CN1431300A - 产生小穗数目增多的转基因水稻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产生小穗数目增多的转基因水稻的方法，它包括步骤：(a)将外源的OsCen1和/或OsCen2基因转入水稻愈伤组织，获得转入了外源OsCen1和/或OsCen2基因的水稻细胞或组织；(b)将步骤(a)中获得的水稻细胞或组织，再生成水稻植株。利用本发明转基因技术异位过量表达水稻的OsCen1基因和OsCen2基因，得到了小穗数目增多的转基因水稻。本发明还提供携带OsCen1和/或OsCen2基因的载体和宿主细胞。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及利用OsCen1和OsCen2基因，产生小穗数目增多的转基因水稻的方法及相关的载体和转基因植物。
背景技术
单子叶植物水稻是世界主要粮食作物之一，水稻幼穗发育的状态直接影响粮食的产量，因此对水稻幼穗发生与基因之间关系的研究，可以为水稻生殖生长发育的人为调控提供理论基础。
目前，对双子叶植物花的发育研究较之单子叶植物花的发育研究，要较为深入一些。尤其是对双子叶模式植物拟南芥和金鱼草的研究，提出了花器官发生的“ABC模型”。总体说来，对花发育的研究主要是从以下三个方面来进行的：(A)花序的发育，(B)花分生组织的启动和(C)花器官的发生。
在拟南芥和金鱼草中已克隆出了与维持花序分生组织和花分生组织相关的基因。已有的研究发现：
(A)在拟南芥中，维持花序分生组织属性的基因为TFL1基因，金鱼草中为CEN基因；
(B)在拟南芥中，维持花分生组织属性的基因为LEAFY基因，金鱼草中为FLO基因。
CEN和FLO是一对在功能上相互排斥又相互协同的基因，在金鱼草的野生型的花序分生组织向花分生组织转变的早期，仅有FLO的表达，FLO表达之后，通过信号分子的传导，活化CEN的表达，CEN的表达加强后，又通过信号分子的传递，抑制FLO的表达，从而使野生型保持无限花序的发育。
因此，CEN和FLO的表达可以认为是花序分生组织向花分生组织之间转变的开关。在拟南芥菜中，TFL1和LEAFY具有与金鱼草中CEN和FLO之间类似的功能。拟南芥中已得到了35S TFL1的转基因植株，TFL1的过量表达极大延长了拟南芥的营养期和花序生长期，并得到比野生型更多的种子。
从水稻中已克隆出与金鱼草FLO基因和拟南芥LFY基因同源的基因，命名为RFL基因。然而，原位杂交结果显示RFL基因并不象FLO和LFY那样属于花分生组织属性基因，RFL可能与一次枝梗及二次枝梗的发育有关。而且将水稻的RFL基因在拟南芥中过量表达，并没有得到与35S LFY一致的结果。
因此，鉴于世界人口的增加，本领域迫切需要开发提高水稻产量的方法。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种使水稻小穗数目增多的方法，它通过转入外源的水稻OsCen1和OsCen2基因，从而产生小穗数目增多的转基因水稻。
本发明的另一目的是提供在产生小穗数目增多的转基因水稻的方法中所使用的基因序列、载体和转基因的水稻细胞、组织和植株。
在本发明的第一方面，提供了一种产生小穗数目增多的转基因水稻的方法，它包括步骤：
(a)将外源的OsCen1和/或OsCen2基因转入水稻细胞或组织，获得转入了外源OsCen1和/或OsCen2基因的水稻细胞或组织；
(b)将步骤(a)中获得的转入了外源OsCen1和/或OsCen2基因的水稻细胞或组织，再生成水稻植株。
在一优选例中，在步骤(a)中，将外源的OsCen1和OsCen2基因两者都转入水稻细胞或组织。
在另一优选例中，在步骤(a)中，用携带OsCen1正义表达载体和/或OsCen2正义表达载体的农杆菌感染水稻愈伤组织。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的OsCen1正义表达载体是pCSL0040，所述的OsCen2正义表达载体是pCSL0042。
在另一优选例中，所述的OsCen1基因编码SEQ ID NO：2所示的蛋白，而所述的OsCen2基因编码SEQ ID NO：6所示的蛋白。
在另一优选例中，所述的OsCen1基因含有SEQ ID NO：1中第27-545位的核苷酸序列，而所述的OsCen2基因含有SEQ ID NO：5中第17-535位的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有选自下组的基因：OsCen1基因和OsCen2基因。
较佳地，在所述的载体中，所述的OsCen1基因编码SEQ ID NO：2所示的蛋白，而所述的OsCen2基因编码SEQ ID NO：6所示的蛋白。
在本发明的第三方面，提供了一种植物细胞，它的基因组中整合有外源的OsCen1基因和/或OsCen2基因。较佳地，所述的植物细胞，来自稻属(Oryza)，更佳地来自水稻(Oryza sativa)。
附图说明
图1显示了含完整ORF加3′UTR的OsCen1 cDNA序列以及引物序列。
图2显示了含完整ORF加3′UTR的OsCen2 cDNA序列以及引物序列。
图3是pCSL0040质粒-OsCen1的正义表达载体的质粒图谱。其中，T-Border(L)和T-Border(R)分别表示T-DNA的左边界和右边界。
图4是pCSL0042质粒-OsCen2的正义表达载体的质粒图谱。其中，T-Border(L)和T-Border(R)分别表示T-DNA的左边界和右边界。
具体实施方式
金鱼草和拟南芥菜为无限花序的双子叶植物，而水稻为有限花序的单子叶植物，因此研究水稻的幼穗发育过程及相关基因的表达，可以比较单子叶植物和双子叶植物中调控花序分生组织和花分生组织调控的模式的异同点。本发明人以水稻为材料，主要研究水稻茎顶端分生组织中的营养顶端分生组织、花序分生组织、花分生组织之间的转变，研究水稻中与CEN基因同源的基因，通过过量表达的方法研究其表达规律，功能以及与RFL的关系，首次证实了可导致小穗增多的基因OsCen1和OsCen2。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“OsCen1蛋白”或“OsCen1多肽”可互换使用，都指具有水稻OsCen1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。术语“OsCen2蛋白”或“OsCen2多肽”可互换使用，都指具有水稻OsCen1氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的蛋白或多肽。它们可以含有或不含起始甲硫氨酸。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的OsCen1或OsCen2蛋白或多肽”是指OsCen1或OsCen2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsCen1或OsCen2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括OsCen1或OsCen2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然OsCen1或OsCen2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“OsCen1或OsCen2多肽”还包括具有与OsCen1或OsCen2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsCen1或OsCen2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsCen1或OsCen2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsCen1或OsCen2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsCen1或OsCen2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsCen1或OsCen2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有OsCen1或OsCen2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供OsCen1或OsCen2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OsCen1或OsCen2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
在本发明中，“OsCen1或OsCen2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
对于OsCen1而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
对于OsCen2而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：6的蛋白质，但与SEQ ID NO：5所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsCen1或OsCen2蛋白的多聚核苷酸。
本发明的OsCen1或OsCen2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OsCen1或OsCen2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的OsCen1或OsCen2多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码OsCen1或OsCen2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，OsCen1或OsCen2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含OsCen1或OsCen2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞或转化受体可以是原核细胞，如细菌细胞(农杆菌)；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。优选的转化受体是植物细胞，尤其是单子叶植物，如禾本科植物。更佳地，转化受体是稻属植物的愈伤组织。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
当然，还可以将OsCen1和OsCen2或携带OsCen1和OsCen2的质粒转入植物愈伤组织，使其直接整合入宿主细胞的染色体中。然后，通过常规植物再生技术，将所述植物细胞或愈伤组织再生成完整的植株。在该植株中，OsCen1和OsCen2得以异位过量表达表达，从而使小穗数目增多。
本发明还包括用本发明方法获得的转基因植物及其子代，包括转基因植物与普通植物的杂交后代。
利用本发明方法获得的OsCen1和OsCen2转基因水稻，其转基因水稻的表型不同于野生型的表型。OsCen1和OsCen2转基因水稻的主要特点如下：
(1)转基因水稻的穗部特征明显不同于中花11野生型：转基因水稻总的小穗的数目比野生型多一倍；转基因水稻的枝梗的数目比野生型多。
(2)转基因水稻植株的高度比中花11野生型矮，转基因水稻的茎比中花11野生型粗，不易倒伏。
(3)转基因水稻的剑叶比中花11野生型的剑叶长、宽。
因此，本发明为人工设计水稻的穗部性状、水稻的遗传改良、水稻育种和遗传工程技术改进提供新的可能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
水稻CENTRORADIALIS(CEN)-like基因OsCen1和OsCen2基因的分离
用金鱼草的CEN基因第四个外显子的保守片段为探针，对水稻(广陆矮4号，籼稻)基因组DNA文库进行原位杂交筛选，经过三轮筛选，得到六个阳性克隆，挑选两个信号最强的阳性克隆FD229和FD322做了物理图谱的构建及亚克隆，并完成了测序工作。获得了2个CEN-like基因OsCen1(又叫FDR1)和OsCen2(又叫FDR2)。
根据OsCen1和OsCen2的基因组序列，设计了特异的引物，并以水稻花序分生组织中的mRNA的反转录产物为模板，通过5′RACE和3′RACE的方法分离到与OsCen1和OsCen2基因相应的cDNA，并完成了测序。OsCen1 cDNA长907bp，OsCen2cDNA长956bp，比较cDNA与基因组序列，发现OsCen1和OsCen2基因组DNA均有四个外显子和三个内含子组成(CEN和TFL基因也有四个外显子和三个内含子)。
根据GCG推测OsCen1和OsCen2均编码一个173个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6)，二者的氨基酸同源性为92.5％。OsCen1和OsCen2基因所编码的蛋白与CEN基因所编码的蛋白均有73.99％同源性，与拟南芥中的TFL1具有72.52％和73.41％的同源性。这些结果表明，水稻的OsCen1和OsCen2基因是金鱼草的CEN基因、拟南芥TFL1基因的类似物。
实施例2
OsCen1和OsCen2完整ORF的获得
(A)OsCen1完整ORF的获得
为了转基因的需要，必须得到完整的ORF，所以在OsCen1基因的起始密码子之前设计5′引物，即OsCen1-ORF-5′：
ttacctgtccctccaaggc(SEQ ID NO：3)
并在终止密码子之后设计3′引物，即OsCen1-ORF-3′：
cacaatctag tgatgtggc (SEQ ID NO：4)
并以水稻花序分生组织中的mRNA的反转录产物为模板，按常规RT-PCR扩增出了OsCen1的ORF加上一段3′UTR区域，全长为643bp，克隆到pGEM-T载体中，阳性克隆的编号为pCSL0034。
扩增出的OsCen1的长为643bp的eDNA如图1和SEQID NO：1所示。编码的OsCen1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(A)OsCen2完整ORF的获得
在OsCen2基因的起始密码子之前设计5′引物，即OsCen2-ORF-5′：
gtctgctcctctaaacatgtctag(SEQ ID NO：7)
并在终止密码子之后设计3′引物，即OsCen2-ORF-3′：
cgactacatc gtcttcttgc(SEQ ID NO：8)
并以水稻花序分生组织中的mRNA的反转录产物为模板，RT-PCR扩增出了OsCen2的ORF加上一段3′UTR区域，全长为638bp，克隆到pGEM-T载体中，阳性克隆的编号为pCSL0035。
扩增出的OsCen1的长为638bp的cDNA如图2和SEQ ID NO：5所示。编码的OsCen1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
实施例3
OsCen1和OsCen2正义表达载体的构建
(A)OsCen1正义表达载体的构建
用SpeI酶切后补平，再用NcoI酶切将pCSL0034质粒中的OsCen1的长为643bp的cDNA切下来，正向连到中间载体pJIT163(可购自英国JOIN INNES研究中心)上，然后将含有2个35S的强启动子加上正向OsCen1 cDNA基因再接上CaMV polyA的片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1301(可购自CAMBIA研究中心)中，得到OsCen1正义的表达载体，命名为pCSL0040，该载体全长为14000bp，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性，该载体在T-DNA区域还带有GUS基因。pCSL0040质粒图谱如图3所示。
(B)OsCen2正义表达载体的构建
OsCen2正义表达载体的构建过程同OsCen1。用用SacII酶切后补平，再用SalI酶切将pCSL0035质粒中的OsCen2的长为638bp的cDNA切下来，正向连到中间载体pJIT163上，然后将含有2个35S的强启动子加上正向OsCen1 cDNA基因再接上CaMV polyA的片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中，得到OsCen2正义的表达载体，命名为pCSL0042，该载体全长为14000bp，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性，该载体在T-DNA区域还带有GUS基因。pCSL0042质粒图谱如图4所示。
实施例4
pCSL0040，pCSL0042质粒对农杆菌EHA105的转化
(A).制备电击转化法的农杆菌感受态细胞
农杆菌EHA105(可购自CAMBIA研究中心)生长于YEB固体培养基的平板上，任挑一单菌落接入5mlYEB液体培养基中于28℃震摇培养过夜；
按1∶100的比例将上述菌液接种入100ml新鲜的YEB液体培养基中，28℃、200rpm震摇培养至生长对数期；
4000rpm、4℃、15min离心收集农杆菌菌体；
弃上清，加入预冷的ddH2O重悬，补水加至50ml；
4000rpm、4℃、15min离心；
弃上清，加入预冷的ddH2O重悬，补水加至50ml；
4000rpm、4℃、15min离心；
弃上清，加入预冷的100ul的ddH2O重悬，20ul/管分装置于冰上，准备电击。
(B)pCSL0040，pCSL0042质粒对农杆菌EHA105的电击转化和鉴定
将电击杯洗干净，无水乙醇冲洗，超净台上吹干；
各取1ul pCSL0040，pCSL0042质粒分别加入到20ul的上述农杆菌感受态细胞中；
电击，加入900ul的SOC培养基；
28℃摇菌，1小时后涂板，28℃倒置培养；
2天后挑取单克隆，摇菌，抽提农杆菌质粒；
PCR和酶切鉴定出阳性克隆。
结果获得了携带OsCen1正义表达载体的农杆菌，以及OsCen2正义表达载体的农杆菌。
实施例5
含表达载体的农杆菌对水稻中花11的转化
在本实施例中，通过农杆菌感染水稻幼胚的方法，分别用含有OsCen1正义表达载体和OsCen2正义表达载体的农杆菌感染中花11水稻(粳稻，Oryza sativajaponic)的幼胚。
(A)水稻愈伤组织的诱导
取授粉后12-15天的水稻未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后于2％的NaClO溶液中(加2-3滴吐温20)消毒60分钟以上，用无菌水冲洗4-5次然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并培养于N6D2或N6D0.5培养基上诱导愈伤组织，4天后可看见明显的愈伤组织块，此时可作为农杆菌转化的受体材料。
(B)根癌农杆菌的培养及水稻转化
农杆菌菌种自YEB(含50mg/L km)平板上接种到3ml含卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含Km50mg/L的AB液体培养基中，200rpm继续培养至OD600为0.8左右，将新鲜的培养液于5000g、4℃离心10min收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，用于水稻材料的转化。
(C)水稻材料与根癌农杆菌的共培养转化
转化前制备N6D2C(或N6C)时，在平板上铺一层无菌滤纸，并用少量新鲜AAM液体培养基湿润，在6cm培养皿中将预培养后的水水稻受体材料浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20min后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液即转移到上述N6D2C培养基于26℃共培养3天。共培养时，除特殊处理外，在共培养基AAM、N6D2C或N6C中都添加100umol/L的乙酰丁香酮(AS)作为农杆菌Vir基因的活化诱导剂。
共培养3天后，从共培养基上取出转化水稻材料，用无菌水洗一次并于无菌滤纸上吸干菌液和水分，然后转入选择培养基进行筛选培养或用于检测GUS基因的瞬间表达。
通过GUS染色初步观察基因的表达情况，结果绝大多数的愈伤组织的反应呈阳性，初步表明外源基因已转入到水稻愈伤组织中。
实施例6
抗性愈伤组织的筛选及植株再生
预培养4天的幼胚与农杆菌共培养3天后，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1进行选择培养，2周后从幼胚盾片处长出的愈伤组织分成小块转到N6D2S2选择培养基上继续筛选2代(2周/代)，6周后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSRCH上分化(12小时光照/天)；再生的小苗在1/2MSENH上生根壮苗，随后移入温室或人工气候室盆栽。
结果：通过农杆菌感染水稻幼胚的方法，分别用含有OsCen1正义表达载体和OsCen2正义表达载体的农杆菌感染中花11水稻的幼胚，得到了来源于17个不同愈伤的34株OsCen1正义转基因水稻，其中分子检测了来源于不同愈伤的12个单株，GUS检测只有一个单株呈阴性，其余均呈阳性，Southern检测大部分为单位点插入，少数为多位点插入；得到了来源于14个不同愈伤的104株OsCen2正义转基因水稻，其中分子检测了来源于不同愈伤14个单株，GUS检测4个单株呈阴性，其余均呈阳性，Southern检测大部分为单位点插入，少数为多位点插入。
在34株OsCen1正义转基因水稻和104株OsCen2正义转基因水稻中，大部分OsCen1和OsCen2转基因水稻在TO代的穗部表型都明显不同于中花11野生型，呈现密穗的特点。由于T0代是由组织培养分化得到的植株，而组织培养有时会引起植物的一些不正常的表型，所以要种植转基因水稻的T1代，并观察表型是否遗传及发生分离。
实施例7
OsCen1和OsCen2转基因水稻T1代的种植及表型分析
将GUS检测呈阳性而且Southern检测为单位点插入的OsCen1和OsCen2正义转基因水稻T0代结的种子(即T1代)种植，T1代发生了分离，转基因表型与野生型分离比符合3∶1，GUS检测阳性与阴性分离比也符合3∶1，而且GUS阳性与转基因表型是共分离的。因此，结论是，在水稻中过量表达OsCen1 cDNA基因和OsCen2 cDNA基因得到了稳定的、可遗传的、不同于野生型的表型。
OsCen1和OsCen2正义转基因水稻的表型如下：
(A)转基因水稻植株的高度比中花11野生型矮8-25cm，转基因水稻的茎比中花11野生型要粗，不易倒伏。
(B)转基因水稻的剑叶比中花11野生型的剑叶要长，要宽。
(C)转基因水稻的穗部特征明显不同于中花11野生型：
转基因水稻总的小穗的数目比野生型多一倍；
转基因水稻的穗子比野生型略短，转基因水稻的一、二次枝梗和小穗梗分别比中花11野生型的一、二次枝梗和小穗梗要短；
转基因水稻的枝梗的数目增多，二次枝梗上又有很多新的枝梗，总的小穗的数目比野生型多一倍；
转基因水稻的穗子明显呈密穗的特点，但有小部分小穗是空壳。
(C)抽穗时间比中花11野生型晚10-15天。(野生型在播种后65天抽穗，而转基因水稻则在播种后75天至80天才抽穗。)
实施例8
OsCen1和OsCen2转基因水稻T2代纯合体的分离、表型分析
将GUS检测呈阳性而且Southern检测为单位点插入的OsCen1和OsCen2正义转基因水稻T1代结的种子(即T2代)种植。在T2代有转基因表型的转基因水稻中有两种情况：第一，有的发生了分离，分离比仍为3∶1，转基因表型与野生型分离比符合3∶1，GUS检测阳性与阴性分离比也符合3∶1，而且GUS阳性与转基因表型是共分离的；第二，有的不发生分离，所有的个体都呈转基因表型，而且GUS检测都呈阳性，Southern检测为单拷贝插入，就确定这样的单株为纯合体。因此根据这样的方法，现已得到OsCen1正义转基因水稻T2代纯合体的一个株系，得到OsCen2正义转基因水稻T2代纯合体的三个株系，并且已得到这四个株系的T3代种子，T3代中仍无分离而且转基因表型稳定。T2纯合体和T3纯合体的转基因表型与T1代的转基因表型一致或略强。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海植物生理研究所
复旦大学<120>产生小穗数目增多的转基因水稻的方法<130>006340<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>643<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(27)..(545)<400>1ttacctgtcc ctccaaggct ccaacc atg tct agg tct gtg gag cct ctt gtt 53
Met Ser Arg Ser Val Glu Pro Leu Val
1 5gtt ggg cgg gta atc gga gaa gtt att gat tca ttc aac cca tgt acg 101Val Gly Arg Val Ile Gly Glu Val Ile Asp Ser Phe Asn Pro Cys Thr10 15 20 25aag atg ata gta acc tac aat tca aac aag ctt gtc ttt aat ggc cat 149Lys Met Ile Val Thr Tyr Asn Ser Asn Lys Leu Val Phe Asn Gly His
30 35 40gag ttc tac cca tca gca gtt gta tct aaa cca aga gtc gag gtc caa 197Glu Phe Tyr Pro Ser Ala Val Val Ser Lys Pro Arg Val Glu Val Gln
45 50 55ggg ggt gat atg cgt tct ttc ttc aca ttg gtt atg aca gac cca gat 245Gly Gly Asp Met Arg Ser Phe Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp
60 65 70gtg cca gga cca agt gat cca tgt cta agg gaa cac cta cat tgg att 293Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro Cys Leu Arg Glu His Leu His Trp Ile
75 80 85gta act gat ata cct gga aca acg gat gcc tct ttt gga cgg gaa atc 341Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr Thr Asp Ala Ser Phe Gly Arg Glu Ile90 95 100 105ata agc tat gag agc cca aag ccc agc att ggt atc cac agg ttc gtt 389Ile Ser Tyr Glu Ser Pro Lys Pro Ser Ile Gly Ile His Arg Phe Val
110 115 120ttt gtg ctc ttc aag cag aag cgt agg cag gct gta gtt gtg cca tcc 437Phe Val Leu Phe Lys Gln Lys Arg Arg Gln Ala Val Val Val Pro Ser
125 130 135tct agg gat cat ttc aat aca cgc cag ttt gct gag gag aac gaa ctt 485Ser Arg Asp His Phe Asn Thr Arg Gln Phe Ala Glu Glu Asn Glu Leu
140 145 150ggc ctt cct gtc gct gct gtc tac ttc aat gct cag aga gag act gct 533Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala
155 160 165gcc agg aga cgc taaaaaattc cagctgtcat tatccccgct gtgataaata 585Ala Arg Arg Arg170aaaaccatcc aatagtttct cctgtcgtct acattatctg ccacatcact agattgtg 643<210>2<211>173<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa)<400>2Met Ser Arg Ser Val Glu Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Glu1 5 10 15Val Ile Asp Ser Phe Asn Pro Cys Thr Lys Met Ile Val Thr Tyr Asn
20 25 30Ser Asn Lys Leu Val Phe Asn Gly His Glu Phe Tyr Pro Ser Ala Val
35 40 45Val Ser Lys Pro Arg Val Glu Val Gln Gly Gly Asp Met Arg Ser Phe
50 55 60Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro65 70 75 80Cys Leu Arg Glu His Leu His Trp Ile Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr
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100 105 110Pro Ser Ile Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Lys Gln Lys
115 120 125Arg Arg Gln Ala Val Val Val Pro Ser Ser Arg Asp His Phe Asn Thr
130 135 140Arg Gln Phe Ala Glu Glu Asn Glu Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val145 150 155 160Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg
165 170<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3ttacctgtcc ctccaaggc 19<210>4<211>19<212>DNA<213>引物<400>4cacaatctag tgatgtggc 19<210>5<211>638<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(17)..(535)<400>5gtctgctcct ctaaac atg tct agg tct gtg gag cct ctt gtt gta ggg cgc 52
Met Ser Arg Ser Val Glu Pro Leu Val Val Gly Arg
1 5 10gtg att ggg gaa gtt ctt gat acc ttt aac cca tgc atg aag atg ata 100Val Ile Gly Glu Val Leu Asp Thr Phe Asn Pro Cys Met Lys Met Ile
15 20 25gtg acc tat aac tcc aac aag ctt gta ttt aat ggt cat gag ctc tac 148Val Thr Tyr Asn Ser Asn Lys Leu Val Phe Asn Gly His Glu Leu Tyr
30 35 40cca tca gca gtt gtg tct aaa cca aga gtt gag gtc caa ggg ggt gac 196Pro Ser Ala Val Val Ser Lys Pro Arg Val Glu Val Gln Gly Gly Asp45 50 55 60ctg cga tct ttc ttc aca ttg gtt atg aca gac cca gat gtg cca gga 244Leu Arg Ser Phe Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly
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95 100 105gag agt cca aag ccg aac att ggc atc cat agg ttc att ttt gtg ctc 388Glu Ser Pro Lys Pro Asn Ile Gly Ile His Arg Phe Ile Phe Val Leu
110 115 120ttc aag cag aag cgc agg caa act gta att gtg cca tcc ttc agg gac 436Phe Lys Gln Lys Arg Arg Gln Thr Val Ile Val Pro Ser Phe Arg Asp125 130 135 140cat ttc aac acc cgc cgg ttc gcc gag gag aat gat ctt ggc ctt cct 484His Phe Asn Thr Arg Arg Phe Ala Glu Glu Asn Asp Leu Gly Leu Pro
145 150 155gtg gct gct gtc tac ttc aat gcc cag aga gag act gca gcc agg agg 532Val Ala Ala Val Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg
160 165 170cgc tgagaaatgc agctccaatt gtcccaaaat tacgactctc tgaaatcaaa 585Argccttttctgc catattactt tctcatgaat caacgttctt ctgctacatc agc 638<210>6<211>173<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa)<400>6Met Ser Arg Ser Val Glu Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Glu1 5 10 15Val Leu Asp Thr Phe Asn Pro Cys Met Lys Met Ile Val Thr Tyr Asn
20 25 30Ser Asn Lys Leu Val Phe Asn Gly His Glu Leu Tyr Pro Ser Ala Val
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50 55 60Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro65 70 75 80Tyr Leu Arg Glu His Leu His Trp Ile Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr
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Claims (10)
1.一种产生小穗数目增多的转基因水稻的方法，其特征在于，它包括步骤：
(a)将外源的OsCen1和/或OsCen2基因转入水稻细胞或组织，获得转入了外源OsCen1和/或OsCen2基因的水稻细胞或组织；
(b)将步骤(a)中获得的转入了外源OsCen1和/或OsCen2基因的水稻细胞或组织，再生成水稻植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将外源的OsCen1和OsCen2基因两者都转入水稻细胞或组织。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，用携带OsCen1正义表达载体和/或OsCen2正义表达载体的农杆菌感染水稻愈伤组织。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的OsCen1正义表达载体是pCSL0040，所述的OsCen2正义表达载体是pCSL0042。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的OsCen1基因编码SEQ IDNO：2所示的蛋白，而所述的OsCen2基因编码SEQ ID NO：6所示的蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的OsCen1基因含有SEQ IDNO：1中第27-545位的核苷酸序列，而所述的OsCen2基因含有SEQ ID NO：5中第17-535位的核苷酸序列。
7.一种表达载体，其特征在于，它含有选自下组的基因：OsCen1基因和OsCen2基因。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的OsCen1基因编码SEQ IDNO：2所示的蛋白，而所述的OsCen2基因编码SEQ ID NO：6所示的蛋白。
9.一种植物细胞，其特征在于，它的基因组中整合有外源的OsCen1基因和/或OsCen2基因。
10.如权利要求9所述的植物细胞，其特征在于，它来自稻属。
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