CN114480418B

CN114480418B - 温敏雄性不育基因hsp60-3b及其应用和育性恢复的方法

Info

Publication number: CN114480418B
Application number: CN202210080137.7A
Authority: CN
Inventors: 梁婉琪; 林森; 刘泽; 张大兵; 袁政; 陈明姣
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114480418A

Abstract

本发明公开了一种温敏雄性不育基因HSP60‑3B及其应用和育性恢复的方法；该基因HSP60‑3B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制HSP60‑3B基因，使得常规水稻品种中的HSP60‑3B基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。本发明通过引物扩增HSP60‑3B基因，使用遗传转化的手段，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻HSP60‑3B不育系营养生长阶段没有明显异常，平均生长温度32℃至34℃条件下不育，平均温度22℃生长条件下可育。HSP60‑3B基因应用于水稻育种时，可以提高水稻生殖期花粉抗高温的能力，有稳产的作用；而HSP60‑3B不育系应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用潜力。

Description

温敏雄性不育基因HSP60-3B及其应用和育性恢复的方法

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，涉及一种生物工程技术领域的水稻不育系创制的方法，具体涉及一种温敏雄性不育基因HSP60-3B及其应用和育性恢复的方法。

背景技术

水稻是我国要的粮食作物之一，不论是种植面积还是总产量都居粮食作物中的第一位。我国约有60％以上的人口以稻米为主食,是世界上最大的稻米生产国和消费国。长期以来，人口的增长、生活质量的提高和耕地面积的减少对作物产量的要求日益增加，因而保障粮食安全一直是我国农业生产所面临的挑战。水稻杂种优势的研究与成功利用，是现代植物遗传育种学科领域的一大成就，为我国乃至世界的粮食增产发挥了重要的作用。水稻杂种优势的利用首先需要获得雄性不育系。植物的雄性不育一直是植物中十分普遍的现象，而且作为一种遗传工具，可以省去人工去雄的麻烦，在农作物杂种优势利用上有重要的应用价值。目前生产上使用的杂交水稻属于三系杂交水稻，比常规水稻增产20％左右。

三系杂交水稻的发展始于野生败育的细胞质雄性不育(CMS-WA)株系的发现，该发现解决了水稻杂交过程中的自授粉问题。三系杂交水稻包括三个不同的株系：恢复系，保持系和细胞质雄性不育系。其中，恢复系提供花粉，与细胞质雄性不育系杂交，F1代能够恢复育性正常接种；保持系与不育系相比具有相同的基因型，但其花粉可育，与细胞质雄性不育系杂交时可提供花粉，产生雄性不育基因型的种子，使这一基因型得以保持。尽管三系杂交被广泛的应用于杂交水稻种子的生产，但三系中对正常细胞质的保持系及核内基因可育的恢复系的需求制约了杂交水稻品系的开发。但是三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系的影响较大，在生产和推广上收到一定的限制。因此，筛选和培育新的不育系一直是杂交水稻育种的重要研究方向之一。

水稻是雌雄同花植物，花药是水稻的雄性生殖器官，其配子体(花粉)成熟于水稻花药中。雄性配子体从形态建成到成熟包含一系列复杂的生物学过程。首先，初生造孢细胞通过增殖和分化形成花粉母细胞，花粉母细胞经过减数分裂形成四分体，随后四分体解离释放出游离的小孢子；小孢子的细胞核经过两次有丝分裂形成两个生殖核和一个营养核，同时小孢子表面的外壁结构逐步形成，最终发育成为成熟花粉。这一系列过程是复杂而精密的，任何一个关键环节失控将会导致小孢子发育异常而导致雄性败育。对水稻雄性生殖发育过程的研究对筛选水稻不育系具有重要的指导意义。

因此，利用物理、化学以及生物等手段对雄性配子体发育过程中的关键基因进行诱变，以阻断相应进程进而导致雄性不育，是创造新型水稻不育系的重要手段。

发明内容

本发明针对现有水稻不育系种质缺乏的限制，提供一种新的温敏雄性不育基因HSP60-3B及其应用和育性恢复的方法。利用HSP60-3B基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有重要的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种水稻温敏雄性不育基因HSP60-3B，所述温敏雄性不育基因HSP60-3B编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，编码所述温敏雄性不育基因HSP60-3B的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，本发明涉及一种水稻温敏雄性不育基因HSP60-3B的应用，所述温敏雄性不育基因HSP60-3B编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的应用具体是，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制HSP60-3B基因，使得常规水稻品种中的HSP60-3B基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

第三方面，本发明涉及一种水稻温敏雄性不育株系的制备方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。通过NCBI数据库检索可知，同物种不同类型HSP蛋白同源性较低，现还未见报道水稻中HSP家族蛋白完全丧失功能的雄性不育突变体。此外突变体hsp60-3b表现出高温雄性不育，其花药中的小孢子和花粉表型也与其他现有技术有所区别，本发明具有创新性及较大的农业生产的应用潜力。

优选地，所述水稻品种为粳稻品种9522、籼稻9311或广陆矮4号。

优选地，所述水稻中编码如SEQ ID No.1所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述水稻温敏雄性不育株系的制备方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID No.8，进而获得所述水稻温敏雄性不育株系，即hsp60-3b突变体。

优选地，所述水稻温敏雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用物理诱变的方法，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得所述水稻雄性不育株系，即hsp60-3b突变体。

优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括：采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法，敲除HSP60-3B基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。

更优选地，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a)合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

HSP60-3B-CRISPRUP(SEQ ID No.3):TGGCGAGCGGTTGGCAAAGCTCTC

HSP60-3B-CRISPRLOW(SEQ ID No.4):AAACGAGAGCTTTGCCAACCGCTC

b)通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与sgRNA-Cas9载体片段进行连接反应，构建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒；所述靶序列如SEQ ID No.13所示；

c)用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d)通过将HSP60-3B基因的特异性引物(引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示)扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

特异性引物序列如下所示：

HSP60-3B-CRISPRUP2(SEQ ID No.11):CCGCTAACATTTAAGATGATACC

HSP60-3B-CRISPRLOW2(SEQ ID No.12):GGTCAAAATATAACTTCAGGGCAC

所述水稻HSP60-3B基因靶序列如下所示：

SEQ ID No.13:GAGCGGTTGGCAAAGCTCTC。

采用sgRNA-Cas9质粒对于基因组的多重编辑能力更强、效率更高。

第四方面，本发明还涉及一种前述的方法获得的水稻温敏雄性不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：所述用途包括：在长光高温(平均温度32℃至34℃)条件下，，以水稻HSP60-3B不育株系作为母本，进行杂交育种；或，在平均温度22℃条件下，以水稻HSP60-3B株系进行自交制种。

第五方面，本发明还涉及一种恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述HSP60-3B基因转入上述方法获得的水稻温敏雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含HSP60-3B互补构建的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中HSP60-3B互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。

更优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物扩增出HSP60-3B基因的8860bp的基因组序列片段(包含启动子序列)；

(b)提供携带表达HSP60-3B互补构建载体的根癌农杆菌EHA105；

(c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。

本发明的研究表明，长光高温32℃至34℃条件下，hsp60-3b完全不育，可以用于杂交育种，免去母本去雄的繁琐工作。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过控制雄性不育基因HSP60-3B及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到部分不育或完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为温敏雄性不育hsp60-3b突变体的温敏不育表型及hsp60-3b crispr的表型示意图；其中，图1A为22℃和34℃生长条件下粳稻9522去部分内外稃花表型图；图1B为22℃生长条件下hsp60-3b去内外稃花表型图；图1C为为34℃生长条件下hsp60-3b去内外稃花表型图；图1D为22℃生长条件下hsp60-3b crispr(粳稻9522背景)去内外稃花表型图；图1E为34℃生长条件下hsp60-3b crispr(粳稻9522背景)去内外稃花表型图；图1F为22℃和34℃生长条件下粳稻9522花粉粒I2-KI染色图；图1G为22℃生长条件下hsp60-3b花粉粒I2-KI染色图；图1H为34℃生长条件下hsp60-3b花粉粒I₂-KI染色图；图1I为22℃生长条件下hsp60-3b crispr(粳稻9522背景)花粉粒I2-KI染色图；图1J为34℃生长条件下hsp60-3b crispr(粳稻9522背景)花粉粒I2-KI染色图；图1A到图1E的图标等于1毫米；图1F到图1J的图标等于100微米；

图2为将HSP60-3B基因组转化突变体得到T₀代互补恢复株系与野生型表型对比图；其中，图2A为34℃野生型小花结构图；图2B为34℃野生型去掉内外稃的小花结构图；图2C为34℃野生型碘染结构图；图2D为34℃T₀代互补株系小花结构图；图2E为34℃T₀代互补株系去掉内外稃结构图；图2F为34℃T₀代互补株系碘染结构图；图2A、2B、2D、2E的图标等于1毫米；图2C、2F的图标等于100微米；

图3为HSP60-3B基因定位、结构和突变位点及突变序列示意图；其中，图3A为HSP60-3B基因定位示意图，竖线上标记的数字为所用的引物的名称，重组子和遗传距离；Chr.10表示基因位于10号染色体上；图3B为HSP60-3B基因结构示意图，前后两个黑色框分别表示5’UTR和3’UTR区域；紫色框表示外显子；黑色细线表示内含子区域；图3C为野生型WT和hsp60-3b突变体中突变位点及突变前后核苷酸和氨基酸序列详细情况示意图；

图4为HSP60-3B基因的表达情况示意图；其中，横坐标所述的St6、St7、St8a、St8b、St9、St10、St11、St12、St13表示水稻雄性生殖发育的各个时期野生型花药材料。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明使用遗传转化的手段，将扩增的HSP60-3B基因转入突变体hsp-3b中，使突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻HSP60-3B不育系营养生长阶段无明显异常,进入生殖期后在均温32℃至34℃条件下不育，在均温22℃生长条件下可育。HSP60-3B不育系应用于杂交育种中，通过控制生长温度可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用潜力。

所述HSP60-3B基因为编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

HSP60-3B基因表达模式图见图4。

实施例1水稻雄性不育株系创制的方法

1.1水稻雄性育性控制基因HSP60-3B的图位克隆

利用发明人构建的包含雄性不育基因HSP60-3B(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其突变基因HSP60-3B(其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因图位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组区间内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白HSP60-3B的基因。

经全核苷酸序列分析结果表明：雄性不育基因HSP60-3B全长为5405bp(SEQ IDNo.10，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID No.2所示，编码全长为634个氨基酸的蛋白HSP60-3B，其序列如SEQ ID No.1所示。

1.2水稻雄性育性控制蛋白基因的点突变

本实施例的HSP60-3B突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对HSP60-3B基因的序列变异获得，经过对HSP60-3B突变基因与HSP60-3B基因的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋白的突变导致蛋白翻译过程移码，使得水稻雄性生殖器官发育过程出现异常，造成植株不育；本实施例HSP60-3B的突变基因是在编码区的八个碱基对的缺失(其序列如SEQ ID No.8所示),使SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，从而引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译异常以及功能改变。

1.3通过CRISPR手段突变水稻品种中的HSP60-3B基因

为了对HSP60-3B蛋白进行应用，构建了HSP60-3B基因CRISPR的载体(HSP60-3B-sgRNA-Cas9)，并转化野生型9522植株，以阻碍HSP60-3B的完整表达，从而达到改变水稻育性的目的(图3B为HSP60-3B基因结构图；图1D、1E分别为hsp60-3b CRISPR株系在22℃和34℃条件下的小花内部结构图；图1I、1J分别为hsp60-3b CRISPR株系在22℃和34℃条件下的花粉I2/KI染色结果)

具体步骤如下：

1.3.1合成单核苷酸序列引物

HSP60-3B-CRISPRUP(其序列如SEQ ID No.3所示):

TGGCGAGCGGTTGGCAAAGCTCTC

HSP60-3B-CRISPRLOW(其序列如SEQ ID No.4所示):

AAACGAGAGCTTTGCCAACCGCTC

1.3.2通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与sgRNA-Cas9载体片段(由上海师范大学张辉老师惠赠，参考文献https://doi.org/10.1111/pbi.12200)进行连接反应，构建含有水稻HSP60-3B基因靶序列(如SEQ ID No.13所示)的HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒；

1.3.3将HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒转入农杆菌中构建得到含有HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的农杆菌在含有Kan(50μg/mL)、利福平(20μg/mL)的YEB平板上划线培养，获得单菌落。挑单菌落接种到3mL含Kan(50μg/mL)、利福平(20μg/mL)的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50mL含Kan(50μg/mL)、利福平(20μg/mL)的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，形成的AAM农杆菌菌液此时即可用于转化水稻各种受体材料。

1.3.4本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的愈伤。取成熟种子置于75％乙醇中浸泡5分钟，用无菌水漂洗3次,再用33％的次氯酸钠溶液消毒20分钟以上(期间摇匀数次)，用无菌水冲洗8-10次后，置于NBD2培养基上，在26±1℃、避光条件下培育，诱导愈伤组织；12天后进行继代，用解剖刀和镊子挑出愈伤组织并接种于NBD2培养基上继续诱导愈伤。7天后可用于转化。将愈伤组织浸泡入新鲜的用AAM培养基重悬的农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将幼胚愈伤组织移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到NBD2-AS培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮(AS)，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有80mg/L潮霉素和400mg/L特美汀的选择培养基上进行选择培养。12天后将抗性愈伤组织转到含有80mg/L潮霉素和400mg/L特美汀的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上(含有干酪素0.5g/L、6-苄氨基嘌呤2mg/L、激动素0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、蔗糖30g/L、山梨醇15g/L的MS培养基)培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

1.3.5将获得的阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列，如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株，即hsp60-3b突变体植株。

1.4 HSP60-3B蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常

对高温条件下(温度为34℃、光照条件为12.5-14小时)种植得到的hsp60-3b突变体植株进行形态学观察。如图1所示，hsp60-3b突变体与野生型相比花药呈淡黄色且略小(图1C)，野生型9522花药发育正常(图1A)；野生型9522成熟花粉可被I₂/KI染色(图1F)，HSP60-3B突变体与野生型花药成熟期相对应的时期可观察到花粉形态皱缩，不能被I₂/KI染色(图1H)。而在低温条件下(温度为22℃)，野生型和突变体hsp60-3b花药几乎没有差异(图1A,1B),碘染都能形成正常的花粉粒(图1F,1G)。

1.5通过物理诱变手段创制HSP60-3B水稻雄性不育株系

本实施例中HSP60-3B基因的编码区序列如SEQ ID No.2所示。本实施例的HSP60-3B突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过常规的基因工程方法突变而得。

本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突变，具体包括经过⁶⁰Coγ射线诱变获得HSP60-3B突变体，处理剂量为280Gy(参照方法：陈亮，储黄伟,袁政,等.⁶⁰Coγ-Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析.厦门大学学报：自然科学版,2006,(S1):82-85)。对诱变的突变体回交三代，获得稳定遗传的突变体库。

1.6 HSP60-3B表达特征

利用HSP60-3B突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定HSP60-3B基因的表达模式(如图4)，发现HSP60-3B基因在水稻雄性生殖发育时期有广泛表达，且在水稻雄性生殖发育时期Stage10和Stage11表达最高；此外，营养发育过程中的叶、内外稃、根中都有表达。

实施例2恢复HSP60-3B突变体雄性不育性状的方法

将编码HSP60-3B基因的基因组核苷酸序列转入突变体HSP60-3B植株，能够使突变体恢复到野生型表型。具体为将含HSP60-3B互补构建的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中HSP60-3B互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。具体步骤如下：

2.1从水稻9522基因组中用引物：

HSP60-3B-CF(其序列如SEQ ID NO.6所示):

ACATGATTACGAATTCTGGAAGATGAGGAAGAGGTAAGTTG(EcoRI)

HSP60-3B-CR(其序列如SEQ ID NO.7所示):

ATTCGAGCTGGTCACCGCAGTTAGCTCTTGCATGAGAGCCA(BstEII)

扩增HSP60-3B基因组片段(包括启动子区2909bp，ATG-TAA区域5081bp，TAA下游870bp)。用内切酶EcoRI和BstEII分别酶切HSP60-3B基因组片段和水稻的双元载体pCAMBIA1301，纯化后用T4连接酶将二者进行连接和转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定后提取质粒并测序；测序验证正确，获得pCAMBIA1301-HSP60-3B载体，该载体转入根癌农杆菌EHA105，得到HSP60-3B互补根癌农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化hsp60-3b突变体的成熟胚愈伤组织，从而使编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。获得T₀代互补植株(即hsp60-3b突变体恢复株系)，图2显示T₀代互补植株在高温下可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出野生型表型。其中，图2A、2B、2C分别为高温下野生型小花内部结构图、去掉内外稃的小花结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果；图2D、2E、2F分别为高温下T₀代互补株系小花内部结构图、去掉内外稃的小花结构图和成熟花粉I₂/KI染色结果。

综上所述，本发明通过控制水稻雄性生殖发育相关基因HSP60-3B及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉基本败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 雄性不育基因HSP60-3B及其应用和育性恢复的方法

<130> KAG48326

<141> 2022-01-17

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Leu Glu Pro Pro Arg Val Phe Ser Ser Leu Ile Lys Ser Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Leu Phe Pro Pro Pro Gln Glu Lys Lys Arg Leu His Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Ser Pro Pro Pro Leu Thr Ser Pro Pro Leu Pro Ser Leu

35 40 45

Leu Leu Pro Ser Pro Arg Ser Leu Leu Gly Ser Ala Met Tyr Arg Ala

50 55 60

Ala Ala Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ser Ala Arg

65 70 75 80

Gln Val Gly Ser Arg Leu Ala Leu Ser Arg Asn Tyr Ala Ala Lys Asp

85 90 95

Ile Lys Phe Gly Val Glu Ala Arg Ala Leu Met Leu Arg Gly Val Glu

100 105 110

Glu Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn

115 120 125

Val Val Ile Glu Gln Ser Tyr Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly

130 135 140

Val Thr Val Ala Lys Ser Ile Glu Phe Lys Asp Arg Val Lys Asn Val

145 150 155 160

Gly Ala Ser Leu Val Lys Gln Val Ala Asn Ala Thr Asn Asp Thr Ala

165 170 175

Gly Asp Gly Thr Thr Cys Ala Thr Val Leu Thr Lys Ala Ile Phe Thr

180 185 190

Glu Gly Cys Lys Ser Val Ala Ala Gly Met Asn Ala Met Asp Leu Arg

195 200 205

Arg Gly Ile Ser Met Ala Val Asp Ala Val Val Thr Asn Leu Lys Gly

210 215 220

Met Ala Arg Met Ile Ser Thr Ser Glu Glu Ile Ala Gln Val Gly Thr

225 230 235 240

Ile Ser Ala Asn Gly Glu Arg Glu Ile Gly Glu Leu Ile Ala Lys Ala

245 250 255

Met Glu Lys Val Gly Lys Glu Gly Val Ile Thr Ile Ala Asp Gly Asn

260 265 270

Thr Leu Tyr Asn Glu Leu Glu Val Val Glu Gly Met Lys Leu Asp Arg

275 280 285

Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr Phe Val Thr Asn Pro Lys Thr Gln Lys Cys

290 295 300

Glu Leu Asp Asp Pro Leu Ile Leu Ile His Asp Lys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Leu His Ala Val Val Lys Val Leu Glu Leu Ala Leu Lys Lys Gln Arg

325 330 335

Pro Leu Leu Ile Val Ala Glu Asp Val Glu Ser Glu Ala Leu Gly Thr

340 345 350

Leu Ile Ile Asn Lys Leu Arg Ala Gly Ile Lys Val Cys Ala Val Lys

355 360 365

Ala Pro Gly Phe Gly Glu Asn Arg Lys Ala Asn Leu Gln Asp Leu Ala

370 375 380

Ile Leu Thr Gly Gly Glu Val Ile Thr Glu Glu Leu Gly Met Asn Leu

385 390 395 400

Glu Lys Phe Glu Pro Gln Met Leu Gly Thr Cys Lys Lys Val Thr Val

405 410 415

Ser Lys Asp Asp Thr Val Ile Leu Asp Gly Ala Gly Asp Lys Lys Ser

420 425 430

Ile Glu Glu Arg Ala Glu Gln Ile Arg Ser Ala Ile Glu Leu Ser Thr

435 440 445

Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser

450 455 460

Gly Gly Val Ala Val Leu Lys Ile Gly Gly Ala Ser Glu Ala Glu Val

465 470 475 480

Gly Glu Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Lys Ala

485 490 495

Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Tyr

500 505 510

Ala Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu Pro Thr Ala Asn Phe Asp Gln Lys

515 520 525

Ile Gly Val Gln Ile Ile Gln Asn Ala Leu Lys Thr Pro Val His Thr

530 535 540

Ile Ala Ser Asn Ala Gly Val Glu Gly Ala Val Val Val Gly Lys Leu

545 550 555 560

Leu Glu Gln Asp Asn Thr Asp Leu Gly Tyr Asp Ala Ala Lys Gly Glu

565 570 575

Tyr Val Asp Met Val Lys Ala Gly Ile Ile Asp Pro Leu Lys Val Ile

580 585 590

Arg Thr Ala Leu Val Asp Ala Ala Ser Val Ser Ser Leu Met Thr Thr

595 600 605

Thr Glu Ser Ile Ile Val Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Glu Ala Pro

610 615 620

Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Met Asp Tyr

625 630

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 41

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ggtattgtac caggtggagg tgttgcactt ctttatgcat caaaggagct ggataaattg 1560

ccgactgcta actttgatca aaagattggt gtacaaatca ttcagaatgc tttgaagaca 1620

ccggtgcaca ctattgcttc caacgcaggt gtagaagggg ctgttgttgt cggtaagctt 1680

ttggaacaag ataacaccga ccttggctat gatgcggcta aaggtgaata tgtggacatg 1740

gtgaaggctg gtatcattga cccactaaaa gtgatcagaa ctggatgctg caagcgtatc 1800

atctctgatg acaaccacgg aatccatcat cgtagagatc ccaaaggaag agaaggaggc 1860

gccagcgatg ggaggcatgg gtggaatgga ttactaa 1897

<210> 9

<211> 632

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Met Leu Leu Glu Pro Pro Arg Val Phe Ser Ser Leu Ile Lys Ser Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Leu Phe Pro Pro Pro Gln Glu Lys Lys Arg Leu His Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Ser Pro Pro Pro Leu Thr Ser Pro Pro Leu Pro Ser Leu

35 40 45

Leu Leu Pro Ser Pro Arg Ser Leu Leu Gly Ser Ala Met Tyr Arg Ala

50 55 60

Ala Ala Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Gln Ala Gly Ser Ser Ala Arg

65 70 75 80

Gln Val Gly Ser Arg Leu Ala Leu Ser Arg Asn Tyr Ala Ala Lys Asp

85 90 95

Ile Lys Phe Gly Val Glu Ala Arg Ala Leu Met Leu Arg Gly Val Glu

100 105 110

Glu Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn

115 120 125

Val Val Ile Glu Gln Ser Tyr Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly

130 135 140

Val Thr Val Ala Lys Ser Ile Glu Phe Lys Asp Arg Val Lys Asn Val

145 150 155 160

Gly Ala Ser Leu Val Lys Gln Val Ala Asn Ala Thr Asn Asp Thr Ala

165 170 175

Gly Asp Gly Thr Thr Cys Ala Thr Val Leu Thr Lys Ala Ile Phe Thr

180 185 190

Glu Gly Cys Lys Ser Val Ala Ala Gly Met Asn Ala Met Asp Leu Arg

195 200 205

Arg Gly Ile Ser Met Ala Val Asp Ala Val Val Thr Asn Leu Lys Gly

210 215 220

Met Ala Arg Met Ile Ser Thr Ser Glu Glu Ile Ala Gln Val Gly Thr

225 230 235 240

Ile Ser Ala Asn Gly Glu Arg Glu Ile Gly Glu Leu Ile Ala Lys Ala

245 250 255

Met Glu Lys Val Gly Lys Glu Gly Val Ile Thr Ile Ala Asp Gly Asn

260 265 270

Thr Leu Tyr Asn Glu Leu Glu Val Val Glu Gly Met Lys Leu Asp Arg

275 280 285

Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr Phe Val Thr Asn Pro Lys Thr Gln Lys Cys

290 295 300

Glu Leu Asp Asp Pro Leu Ile Leu Ile His Asp Lys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Leu His Ala Val Val Lys Val Leu Glu Leu Ala Leu Lys Lys Gln Arg

325 330 335

Pro Leu Leu Ile Val Ala Glu Asp Val Glu Ser Glu Ala Leu Gly Thr

340 345 350

Leu Ile Ile Asn Lys Leu Arg Ala Gly Ile Lys Val Cys Ala Val Lys

355 360 365

Ala Pro Gly Phe Gly Glu Asn Arg Lys Ala Asn Leu Gln Asp Leu Ala

370 375 380

Ile Leu Thr Gly Gly Glu Val Ile Thr Glu Glu Leu Gly Met Asn Leu

385 390 395 400

Glu Lys Phe Glu Pro Gln Met Leu Gly Thr Cys Lys Lys Val Thr Val

405 410 415

Ser Lys Asp Asp Thr Val Ile Leu Asp Gly Ala Gly Asp Lys Lys Ser

420 425 430

Ile Glu Glu Arg Ala Glu Gln Ile Arg Ser Ala Ile Glu Leu Ser Thr

435 440 445

Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser

450 455 460

Gly Gly Val Ala Val Leu Lys Ile Gly Gly Ala Ser Glu Ala Glu Val

465 470 475 480

Gly Glu Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Lys Ala

485 490 495

Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Tyr

500 505 510

Ala Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu Pro Thr Ala Asn Phe Asp Gln Lys

515 520 525

Ile Gly Val Gln Ile Ile Gln Asn Ala Leu Lys Thr Pro Val His Thr

530 535 540

Ile Ala Ser Asn Ala Gly Val Glu Gly Ala Val Val Val Gly Lys Leu

545 550 555 560

Leu Glu Gln Asp Asn Thr Asp Leu Gly Tyr Asp Ala Ala Lys Gly Glu

565 570 575

Tyr Val Asp Met Val Lys Ala Gly Ile Ile Asp Pro Leu Lys Val Ile

580 585 590

Arg Thr Gly Cys Cys Lys Arg Ile Ile Ser Asp Asp Asn His Gly Ile

595 600 605

His His Arg Arg Asp Pro Lys Gly Arg Glu Gly Gly Ala Ser Asp Gly

610 615 620

Arg His Gly Trp Asn Gly Leu Leu

625 630

<210> 10

<211> 5405

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gtggatggat gcttctagag cctcctcgcg tcttctcctc tctcatcaaa tcccctcgcc 60

ctcctctctt tcctcctccc caagaaaaaa aaaggcttca tagctcaacc tcctcgccgc 120

cgccgctcac ctcccctccc ctcccatccc tcctcctccc tagccccagg tcgctgctcg 180

gctccgccat gtaccgcgcg gccgccagcc tcgcctccaa ggctcggtga gtgtgcttgc 240

ttgattcccc tcctccgccc gcattgcgat ctgagtctcg cgacgcgcct gctgttcttt 300

ccgacgtttg agcggtttgc tgaactgttt cgttgttggt gcaggcaagc cgggagcagc 360

gctcgccagg tgagcggatt cgtgatggag tggggttttg tctcgctggg tttattagtt 420

tgagttagtg tgggtgtggg agtgggagtg ggaggttgtg cgtctcgttc cggtttggtg 480

atgtgtgtgg ggggtgggag attcgtttgg ggtttctgtg ctgggcttcg tgaaatctgt 540

ttgaatggct agaatccact ggatttacac ttgaagtttg atttagtcca ttgtggtggt 600

cagggatcaa gtagtaccgt tgatttcaat tgtcgatgtt gtgaaattgg ttgtttgcta 660

gtgtaaagat caatgcttgc tggcactcaa gaaagatcta tgcttttttt tttctttcga 720

ggtggcggcg aaaagatata tgcttgtttc tgttagatgt tatgtcagtg acgactgttg 780

aagagttagc gacttgtttt tgtgtatgta gtttagctca gaagttgaat tttgctccaa 840

ttgagtaagt ctgcttgtga tcctcagttt ctcactggtc tgtaatcgtc gtgagttgat 900

ggtggtcaga gttggttgta atcaaatgaa ctttcttttt tgctttgttt ccttatatat 960

gatgatatgt aggttggaag caggcttgcc ttgagcagga actatgctgc caaggatatc 1020

aagtttggag ttgaggcccg tgctttgatg ctgaggggtg ttgaggagtt ggcagatgca 1080

gtcaaagtga caatgggtcc taaggtataa ttgtgttcat gtaaatgtgt cattgtgcac 1140

ttgtgtactt gtctgaatac gttaattgtt ttgtagctat tataaatgaa gttcctttga 1200

tagaaagcca aatgattggt ttatgattct gaaaataact gtcataaaca tggtgcacct 1260

tttctctgat gacaaaatta gtctttatgt catgctttca ttgttgcagc acagtgtttg 1320

ttgggcctac aactttttat gtttttattt tgtcagagtg ctgtgttgtg ttatttgcag 1380

attggactta acgtgtctat tatgcaggga cgcaatgtgg ttattgagca gagctatggt 1440

tcaccgaaag tcacaaagga cggtgtgact gttgccaaga gcattgagtt caaggataga 1500

gtcaagaatg ttggtgcaag ccttgtaaag caggttgcta atgcgaccaa tgatactgct 1560

ggagatggta tggctgtact tgtaccattc tgttgagaat acttggtcct tctgttagca 1620

ttctacaact ttggttatat attataaaca attccagacc atctcatgtt ttgccttcct 1680

gtaatattta acctgtaact tatatttaca aatatgttca ttatttgcat ttttgcataa 1740

agtaattcac tgtatttaat ttattgttgg acgaaggttt gagtgtatgc agttcttatc 1800

ttcattgtat tcataggtgt gagttttggc attgtaattt attgttgttt gggcattttc 1860

aatcatctat caatgctacc ttgaattata atgctatata gtaccactgg tttttgatag 1920

atgtcacggt tgactttttt atacacaatt tgttttgtta aaaaacgaaa attattattc 1980

attttgttgt gacttggttt atcatcaaag gtagtataag catgacttac attttcacat 2040

atttgcacaa attcaatatg tggattgcat tgtactttag gatttgctta gttgcataat 2100

ttgtttgttc taactgtgtt attctgatcc aaaattcagg taccacttgt gctactgtat 2160

tgactaaagc aatatttact gaggggtgca agtctgttgc tgctggcatg aatgcaatgg 2220

atttaaggcg tggtatttca atggctgttg atgctgttgt aactaaccta aagggcatgg 2280

ctagaatgat cagcacatca gaggaaatag ctcaggtaat acttgtgatt cattgcagat 2340

ctcattatgt gtttgacttg tttcttaatc ttaatctgtt actaagttct tatgttcata 2400

tataaaggtg ggcacaatat cagcaaatgg ggaaagggaa attggtgagc ttattgcaaa 2460

ggctatggag aaggttggca aggagggtgt aatcaccatt gcggtaagtt gatccaagtt 2520

aaaactgaac ttggcctctc ttatctctat ttggttggta gacttccttt agttaaaact 2580

gaacttgtgc caacactctg gtttttcgtt aatttgtttg cttaaacatt tggtaggatg 2640

gtaacaccct ttacaatgag cttgaagttg tggaaggcat gaaacttgac agaggctaca 2700

tctctcctta ctttgttacc aacccaaaga cccagaaatg tgtaagtttt taacttctgt 2760

tgttggttga tatgttcagt ttttcttttg gaactatcta agtcatgagg ttatatttaa 2820

caggaactgg atgacccctt gatcctgata catgacaaga aggtttcgaa cctgcatgca 2880

gtagttaaag tcttggagtt ggctctgaag gtatgtgttt gctttcataa aatagttgta 2940

tattgtggtg gtgctactga ttttcttgct ataactggtc aacatcttgc cttgcacaga 3000

agcaaaggcc tctgctgatt gttgctgaag atgtagagag cgaggcattg ggtactctga 3060

ttattaacaa gcttcgtgca ggcatcaagg tcagtaaata ctgggcattt gtgatttgaa 3120

tctgtgtagt tgtcctaaat gagggatgtg ttgttcaggt ctgtgctgtt aaagctcctg 3180

ggtttgggga gaacaggaaa gcaaacttac aggaccttgc gatccttact ggaggagaag 3240

taagtttaac aatcacctct ccaagttggt gcatataaat ttaaccaatt gaatgcatta 3300

taacctgttt attttaatga ttcaggtcat aactgaagag ctaggaatga atcttgagaa 3360

gttcgagcct cagatgttgg gtacatgcaa gaaggtatga atgattccta gaaggctggt 3420

agataagctt tggctatctt tggaaagaaa tttgtttgaa gtgtatcttt tgtccgctaa 3480

catttaagat gataccagtc tgttctgatg gttgagtgat attccatgtc cattacaggt 3540

aactgtatct aaggacgaca ctgttattct tgatggagct ggagacaaga aatccattga 3600

agagagggct gagcaggttc gtacaacatt aattcattgc gttactagtg cattattttg 3660

aaaatcgtgg ttgttgatag attatataaa tgctgtgttg cagattagat ctgcaattga 3720

gctaagcact tctgattatg acaaggaaaa gctacaggag cggttggcaa agctctccgg 3780

aggtgttgct gttctaaagg tgaggttcac aatattatgt ttatattgag gaatatatat 3840

tgaatgaaat aacaaacttt ccgaacattc catggttaga taaaccatct gaaagagcca 3900

atgttagaca gaataccaga tatgttactg tgtagccacc tagtgttgat tctattatat 3960

tgatggtaaa agcttgtgaa gtctcattag agacctcaca cttgtaacac acaatgatgt 4020

tgagaatgga agttgaattg cactgctagg agtggtgccc tgaagttata ttttgacctg 4080

tatatgcatc atgacctttc ctacagatcg gaggagccag tgaagctgaa gttggtgaga 4140

agaaggatag agtgacagat gcattgaatg ccactaaagc tgctgtggaa gagggtattg 4200

taccaggtat gcagttgctc cacttcagta gatttctttc aatatgtttt ccttgtaatg 4260

tacttgttca gtttgcatct ttgcattatt atgcccaagt atgctgacat gacatctttg 4320

cattacaata caggtggagg tgttgcactt ctttatgcat caaaggagct ggataaattg 4380

ccgactgcta actttgatca aaagattggt gtacaaatca ttcagaatgc tttgaaggtt 4440

tgggagggat aataacttct catttcctgt tttgctgatt tcttctctgg gagcaaaacc 4500

tgatgacaac ttattttgca gacaccggtg cacactattg cttccaacgc aggtgtagaa 4560

ggggctgttg ttgtcggtaa gcttttggaa caagataaca ccgaccttgg ctatgatgcg 4620

gctaaaggta tgattgaacc tttcctcatt gaatatcgta atatcccatg attgtcgtct 4680

gtagtttgtt gctgatccgt gtgcgatata ccttatgtag gtgaatatgt ggacatggtg 4740

aaggctggta tcattgaccc actaaaagtg atcagaactg ccttggtgga tgctgcaagg 4800

taagctctca agttcatggt tctgtgcttt agttctttac attaaattgt tgatcaaaca 4860

tgggtgatac actgaagcac ccacctcatc ccttgtgctt atttcggttt ttgatctgaa 4920

atttttcacc catttaacgt tacttttggc tcttgcgggt tcttacaagt tgtttgcctt 4980

ctgcagcgta tcatctctga tgacaaccac ggaatccatc atcgtagaga tcccaaagga 5040

agagaaggag gcgccagcga tgggaggcat gggtggaatg gattactaat caacacccat 5100

taaagtaaac taaaaacata ctcctgggat ttaggatttt ttttgcggtg caagttcatc 5160

gtcgatgtat tttttgttct tgttgatgag gtggttgtca gacaattttg attccactgg 5220

cggtaggacg ggttggaacg aataaaattt tagttcagag ctaggagttc ttgagagctg 5280

aggactgcac ttcgatcaaa attgaatctg acaccttgtg ccggaacatt tttatgagct 5340

gatctgaaag attacgcctt ttggcctgag gtggtgtgca gttgttttta ttcattctct 5400

ttagt 5405

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccgctaacat ttaagatgat acc 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ggtcaaaata taacttcagg gcac 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gagcggttgg caaagctctc 20

Claims

1.一种水稻温敏雄性不育基因HSP60-3B的应用，其特征在于，所述温敏雄性不育基因HSP60-3B编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述的应用具体是，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得水稻雄性不育株系；所述常规水稻品种为粳稻品种9522；

或，采用CRISPR/Cas9系统定点敲除HSP60-3B基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，获得水稻温敏雄性不育株系；所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应，构建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒；所述靶序列如SEQ IDNo.13所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d) 通过将HSP60-3B基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

2.一种水稻温敏雄性不育株系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻温敏雄性不育株系，所述处理为，使常规水稻品种中如SEQID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得水稻雄性不育株系；所述常规水稻品种为粳稻品种9522；

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

3.一种如权利要求2所述的方法获得的水稻温敏雄性不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途为：在平均温度32℃至34℃条件下，以水稻HSP60-3B不育株系作为母本，进行杂交育种；或，在平均温度22℃条件下，以水稻HSP60-3B株系进行自交制种。

4.一种恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述HSP60-3B基因转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型；所述HSP60-3B基因编码的氨基酸序列如SEQID No. 1所示。

5.如权利要求4所述的恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含HSP60-3B互补构建载体的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中HSP60-3B互补构建载体含有序列如SEQ ID No. 5 所示的核苷酸。

6.如权利要求5所述的恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物扩增出HSP60-3B基因的基因组序列片段；

(b)提供权利要求5中含HSP60-3B互补构建载体的根癌农杆菌EHA105；

(c)将根据权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞、组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。