CN102260679B - 调控果实和种子发育的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控果实和种子发育的蛋白及其应用。首次揭示了ENS基因在调控茄科植物果实或种子大小方面的用途。还揭示了利用ENS基因调控茄科植物果实或种子的性状的方法。通过本发明的方法能控制番茄果实和种子的大小，快速培育出果实和种子发生改变的农作物新品种。

Description

调控果实和种子发育的蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及调控果实和种子发育的蛋白及其应用。

背景技术

茄科(Solanaceae)是双子叶植物纲菊亚纲有花植物中较为进化的一群，草本、灌木或小乔木；叶互生或在开花枝段上有大小不等的二叶双生，全缘或各式的分裂或为复叶，无托叶；花两性或稀杂性，辐射对称，单生或排成聚伞花序或花束；萼5裂或截平形，常宿存；花冠合瓣，形状种种，裂片5，常折叠；雄蕊5，稀4枚，着生于冠管上；子房2室，或不完全的1-4室，2心皮不位于正中线上而偏斜，中轴胎座有胚珠极多数，很少为1枚；胚珠倒生、弯生或横生；果为浆果或蒴果；种子圆盘形或肾形，有肉质而丰富的胚乳；胚弯曲成钩状、环状或螺旋状卷曲，位于周边而埋藏于胚乳中，或直而位于中轴上。

番茄为茄科茄属的草本植物，是世界上重要蔬菜作物之一，其味甘、酸，性微寒。除大家熟知的含有大量的维生素有美容的功效外，还对于许多疾病有缓解或治疗作用。

当前番茄品种繁多，不同番茄品种果实的特征特性相差悬殊，系统的研究报道不多。在实际生产中，番茄的种植往往缺乏有效管理，导致获得的果实大小不一、口味不稳定，影响其市场价值。鉴于人们对于番茄的喜爱，培育出小果实或大果实品种的番茄是有很大的经济价值的，例如樱桃番茄是近年新兴发展起来的一种水果蔬菜，其果实圆整，大小均匀，果味浓郁，味甜爽口而深受人们的喜爱；其还适宜庭院栽种或盆栽，作为景观植物。此外，培育出小型的番茄果实也可为包装和食用带来方便；并且，种子变小的番茄在口感上要优于一般的番茄。

目前，番茄的主要选育方式还局限于传统方法，选育时间漫长且效率低，采用基因工程技术对番茄进行品种改良的报导还不多。

因此，有必要研究调控番茄果实以及种子大小的基因，从而实现对番茄的品种改良，开发出具有经济价值或观赏价值的植物。

发明内容

本发明的目的在于提供调控果实或种子性状的蛋白及其应用。

本发明的目的还在于提供一种调控茄科植物果实或种子的性状的方法以及由所述方法获得的植物。

在本发明的第一方面，提供一种ENS基因(Enlarge Silique 1，果荚膨大基因1；又称为Peapod(PPD)基因；或称为ENS-PPD基因)或ENS蛋白的用途，用于调控茄科植物果实或种子发育，改变果实和种子的性状或形态(如大小)。

在一个优选例中，所述的ENS基因或ENS蛋白来源于十字花科植物。

在另一优选例中，所述的十字花科植物是拟南芥。

在另一优选例中，所述的茄科植物是：茄科茄属植物。较佳地，所述的茄科茄属植物是番茄。

在另一优选例中，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括：

调控果实的大小或重量；

调控种子的大小或重量；或

调控果实的心皮壁厚度。

在另一优选例中，所述的ENS基因或ENS蛋白：

促进果实变小或降低果实重量；

促进种子变小或降低种子重量；或

降低果实的心皮壁厚度。

在另一优选例中，所述的ENS蛋白是(a)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的ENS基因编码ENS蛋白；较佳地，所述的ENS基因编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的ENS基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种调控茄科植物果实或种子的性状的方法，所述方法包括：

将ENS基因转入茄科植物中，获得果实或种子的性状发生改变的植物。

在一个优选例中，所述的将ENS基因转入茄科植物中的方法包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ENS基因序列；

(S2)将茄科植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的ENS基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物，所述植物即是果实或种子的性状发生改变的植物。

在另一优选例中，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括：

促进果实变小或降低果实重量；

促进种子变小或降低种子重量；或

降低果实的心皮壁厚度。

另一方面，提供一种植物，所述的植物是：转入了ENS基因的转基因植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了拟南芥ENS基因在转基因番茄植株中的半定量RT-PCR检测。其中：CK为非转基因番茄的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，1-6为转基因番茄的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2A显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株果实鲜重比较。

图2B和图2C显示转基因番茄植株与非转基因番茄植株的果实照片。

其中：CK为非转基因番茄，OE-1和OE-3为过表达转基因番茄。

图3A-C显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株果实心皮壁照片；

图3D显示图3A-C植株果实心皮壁厚度比较。

其中：CK为非转基因番茄，OE-1和OE-3为过表达转基因番茄，白色线指示果实的心皮壁。

图4A显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株种子大小比较。

图4B-E显示转基因番茄植株与非转基因番茄植株种子。

其中：CK为非转基因番茄植株的种子，OE-1和OE-3为过表达转基因番茄植株的种子。

具体实施方式

鉴于现有技术中对于茄科植物果实或种子大小调控方面了解甚少，本发明人进行了深入的研究，首次揭示了一种ENS基因或ENS蛋白在调控茄科植物果实或种子大小方面的用途，其可促进茄科植物的果实或种子变小，并使得其心皮壁厚度变小。因此，可利用该基因进行茄科植物的品种改良。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：茄科植物。较佳的，所述的茄科植物是番茄。

本发明的ENS蛋白(多肽)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，植物、细菌、酵母)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括ENS蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ENS蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种ENS蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，ENS蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的ENS蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长ENS蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长ENS蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“ENS蛋白”指具有ENS蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与ENS蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括ENS蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ENS蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗ENS蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ENS蛋白或其片段的融合蛋白。

任何与所述的ENS蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO：2所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有ENS蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供ENS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然ENS蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“ENS蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码本发明ENS蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ENS蛋白的多聚核苷酸。

应理解，虽然本发明的ENS基因优选获自十字花科植物(更优选拟南芥)，但是获自其它植物的与拟南芥ENS基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的ENS核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或ENS蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，ENS蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得果实或种子形态发生改变的植物。

本发明提供了所述的ENS蛋白或其编码基因的用途，用于调控茄科植物果实或种子的形态。作为一种优选方式，所述的ENS蛋白或其编码基因可用于：促进果实变小或降低果实重量；促进种子变小或降低种子重量；或降低果实的心皮壁厚度。

本发明还提供了一种调节茄科植物果实或种子的形态的方法，所述的方法包括：将ENS基因转入茄科植物中。

在得知了所述的ENS蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的ENS蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带ENS基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的ENS蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码ENS蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述ENS蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达ENS蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得(过量)表达ENS蛋白的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的ENS蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入ENS蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源ENS蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ENS蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使ENS蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入ENS蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

其它增加ENS基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强ENS基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该ENS基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物是：转入了ENS基因或其同源基因的转基因植物。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明揭示了一种调控果实和种子发育的基因及其应用，通过本发明的方法能控制番茄果实和种子的大小，培育出果实和种子发生改变的农作物新品种。

(2)本发明不仅将有利于理解植物果实发育的分子机制，而且也有助于认识调控果实大小形成的分子机理，为番茄品质育种提供理论依据，加快品质育种进程。与传统的育种方法相比，本发明的方法更具有快速改良目标性状的优越性。

(3)利用本发明的方法，培育出小型的番茄果实也可为包装和食用带来方便；同时，种子变小后的番茄在口感上也优于一般的番茄，经济价值不可估量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、植物材料与生长条件

拟南芥野生型Columbia-0种子从美国ABRC中心购买。番茄VF36种子由中科院上海生科院植生所提供(或参见《植物组织培养手册》，1991年发表的文章“用农杆菌转化番茄”(SHEILA McCORMICK Transformation of tomatowith Agrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，1991，B6：1-9))。拟南芥植株生长在21℃的人工温室中，光照16小时，黑暗8小时。番茄植株生长在人工温室(日温22-26℃，夜温15-20℃)中，光照12小时，黑暗12小时。

实施例2、拟南芥ENS基因的克隆

(1)RNA的分离

取拟南芥叶片组织，用液氮研磨后装入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol后，充分振荡，加入1/5体积氯仿，颠倒混匀，室温放置5min，12000rpm离心5分钟后取上清，加入等体积异丙醇混匀，室温放置5min，12000rpm离心5分钟后倒掉上清，加入预冷的75％乙醇，7500rpm离心5min，倒掉上清，空气干燥5-10min，溶于DEPC水中。用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

(2)RT-PCR

以拟南芥总RNA为模板，采用TOYOBO反转录试剂(ReverTra Ace)进行cDNA第一链合成，反转录步骤参照该试剂的用户手册。反转录反应后合成的cDNA第一链可用于ENS基因的编码区克隆。

(3)基因编码区的克隆

设计扩增出完整的编码区的引物，并结合表达载体的多克隆位点，在上游和下游引物上分别加入XhoI和EcoRI两个限制性内切酶位点(上游引物ENSCDS-F序列为5’-CTCGAGGATGTAGGAGTTACTACG-3’(SEQ IDNO：3)；下游引物ENSCDS-R序列为5’-GAATTC

ATTATCTTCGCTGTTTAG-3’(SEQ ID NO：4))，以方便构建表达载体。以获得的cDNA为模板，用TOYOBO高保真PCR试剂(KOD Plus)扩增，反应液配制参见试剂说明书，反应完成后为了方便克隆到T载体，加入1μl普通Taq酶72℃保温15min。

PCR程序为94℃2分钟；35个循环，94℃15秒；52℃30秒，68℃50秒；68℃7分钟。

将反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，目标片段用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。回收产物连接到pMD19-T载体(购于TaKaRa公司)上，热激转化E.coli DH5α的感受态细胞，具体方法如下：取5μl连接产物加入50μl感受态细胞中，冰上放置30min，然后42℃水浴90s，冰上放置3min，加1ml LB液体培养基，37℃摇床200r/min复苏一小时，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，该培养基含：氨苄100mg/ml，IPTG和x-gal。涂好的平板倒置于37℃培养箱培养过夜。用灭过菌的牙签将平板上显示为白色的菌落挑到2ml含氨苄(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养2h后进行菌液PCR，剩余菌液继续在37℃，200rmp/min培养过夜。菌液PCR的反应体系为：T载引物0.1μmol/L，dNTPs 200μmol/L，1×Taq Buffer，1U Taq DNA聚合酶，菌液1μl，总反应体系为20μl。菌液PCR的反应程序为：94℃2min；30cycles，94℃30s；52℃30s，72℃45s；72℃5min。反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，将扩增出预期大小片段的阳性克隆菌液送由上海生工进行测序。测序结果用BLAST程序在NCBI数据库上进行比对。

实施例3、拟南芥ENS基因在番茄中进行真核细胞表达

(1)含拟南芥ENS基因的植物表达载体的构建

将含有ENS编码区的阳性克隆的菌液用碱提取法抽取质粒，在37℃用XhoI和EcoRI酶切过夜。同时将植物表达载体pMon530质粒(购自美国MonSanto公司)进行相同的酶切反应，按照载体和目的片段3∶1(摩尔浓度比)的比例用T4连接酶16℃进行连接过夜，获得重组表达载体。

(2)构建好的重组表达载体转化番茄

在保证阅读框正确的前提下鉴定好的表达载体，将其电击转化入农杆菌(Agrobacterium)GV3101(购自Invitrogen)的感受态细胞中，转化方法及农杆菌的使用参照文献《植物组织培养手册》1991年发表的文章“用农杆菌转化番茄”(SHEILA McCORMICK Transformation of tomato with Agrobacteriumtumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，1991，B6：1-9)。具体步骤如下：

将番茄种子用10％的次氯酸钠溶液加0.1％Tween-20消毒15分钟，用无菌水清洗3-5次，然后把种子播种到1/2MS培养基中，每瓶约50粒种子，26℃每天光照16h，黑暗8h、培养7-10天；在无真叶或真叶很小时将番茄苗上部切下放在MS液体培养基中，将子叶头尾切掉，正面向下置于MS培养基(含有200uMAS+2.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA)预培养1-2天；将农杆菌菌液培养至OD600约0.6，离心收集菌体，用等量MS液体培养基(含有200uM AS)悬浮，将预培养的子叶片段放入准备好的农杆菌菌液中，浸染10分钟之后将农杆菌倒掉，将子叶片段在无菌的滤纸上晾干，放回预培养时的MS培养基(含有200uMAS+2.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA)上进行共培养，26℃暗培养2天；然后将子叶片段取出，清洗掉子叶片段上的农杆菌并在其晾干后放到的MS培养基(含有100mg/L Km+2.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA)上；3-6周后，将分化的小苗从外植体部位切下，继续放到的MS培养基(含有100mg/L Km+2.0mg/L BA+0.1mg/L IAA)上，筛选2个月后，将存活的小苗放含有MS培养基(100mg/L Km+0.1mg/L IAA)上生根，2-4周后，将生根的小苗移栽到花盆中(黑土∶蛭石∶珍珠岩＝3∶1∶1)，放到温室中培养，日温22-26℃，夜温15-20℃，每隔三天浇灌1/2Hogland营养液。

实施例4、转基因植株的鉴定

根据拟南芥ENS基因的编码区序列设计了一对引物检测转基因植株中ENS基因的表达，将转基因植株叶片和同时组培再生的非转基因番茄叶片用Trizol法提取总RNA，用上述的方法将总RNA转录成cDNA第一链，随后在RT反应中作为模板，RT引物序列为ENSRT-F 5’-GTT ACT ACG GCG AAGTCT ATA C-3’(SEQ ID NO：5)；ENSRT-R 5’-CCA CCA TCT TCT CTT TACTCA T-3’(SEQ ID NO：6)，PCR产物大小为620bp。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果为转基因植株有预期大小的扩增产物，而对照野生型没有扩增条带(如图1所示)。证明转基因植株表型是过表达拟南芥ENS基因引起的。

实施例5、转基因番茄植株果实表型

(1)转基因番茄植株与非转基因番茄果实鲜重比较

转基因番茄果实明显比非转基因番茄果实变小，而且果实鲜重也变小，经过T-test，差异显著。如图2所示。

(2)转基因番茄植株与非转基因番茄果实心皮壁厚度比较

转基因番茄果实明显比非转基因番茄果实心皮壁厚度变小，经过T-test，差异极显著。如图3所示。

(3)转基因番茄植株与非转基因番茄种子大小比较

转基因番茄种子明显比非转基因番茄种子变小，如图4所示。经过对种子百粒重统计，转基因番茄植株分别比非转基因植株种子百粒重减少25％和58％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>调控果实和种子发育的蛋白及其应用

<130>102420

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>948

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atggatgtag gagttactac ggcgaagtct atacttgaga agcctctgaa gcttctcact    60

gaagaagaca tttctcagct tactcgcgaa gattgccgca aattcctcaa agagaaagga    120

atgcgcaggc cttcgtggaa taaatctcag gcgatccagc aagttttatc tcttaaagct    180

ctctatgaac ctggagatga ttccggcgcc ggaatcctcc gcaagatcct tgtttctcag    240

ccgccaaatc cgcctcgcgt tacaacaacg ttgattgagc caaggaacga gctcgaagct    300

tgtggaagga ttcctttaca ggaagatgat ggtgcgtgcc atagaaggga ttctccaaga    360

tcagctgagt tttctggtag ttctggtcag tttgttgcgg ataaagatag ccacaagact    420

gtttctgttt cccccagaag cccagctgaa acaaatgcgg tggttgggca aatgacgata    480

ttttatagtg gcaaagtgaa tgtatatgat ggagtaccac ctgaaaaggc ccggtctatc    540

atgcattttg cagccaatcc aattgatttg cctgaaaatg gtatttttgc ttctagtaga    600

atgatttcga aacccatgag taaagagaag atggtggagc ttccccaata tggacttgaa    660

aaggcacctg cttctcgtga ttctgatgtt gagggtcagg cgaacagaaa agtatcgttg    720

caaagatatc ttgaaaagcg gaaagacaga agattttcta agaccaagaa ggctccagga    780

gttgcgtcct ctagcttgga gatgtttctg aatcgtcagc cacggatgaa cgctgcatat    840

tcacaaaacc ttagtggcac agggcattgc gagtcacctg aaaatcaaac aaaaagtccc    900

aatatctcag ttgatctaaa cagtgatcta aacagcgaag ataattaa                 948

<210>2

<211>315

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Asp Val Gly Val Thr Thr Ala Lys Ser Ile Leu Glu Lys Pro Leu

1               5                   10                  15

Lys Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Asp Cys

            20                  25                  30

Arg Lys Phe Leu Lys Glu Lys Gly Met Arg Arg Pro Ser Trp Asn Lys

        35                  40                  45

Ser Gln Ala Ile Gln Gln Val Leu Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Glu Pro

    50                  55                  60

Gly Asp Asp Ser Gly Ala Gly Ile Leu Arg Lys Ile Leu Val Ser Gln

65                  70                  75                  80

Pro Pro Asn Pro Pro Arg Val Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Arg Asn

                85                  90                  95

Glu Leu Glu Ala Cys Gly Arg Ile Pro Leu Gln Glu Asp Asp Gly Ala

            100                 105                 110

Cys His Arg Arg Asp Ser Pro Arg Ser Ala Glu Phe Ser Gly Ser Ser

        115                 120                 125

Gly Gln Phe Val Ala Asp Lys Asp Ser His Lys Thr Val Ser Val Ser

    130                 135                 140

Pro Arg Ser Pro Ala Glu Thr Asn Ala Val Val Gly Gln Met Thr Ile

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Ser Gly Lys Val Asn Val Tyr Asp Gly Val Pro Pro Glu Lys

                165                 170                 175

Ala Arg Ser Ile Met His Phe Ala Ala Asn Pro Ile Asp Leu Pro Glu

            180                 185                 190

Asn Gly Ile Phe Ala Ser Ser Arg Met Ile Ser Lys Pro Met Ser Lys

        195                 200                 205

Glu Lys Met Val Glu Leu Pro Gln Tyr Gly Leu Glu Lys Ala Pro Ala

    210                 215                 220

Ser Arg Asp Ser Asp Val Glu Gly Gln Ala Asn Arg Lys Val Ser Leu

225                 230                 235                 240

Gln Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Lys Asp Arg Arg Phe Ser Lys Thr Lys

                245                 250                 255

Lys Ala Pro Gly Val Ala Ser Ser Ser Leu Glu Met Phe Leu Asn Arg

            260                 265                 270

Gln Pro Arg Met Asn Ala Ala Tyr Ser Gln Asn Leu Ser Gly Thr Gly

        275                 280                 285

His Cys Glu Ser Pro Glu Asn Gln Thr Lys Ser Pro Asn Ile Ser Val

    290                 295                 300

Asp Leu Asn Ser Asp Leu Asn Ser Glu Asp Asn

305                 310                 315

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ctcgagatgg atgtaggagt tactacg                                        27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gaattcttaa ttatcttcgc tgtttag                                        27

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gttactacgg cgaagtctat ac                                             22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ccaccatctt ctctttactc at                                             22

Claims (10)

1.一种Peapod基因或Peapod蛋白的用途，用于调控茄科植物果实或种子发育，改变果实或种子的性状或形态。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Peapod基因或Peapod蛋白来源于十字花科植物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的十字花科植物是拟南芥。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的茄科植物是：茄科茄属植物。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括：

调控果实的大小或重量；

调控种子的大小或重量；或

调控果实的心皮壁厚度。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的Peapod基因或Peapod蛋白：

促进果实变小或降低果实重量；

促进种子变小或降低种子重量；或

降低果实的心皮壁厚度。

7.一种调控茄科植物果实或种子的性状的方法，所述方法包括：

将Peapod基因转入茄科植物中，获得果实或种子的性状发生改变的植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的将Peapod基因转入茄科植物中的方法包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有Peapod基因序列；

(S2)将茄科植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的Peapod基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物，所述植物即是果实或种子的性状发生改变的植物。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括：

促进果实变小或降低果实重量；

促进种子变小或降低种子重量；或

降低果实的心皮壁厚度。

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