CN106011167B - 雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法；采用常规基因工程方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得OsDPW2基因表达水降低，进而获得水稻雄性不育系。本发明还涉及一种水稻育性恢复的方法，通过引物扩增OsDPW2基因，使用遗传转化的手段转化突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常。如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用。

Description

雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的水稻株系创制的方法，具体涉及一种雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法。

背景技术

水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以水稻为主食，大米也是加工许多食品的原材料。由于水稻的基因组较小，且水稻转化系统非常成熟，可以作为单子叶研究的模式植物，人们对水稻生殖发育机制还有待了解。水稻雄性不育系的发现及其利用开创了水稻杂交育种的新时代，对提高水稻产量发挥了巨大作用。由于目前水稻杂交过程中使用的不育系存在育性不稳定、细胞质负效应等缺点，因此深入开展水稻雄性不育调控机制的研究，对获得新型水稻不育系，提高农业产量等具有重要意义。同时对揭示植物生殖发育的分子调控机理等方面也具有重要的理论意义。

雄性不育系：是指一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于三系法品种间杂交优势利用的范畴，这种三系杂交稻一般要比常规水稻增产20％左右，当前仍处于方兴未艾时期。但是，三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限制，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，以期扩展细胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复(即，恢复水稻雄性不育)的方法。本发明利用OsDPW2基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种雄性不育基因OsDPW2的应用，所述的雄性不育基因OsDPW2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsDPW2基因，使得常规水稻品种中的OsDPW2基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

第二方面，本发明还涉及一种水稻不育株系创制的方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。

优选地，所述水稻品种为粳稻品种9522。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得所述水稻雄性不育株系，即osdpw2突变体。

优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.10，进而获得所述水稻雄性不育株系，即osdpw2突变体。

优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法，敲除OsDPW2基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

更优选地，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a)合成单核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

OsDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG

OsDPW2CRISPRDOWN(SEQ ID No.4)：AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA

b)通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自百格公司，货号BGKO3)进行连接反应，构建含有水稻OsDPW2基因靶序列(如SEQ ID No.5所示)的OsDPW2-BGKO3质粒；

c)用含OsDPW2-BGKO3质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d)通过利用如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的OsDPW2基因的特异性引物，扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

Identify-F(SEQ ID No.11)：GTGGAGCTTGGAGTGAAGCGA

Identify-R(SEQ ID No.12)：GGGGTCGGGGCGGGTGATGTC

所述水稻OsDPW2基因靶序列如下所示：

SEQ ID No.5：GCGGCGCCGGCGACGCACTG

第三方面，本发明还涉及一种所述水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。

第四方面，本发明还涉及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述OsDPW2基因，转入如前述所述应用获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsDPW2互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsDPW2互补构建含有编码如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

更优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用碱基序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增出OsDPW2基因的如SEQ ID NO.6所示的5997bp的基因组序列片段；

(b)提供携带表达OsDPW2互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；

(c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得恢复育性的水稻植株。

优选地，编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID No.2所示。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过控制水稻花粉乙酰转移酶OsDPW2基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；

2、本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，与来源亲本无明显差异，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，花粉败育，得到完全不育的植株，如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为osdpw2突变体植株的形态学观察示意图；其中，图1A为野生型9522和osdpw2突变体整株表型；图1B为野生型9522和osdpw2突变体穗形；图1C为野生型9522和osdpw2突变体小穗；图1D为野生型9522和osdpw2突变体小花内部结构；图1E为野生型9522和osdpw2突变体雄蕊；图1F为野生型9522成熟花粉I₂/KI染色结果；图1G为osdpw2突变体I₂/KI染色结果；

图2为OsDPW2表达模式示意图；其中，图2A为半定量RT-PCR法确定OsDPW2基因的表达模式示意图；图2B为荧光定量PCR确定OsDPW2基因的表达模式示意图；图2C为GUS染色分析结果示意图；图2D为染色的Stage10花药半薄切片示意图；

图3为互补osdpw2突变体得到野生型表型示意图；其中，图3A为野生型9522小花内部结构图；图3B为野生型成熟花粉I₂/KI染色结果；图3C为野生型9522恢复育性时小穗种子图；图3D为互补osdpw2突变体后代的小花内部结构图；图3E为互补osdpw2突变体后代的成熟花粉I₂/KI染色结果；图3F为互补osdpw2突变体后代恢复育性时小穗种子图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述OsDPW2基因为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IDNO.2。

实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法

1.1通过常规育种手段创制osdpw2水稻雄性不育株系

本实施例的osdpw2突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过常规的基因工程方法突变而得。

本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突变，具体包括经过⁶⁰Coγ射线诱变获得osdpw2突变体，处理剂量为280Gy(参照方法：陈亮，储黄伟，袁政，et al.60Coγ-Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析[J].厦门大学学报：自然科学版，2006，(S1)：82-85)。对诱变的突变体回交三代，获得隐性核单基因控制的稳定遗传的osdpw2突变体。将osdpw2突变体与9522回交，所有F1代的表型都与9522一致，表现为可育。突变体与野生型杂交的F1代自交后产生的F2代群体中，可育与不育植株的分离比约为3∶1，表明这是一个由隐性单基因突变导致的突变体不育的表型。

1.2水稻育性控制蛋白基因OsDPW2的克隆

利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因OsDPW2(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其突变基因osdpw2(其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组片段内，例如100Kb内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白OsDPW2。

经全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性OsDPW2基因全长为2129bp(SEQ IDNO.13，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为447个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。

1.3水稻育性控制蛋白基因OsDPW2的点突变

本实施例的osdpw2突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对OsDPW2基因的序列变异获得，经过对OsDPW2突变基因osdpw2的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋白的移码和提前终止会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育；本实施例OsDPW2突变基因是在编码区的1个碱基对缺失(其序列如SEQ ID NO.9所示)引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译得提前终止和功能丧失。

1.4通过CRISPR手段降低水稻品种中的OsDPW2的表达水平

为了对OsDPW2蛋白进行应用，构建了OsDPW2基因CRISPR的载体(载体来自百格公司，货号BGKO3)，并转化野生型9522植株，以降低OsDPW2的表达，从而达到改变水稻育性的目的。

合成单核苷酸序列引物

OsDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG

OsDPW2CRISPRDOWN(SEQ ID No.4)：AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA

通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自百格公司，货号BGKO3)进行连接反应，构建含有水稻OsDPW2基因靶序列OsDPW2-BGKO3质粒；

将含有OsDPW2-BGKO3构建的农杆菌在含有Kan(50μg/μl)的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.4至0.6左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的9522未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于次氯酸钠溶液中(与水1∶3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并转入到N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/L潮霉素的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列，如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株。

1.5OsDPW2蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常

对osdpw2突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型osdpw2的表型在营养生长时期没有明显差别，在营养生殖生长时期，野生型和突变型osdpw2的穗形、穗粒数均没有明显差异，但是对比显示野生型9522花药发育正常，而osdpw2突变型花药变白变小(D，E)；野生型9522碘染正常(F)，突变型osdpw2花药碘染不上成熟的花粉粒(G)。

1.6OsDPW2表达特征

利用osdpw2突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用半定量RT-PCR(图2A)和荧光定量PCR的方法确定OsDPW2基因的表达模式(图2B)，发现OsDPW2基因在水稻中是广泛表达的，在根、茎、叶和不同发育时期的花药中都有表达。在水稻雄性生殖发育时期花药的Stage7至Stage11显著表达。用OsDPW2基因自身启动子融合GUS报告基因，转化野生型，染色T1代转基因阳性植株，GUS染色分析显示其在花药的Stage7至Stage11表达(图2C)，对染色的Stage10花药半薄切片显示其在花药的绒毡层和小孢子中高表达(图2D)。

1.7OsDPW2基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将osdpw2突变体与籼稻品种9311、龙特甫或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3∶1分离规律，进而证明OsDPW2基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。

实施例2、osdpw2突变体在水稻制种中的用途

将osdpw2突变体作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。

实施例3、恢复osdpw2突变体雄性不育性状的方法

将编码OsDPW2基因的基因组核苷酸序列转入突变体osdpw2突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。

从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用引物：

70025gDNAF(其序列如SEQ ID NO.7所示)：

CCATGATTACGAATTCTATTGCCTGTTTGTGGCTGGAC，

70025gDNAR(其序列如SEQ ID NO.8所示)：ATTCGAGCTGGTCACCGCCGCTTACACGTTACTGTATTGG

扩增出OsDPW2基因的如SEQ ID NO.6所示的5997bp的基因组序列片段；

将该片段通过大连宝生物公司的In-Fusion转化体系将扩增的DNA片段插入到用于转化水稻的双元载体DCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105得到OsDPW2互补根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，使用遗传转化手段转化突变体osdpw2突变体营养生殖生长期的幼穗愈伤，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。

T₀代获得互补植株，图3显示T₀代互补植株可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出的野生型表型。

综上所述，本发明通过控制水稻BAHD家族HXXXD类型的乙酰转移酶OsDPW2基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种雄性不育基因OsDPW2的应用，其特征在于，所述的雄性不育基因OsDPW2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规基因工程方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得OsDPW2基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系；所述敲除、改变或抑制OsDPW2基因的方法为：将SEQID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.10所示氨基酸序列。

2.一种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规基因工程方法或基于CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列突变为SEQ ID No.9所示核苷酸序列，进而使得SEQ ID NO.1对应多肽的表达水平降低或者活性丧失。

3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征是，所述水稻品种为粳稻品种9522。

4.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征是，所述编码SEQ IDNO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除OsDPW2基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

6.如权利要求5所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述基于CRISPR/Cas9系统的方法包括如下步骤：

a)合成单核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

b)通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与BGK03载体片段进行连接反应，构建含有水稻OsDPW2基因靶序列的OsDPW2-BGK03质粒；所述靶序列如SEQ ID No.5所示；

c)用含OsDPW2-BGK03质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d)通过利用如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的OsDPW2基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序,筛选突变植株。

7.一种如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。

8.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将OsDPW2基因，转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型；所述OsDPW2基因如SEQ ID NO.2所示。

9.如权利要求8所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含OsDPW2互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsDPW2互补构建载体含有编码如SEQID NO.6所示的核苷酸序列。

10.如权利要求9所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用碱基序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增出OsDPW2基因的如SEQ ID NO.6所示的5997bp的基因组序列片段；

(b)提供携带表达OsDPW2互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；

(c)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得恢复育性的水稻植株。