CN101810140B - 一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法，它包括如下步骤：a、选用铁皮石斛茎段或茎段腋芽为外植体，其中茎段或茎段腋芽的叶绿体具有GenBank登录号为：FJ530946的基因序列；b、腋芽成活生长，丛生芽的诱导与增殖，成苗；其中，培养条件是：培养室温度(26±2)℃，光照强度2000lx，pH 5.8~6.0，光源为日光灯或LED光源，每天光照12h。本发明方法是针对目前石斛组织培养方法的不足，对其进行改进，提供一种铁皮石斛种苗快速繁殖的方法，该方法可以在短时间内满足大规模生产所需的种苗，还具有成本低、种苗生长整齐、练苗方法简单易行、遗传稳定性好等特点。

Description

一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法

技术领域

本发明涉及一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法，属栽培领域。

背景技术

石斛属(Dendrobium)为兰科的一个属，包括1600多种植物，我国约有76种，其中铁皮石斛最为珍贵。中医认为石斛具有滋阴清热、生精止渴和明目强身的作用。现代医学发现石斛含有多种生物碱、多糖和氨基酸，具有提高免疫力、抑制血栓形成、抑制肿瘤和延缓衰老的作用。

石斛是我国的传统名贵中药，由于生长条件苛刻，附生在悬崖峭壁的石缝或石槽、林内树干上，自然产量极少，自然条件下生长极为缓慢，更因长期采挖，致使野生资源濒临绝种。作为一味传统的名贵中药，近年来国内外对石斛尤其是铁皮石斛的需求量越来越大，石斛的栽培研究虽然很多，但由于石斛生长非常缓慢，目前的栽培远不能满足市场的需求。因此，关于石斛属植物的组织培养日益引起人们的重视，各研究机构和企业纷纷投入，有关这方面的研究逐渐增多，这些研究主要集中在培养基的筛选上，且大多为实验研究阶段，真正成功应用于生产，进行规模生产的却为数不多。铁皮石斛试管苗成本高，移植成活率低，成为铁皮石斛产业化生产的“瓶颈”。

梁日高，石斛茎段在简易培养基上快速繁殖，《中国花卉园艺》，2008年2期，该文献公开了以茎段为外植体，以简易培养基培养，在适宜的条件下，诱导出腋芽，再进行增繁、生根培养，不仅缩短了时间，也能保持品种的优良性状。但该方法由于直接成苗，繁殖系数低，不能成为大规模培养的有效途径。申请号：200410017380.6，发明名称：一种铁皮石斛的培育方法，该方法包括细胞分化、种苗培育、定植培育三个步骤。该方法大大缩短了铁皮石斛的培育时间，整个周期控制在6个月左右，且无需田间栽培，可以大规模工业化生产，优选培育种苗，培养生产的铁皮石斛鲜品质量更加稳定，食用药效更加上乘。申请号：200910036502.9，发明名称：铁皮石斛种苗高效繁殖方法，涉及一种铁皮石斛种苗的繁殖方法，其特征是将生长健壮的铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)母株人工授粉得到的果实消毒杀菌后切开，用种子萌发培养基培养，使种子萌发成原球茎并进一步形成小苗，再将试管繁殖来的小苗用试管开花培养基培养，开花后选择生长健壮的植株进行试管内人工授粉，果实成熟后切开进行无菌播种，使种子长成小植株，小植株在壮苗培养基上培养，形成成苗，将成苗在自然光下炼苗，进一步栽培成种苗。李进进，等，铁皮石斛试管苗栽培技术研究，《中药材》，2006年29卷11期，采用不同基质、不同来源种苗及在不同海拔高度栽培试验。结果：原球茎增殖超过4代或者茎段增殖超过6代的试管生根苗的移栽成活率显著下降；海拔高度对移栽成活率没有显著影响，但生长质量及石斛多糖含量有明显的差异；移栽的基质以松树皮与碎石、花生壳与碎石综合效果较好，移栽成活率达到95％以上。结论：种苗质量及适当的栽培基质是实现铁皮石斛组培苗产业化生产的根本保证，采用“平地育苗，高山栽培”是保证铁皮石斛药材质量的有效方式。邢福桑，等，铁皮石斛栽培技术的研究概况，《时珍国医国药》，2002年13卷9期，综述了近年来国内关于铁皮石斛栽培技术的研究概况，指出由于铁皮石斛自然繁殖率低，通过试验研究，用组织培养繁殖试管苗是解决种苗的有效途径。实验得出铁皮石斛的繁殖程序是：原球茎增殖的培养、原球茎分化、壮苗培养，是可行有效的，该文献还公开了具体培养基和培养条件参数。以上公开的方法难以在大规模生产过程中实现。

在植物组织培养过程中，环境因子对试管苗的生长发育的影响极大。光是最重要的环境因子之一。高效人工光源的发展一直是植物组织培养研究和生产中一项非常重要的课题。长期以来，植物组培室中使用最为广泛也是最普通的人工光源有荧光灯、高压钠灯和金属卤化物灯。但是，上述人工光源普遍存在寿命短、发热量大以及发光效率不高等缺点。而植物对以上的光源利用率仅50％左右。大量的能量被浪费掉。20世纪80年代以来，人们纷纷利用发光二极管具有光电转化率高、体积小、寿命长、波长固定、光强可调、发热量低、节约能源和可提高单位面积栽培量的优点，进行了在各种植物上应用的研究。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法。

本发明提供了一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法，它包括如下步骤：

a、选择铁皮石斛茎段或茎段腋芽为外植体，检测其茎段或茎段腋芽的叶绿体具有GenBank的登录号为：FJ530946的基因序列，如SEQ ID NO：1所示的外植体备用；

b、腋芽成活生长，丛生芽的诱导与增殖，成苗；其中，培养条件是：培养室温度(26±2)℃，光照强度2000lx，pH 5.8~6.0，光源为日光灯或LED光源，每天光照12h。

其中，检测外植体的方法如下：

1)提取外植体DNA；

2)用序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物，对1)提取的DNA进行PCR扩增，

SEQ ID NO：2：5‘-CCTATATCCGCTACTCCTTC-3’，

SEQ ID NO：3：5’-CTCAGTGAATTTCACCACG-3’，

3)将SEQ ID NO：1基因序列作为阳性对照；

4)检测扩增产物，判断是否含有SEQ ID NO：1所示序列。

其中，所述的LED光源中红光和蓝光的比例为6-9∶1-4。

其中，所述的腋芽成活生长培养基为：1/2MS+NAA 0.2mg/L+BA 1mg/L。

其中，所述的丛生芽的诱导与增殖培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L+香蕉汁100g/L。或所述的丛生芽的诱导与增殖培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L+马铃薯汁200g/L。

本发明方法具有如下优点或效果：

1、本方法具有节能的优点，提高了铁皮石斛组培苗对有效光的利用率，同时试管苗生长整齐。

2、本发明的原球茎实质上是体细胞胚，是试管苗生长发育的必经阶段，具有成熟植株的生长发育潜能。铁皮石斛原球茎的生长周期为45天左右，缩短了生长周期。

本发明避免了传统组培室夏季大量使用空调降温，克服了传统组织培养过程中成本低的弊端。

3、由于采用成熟的茎段做外植体，保证了遗传的稳定性，同时由于其数量多，可以在一年四季中随时更新。

4、本发明克服了传统繁殖方法繁殖速度慢，很难满足大规模生产需要的不足，可以将铁皮石斛种苗繁殖工厂化，在短时间内能够繁殖出大规模生产所需要的种苗。

本发明方法是针对目前石斛组织培养方法的不足，对其进行改进，提供一种铁皮石斛种苗快速繁殖的方法，该方法可以在短时间内满足大规模生产所需的种苗，还具有成本低、种苗生长整齐、练苗方法简单易行、遗传稳定性好等特点。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1叶绿体matk基因的基本结构

具体实施方式

实施例1本发明铁皮石斛试管苗的繁殖方法

1材料与方法

1.1材料

供试材料铁皮石斛(D.officinale)采自贵州荔波、三都，广西乐业、永福，种植于本所苗圃。

1.2方法

当铁皮石斛植株茎节间新长出腋芽长0.5~1.0cm时，用刀片小心切下完整腋芽，自来水冲洗干净。在超净工作台上，材料先用75％酒精浸泡30s后，0.1％升汞消毒10min，无菌蒸馏水浸洗4次，每次5min。多余水分用无菌滤纸吸干。最后将材料接种在试验培养基上。

以MS为基本培养基，分别添加不同种类和浓度的NAA、BA以及不同的天然提取物香蕉汁100g/L或马铃薯200g/L，蔗糖3％，琼脂7g/L，pH 5.8~6.0，高压灭菌20~25min。培养室温度(26±2)℃，以日光灯为光源，光照强度2000lx，每天光照12h。

材料接种培养后，随时观察腋芽的成活生长、丛生芽的诱导增殖以及试管苗的健壮情况，并定期统计腋芽成活率、丛生芽的诱导增殖倍数和丛芽个数，同时对出瓶试管苗的茎粗、茎高、叶片数、叶色以及根数等形态学特征进行了调查。

2结果

2.1不同激素组合对腋芽成活生长的影响

基本培养基为1/2MS，将添加不同种类和浓度的NAA、BA对腋芽的成活生长情况列于表1中。由表1可见，当培养基中没有添加任何激素时，培养60天后，有50％的腋芽仍保持成活，但基本维持原来状态，没有进一步的生长。而有50％的腋芽会逐渐变黄褐化而死亡。培养基中添加激素后，腋芽开始伸长生长，并分化出叶。只是激素比例不同，腋芽萌发生长的时间、存活率有所差异。如果只添加NAA，腋芽成活率只有33.3％。当NAA和BA浓度相同或大于BA时，腋芽最长0.5cm，成活率分别为42.5％和50％。当BA浓度大于NAA时，腋芽萌动时间最早，培养10天就可见腋芽变粗、伸长，60天后，长度可达1.5~1.8cm，长出3片叶，并且成活率为100％。以上结果表明，最适合石斛腋芽接种后成活生长的培养基为：1/2MS+NAA 0.2mg/L+BA 1mg/L。

表1不同激素组合对腋芽成活生长的影响

Table 1 Effect of combinations of NAA with BA on in vitro survive and growth of the axillary buds

*：腋芽成活率＝腋芽成活生长的总数/接种的腋芽总数

*：survive of the axillary buds rate＝No.of survive and growth/No.of inoculation

2.2不同BA与香蕉汁组合对丛生芽诱导增殖的作用

在腋芽继续伸长生长的同时，其基部不断有新的丛生芽发生。表2列出了培养基中添加天然提取物香蕉汁和不同浓度的细胞分裂素BA对丛生芽诱导增殖的影响。由表2可见，加入香蕉汁后发生丛生芽的时间提前，并能提高芽的增殖倍数，有利于铁皮石斛丛生芽的诱导与增殖。在生长素NAA浓度相同(0.5mg/L)的情况下，随着BA浓度的不断增加，增殖倍数不断提高，当BA浓度为2.0mg/L时，培养160d，增殖倍数达最大值14.0，平均增殖倍数也是最高的，为6.4，1个腋芽能增殖的最多丛芽数高达111个。但BA浓度超过2.0mg/L，为5.0mg/L时，增殖倍数又呈下降趋势。本试验表明NAA和BA适当组合能较大程度的提高增殖倍数，促进丛生芽的诱导与增殖。其最适培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L+香蕉汁100g/L。从表2还可以看出，随着培养时间的延长，增殖倍数也呈逐渐提高趋势。

表2不同BA与香蕉汁组合对丛生芽诱导增殖的作用

Table 2 Effect of BA with banana juice on in vitro multiple shoot induction and prolifernation

*：丛芽增殖倍数＝新发生的丛芽总数/转接的新芽总数；培养天数从接种腋芽材料的第

1天开始计算连续的培养天数总和

*：propagation coefficient＝No.of shoot propagation/No.of inoculation；day of culture wascalculated from the first day of culture.

2.3天然提取物对丛生芽生长成苗的影响

丛生芽转到新的培养基中，经过2~3个月的壮苗培养，形成试管苗。表3表明，当培养基中没有添加任何天然提取物时，丛生芽长成的试管苗纤细、矮小，叶色淡绿，叶片数少，每苗根数较少。只有13.2％的试管苗达到优质苗的标准。当培养基中添加了香蕉汁或马铃薯汁时，试管苗的质量得到明显改善，90％以上的试管苗为优质苗。茎高为6~14cm，茎粗为0.2~0.4cm，叶色浓绿或淡绿，叶片数增加到5~9片，每株苗根数增多为5~9条。本试验表明天然提取物香蕉汁或马铃薯汁均有利于壮苗、生根。

表3天然提取物对丛生芽生长成苗的影响

Table 3 Effect of banana and tomato juice on shoot growth

3讨论：

铁皮石斛丛生芽诱导与增殖的最佳比例为NAA 0.5mg/L，BA 2.0mg/L。在培养基中添加天然提取物香蕉汁有利于丛芽的增殖，当添加另外的天然提取物香蕉汁也同样有利于丛芽的增殖。本试验特别对试管苗的根、茎、叶等形态学特征进行了调查，并与生产中铁皮石斛种苗的等级进行了比较，发现培养基中添加天然提取物香蕉汁或马铃薯汁均能获得优质苗。优质苗的获得为成功移栽奠定了材料基础。

同时，通过丛生芽途径建立的快繁体系，也使铁皮石斛优质试管苗的数量得到极大提高，在合适的培养基上，丛生芽诱导的最大增殖倍数可达14.0。以平均增殖倍数6.4计算，如果1个芽1年继代培养5次，可获得6.4⁵＝10737.4个芽，培养100个腋芽就可以获得100万个左右的丛生芽，进而可获得100万丛试管苗。与分株繁殖相比，大大提高了繁殖系数。

濒危植物铁皮石斛高效快繁体系的建立为规模化生产提供了技术上的可能性。其深远意义不仅仅是规模化生产的种苗依靠人工栽培来满足市场需求，产生经济效益，并且规模繁殖成功还可以增加野生居群数量，有利于野生居群的恢复，产生良好的社会效益和生态效益。

实施例2本发明铁皮石斛试管苗繁殖过程中光源的选择试验

取已经分化的高度2cm左右的铁皮石斛试管苗小植株，每个培养瓶中接种5株，共10瓶。培养时间为50天，测定株高、叶数、根数、最大根长。以普通荧光灯为对照光源。

当LED光源中红光和蓝光的比例为(6-9)∶(1-4)变化时，试苗管都能生长健壮，与对照比差异显著，并且长势均一。

实施例3试管苗特定基因序列检测

1、铁皮石斛基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法：

(1)取石斛新鲜的叶片0.1g，用无菌水冲洗干净，在液氮中研磨成粉。

(2)将研磨好的组织粉末迅速装入2mL离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液700μL(含2％的CTAB，1.4mol·L^-1的NaCl，0.02mol·L^-1的EDTA，1％的PVP)，65℃水浴30min，并不时的颠倒混匀。

(3)加入相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，抽提10min(上下轻轻翻动)后以8000r·min^-1的转速离心10min。

(4)取上清加等体积苯酚-氯仿-异戊醇按步骤3再抽提1次。

(5)小心取上清液于1.5mL的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，室温下放置30min沉淀DNA，然后5000r·min^-1离心10min。

(6)轻轻倒掉乙醇，用70％的乙醇清洗DNA 2次，倒掉残留的乙醇，操作过程动作要轻缓。

(7)在室温下将DNA干燥，然后用50μLTE溶解DNA。

(8)用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并经EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像系统(UVP GDS-8000)上观测其纯度并判断DNA分子的大小及一致性。

2、matk基因序列扩增引物

根据GenBank中已发表的兰科matK基因序列，设计1对引物序列M1和M2，

序列如下：M1为5‘-CCTATATCCGCTACTCCTTC-3’，

          M2为5’-CTCAGTGAATTTCACCACG-3’，

由上海生物工程有限公司合成。用1对引物M1，M2扩增出石斛的叶绿体matK基因序列，如图1。

3、PCR反应体系和反应程序

PCR扩增反应在25μL的体系中完成。

反应体系：灭菌ddH₂O             15.9μL

          10×Buffer            2.5μL

          MgCl₂                 1.5μL

          dNTP                  2μL

          引物M1，M2            各1uL

          模板                  1μL，约50ng

          Taq酶                 0.1μL

扩增程序：94℃预变性            5min

          94℃变性              30s

          50℃退火              30s

          72℃延伸              1.5min

          共30个循环后，

          72℃延伸              7min

以ddH₂O代替DNA作空白对照。

4、PCR产物的回收和纯化

PCR产物回收纯化用AXYGEN试剂盒，操作步骤如下：

使用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，PCR产物经电泳后利用回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸干凝胶表面的液体并切碎。应注意尽量切除不含目的片段的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收效率，此外，注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，防止DNA损伤。

(2)切碎胶块，称量凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，计算凝胶体积(如1mg＝1μL体积)。

(3)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2~3min)，直至胶块完全熔化(约6~8min)。

(4)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(5)吸取混合液，转移到DNA制备管(置于2mL离心管)中，12000×g离心1min，弃滤液。

(6)将制备管置回离心管，加500μL BufferW1，12000×g离心30s，弃滤液。

(7)将制备管置回离心管，加700μL BufferW2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL BufferW2洗涤一次12000×g离心1min。

(8)将制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1min。

(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25~30μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。

5、DNA片段的连接

载体为购自大连宝生物公司的pMD18-T。

连接体系共10μL：

          PCR胶回收純化产物    4.5μL

          Solution I           5μL

          pMD18-T Vector       0.5μL

16℃下连接过夜。

6、质粒的转化

利用E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞进行质粒的转化，操作步骤如下：

(1)从液氮罐中取出冻存的大肠杆菌感受态细胞(DH5α)于冰上解冻后，取50μL于预冷的1.5mL离心管中。

(2)加入5μL连接产物，用枪头轻轻搅拌使其混匀，继续将其置于冰上30min。

(3)热冲击：42℃水浴下准确放置120s。

(4)冰上放置5min后，加入800μL LB培养基，200rpm，37℃振荡恢复培养1h。

(5)融化固体LB培养基，待其温度降至40℃左右时加入氨苄青霉素，使培养基中氨苄青霉素浓度约为100μg·mL^-1。摇匀后倒平板，冷凝待用。

(6)将上述离心管取出于5000rpm离心5min，使大肠杆菌沉淀于管低，倒掉上清液一部分，留100~150μL倒平板。

(7)用移液枪轻轻吸打剩下的菌液使其混匀，取100μL较浓菌液涂布LB固体平板，倒入5、6枚玻璃珠，左右水平摇晃，37℃倒置培养12~16h。

7、阳性克隆的鉴定及序列测定

(1)待LB平板上长出乳白色较大的菌落时，用灭过菌的牙签挑取单菌落接种于含1mLLB液体培养基中(含100μg·mL^-1的氨苄青霉素)的1.5mL离心管中，37℃培养、200r·min^-1震荡培养4~5h。

(2)取出摇好的菌，吸取200μL菌液于PCR管中。

(3)80000r·min^-1离心2min，弃去上清液(应尽量吸干)。

(4)加入20μL 2×Craking裂解液，用移液枪反复吸打使细胞裂解充分直至出现粘稠细丝。

(5)加入Loading Buffer 2L后8000r·min^-1离心10min。

(6)以质粒PUC-18做对照在1％琼脂糖凝胶电泳中检测阳性克隆。

(7)DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司和上海生物工程有限公司完成。

8、序列测定

DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司和上海生物工程有限公司完成。

9、数据处理方法

DNA序列的排序用BioEdit软件完成，排序后的序列用MEGA4.0软件分析。

通过上述方法对外植体和制备的制备的试管苗进行检测，其中茎段或茎段腋芽及试管苗的叶绿体具有GenBank登录号为：FJ530946的基因序列。

Untitled.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>四川万安石斛产业开发有限公司

<120>一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法

<130>CD562-09P108054

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1416

<212>DNA

<213>叶绿体matK

<400>1

cattatcata gcttaaatag tttgattttt tacgaacctg tggaatttct aggttatgac   60

agtaaattta gtttagtact tgtgaaacgt ttaattattc gaatgtatca acagaaatct  120

ttgatttctt cggtgaatta ttctaaccaa aatggatctt gggagcacaa gaattctttt  180

tcttctcatt tttcttctca aatggtatca gaaggttttg gagtcattct ggaaattcca  240

ttctcgtcgc aattcttagt atcttccctt gaagaaaaaa gaataccaaa atctcagaat  300

ttacgatcta ttcattcaat atttcccttt ttagaggata aattatcgca tttaaattat  360

gtgtcagatc tactaatacc ccatcccatc catctggaaa tcttggttca aatccttcaa  420

tgttggatta aagatgttcc ttctttgaat ttcttgcgat tgtttttcca cgaatatcat  480

aatttgaata gtctctttac ttcaaagaaa tccatttacg tcttttcaaa aagaaagaaa  540

agattctttt ggttcctaca taattcttat gtatatgaat gcgaatatat attcctgttt  600

cttcgtaaac agtcttctta tttacgatca atatcttctg gagtctttct tgagcgaaca  660

catttctatg gaaaaataga atatcttata gtcgtgtgtt gtaatttctt ttcagaggat  720

cctatggttc ctcaaggata ctttcataca ttatgttcga tatcaaggaa aagcaattct  780

ggcttcaaaa ggaactctta ttctgatgaa aaaatgggaa tttcatcttg tgaatttttg  840

gcaatcttat tttcactttt gggtttcaac cttataggat ctatataaag caattaccca  900

actattcctt ctcttttctg gggttatttt caagtgtact gaaaaatcct tttgtagtaa  960

gaaatcaaat gctagagaat tcatttcata ataaatactc tatctaagaa attagatacc 1020

atagccccag ttatttctct tattggatca ttgtcgaaag atcgattttg tactgtattg 1080

ggtcatccta ttagtaaacc gatctggacc gatttatcgg attctgatat tcttgatcga 1140

ttttgtcgga tatgtagaaa tctttgtcgt tatcacagcg gatcctcaaa gaaacaggtt 1200

ttgtatcgta taaagtatat acttcgactt tcgtgtgcta gaactttggc tcgtaaacat 1260

aaaagtacag tacgcacttt tatgcgaagg ttaggttcgg gattcttaga agaattcttt 1320

tttgaagaag aacaatctct ttctttaatc ttcctccaaa aaataccttt tattttacac 1380

ggattacata gagaacgtat ttggtatttg gacatt                           1416

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>引物1

<400>2

cctatatccg ctactccttc                                               20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>引物2

<400>3

ctcagtgaat ttcaccacg                                    19

Claims (1)

1.一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、选择铁皮石斛茎段或茎段腋芽为外植体，检测其茎段或茎段腋芽的叶绿体具有GenBank的登录号为：FJ530946的基因序列，如SEQ ID NO：1所示的外植体备用；

b、腋芽成活生长，丛生芽的诱导与增殖，成苗；其中，培养条件是：培养室温度（26±2）℃，光照强度2000 lx，pH 5.8-6.0，光源为LED光源，每天光照12 h；

所述检测外植体的方法如下：

1）提取外植体DNA；

2）用序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物，对1）提取的DNA进行PCR扩增，

SEQ ID NO：2：5‘-CCTATATCCGCTACTCCTTC-3’，

SEQ ID NO：3：5’-CTCAGTGAATTTCACCACG-3’，

3）将SEQ ID NO：1基因序列作为阳性对照；

4）检测扩增产物，判断是否含有SEQ ID NO：1所示序列；

所述的腋芽成活生长培养基为：1/2MS＋NAA 0.2 mg/L＋BA 1 mg/L；

所述的丛生芽的诱导与增殖培养基为：1/2MS﹢NAA 0.5 mg/L﹢BA 2.0 mg/L ﹢香蕉汁100 g/L或者1/2MS﹢NAA 0.5 mg/L﹢BA 2.0 mg/L ﹢马铃薯汁200 g/L。

所述的LED光源中红光和蓝光的比例为6-9︰1-4。

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