的全基因组序列，通过网站(CRISPR-GE(GenomeEditing)-Liu YG Lab(http://skl.scau.edu.cn/)中的target design设计并选取脱靶率较低的靶点，并设计相应靶点引物。引物序列为

F(SEQ ID NO:14)：ggcaTGTGTCTAAACCAAGAGTTG；

R(SEQ ID NO:15)：aaacCAACTCTTGGTTTAGACACA。

(2)采用BsaI将U3 gRNA载体切开，通过T4连接酶(New England Biolabs(UK)Ltd-T4 DNA Ligase)将靶点连接到U3 gRNA表达盒中，22℃，30min，构建CRISPR/gRNA载体(见图3)。

连接体系：

(3)一轮PCR采用如下引物：

UF(SEQ ID NO:16)：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG；

gRNAR(SEQ ID NO:17)：CGGAGGAAAATTCCATCCAC；

利用上述引物克隆步骤(2)中的连接产物(95℃10s，58℃15s，72℃15s，25个循环)，取0.1μL PCR产物当作模板，采用如下引物：

B1(SEQ ID NO:18)：ttcagaggtctctaccgactagtcacgcgtatggaatcggcagcaaa；

BL(SEQ ID NO:19)：agcgtgggtctcgctcgacgcgtatccatccactccaagc；

利用上述引物进行二轮PCR克隆U3 gRNA表达盒(95℃10s，58℃15s，72℃20s，25个循环)，将二轮扩增片段进行回收。并将采用边切边连的方法将其连接到pYLCRISPR/Cas9-Mtmono双元载体(37℃5min,10℃5min，20℃5min，13个循环；37℃5min)(见图4)，获得OsCEN2基因敲除载体。

(4)采用电击方法将阳性质粒转化至农杆菌感受态细胞中，得到阳性农杆菌。并通过同样的检测方法对阳性农杆菌进行检测，确保用于转化的农杆菌包含目的基因。利用根瘤农杆菌介导的遗传转化法，将前面获得的阳性农杆菌对水稻愈伤组织进行侵染，通过筛选、预分化、生根过程获得多个从不同愈伤组织转化而来的植株(同上述(3)培育转化植株)。

(5)设计特异引物：

F(SEQ ID NO:20)：gttgcaagacacttgaccagc；

R(SEQ ID NO:21)：atcacttggtcctggcacat；

通过普通PCR对靶点位置进行扩增。

扩增体系：

扩增程序：(1)预变性95℃3min；(2)95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共35个循环；(3)72℃延伸5min。

(6)将扩增后PCR产物进行测序，并分析结果。结果发现Cas-6株系和Cas-20株系在靶点位置上分别缺失了11个碱基(AAACCAAGAGT)以及插入1个碱基(T)，导致这两个株系分别在第51个氨基酸处终止翻译以及第54个氨基酸处提前终止翻译。

(7)从T1代开始筛选潮霉素阴性且靶点纯合植株。通过PCR扩增突变位点，并通过序列测定，检测突变位点确定序列突变情况(突变类型)获得纯合植株。

4、植株萌发表型观察

(1)取同一时期收获，统一烘干的种子进行挑选，选择健康饱满的进行实验。每个培养皿放置50±4颗种子，每个株系3个重复，加水浸泡，30℃黑暗培养，此时记为吸水0h。

(2)浸泡24h后将水倒掉，每天保持培养皿中滤纸湿润，每3h统计萌发数。

(3)选取合适的时间点进行拍照。

通过对野生型、过量表达株系(OE 1、OE 2)和RNAi株系(RNAi 2、RNAi 12)的种子进行萌发实验并观察。结果发现，OE 1和OE 2种子的萌发速率比野生型慢，RNAi 2和RNAi12种子的萌发速率比野生型快(见图6)。对萌发48h的种子进行拍照观察，明显看到萌发速率的差异(见图7)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2385

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atacataaaa ataatcataa catgctaaag agtatattgt catgcagact ctgcagatcg 60

gcagacagga ggacgaacac tgtttattga ccgataagat tgctcagcaa cgtaatcttc 120

atagatccac ttgcctcaag gtttcttatg tttcagagga atagcataaa tctagtgatc 180

tataatattt tttgagtaaa ctactgtgga caaactatca aactatcagc ttgaaagaaa 240

aaatcatatc atgaaaaaaa ataatggtct tctactgaca aaatgtttgt attaataacc 300

aaaaagaaag gacctgaaaa gaggtgtatt aacacctcca gagagttcaa tagcactggt 360

gacttgcatc tttcccacgc aaacagttct tttaaggggg aaaaaaacaa atgcagaggg 420

attatcctta gaacttgatg gaagatacat gaagtacagc gtcagcgtgt atagattcta 480

ttgcaaactg ttatagaaga aaataagacc cttggttggt tatgctgcaa aagttgttag 540

ctactttctg tagccttttc agttattttc cacggcatac ctgactaaaa aacacacata 600

ctactcatgt ctcacattgt ccattgaggt tgcaagacac ttgaccagca ggctgctggc 660

cactataaat agaggctcgt actaccattg ccaagcaatc agcccacagc tcaccgaagt 720

gcattagctc accacgacta gctagagcac tcattggtgt gcaaaatatt actgtctgct 780

cctctaaaca tgtctaggtc tgtggagcct cttgttgtag ggcgcgtgat tggggaagtt 840

cttgatacct ttaacccatg catgaagatg atagtgacct ataactccaa caagcttgta 900

tttaatggtc atgagctcta cccatcagca gttgtgtcta aaccaagagt tgaggtccaa 960

gggggtgacc tgcgatcttt cttcacattg gtgcggagca ctcaacttca tagttggttt 1020

acgatttttt tccctggtta accataactc ctcatgtttc aggttatgac agacccagat 1080

gtgccaggac caagtgatcc ttatctaagg gagcaccttc attggtaacc aaccatgaac 1140

atttgtatct aaatactata tatttgtttc ttgtgggtgg ttaccgatta gctagacatg 1200

ttagttatgt ttctagggaa gataggacaa ttactttagc tttcatatgc atacaaacaa 1260

cacataatct gactagtctt aacatgaata gtaatgtggc taaattatca gcaaatctca 1320

ccttaacatt tacgcaggat tgttactgat atacctggga caacggatgc ttcttttggt 1380

aggtccttcc tctaatttgt gtcagttttt ttttccatct tattcattga gtttctcctt 1440

gtgaataaac aactgtacca ctttccgatt gaaggacgcg aggtcataag ctatgagagt 1500

ccaaagccga acattggcat ccataggttc atttttgtgc tcttcaagca gaagcgcagg 1560

caaactgtaa ttgtgccatc cttcagggac catttcaaca cccgccggtt cgccgaggag 1620

aatgatcttg gccttcctgt ggctgctgtc tacttcaatg cccagagaga gactgcagcc 1680

aggaggcgct gagaaatgca gctccaattg tcccaaaatt acgattctct gaaatcaaac 1740

cttttctgcc atattacttt ctcatgaatc aacgttcttc tgctacatca gcagccagta 1800

tatctgcgaa taaaccagat gcattttgca gcatgtatta gtattagatt tctttccgta 1860

tcaagaacat attagtggat tattttgtaa gcagtaagat tgatagccat gttggcaaat 1920

tccagtgcac taatatgtaa accacgttat tattaatgtt tttaagtcat gtataagcca 1980

attcatgctg gtggacaaac ccaactggta gaaagggctt tttatctatt tgtatgtcgc 2040

ttggtggctc cacatggtgt cgcttggtgg ctccacattg catactacta ttcaggttat 2100

taacttgtag taataagtga cacggggaaa aagtgcagta gtaagtaaca gcaatgatat 2160

gataggaatc cagttttatt tttgtacaaa aatcatccac attgcatact agtagtacta 2220

tgcaggttat taacatgtag tatgtgacac aatggaaaaa aatgcagtaa gtaacaacac 2280

tgatatgatg ggaatccagc tttctttttt tgtacaaatt catccagatt gcatactact 2340

atgcaggtta ttatttatta acatgtagta gtaagtaaca cataa 2385

<210> 2

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctaggt ctgtggagcc tcttgttgta gggcgcgtga ttggggaagt tcttgatacc 60

tttaacccat gcatgaagat gatagtgacc tataactcca acaagcttgt atttaatggt 120

catgagctct acccatcagc agttgtgtct aaaccaagag ttgaggtcca agggggtgac 180

ctgcgatctt tcttcacatt ggttatgaca gacccagatg tgccaggacc aagtgatcct 240

tatctaaggg agcaccttca ttggattgtt actgatatac ctgggacaac ggatgcttct 300

tttggacgcg aggtcataag ctatgagagt ccaaagccga acattggcat ccataggttc 360

atttttgtgc tcttcaagca gaagcgcagg caaactgtaa ttgtgccatc cttcagggac 420

catttcaaca cccgccggtt cgccgaggag aatgatcttg gccttcctgt ggctgctgtc 480

tacttcaatg cccagagaga gactgcagcc aggaggcgct ga 522

<210> 3

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Arg Ser Val Glu Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Glu

1 5 10 15

Val Leu Asp Thr Phe Asn Pro Cys Met Lys Met Ile Val Thr Tyr Asn

20 25 30

Ser Asn Lys Leu Val Phe Asn Gly His Glu Leu Tyr Pro Ser Ala Val

35 40 45

Val Ser Lys Pro Arg Val Glu Val Gln Gly Gly Asp Leu Arg Ser Phe

50 55 60

Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro

65 70 75 80

Tyr Leu Arg Glu His Leu His Trp Ile Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr

85 90 95

Thr Asp Ala Ser Phe Gly Arg Glu Val Ile Ser Tyr Glu Ser Pro Lys

100 105 110

Pro Asn Ile Gly Ile His Arg Phe Ile Phe Val Leu Phe Lys Gln Lys

115 120 125

Arg Arg Gln Thr Val Ile Val Pro Ser Phe Arg Asp His Phe Asn Thr

130 135 140

Arg Arg Phe Ala Glu Glu Asn Asp Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val

145 150 155 160

Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg

165 170

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttacttctgc agggtaccat gtctaggtct gtggagcc 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgcgtacta gtaagctttc agcgcctcct ggctgcag 38

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatgagagt ccaaagccga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggccaagat cattctcctc 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtctaggt ctgtggagcc tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatcacttgg tcctggcaca tc 22

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccctgacg cgtggtgtta cttctgaaga gg 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actagaactg cagcctcaga tctaccatgg tcg 33

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctatgagagt ccaaagccga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggccaagat cattctcctc 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcatgtgtc taaaccaaga gttg 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaaccaactc ttggtttaga caca 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttcagaggtc tctaccgact agtcacgcgt atggaatcgg cagcaaa 47

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcgtgggtc tcgctcgacg cgtatccatc cactccaagc 40

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gttgcaagac acttgaccag c 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atcacttggt cctggcacat 20

Claims (8)

1.OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsCEN2基因为如SEQ ID NO：1所示的全基因序列，或如SEQ ID NO：2所示的基因片段。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsCEN2基因过表达使水稻种子萌发速率变慢；所述OsCEN2基因降低表达或者突变后，使水稻种子萌发速度加快。

4.OsCEN2蛋白在调控水稻种子萌发速率中的应用，其特征在于，所述OsCEN2蛋白的编码区为SEQ ID NO：2所示序列编码。

5.重组载体在调控水稻种子萌发速率中的应用，其特征在于，所述重组载体包括如下任意一种：

a：含有编码OsCEN2基因的cDNA全长的重组载体；

b：可以降低OsCEN2基因表达量的重组载体；

c：可以靶向敲除OsCEN2基因的重组载体。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组载体过表达OsCEN2基因时，使水稻种子萌发速率变慢；所述重组载体降低或缺失OsCEN2基因降低表达时，使水稻种子萌发速度加快。

7.一种利用OsCEN2基因调控水稻种子萌发速率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组载体，并将所述重组载体转入宿主菌，再利用根瘤农杆菌介导的遗传转化法，获取基因转化植株；

其中，所述重组载体包括如下任意一种：

a：含有编码OsCEN2基因的cDNA全长的重组载体；

b：可以降低OsCEN2基因表达量的重组载体；

c：可以靶向敲除OsCEN2基因的重组载体；

(2)从基因转化植株中筛选OsCEN2基因不同表达情况的转基因植株。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述OsCEN2基因不同表达情况包括：

S1：OsCEN2基因过表达，使水稻种子萌发率变慢；

S2：OsCEN2基因降低表达，使水稻种子萌发速度加快；

S3：OsCEN2基因缺失，使水稻种子萌发速度加快。

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