CN1614024A - 降解有机汞污染的转基因烟草 - Google Patents

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CN1614024A CN 200310108449 CN200310108449A CN1614024A CN 1614024 A CN1614024 A CN 1614024A CN 200310108449 CN200310108449 CN 200310108449 CN 200310108449 A CN200310108449 A CN 200310108449A CN 1614024 A CN1614024 A CN 1614024A
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Abstract

本发明提供了一种适合在植物中表达的有机汞裂解酶merB基因，该基因是对细菌中催化甲基汞转变为离子汞的merB基因进行序列改造获得的。该本发明还涉及将改造的merB基因转入植物，从而获得对有机汞有强抗性的转基因植物。本发明的转基因植物可用于降解土壤中的有机汞污染物。

Description

降解有机汞污染的转基因烟草
技术领域
本发明属于植物学和污染防治领域，具体地说，本发明涉及对有机汞裂解酶merB基因的改造，用改造的merB基因制备对有机汞污染有高抗性的转基因植物(尤其是烟草)的方法。本发明还涉及用所述的转基因植物降解有机汞污染的方法。
背景技术
汞广泛应用于化学工业，造纸业，采矿业和国防工业，是土壤、水和空气重金属污染的主要元素之一。环境中的汞有单质汞、离子汞和有机汞(如甲基汞)3种形态。有些微生物可以使毒性低的无机汞转变成毒性高的甲基汞，甲基汞的生理毒性为单质汞的数千倍。鱼类吸收甲基汞的速度很快，通过食物链引起生物富集，并不易在生物体内排出。日本的“水俣病”就是由于汞污染鱼贝类造成的。
受汞污染的土壤中有一种优势细菌，具有把甲基汞转变为离子汞，离子汞转变为单质汞，并将其排出体内的能力。有人从该细菌中先后分离出merA和merB基因，其中merA基因编码汞还原酶，催化离子汞转变为单质汞的过程；merB基因编码的酶被称为有机汞裂解酶(organomercurial lyase)，催化甲基汞转变为离子汞。两个基因联合作用就会将有机态的汞转化为气态的单质汞。
一般情况下，无机汞化合物的解毒可以由merA基因的表达产物来实现。然而，有机汞的解毒至少需要两步转化，即有机汞降解为无机汞，无机汞汽化为单质汞。
单质汞的毒性小，排到大气中的汞已稀释到安全浓度。利用此原理，人们尝试将merA或merB基因导入植物，采用基因工程方法创造转基因植物，目的是转化汞的存在形态，修复有机汞或无机汞污染的土壤和水体。
Meagher博士领导的研究小组首先在模式植物拟南芥上转移merA和merB基因，获得抗汞和挥发汞的转基因植物。然而，人们发现，直接用细菌的merA和merB所获得的转基因植物对有机汞的抗性仍然难以令人满意。
因此，本领域迫切需要开发对有机汞有高抗性的转基因植物，以便能够有效和低廉地降解环境中的有机汞污染。
发明内容
本发明的目的就是提供一种制备对有机汞有很高抗性的转基因植物的方法，并将该转基因植物用于降解有机汞污染。
在本发明的第一方面，提供了本发明还提供了一种具有有机汞降解功能的多肽，它选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有有机汞降解功能的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了一种编码上述多肽的多核苷酸。在优选例中，提供了一种分离的多核苷酸，它是经过改造的特别适合在植物细胞中表达的merB基因，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％。
在另一优选例中，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值小于2％。
更佳地，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值小于1％。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1或3所示的核苷酸序列。
更佳地，在起始密码子ATG上游的15个核苷酸内含有植物翻译一致性序列AGAACCAC。
在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有本发明所述的改造的merB基因的多核苷酸。
在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体，或者所述宿主细胞的染色体中整合有本发明所述的改造的merB基因的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的细胞是植物细胞，尤其是烟草、水稻、小麦、玉米等作物。
在本发明的第四方面，提供了一种改变植物抗有机汞抗性的方法，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码merB的核苷酸序列，核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使编码merB的核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入编码merB的核苷酸序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
在另一优选例中，所述的植物是烟草、水稻、小麦、或玉米等作物。更佳地，所述的植物是烟草。
在本发明的五方面，提供了用本发明上述方法获得的转基因植物。
在本发明第六方面，提供了本发明转基因植物的用途，它们被用于降解土壤中的有机汞污染。
附图说明
图1A和1B显示了本发明改造的merB基因(merBhe基因)的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。
图2显示了merBhe基因表达载体pJR1∷merBhe的结构示意图。
图3显示了merBhe转基因烟草的Southern和Northern杂交结果。其中，
(a)Southern杂交。第1，3泳道分别为MerBhe-13和MerBhe-14两个转基因株系，第2泳道为野生型烟草，第4泳道为merBhe基因的探针。
(b)Northern杂交。第1，3泳道分别为MerBhe-13和MerBhe-14两个转基因株系，第2泳道为野生型烟草，第4泳道为merBhe基因的探针
图4显示了merBhe转基因烟草在含有0.5μmol/L PMA培养基上的发芽与生长情况。其中，(a)野生型烟草，(b)转基因株系MerBhe-14。
具体实施方式
本发明人经过研究发现，将细菌的merA或merB直接导入植物无法获得对有机汞有高抗性的植株的主要原因是细菌基因的G+C含量太高，在植物体内不表达或表达水平很低。适当降低G+C的含量，获得改造的merB基因，将改造的merB基因导入烟草，结果获得了对有机汞的抗性远高于现有技术的转基因植物。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“改造的merB基因”或“本发明的merB基因”可互换使用，指这样的核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％。较佳地，该差值绝对值小于2％，更佳地小于1％，最佳地小于0.5％。
如本文所用，术语“merBhe基因”指具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子。其中G+C百分比含量为51.8％。该术语还可包括在起始密码子上游和终止密码子下游20个以内的核苷酸，如SEQ ID NO：3所示的序列，其中G+C百分比含量为48.6％。
在本发明中，术语“merB蛋白”或“merB多肽”可互换使用，都指具有merB氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的merB。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明还包括merB的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然merB相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“merB多肽”指具有merB活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与merB的相同功能(降解有机汞功能)的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括merB的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与merB DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗merB多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含merB多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了merB多肽的片段。通常，该片段具有merB多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸。
发明还提供merB或多肽的类似物。这些类似物与天然merB多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
在本发明中，“merB保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
                      表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明涉及的核苷酸序列还包括G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％的核苷酸序列。其中该差值可通过下式计算：
差值＝某序列的G+C百分比-SEQ ID NO：1或3的G+C百分比
本发明的改造的merB的核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。通常，可先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。还可用PCR法获得本发明改造的merB基因。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或merB编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的merB多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码merB多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，merB多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含merB编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。优选的宿主细胞是植物细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗有机汞抗性提高的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对merB DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明的主要优点在于：
(a)改造的merB基因特别适合在植物细胞中表达。
(b)获得的转基因植物的抗有机汞抗性远高于现有技术。
因此，本发明的merB为改变植物的抗有机汞抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将merB的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的抗有机汞抗性，可获得抗有机汞的小麦、水稻或其它农作物品种，从而降解环境中的有机汞污染。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1材料与方法
(i)植物材料。试验植物为烟草(Nicotiana tabacum)。采用常规方法消毒烟草种子，在MS培养基上播种，并获得无菌苗，取25～30d苗龄的叶片作为遗传转化的受体材料。
(ii)菌种、质粒、工具酶。菌种包括大肠杆菌DH5α，农杆菌LBA4404(美国专利5659121和美国专利5808034)，实验所用的克隆载体为T-easy(Promega公司产品)，pBluescript KS(+)；植物基因表达载体为pJR1(美国专利5659121和美国专利5808034)，上述质粒和细菌都是本领域常用的，在众多专利文献中公开过或者可通过商业渠道购得。限制性内切酶、修饰酶购自华美生物工程公司。
(iii)对merB序列的改造设计、人工全合成和载体构建。本发明设计的改造的merB基因被称为merBhe，具体序列如图1和SEQ ID NO：3所示，其中编码区序列示于SEQ ID NO：1。将设计的序列用常规方法进行全基因合成。将合成的merBhe序列(SEQ ID NO：3)克隆在T-easy载体中，随后亚克隆在pBluescriptKS(+)质粒中。将merBhe片段插入pJR1载体中，构建成merBhe基因的表达载体pJR1∷merB。采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404。
(iv)遗传转化。烟草的转化用常规的叶盘法进行，方法如下：将过夜培养的农杆菌离心，菌体用MS液体培养基10倍悬浮。将烟草叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，放入菌液中浸泡10min，吸干多余的菌液后平放在MS+6-BA 3mg/L的培养基预培养2d。然后转接到分化和筛选培养基(MS+6-BA 3mg/L+Km 50mg/L+羧苄青霉素Cb 500mg/L)上，在25℃下共培养。等芽长到2cm高时，切下芽并转入生根培养基(1/2MS+NAA 1mg/L+Cb 300mg/L)上进行生根。待根长出后移栽到盆钵内，温室内培养至开花。每个转基因植株标记为一个转基因株系，按每个果实分别收获种子并编号。
(v)转基因种子的卡那霉素抗性筛选。从转化植株上收获的种子经表面消毒后播种在含有45mg/L卡那霉素(Km)的1/2MS固体培养基上筛选，21d后挑出绿苗移栽于蛭石和珍珠岩的人工土中，使其在人工气候室中生长。
(vi)有机汞抗性的测定。以醋酸苯汞(PMA)代表有机汞。在MS培养基中加入PMA，配制成不同PMA浓度处理的培养基，使其处理浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L。取转化植株的种子，经表面消毒后播种在含有不同PMA的MS固体培养基上，在培养室内培养。能够发芽且长出绿色真叶的种子认定为抗PMA的种子，不能萌发或发芽后心叶变白的种子视为不抗PMA。另外，在培养基中同时加入Km和PMA，观察转基因植株对Km和PMA的抗性是否同步。
为了确认转基因植株在苗期对PMA的抗性，在种有烟草转基因苗的土壤中加入PMA，根据幼苗的生长状况判断其抗性。
(vii)Southern和Northern杂交。用常规的CTAB法提取烟草转化植株总DNA，用EcoRI消化3h后，在0.7％琼脂糖凝胶上电泳。将DNA转移到尼龙膜(amersham)上。用XbaI/SalI双酶切pJR1∷merBhe载体，得到以32P-dCTP为标记物的合成探针，在42℃预杂交4h，预杂交缓冲液含有25％甲酰胺，100μg/mL变性的鲑精DNA，10μg/mL酵母RNA，5×Denhardt’s试剂，50mmol/L磷酸钠(pH 6.5)，5×SSC和0.2％SDS。向预杂交缓冲液中加入经过变性的探针，在同样的温度下温育24h。在室温下用漂洗缓冲液(0.05mol/L NaH2PO4，0.05mol/L Na2HPO4，5×SSC和25％甲酰胺)漂洗杂交膜，然后在42℃下用2×SSC/0.02％SDS继续漂洗。滤膜烘干后加增感屏对X射线片曝光。从转基因烟草和野生型烟草的叶片中分别提取总RNA，以32P-dCTP为标记的merBhe基因片段为探针进行Northern杂交，杂交温度为58℃。
2结果
2.1merB基因序列改造和植物表达载体构建
改造后的merBhe基因(图1)中增加了A和T的含量，但没有改变氨基酸序列，仍然编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。此外，merBhe序列起始密码子ATG上游还包括了植物翻译一致性序列AGAACCAC，使之更符合真核生物的序列特征。
将该全合成的产物克隆在T-easy载体上，经测序得到与预测序列相同的merBhe基因，其中编码区为639bp。由于合成的merBhe序列中G+C的含量明显降低(由55.3％降为48.6％)，因此，所获得的merBhe基因的编码区更加符合真核生物的序列特征。
用XbaI/SalI酶切pBluescript载体，得到merBhe基因的编码序列，以同样的酶切位点插入到pJR1双元载体中，构建成pJR1∷merBhe植物基因表达载体(图2)。用冻融法将该载体转化到农杆菌LBA4404中。
2.2烟草转化和抗有机汞筛选
采用叶盘法转化，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3mg/L+Km 50mg/L+Cb 500mg/L，生根培养基为1/2MS+NAA 1mg/L+Cb 300mg/L在Km筛选培养基上，转接14d后烟草叶片开始膨胀，增厚，叶缘开始产生皱褶，并有白色的愈伤组织生成。22d后可见芽的分化。此后，一部分再生芽变白而淘汰。培养绿色再生芽至2cm左右后，进行生根培养，1个月左右根系生长健壮，移栽到温室的盆钵中。本次实验得到120株再生苗，移栽成活86株。每个转基因植株单独收种、编号。
分别从转基因植株的叶片中提取总DNA，以merBhe基因的DNA片段为探针进行杂交，结果在4个DNA样品中有3个转基因植株的DNA样品显示杂交信号(图3a)。其中MerBhe-13和MerBhe-14两个转基因植株中merBhe基因为单拷贝插入。从上述2个转基因株系和野生型烟草的叶片中分别提取总RNA，以32P-dCTP标记的merBhe基因片段为探针进行Northern杂交，结果在MerBhe-13和MerBhe-14两个转基因株系中均出现了杂交带(图3b)。说明merBhe基因在该株系上得到了表达。
表1为用不同汞浓度筛选T1代转基因烟草种子的筛选情况。
表1T1代转基因烟草种子在含有PMA的筛选培养基上的出苗率a)
    PMA(μmol.L-1)              出苗率(％)
    对照   MerBhe-13   MerBhe-14
    0     88     91     80
    0.5     0     83     72
    1.0     0     78     63
    1.5     0     60     48
    2.0     0     39     20
    2.5     0     13     6
    3.0     0     5     0
    3.5     0     0     0
a)在播种后35d测定
表1结果表明，对照种子在PMA的浓度为0.5μmol/L时，即不能出苗，转基因种子的发芽情况很好。但是，有些发芽的种子后来死掉了。因此那些长出绿色真叶的幼苗才算出苗。出苗率随PMA的浓度增大而降低，其中MerBhe-13株系在2.5μmol/L时出苗率为13％，3.0μmol/L时仍有5％的出苗率，MerBhe-14株系在2.5μmol/L时出苗率为6％，3.0μmol/L时不能出苗。
由于植物表达载体含有植物选择标记基因NPTII(新霉素磷酸转移酶基因)，利用含Km的培养基筛选种子，可确定基因转化率和转基因植株。为了解转基因植株抗Km和抗汞是否同步，本发明人用含有Km，汞，Km+汞3种培养基筛选转基因种子。汞的筛选浓度采用烟草的致死浓度，转merBhe基因种子用PMA 0.5μmol/L筛选；Km的筛选浓度为50mg/L。MerBhe-13株系的种子群体中，抗Km和抗汞的比例较高，几乎占所处理种子的2/3(表2)；MerBhe-14株系群体中，抗Km和抗汞的比例较低，还不到所处理种子的1/3。在同时含有Km和PMA的培养基上，MerBhe-13株系中双抗幼苗的比例接近单抗的比例，而MerBhe-14株系的双抗比例明显低于单抗，说明有些抗Km的植株并不抗PMA，而有些抗汞的植株并不抗Km。
        表2 T1代merBhe转基因烟草对Km和PMA的反应a)
                                     出苗率/％
        处理
                        对照         MerBhe-13     MerBhe-14
        Km+             0            56            26
        Hg+             0            59            23
        Km+，Hg+        0            54            10
a)在播种后35d测定。Km+示抗卡那霉素，Hg+示抗有机汞
从理论上讲，在转基因植株体内，T-DNA的整合同时导入merBhe和NPTII基因。当Km抗性和汞抗性不一致时，最好的解释是，有些转基因植株的merBhe或NPTII基因没有表达或表达水平很低。
2.3转基因植株的形态表现
图4显示，在含有0.5μmol/L PMA的培养基上，野生型的烟草种子没有发芽，而转基因株系MerBhe-13和MerBhe-14的种子发芽情况基本正常，并且能够正常生长。当PMA浓度提高到1.0μmol/L时，转基因种子虽然能够发芽和生长，但下胚轴和叶片的伸展开始出现异常现象，表现在有些下胚轴短缩和倾斜，叶片变小和扭曲。随着PMA浓度的升高，幼苗生长的异常程度增加。
经PMA初步筛选的MerBhe-13幼苗，移栽于盆钵土壤中，用含PMA的营养液浇灌。结果显示，野生型烟草PMA的死亡临界浓度均为0.1μmol/L，在此浓度下，幼苗培养5d后叶片开始发黄并逐渐死亡。与此不同，MerBhe-13幼苗在0.1μmol/LPMA的条件下健康生长。随着PMA浓度的增大，生长开始受到不同程度的抑制，表现在叶片数的减少，株高的降低，叶色变黄，根系变小。其中2.0μmol/L时，植株的下部叶黄化死亡，但上部叶仍为黄绿色，新叶为淡绿色，可维持生长。PMA浓度为2.5μmol/L时，全部叶黄化，但若在黄化时转入不含PMA的培养基中，经1周后，新叶转绿，表明伤害可逆转。3.0μmol/L的伤害出现得早，也不可逆。因此，2.5umol/L PMA是MerBhe-13转基因株系的致死临界浓度，相比未转基因的烟草幼苗，抗汞性提高了25倍。
3讨论
植物修复技术(phytoremediation)是近年来发展起来的一种绿色生态技术，其中利用重金属超富集植物(hyperaccumulator)进行修复是当前环境生物学研究的热点领域，它是经济、有效的污染治理方法。目前已有Cd，Co，Cr，Cu，Mn，Ni，Pb，Zn和As等超富集植物发现的报道，但相对而言植物不易富集汞，目前还没有汞超富集植物的报道。因此，利用汞的天然超富集植物来吸收富集，从而从环境中排除汞的可能性很小。本发明通过merBhe的修饰和转移，创造转基因植物，结果得到对有机汞表现高抗作用的转基因系，这些转基因植物可用来吸收和转化污染环境中的有机汞，是汞污染土壤治理的有效途径。
在转基因植物体内，merA基因的表达产物具有吸收和挥发离子汞的解毒作用，这一点在转基因拟南芥、北美鹅掌楸和烟草上得到了证实，与此同时，在转基因拟南芥上merB基因将有机汞转化为无机汞。然而，merB转基因植物无法使无机汞挥发。要使植物完成有机态的汞到气态汞的挥发，可以有两种选择：一是在该植物中同时导入merA和merB两个基因，二是将merA转基因植株和merB转基因植株杂交，其后代的染色体组同时具有这两个基因。Bizily等人将merA和merB转基因拟南芥作为父母本杂交，所获得的杂交后代同预期的一样能够将有机汞直接转化为气态的单质汞。到目前为止，大多数汞解毒的研究集中在转基因拟南芥上。由于模式植物拟南芥个体很小，不可能用于大规模的植物修复。要采用植物修复的方法处理土壤和水体中的汞污染，必须采用生物量较大的植物。在这方面，烟草是一种比较理想的植物。
野生型的烟草植株由于缺乏外源merB基因，无法有效地转化PMA，因此对PMA表现出高度的敏感性，转基因烟草之所以对PMA表现出抗性，是因为它吸收PMA，并且在merB基因表达产物的作用下将有机态的PMA(有机汞)转化为离子态的汞。其结果是植株体内的离子汞浓度增加，植株本身也成为汞离子的超富集载体。在本发明的实验中，当PMA浓度为0.5μmol/L时，merB转基因烟草的出苗和生长基本上是正常的，而野生型烟草不能发芽，说明此浓度下转基因烟草对PMA表现出完全的抗性；随着PMA浓度的升高，转基因植株虽然能够生长，但受到越来越大的抑制。这是因为，转基因植株体内累积的离子汞不断增多，对植物组织的危害程度逐渐增强。同时因植株吸收PMA也使苯环的浓度增加。植物体内的苯环超过一定量后也有可能对生长造成危害。但是，在此类实验中，苯环的危害不是明显的。Bizily等人用甲基汞和PMA筛选merB转基因拟南芥，结果发现两者的筛选效果是一致的。
merBhe转基因烟草对PMA的抗性高达3.0μmol/L，由merBhe基因作用所产生汞离子可以进一步转化为低毒的单质汞，这一过程有赖于merA基因的作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                          序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>降解有机汞污染的转基因烟草
<130>036598
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>639
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(639)
<223>merB编码序列
<400>1
atgaaacttg ctccatatat tttagaatta ttaacttcag ttaatagaac taatggtact     60
gcagatctat tagtacctct acttagagaa ctagctaaag gtagaccagt ttcacgaacg    120
acacttgcct ggattctcga ctggcccgct gagcgagtgg ccgccgtact cgaacaggcc    180
accagtaccg aatatgacaa agatgtgaac atcatcggct acggcctcac cttgcgcgag    240
acttcgtatg tctttgaaat tgacgaccgc cgtctgtatg cctggtgcgc gctggacacc    300
ttgatatttc cggcgctgat cggacgtaca gctcgcgtct catcacattg cgctgcaacc    360
ggagcaccgg tttcactcac ggtttcaccc agcgagatac aggctgtcga acctgccgtc    420
atggcggtgt ccttggtatt gccgcaggaa gcagccgacg ttcgtcagtc cttctgttgc    480
catgtacatt tctttgcatc tgtcccgacg gcggaagact gggcctcaaa gcatcaagga    540
ttggaaggat tagcaattgt aagtgttcat gaagctttag gtttaggtca agaatttaat    600
cgacatctat tacaaacaat gtcatctaga acaccttga                           639
<210>2
<211>212
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>有机汞裂解酶
<400>2
Met Lys Leu Ala Pro Tyr Ile Leu Glu Leu LeuThr Ser Val Asn Arg
1               5                   10                 15
Thr Asn Gly Thr Ala Asp Leu Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ala
            20                  25                  30
Lys Gly Arg Pro Val Ser Arg Thr Thr Leu Ala Trp Ile Leu Asp Trp
        35                  40                  45
Pro Ala Glu Arg Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ala Thr Ser Thr Glu
    50                  55                  60
Tyr Asp Lys Asp Val Asn Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Arg Glu
65                  70                  75                  80
Thr Ser Tyr Val Phe Glu Ile Asp Asp Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Cys
                85                  90                  95
Ala Leu Asp Thr Leu Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg Thr Ala Arg
            100                 105                 110
Val Ser Ser His Cys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Ser Leu Thr Val
        115                 120                 125
Ser Pro Ser Glu Ile Gln Ala Val Glu Pro Ala Val Met Ala Val Ser
    130                 135                 140
Leu Val Leu Pro Gln Glu Ala Ala Asp Val Arg Gln Ser Phe Cys Cys
145                 150                 155                 160
His Val His Phe Phe Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Asp Trp Ala Ser
                165                 170                 175
Lys His Gln Gly Leu Glu Gly Leu Ala Ile Val Ser Val His Glu Ala
            180                 185                 190
Leu Gly Leu Gly Gln Glu Phe Asn Arg His Leu Leu Gln Thr Met Ser
        195                 200                 205
Ser Arg Thr Pro
210
<210>3
<211>658
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>含上游和下游部分序列的merBhe
<400>3
ctctagaacc acaatgaaac ttgctccata tattttagaa ttattaactt cagttaatag     60
aactaatggt actgcagatc tattagtacc tctacttaga gaactagcta aaggtagacc    120
agtttcacga acgacacttg cctggattct cgactggccc gctgagcgag tggccgccgt    180
actcgaacag gccaccagta ccgaatatga caaagatgtg aacatcatcg gctacggcct    240
caccttgcgc gagacttcgt atgtctttga aattgacgac cgccgtctgt atgcctggtg    300
cgcgctggac accttgatat ttccggcgct gatcggacgt acagctcgcg tctcatcaca    360
ttgcgctgca accggagcac cggtttcact cacggtttca cccagcgaga tacaggctgt    420
cgaacctgcc gtcatggcgg tgtccttggt attgccgcag gaagcagccg acgttcgtca    480
gtccttctgt tgccatgtac atttctttgc atctgtcccg acggcggaag actgggcctc    540
aaagcatcaa ggattggaag gattagcaat tgtaagtgtt catgaagctt taggtttagg    600
tcaagaattt aatcgacatc tattacaaac aatgtcatct agaacacctt gaagcttc      658

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值小于2％。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值小于1％。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸序列具有SEQID NO：1或3所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或者所述宿主细胞的染色体中整合有权利要求1所述的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述的细胞是植物细胞。
8.一种改变植物抗有机汞抗性的方法，其特征在于，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码merB的核苷酸序列，核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量与SEQ ID NO：1中的G+C的百分比含量的差值绝对值小于5％；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使编码merB的核苷酸序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入编码merB的核苷酸序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物是烟草。
10.一种用权利要求8所述方法获得的转基因植物的用途，其特征在于，它被用于降解土壤中的有机汞污染。
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